JP6420379B2 - ヒトox40受容体に対する結合分子 - Google Patents
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Description
本明細書における開示及び特許請求の範囲は、特許請求された発明主題が実施された日付に又はその前に効力があるPfizer Inc.とMedarex, Incとの間の共同研究の合意の範疇
で実行された活動の結果として実施されたものである。
されることが見いだされている。OX40R+ T細胞の多さは腫瘍(腫瘍浸潤性リンパ球)内及
びがん患者の流入領域リンパ節において実証されている(非特許文献3;非特許文献4;
非特許文献5)。腫瘍プライミングの間のインビボでのOX40R結合は、コントロール処置マウスと比較して有意に遅くなり、腫瘍の出現を妨げることが、マウスにおける腫瘍モデルにおいて示された(Weinbergら、2000)。従って、OX40R結合剤を使用してOX40Rを結合させることにより抗原に対する哺乳動物の免疫応答を増強することが検討されている(特許文献1;Weinberg ら、2000)。
本開示は、OX40R抗体、OX40R抗体の抗原結合フラグメント、及びOX40R抗体の誘導体を
含む、ヒトOX40Rに結合する単離された結合分子を提供する。いくつかの実施態様におい
て、本結合分子は、1×10-7 M又はそれ以下のKDでヒトOX40Rに結合し、そしてヒトOX40Rに対してアゴニスト活性を有する。いくつかのさらなる実施態様において、本結合分子は、100nM又はそれ以下のKDでヒトOX40Rに特異的に結合するヒトモノクローナル抗体である。
又はその抗原結合フラグメントである。本組成物は、さらなる薬剤、例えば化学療法薬、免疫治療薬、及びホルモン(homornal)治療薬をさらに含み得る。
定義
用語「アゴニスト」は、本明細書で定義される場合、OX40Rに結合する際に、(1)OX40R
を刺激若しくは活性化し、(2)OX40Rの活性、機能若しくは存在を増強、増加、促進、誘導若しくは延長し、又は(3)OX40Rの発現を増強、増加、促進若しくは誘導する、結合分子を指す。
は、カッパ軽鎖及びラムダ軽鎖として分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、又はエプシロンとして分類され、そして抗体のアイソタイプをそれぞれIgM、IgD、IgG、IgA、及びIgEと定義する。軽鎖及び重鎖内で、可変領域及び定常領域は約12個
又はそれ以上のアミノ酸の「J」領域で結合され、重鎖は約3個又はそれ以上のアミノ酸
の「D」領域も含む。各重鎖は重鎖可変領域(本明細書ではHCVR又はVHと略される)及び重
鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、3つのドメイン、CH1、CH2及びCH3からなる。各
軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書ではLCVR又はVLと略される)及び軽鎖定常領域から成る。軽鎖定常領域は1つのドメインCLから成る。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞(例
えばエフェクター細胞)及び古典的補体系の第一の成分(C1q)を含む、宿主組織又は因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介し得る。VH領域及びVL領域は、より保存されたフレームワーク領域(FR)と呼ばれる領域が組み込まれた、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超多
様性(hypervariability)の領域にさらに細分することができる。VH及びVLはそれぞれ、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端まで配置された3つのCDR及び4つのFRから
構成される: FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。各重鎖/軽鎖対(VH及びVL)の可
変領域はそれぞれ、抗体結合部位を形成する。各領域又はドメインへのアミノ酸の帰属は、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987及び1991))又はChothia及びLesk(1987) J. Mol. Biol. 196:901−917;Chothia et al. (1989) Nature 342:878−883の定義に従う。用語「抗体」は、抗体多量体(抗体の多量体形態)、例えば二量体、三量体又は単量体抗体のより高次の多量体の一部である抗体を包含する。非抗体部分に連結若しくは結合されているか、又はそうでなければ物理的もしくは機能的に関連している抗体も包含する。さらに、用語「抗体」は、抗体を製造するいずれかの特定の方法に限定されない。例えば、とりわけ、組み換え抗体、モノクローナル抗体、及びポリクローナル抗体が含まれる。
えばOX40R)に結合することがで、そしてさらなる分子実体に連結された抗体のアミノ酸配列を含む分子を指す。抗体誘導体に含まれる抗体のアミノ酸配列は、全長抗体であっても、全長抗体のいずれかの部分であってもよい。さらなる分子実体は化学的分子であっても
生物学的分子であってもよい。さらなる分子実体の例としては、化学基、アミノ酸、ペプチド、タンパク質(例えば酵素、抗体)、及び化学的化合物が挙げられる。さらなる分子実体は、任意の有用性を有し得、例えば検出剤、標識、マーカー、薬剤又は治療剤としての使用のためのものであり得る。抗体のアミノ酸配列は、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合又は別のものでさらなる実体に結合又は連結され得る。用語「抗体誘導体」はまた、キメラ抗体、ヒト化抗体、並びにOX40R抗体のアミノ酸配列の改変、例えば保存
的アミノ酸置換、付加及び挿入から誘導される分子を包含する。
似の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例としては、1)脂肪族側鎖:グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン;2)脂肪族−ヒドロキシル側鎖:セリン及びトレオニン;3)アミド含有側鎖:アスパラギン及びグルタミン;4)芳香族側鎖:フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン;5)塩基性側鎖:リジン、アルギニン、及びヒスチジン;6)酸性側鎖:アスパラギン酸及びグルタミン酸;並びに7)硫黄含有側鎖:システイン及びメチオニンが挙げられる。保存的アミノ酸置換の群は、例えばバリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、及びアスパラギン−グルタミンであり得る。
には特有の3次元構造特徴、さらには特有の電荷の特徴を有する。エピトープは「線状」でも「立体的(conformational)」であってもよい。抗原上の望ましいエピトープが決定されると、そのエピトープに対する抗体を、例えば本明細書中に記載される技術を使用して生成することができる。抗体の生成及び特徴付けはまた、望ましいエピトープについて
の情報を明らかにするかもしれない。次いでこの情報から、同じエピトープに対する結合について競合的に抗体をスクリーニングすることが可能である。これを達成するためのアプローチは、互いに競合的に結合する抗体、すなわち抗原に対する結合について競合する抗体を発見するための交差競合研究を行うことである。それらの交差競合に基づく「結合」抗体についてのハイスループット法は、PCT公開公報第WO03/48731号に記載される。
ームワーク領域及び定常領域は、ヒト抗体配列から誘導されたアミノ酸残基を含む。
’末端及び3’末端に位置する配列)を含まない。
ている天然で結合する成分とは結合しておらず;(2)同じ種からの他のタンパク質を含ま
ず;(3)異なる種からの細胞で発現され;又は(4)天然では存在しない、抗体又は結合分子を指す。単離された抗体の例としては、OX40Rを使用してアフィニティ精製されたOX40R抗体、インビトロでハイブリドーマ又は他の細胞株により生成されたOX40R抗体、及びトラ
ンスジェニック動物由来のヒトOX40R抗体が挙げられる。
えば抗体)とタンパク質(例えばOX40R)との間の結合親和性を記載するために使用される。平衡解離定数が小さいほど、リガンドはよりしっかりと結合しているか、又はリガンドとタンパク質との間の親和性がより高い。KDは、表面プラズモン共鳴、例えばBIACORETMシ
ステムを使用して測定することができる。BIACORETMシステムを使用するアッセイ手順(BIAcoreアッセイ)は、本開示の実施例の部分で記載される。
数を指す。解離速度定数は、表面プラズモン共鳴、例えばBIACORETMを使用して測定する
ことができる。
トOX40R、さらに変異体、アイソフォーム、及びその種相同体を含む。従って、本明細書
中に開示されるヒト結合分子は、特定の場合に、ヒト以外の種由来のOX40Rにも結合し得
る。他の場合には、本結合分子は、ヒトOX40Rに対して完全に特異的であり得、そして種
又は他の種類の交差反応性を示さないかもしれない。
ナー(例えば抗原)との相互作用への言及において、CD40、CD137又はCD271に対する結合についての結合分子のKDが、インビトロアッセイにおいて決定した場合に、ヒトOX40Rに
対するその結合のKDの100倍より高いことを意味する。
導入の際に宿主細胞のゲノム中に組み込むことができ、それによりそれらは宿主ゲノムとともに複製される(例えば、非エピソームほ乳類ベクター)。特定のベクターは、それらが機能可能に連結されている遺伝子の発現を誘導することができ、従って「発現ベクター」と呼ばれ得る。
本開示は、ヒトOX40R(OX40R抗体、OX40R抗体の抗原結合フラグメント、及びOX40R抗体の誘導体を含む)に結合する単離された結合分子を提供する。結合分子は、以下の機能的特性の少なくとも1つにより特徴付けられる:(a)1×10-6M又はそれ以下のKDでヒトOX40Rに結合し;(b)ヒトOX40Rに対してアゴニスト活性を有し;(c)500nMまでの濃度でCD40受
容体に結合せず;(d)500nMまでの濃度でCD137受容体に結合せず;(e)500nMまでの濃度でCD271受容体に結合せず;(f)単離されたヒトT細胞によるIL−2産生を増強することができ;(g)免疫応答を増強することができ;(h)腫瘍細胞の増殖を阻害することができ;そして(i)がんに対して治療効果を有する。いくつかの実施態様において、本結合分子は、ヒトOX40Rに1×10-7M若しくはそれ以下のKD、又は1×10-8M若しくはそれ以下のKD、又は5×1×10-9M若しくはそれ以下のKDで結合する。
いくつかの第一の局面において、本開示は、ヒトOX40Rに結合するヒト抗体を提供する
。いくつかの実施態様において、ヒト抗体は、100nM又はそれ以下、好ましくは10nM又は
それ以下のKDでヒトOX40Rに特異的に結合し、そしてヒトOX40Rに対してアゴニスト活性を有するモノクローナル抗体である。このようなヒト抗体の一例は、ヒトモノクローナル抗体11D4である。抗体(antiboduy)11D4の重鎖のアミノ酸配列及び重鎖の可変領域(VH)の
アミノ酸配列は、それぞれ配列番号9及び7で示される。抗体11D4の軽鎖のアミノ酸配列及び軽鎖の可変領域(VL )のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号10及び8で示される。
抗体11D4のアイソタイプは、重鎖についてIgG2であり、そして軽鎖についてκである。抗体11D4のアロタイプは重鎖についてG2(n−)であり、そして軽鎖についてKm3である。成熟重鎖及び成熟軽鎖アミノ酸配列は、発現構築物におけるDNA配列の概念翻訳(conceptual translation)から誘導される。抗体11D4は、重鎖又は軽鎖におけるフレームワーク変異
を含まないが、重鎖CDR2中に1つの変異を含む。
のような「混合及び適合され」た抗体のOX40Rに対する結合は、当該分野で公知の結合ア
ッセイ(実施例に記載されるアッセイを含む)を使用して試験することができる。ある場合には、VH領域及びVL領域が混合及び適合されて、特定のVH/VL対からのVH配列は、構造的に類似したVH配列と置き換えられる。同様に、別の場合には、特定のVH/VL対からのVL配列は、構造的に類似したVLと置き換えられる。
む軽鎖可変領域、又は(3)配列番号12若しくは24の核酸配列によりコードされるアミ
ノ酸配列を含む軽鎖可変領域、を含む単離されたOX40R抗体を提供する。
のVL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号4、5、及び6
に示される。抗体18D8のVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3のアミノ酸配列は、それぞれ配
列番号13、14及び15に示される。抗体18D8のVL CDR1、VLCDR2、及びVL CDR3のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号16、17及び18に示される。CDR領域は、Kabatシステム(Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.
91−3242)を使用して描写される。
合、特定のVH配列からのCDR1、CDR2及び/又はCDR3配列は、構造的に類似したCDR配列と
置き換えられる。同様に、VL CDR配列が混合及び適合される場合、特定のVL配列からのCDR1、CDR2及び/又は CDR3配列が、典型的には、構造的に類似したCDR配列と置き換えられる。新規なVH配列及びVL配列が、1つ又はそれ以上のVH及び/又はVL CDR領域配列を、本
明細書中に開示されるCDR配列からの構造的に類似した配列で置き換えることにより作製
され得ることは、当業者に容易に明らかとなるだろう。
CDR2、又はVH CDR3から選択される少なくとも1つのCDRを含む単離されたモノクローナ
ル抗体を提供する。いくつかの他の実施態様において、本開示は、抗体11D4又は18D8のVL
CDR1、VL CDR2又はVL CDR3から選択される少なくとも1つのCDRを含む単離されたモノクローナル抗体を提供する。いくつかのさらなる実施態様において、本開示は:配列番号1若しくは13のアミノ酸配列又は配列番号1若しくは3と1、2、3、若しくは4個の保存的アミノ酸置換だけ異なる配列を含むVH CDR1;配列番号2若しくは14のアミノ酸配
列又は配列番号2若しくは14と1、2、3、若しくは4個の保存的アミノ酸置換だけ異なる配列を含む、VH CDR2;並びに、配列番号3若しくは15のアミノ酸配列又は配列番
号3若しくは15と1、2、3、若しくは4個の保存的アミノ酸置換だけ異なる配列を含むVH CDR3、より選択される少なくとも1つのCDRを含む、単離されたモノクローナル抗体を提供する。
号5若しくは17と1、2、3、若しくは4つの保存的アミノ酸置換だけ異なる配列を含むVL CDR2;並びに、配列番号6若しくは18のアミノ酸配列、又は配列番号6若しくは
18と1、2、3、若しくは4つの保存的アミノ酸置換だけ異なる配列を含むVLCDR3、より選択される少なくとも1つのCDRを含む単離されたモノクローナル抗体を提供する。
ナル配列を場合により含んでいてもよい。
いは、クラス及びサブクラスは、抗体の重鎖及び/又は軽鎖の定常ドメインの全て又は一部を配列決定し、それらのアミノ酸配列を免疫グロブリンの種々のクラス及びサブクラスの既知のアミノ酸配列と比較し、そして抗体のクラス及びサブクラスを決定することにより決定され得る。OX40R抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、又はIgD分子であり得る。例えば、OX40R抗体は、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4サブクラスであるIgGであり得る。従って、本開示の別の局面は、OX40R抗体のクラス又はサブクラスを別のクラス又はサブクラスに変換
するための方法を提供する。いくつかの場合に、CL又はCHをコードする配列を含まないVL又はVHをコードする核酸分子は、当該分野で周知の方法を使用して単離される。次いで核酸分子は、所望の免疫グロブリンのクラス又はサブクラスからのCL又はCHをコードする核酸配列に機能可能に連結される。これは、上記のように、CL又はCH鎖を含むベクター又は核酸分子を使用して達成され得る。例えば、元はIgMであったOX40R抗体を、IgGにクラス
スイッチすることができる。さらに、クラススイッチは、1つのIgGサブクラスを別のも
のに、例えばIgG1からIgG2に、変換するために使用され得る。所望のアイソタイプを含む抗体を製造するための別の方法は、OX40R抗体の重鎖をコードする核酸及びOX40R抗体の軽鎖をコードする核酸を単離する工程、VH領域をコードする配列を単離する工程、VH配列を所望のアイソタイプの重鎖定常ドメインをコードする配列に連結する工程、軽鎖遺伝子及び重鎖構築物を細胞中で発現させる工程、並びに所望のアイソタイプのOX40R抗体を採取
する工程を含む。
別の局面において、本開示は、本明細書で上記されたような、ヒトOX40R抗体のいずれ
かの抗原結合フラグメントを提供する。いくつかの実施態様において、抗原結合フラグメントは: (1)OX40R抗体の軽鎖;(2)OX40R抗体の重鎖;(3)OX40R抗体の軽鎖からの可変領
域;(4)OX40R抗体の重鎖からの可変領域;(5)OX40R抗体の1つ若しくはそれ以上のCDR(2、3、4、5又は6つのCDR);又は(6)OX40R抗体の軽鎖からの3つのCDR及び重鎖からの
3つのCDRより選択される。いくつかの特定の実施態様において、本開示は、抗体11D4又
は18D8の抗原結合フラグメントを提供する。いくつかの他の特定の実施態様において、OX40R抗体の抗原結合フラグメントには:(i)Fabフラグメント、VL、VH、CL及びCH1ドメインからなる一価フラグメント;(ii)F(ab’)2フラグメント、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により連結された2つのFabフラグメントを含む二価フラグメント;(iii) VH及びCH1ドメインからなるFdフラグメント;(iv)抗体のシングルアーム(single arm)のVL及びVHドメインからなるFvフラグメント;(v)VHドメインからなるdAbフラグメント(Ward et al.、(1989) Nature 341:544−546);(vi)単離されたCDR、並びに(vii)抗体のVH領域に連結された抗体のVL領域を含むポリペプチドである単鎖抗体(scFv)が含まれる。Bird et al.、(1988) Science 242:423−426 and Huston et al.、(1988) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 85:5879−5883。抗原結合フラグメントはまた、同じ重鎖若しくは同じ軽鎖、又は
異なる鎖のいずれかからの、2つ又はそれ以上のより短いフラグメントをを含み得る。抗原結合フラグメント、例えばFab及びF(ab’)2フラグメントは、従来の技術を使用して抗
体全体から、例えば抗体全体からそれぞれパパイン又はペプシン消化を使用して製造することができる。これらは、本明細書に記載されるような組み換えDNA技術を使用して得る
こともできる。
いくつかのさらなる局面において、本開示は、本明細書において上で記載されるようなOX40R抗体のいずれかの誘導体を提供する。
り誘導される。抗体鎖のあらゆる領域(例えば、フレームワーク領域、CDR領域、又は定
常領域)のアミノ酸配列が改変され得る。改変は、当該分野で公知の標準的な技術、例えば部位特異的変異誘発及びランダムPCR媒介変異誘発、により導入することができ、天然
、さらには非天然のアミノ酸を含み得る。
、又はそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施態様において、抗体誘導体は、重鎖CDRにおいて1、2、3、若しくは4つのアミノ酸置換及び/又は軽鎖CDRにおいて1つのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態様において、OX40R抗体の誘導体は、ヒト遺
伝子の生殖系列アミノ酸配列に対して1つ又はそれ以上のアミノ酸置換を含む。特定の実施態様において、生殖系列からのこれらの置換の1つ又はそれ以上は、重鎖のCDR2領域にある。別の特定の実施態様において、生殖系列に対するアミノ酸置換は、抗体11D4又は18D8における生殖系列に対する置換と同じ位置の1つ又はそれ以上にある。別の実施態様において、アミノ酸置換は、抗体における1つ又はそれ以上のシステインを別の残基、例えば、制限することなく、アラニン又はセリンに変更することである。システインは、標準的(canonical)システインでも非標準的(non−canonical)システインでもよい。置換
は、抗体の可変ドメインのCDR若しくはフレームワーク領域又は定常ドメインにおいてな
され得る。別の種類のアミノ酸置換は、アスパラギン−グリシン対を除去することであり、これは残基の1つ又は両方を変更することにより潜在的な脱アミド部位を形成する。さらに他の実施態様において、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換である。一実施態様にお
いて、抗体誘導体は、11D4又は18D8のアミノ酸配列と比較して、重鎖CDR領域において1
、2、3、又は4つの保存的アミノ酸置換を有する。
「変更(alteration)」は、抗体において見いだされる1つ若しくはそれ以上の炭水化物部分の欠失、及び/又は抗体中に存在しない1つ若しくはグリコシル化部位の付加を指す。抗体のグリコシル化は典型的にはN連結される。N連結は、炭水化物部分の、アスパラギン残基の側鎖への連結を指す。抗体へのグリコシル化部位の付加は、(N連結グリコシ
ル化部位について)上記のトリペプチド配列の1つ又はそれ以上を含むようにアミノ酸配
列を変更することにより都合よく達成される。
、そしてEdge、A. S.らによりAnal. Biochem. 118 (1981) 131−137に記載される。抗体
上の炭水化物部分の酵素による切断は、Thotakura、N. R.、及びBahl、O. P.により(Meth. Enzymol. 138 (1987) 350−359)記載されるように、種々のエンドグリコシダーゼ及
びエキソグリコシダーゼを使用することにより達成することができる。
分子実体の例としては、薬剤、ペプチド、又はタンパク質、及び検出剤又は標識が挙げられる。OX40R抗体に連結され得る薬剤の具体例としては、細胞傷害性薬剤又は他のがん治
療薬、及び放射性同位体が挙げられる。OX40R抗体に連結され得るペプチド又はタンパク
質の具体例としては抗体が挙げられ、これは同じOX40R抗体でも異なる抗体でもよい。OX40R抗体に連結され得る検出剤又は標識の具体例としては、(1)蛍光性化合物、例えばフル
オレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、5−ジメチルアミン−1−ナフタレンスルホニル(naphtthalenesulfonyl)クロリド、フィコエリトリン、及びランタニド蛍光体;(2)酵素、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダー
ゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、及びグルコースオキシダーゼ;(3)ビオ
チン;(4)二次レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ、例えばロイ
シンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、及びエピトープタグが挙げられる。特定の実施態様において、抗体誘導体はOX40R抗体多量体であり、これはOX40R抗体の多量体形態、例えば抗体二量体、三量体、又は単量体抗体のより高次の多量体である。抗体多量体内の個々の単量体は、同一でも異なっていてもよく、すなわちそれらはヘテロマー抗体多量体でもホモマー抗体多量体でもよい。多量体内の個々の抗体は、同じか又は異なる結合特異性を有し得る。抗体の多量体化は、抗体の自然な凝集により達成され得る。例えば、いくらかの割合の精製された抗体調製物(例えば、精製されたIgG1分子)は、抗体ホモ二量体、及び他の高次の抗体多量体を含有するタンパク質凝集体を自然発生的に形成する。あるいは、抗体ホモ二量体は、当該分野で公知の化学的連結技術により、例えばヘテロ二官能性架橋剤を使用することにより形成され得る。適切な架橋剤としては、ヘテロ二官能性であり、適切なスペーサーにより隔てられた2つの非常に反応性の基を有
するもの(例えばm−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ス
クシンイミジル 4−(マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレート、及びN−スクシンイミジル S−アセチルチオ−アセテート)、又はホモ二官能性のもの(例えばスベリン酸ジスクシンイミジル)が挙げられる。このようなリンカーは、Pierce Chemical Company、Rockford、ILから市販されている。抗体はまた、当該分野で公知の組み換えDNA技
術により多量体化するように作製され得る。
ミノ酸配列を含むキメラ抗体である。一例において、ヒトOX40R抗体からの1つ又はそれ
以上のCDRを、非ヒト動物(例えばマウス又はラット)からの抗体からのCDRと組み合わせる。別の例では、キメラ抗体の全てのCDRはヒトOX40R抗体由来である。別の例では、1つより多くのヒトOX40R抗体からのCDRをキメラ抗体において組み合わせる。さらに、キメラ抗体は、1つのヒトOX40R抗体由来のフレームワーク領域、及び1つ又はそれ以上の異な
るヒト抗体からの1つ又はそれ以上のCDRを含み得る。キメラ抗体は、当該分野で公知の
従来の方法を使用して作製することができる。いくつかの特定の実施態様において、キメラ抗体は、抗体 11D4又は18D8から選択される抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域から
の1つ、2つ、又は3つのCDRを含む。
al.、(1988) Science 242:423−426 and Huston et al.、(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879−5883を参照のこと)。「二重特異性抗体(diabody)」は2つの鎖からなり、各鎖は短いペプチドリンカーにより接続された同じポリペプチド鎖上の軽鎖可変領域に接続された重鎖可変領域を含み、ここで同じ鎖上の2つの領域は、互いと対にならないが他の鎖上の相補ドメインと対になって二重特異性分子を形成する。二重特異性抗体を製造する方法は、当該分野で公知である(例えば、Holliger P. et al.、(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444−6448、及びPoljak R. J. et al.、(1994) Structure 2:1121−1123を参照のこと)。ドメイン抗体(dAb)は、抗体の小さな機能的結合単位であり、抗体の重鎖又は軽鎖のいずれかの可変領域に相当する。ドメイン抗体は、細菌系、酵母系及び哺乳動物細胞系においてよく発現される。ドメイン抗体のさらなる詳細及びその製造方法は、当該分野で公知である(例えば、米国特許第6,291,158号;同第6,582,915号;同
第6,593,081号;同第6,172,197号;同第6,696,245号;欧州特許第0368684号及び同第0616640号;WO05/035572、WO04/101790、WO04/081026、WO04/058821、WO04/003019及びWO03/002609を参照のこと)。ナノボディは抗体の重鎖から誘導される。ナノボディは典
型的には単一の可変ドメイン及び2つの定常ドメイン(CH2及びCH3)を含み、そして元の抗体の抗原結合能力を保持する。ナノボディは当該分野で公知の方法により製造することができる(例えば、米国特許第6,765,087号、米国特許第6,838,254号、WO 06/079372を参照のこと)。ユニボディは、IgG4 抗体の1つの軽鎖及び1つの重鎖からなる。ユニボディは、IgG4抗体のヒンジ領域を除去することにより作製され得る。ユニボディの更なる詳細及びそれらを製造する方法は、WO2007/059782に見いだされ得る。
本明細書で開示される結合分子は、従来のモノクローナル抗体方法論、例えば、Kohler及びMilsteinの標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術(Nature 256:495、(1975))
、さらにはBリンパ球のウイルス形質転換又はがん化形質転換のような他の技術を含む、当該分野で公知の技術により製造することができる。
本開示はまた、OX40R抗体又はその抗原結合フラグメントを作製するための方法を提供
し、この方法は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物をOX40R抗原で免疫する
こと、及び免疫された動物から又は免疫された動物由来の細胞から抗体を単離することを含む。
ス」、及び「XenomouseTM」が挙げられる。HuMAb Mouse(登録商標)(Medarex、Inc.)は
、内因性μ及びκ鎖遺伝子座を不活化する標的変異とともに、再配列されていないヒト重鎖(μ及びγ)及びκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座(miniloci)を含む(例えば、Lonberg、et al. (1994) Nature 368: 856−859
を参照のこと)。従って、これらのマウスはマウスIgM又はκの減少した発現を示し、そして免疫に応じて、導入されたヒト重鎖及び軽鎖導入遺伝子は、クラススイッチ及び体細胞変異を受けて高親和性のヒトIgGκモノクローナル抗体を生じる(例えば、Harding、F. and Lonberg、N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536−546を参照のこと)。HuMAb Mouse(登録商標)の製造及び使用、並びにこのようなマウスにより行われるゲノム改変は当
該分野で周知である(例えば、Fishwild、D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845−851を参照のこと)。KM miceTMは、ヒト重鎖導入遺伝子及びヒト軽鎖トランス染色体
(transchromosome)を保持し、そしてWO 02/43478において詳細に記載される。XenomouseTM(Abgenix、Inc.)は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の大きなフラグメントを含み、そ
してマウス抗体産生を欠いている。この動物モデルは当該分野で周知である(例えば、米
国特許第5,939,598号;同第6,075,181号;同第6,114,598号;同第6,150,584号;及び同第6,162,963号を参照のこと)。「TCマウス」もまた、ヒト重鎖トランス染色体及びヒト軽鎖トランス染色体の両方を保持する人工的に操作されたマウスである。このようなマウスはTomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722−727に記載される。
ラグメントであり、好ましくはOX40Rの細胞外ドメインである。別の実施態様において、OX40R抗原は、ヒトOX40Rの少なくとも1つのエピトープを含むフラグメントである。別の
実施態様において、OX40R抗原は、その細胞表面においてOX40Rを発現する細胞、より詳細にはその細胞表面においてOX40Rを過剰発現する細胞である。動物の免疫は、当該分野で
公知のあらゆる適切な方法により行われ得る。(例えば、Harlow and Lane, Antibodies:
A Laboratory Manual、New York: Cold Spring Harbor Press、1990を参照のこと)。非ヒト動物(例えばマウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ及びウマ)を免疫する特定の方法は当該分野で周知である(例えば、Harlow and Lane (1990);U.S. Pat. No. 5,994,619を参照のこと)。実施例1は、HuMabマウスを免疫するための方法を提供する。
ことができる。一実施態様において、血清は動物から得られ、そして免疫グロブリンフラクションは血清から得られ得、又はOX40R抗体はその血清から精製され得る。
胞を使用して製造し得る。免疫後に、リンパ節及び/又は脾臓B細胞をその動物から採取し、そして適切な手段により不死化する。細胞を不死化する方法としては、限定されないが、がん遺伝子を用いてそれらをトランスフェクトすること、腫瘍ウイルスにそれらを感染させること、及び不死化細胞を選択する条件下でそれらを培養すること、それらを発がん性又は変異誘発性(mutating)化合物に暴露すること、それらを不死化細胞(例えば骨髄腫細胞)と融合すること、及び腫瘍抑制遺伝子を不活化することが挙げられる(例えば
、Harlow and Lane(同上)を参照のこと)。特定の実施態様において、免疫された動物から採取された脾臓B細胞を不死化した骨髄腫細胞に融合して、抗体産生不活化ハイブリドーマを形成する。骨髄腫細胞は好ましくは免疫グロブリンポリペプチドを分泌しない(非分泌細胞株)。不死化されたハイブリドーマを、OX40抗原(例えばOX40R、その一部、又はOX40Rを発現している細胞)を使用してスクリーニングする。初期スクリーニングは、例え
ば酵素結合免疫アッセイ(ELISA)又は放射免疫アッセイを使用して行われ得る。ELISAスクリーニングの例はWO 00/37504に記載される。
さらに所望の特徴(健全な増殖、高い抗体産生、及び以下においてさらに考察されるような所望の抗体の特徴を含む)についてスクリーニングされる。ハイブリドーマは、同種の動物においてインビボで、免疫系を欠く動物において、例えばヌードマウスにおいて、又はインビトロで細胞培養において増殖させることができる。
を製造するための方法が提供され、この方法は: (a)非ヒトトランスジェニック動物をOX40R抗原で免疫すること;(b)動物がOX40R抗原に対する免疫応答を開始することを可能に
すること;(c)抗体を産生している細胞を動物から単離すること;及び(d)抗体を産生している細胞を不死化することを含む。一実施態様において、この方法はさらに、(e)不死化
された抗体を産生している細胞の個々のモノクローナル集団を作製すること;及び(f)所
望のOX40R抗体を産生する不死化された抗体を産生している細胞をスクリーニングするこ
とを含む。
本開示の別の局面は、ヒトOX40Rに結合する結合分子のアミノ酸配列をコードする単離
された核酸分子を提供する。この核酸分子にコードされるアミノ酸配列は、インタクトな抗体の任意の部分、例えばCDR、1つ、2つ若しくは3つのCDRを含む配列、又は重鎖若しくは軽鎖の可変領域であっても、全長の重鎖若しくは軽鎖であってもよい。いくつかの実施態様において、本核酸分子は、(1)抗体11D4若しくは18D8のCDR3領域、特に重鎖CDR3領
域;(2)抗体11D4若しくは18D8の重鎖の可変領域若しくは軽鎖の可変領域;又は(3)抗体11D4若しくは18D8の重鎖若しくは軽鎖を含むアミノ酸配列をコードする。他の実施態様において、本核酸分子は、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、13、14、15、16、17、18、19、20、21、及び22からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。さらに他の実施態様において、本核酸分子は、配列番号11、12、23、及び24からなる群より選択される。
れ得る。OX40R抗体産生細胞からのmRNAは、標準的な技術により単離され得、PCR及びライブラリー構築技術を使用してクローン及び/又は増幅され得、そしてOX40R抗体のアミノ
酸配列をコードする核酸分子を得るための標準的なプロトコルを使用してスクリーニングされ得る。このmRNAは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)又は抗体遺伝子のcDNAクローニング
において使用するためのcDNAを作製するために使用され得る。一実施態様において、核酸分子は、上記のような、OX40R抗体を発現するハイブリドーマ、好ましくはその融合パー
トナーの1つとしてヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する非ヒトトランスジェニック動物細胞を有するハイブリドーマから得られる。別の実施態様において、ハイブリドーマは非ヒト、非トランスジェニック動物由来である。
の定常領域をコードする核酸と融合することにより構築され得る。VH及びVL鎖をコードする核酸は、VHセグメントがベクター内の重鎖定常領域(CH)セグメントに機能可能に連結され、そしてVLセグメントがベクター内の軽鎖定常領域(CL)セグメントに機能可能に連結されるように、それぞれ重鎖定常領域及び軽鎖定常領域を既にコードしている発現ベクター内にそれらを挿入することにより、全長抗体遺伝子へと変換され得る。あるいは、VH鎖又はVL鎖をコードする核酸分子は、連結することにより、例えば、VH鎖をコードする核酸分子を 、CH鎖をコードする核酸分子に、標準的な分子生物学の技術を使用してライゲーシ
ョンすることにより、全長抗体遺伝子へと変換される。同じことが、VL及びCL鎖をコードする核酸分子を使用して達成され得る。ヒト重鎖及び軽鎖定常領域遺伝子の配列は当該分野で公知である。例えば、Kabat et al.、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5th Ed.、NIH Publ. No. 91−3242、1991を参照のこと。次いで全長重鎖及び/又は軽鎖をコードする核酸分子を、それらが導入された細胞から発現させてOX40R抗体を単
離し得る。
に使用され得る。本核酸分子はまた、本開示により提供される他の結合分子、例えば本明細書の他所で記載されたような、キメラ抗体、単鎖抗体、イムノアドヘシン、二重特異性抗体、変異した抗体、及び抗体誘導体を製造するために使用され得る。一実施態様において、核酸分子は、特定の抗体配列のためのプローブ又はPCRプライマーとして使用される
。例えば、核酸分子プローブは診断方法において使用され得るか、又は核酸分子PCRプラ
イマーは、とりわけOX40R抗体の可変領域を産生する際の使用のための核酸配列を単離す
るために使用され得るDNAの領域を増幅するために使用され得る。
をさらに組み換えDNA技術により操作して、例えば 可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子に、Fabフラグメント遺伝子に、又はscFv遺伝子に変換することができる。これらの操作に
おいて、VLをコードするDNA分子又はVHをコードするDNA分子は、抗体定常領域又は可動性リンカーのような別のポリペプチドをコードする別のDNA分子に機能可能に連結される。
用語「機能可能に連結される」は、この文脈において使用される場合、2つのDNA分子が
、その2つのDNA分子によりコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるよう
に結合されることを意味する。
常領域において天然に存在するアミノ酸置換に相当する。Fabフラグメント重鎖遺伝子に
ついては、VHをコードするDNAは、重鎖CH1定常領域のみをコードする別のDNA分子に機能
可能に連結され得る。CH1重鎖定常領域は、重鎖遺伝子のいずれかから誘導され得る。
例えば、Kabat、E. A.、et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Inter
est、Fifth Edition、U.S. Department of Health and Human Services、NIH Publication No. 91−3242を参照のこと)、そしてこれらの領域を含むDNAフラグメントは、標準的なPCR増幅により得ることができる。軽鎖定常領域は、カッパ又はラムダ定常領域であり得
る。カッパ定常領域は、Inv(1)、Inv(2)、及びInv(3)のような異なる個体間で発生することが知られている種々の対立遺伝子のいずれかであり得る。ラムダ定常領域は3つのラムダ遺伝子のいずれかから誘導され得る。
つのVH及びVLが使用される場合、二価であり得、又は2つより多くのVH及びVLが使用される場合、多価であり得る。OX40R及び別の分子に特異的に結合する二重特異性又は多価の
抗体が生成され得る。
していても、全長軽鎖若しくは重鎖をコードしていても、一部若しくは全長の重鎖若しくは軽鎖を含むポリペプチドをコードしていても、又は抗体誘導体若しくは抗原結合フラグメントのアミノ酸配列をコードしていてもよい。結合分子を発現させるために、部分的又は全長の結合分子をコードするDNA分子は、このDNA分子が転写及び翻訳制御配列に機能可能に連結されるように、発現ベクター中に挿入される。この文脈において、用語「機能可能に連結される」は、ベクター内の転写及び翻訳制御配列がDNA分子の転写及び翻訳を調
節するというそれらの意図された機能を果たすように、DNA分子がベクターにライゲーシ
ョンされることを意味するように意図される。発現ベクター及び発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選択される。発現ベクターとしては、例えば、プラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、植物ウイルス(例
えばカリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルス)、コスミド、YAC、及びEBV由来エピソームが挙げられる。軽鎖のアミノ酸配列をコードするDNA分子及び重鎖のア
ミノ酸配列をコードするDNA分子を、別々のベクター又は同じベクターに挿入することが
できる。DNA分子は、あらゆる適切な方法(例えば、抗体遺伝子フラグメント上の相補的
制限部位及びベクターのライゲーション、又は制限部位が存在しない場合は平滑末端ライゲーション)により発現ベクター中に挿入される。
れるようにベクターにクローンされ得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種シグナルペプチド(すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグ
ナルペプチド)であり得る。
ーは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を有する。調節配列の選択を含む、発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどのような因子に依存し得る。哺乳動物宿主細胞発現のための調節配列は、
哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を誘導するウイルスエレメントを含む(例えば、レトロウイルスLTR由来のプロモーター及び/又はエンハンサー、サイトメガロ
ウイルス(CMV)(例えばCMVプロモーター/エンハンサー)、シミアンウイルス40(SV40)(例
えばSV40プロモーター/エンハンサー)、アデノウイルス、(例えば、アデノウイルス主要後期(major late)プロモーター(AdMLP))、ポリオーマ及び強力哺乳動物プロモーター、例えばネイティブ免疫グロブリン及びアクチンプロモーター)。ウイルス調節エレメント、及びその配列のさらなる説明については、例えば米国特許第5,168,062号、同第4,510,245号、及び同第4,968,615号を参照のこと。
えば、米国特許第4,399,216号、同第4,634,665号及び同第5,179,017号を参照のこと)。選択可能マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)遺伝子(メトオレキサート
選択/増幅を用いたdhfr−宿主細胞における使用のため)、ネオマイシンホスホトランス
フェラーゼ遺伝子(G418選択のため)、及びグルタミン酸合成酵素遺伝子が挙げられる。調節配列の選択を含む、発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどのような多数の因子に依存し得る。 結合分子をコードする核
酸分子、及びこれらの核酸分子を含むベクターを、結合分子の組み替え産生のための適切な宿主細胞の形質転換に使用することができる。適切な宿主細胞は、アミノ酸配列が宿主細胞で発現され、そして典型的には宿主細胞が培養されてその培地からアミノ酸配列を回収することができる培地中に分泌されるように、結合分子のアミノ酸配列をコードする核酸分子を有する1つ又はそれ以上の発現ベクターを用いて形質転換される。宿主細胞の形質転換は、当該分野で公知のあらゆる適切な方法、例えば米国特許第4,399,216号、第4,912,040号、第4,740,461号、及び同第4,959,455号に開示されるものにより行われ得る。
及び多数の他の細胞株が挙げられる。昆虫細胞株の例としては、Sf9細胞又はSf21細胞が
挙げられる。植物宿主細胞の例としては、タバコ、シロイヌナズナ、ウキクサ、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモなどが挙げられる。細菌宿主細胞としては、E.coli及びストレプトマイセス属(Streptomyces)の種が挙げられる。酵母宿主細胞の例としては、分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、及びピキ
ア・パストリス(Pichia pastoris)が挙げられる。
ディスプレイを使用して製造するための方法を提供する。この方法は、(a)ファージ上で
ヒト抗体のライブラリを合成すること、(b)このライブラリをOX40R又はその一部を用いてスクリーニングすること、(c) OX40R又はその一部にに結合するファージを単離すること
、及び(d)そのファージから抗体を得ることを含む。抗体のライブラリを製造するための
1つの典型的な方法は:(a)ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物をOX40R又はその抗原性部分を用いて免疫して免疫応答を生じさせる工程;(b)抗体を産生している細胞
を免疫された動物から抽出する工程;(c)抽出された細胞から、OX40R抗体の重鎖及び軽鎖
をコードするRNAを単離する工程;(d)RNAを逆転写してcDNAを生成する工程;(e)cDNAを増幅する工程;並びに(f)抗体がファージ上で発現されるようにこのcDNAをファージディス
プレイベクター中に挿入する工程を含む。組み換えヒトOX40R抗体又はその抗原結合フラ
グメントは、組み換えコンビナトリアル抗体ライブラリをスクリーニングすることにより単離することができる。このライブラリは、B細胞から単離されたmRNAから製造されたヒトVL及びVH cDNAを使用して生成された、scFvファージディスプレイライブラリであって
もよい。このようなライブラリを製造及びスクリーニングするための方法は当該分野で公知である。ファージディスプレイライブラリを作製するためのキットは市販されている(
例えば、Pharmacia Recombinant Phage Antibody System、カタログ番号27−9400−01;
及びStratagene SurfZAPTMファージディスプレイキット、カタログ番号240612)。
野で公知の方法(例えば、WO 93/06213に記載されるエピトープ刷り込み(epitope imprinting)法)を使用して、本明細書で記載されるヒトOX40R抗体を最初に使用してOX40Rに対して類似した結合活性を有するヒト重鎖及び軽鎖配列を選択する。この方法において使用される抗体ライブラリは、WO 92/01047、McCafferty et al.、Nature 348:552−554 (1990);及びGriffiths et al.、EMBO J. 12:725−734 (1993)において記載されるよう
に製造及びスクリーニングされるscFvライブラリであり得る。scFv抗体ライブラリは、ヒトCCR2を抗原として使用してスクリーニングされ得る。
行われ、ここでは最初に選択されたVL及びVHセグメントの異なる対をOX40R結合について
スクリーニングしてVL/VH対の組み合わせを選択する。さらに、抗体の質をさらに改善するために、VL/VH対のVL及びVHセグメントを、天然の免疫応答の間の抗体の親和性成熟の原因であるインビボでの体細胞変異プロセスと同様のプロセスで、VH及び/又はVLのCDR3領域内で無作為に変異させ得る。このインビトロ親和性成熟は、それぞれVH CDR3又はVL CDR3に対して相補的な(complimentary)PCRプライマーを使用して、VH及びVLドメインを増幅することにより達成され、これらのプライマーは、得られたPCR産物が、無作為の変
異がVH及び/又はVL CDR3領域中に導入されているVHセグメント及びVLセグメントをコー
ドするように、特定の位置において4つのヌクレオチド塩基の無作為混合物で「スパイクされている(spiked)」。これらの無作為に変異誘発されたVHセグメント及びVLセグメントを、OX40Rヘの結合について再スクリーニングし得る。
スクリーニング及び単離に続いて、選択された結合分子をコードする核酸をディスプレイパッケージから(例えばファージゲノムから)回収して、組み換えDNA技術により他の発
現ベクターにサブクローニングすることができる。必要なら、以下に記載されるように、核酸をさらに操作して他の抗体形態を作製し得る。コンビナトリアルライブラリのスクリーニングにより単離された組み換えヒト抗体を発現させるために、上記のように、その抗体をコードするDNAを組み換え発現ベクター中にクローン化し、そして哺乳動物宿主細胞
中に導入する。
別の局面において、本開示は、組成物、例えば、本開示により提供される1つの結合分子又はそれらの組み合わせ、及び場合により薬学的に許容しうる担体を含む医薬組成物を提供する。本組成物は、当該分野で公知の従来の方法により製造することができる。
を含む。特定の実施態様において、本組成物は、抗体11D4若しくは抗体18D8、又はいずれかの抗体の抗原結合フラグメントを含む。さらに他の実施態様において、本組成物は、抗
体11D4又は抗体18D8の誘導体を含む。
ングリコール、ポリエチレングリコールなど)デキストロース、植物油(例えばオリーブ油)、食塩水、緩衝剤、緩衝化食塩水、及び等張剤、例えば糖類、ポリアルコール類、ソル
ビトール、及び塩化ナトリウムが挙げられる。
約30パーセントの範囲に及ぶ。
本開示により提供される結合分子及び結合分子を含む医薬組成物は、治療、診断又は他の目的、例えば免疫応答を増強すること、がんの処置、他のがん治療の有効性を増強すること、又はワクチンの有効性を増強することに有用であり、そして薬剤又は診断剤としての使用のような多数の実用性を有する。したがって、別の局面において、本開示は結合分子又は医薬組成物の使用方法を提供する。
り、哺乳動物はヒトである。さらなる実施態様において、結合分子は抗体11D4若しくは抗体18D8、又はいずれかの抗体の抗原結合フラグメントである。用語「免疫応答を増強する
こと」又はその文法上の変形は、哺乳動物の免疫系のいずれかの応答を、刺激すること、惹起すること、増加すること、改善すること、又は増大させることを意味する。免疫応答は、細胞性応答(すなわち、細胞媒介、例えば細胞傷害性Tリンパ球媒介)又は体液性応答(すなわち、抗体媒介応答)であり得、そして一次免疫応答でも二次免疫応答でもよい。
の生成が挙げられる。免疫応答の増強は、当業者に公知の多数のインビトロ又はインビボでの測定を使用して評価することができ、これらとしては、限定されないが、細胞傷害性Tリンパ球アッセイ、サイトカインの放出(例えばIL−2産生)、腫瘍の退縮、腫瘍を有す
る動物の生存、 抗体産生、免疫細胞増殖、細胞表面マーカーの発現、及び細胞傷害性が
挙げられる。典型的には、本開示の方法は、未処置の哺乳動物又は特許請求された方法を使用して処置されていない動物と比較した場合に、哺乳動物による免疫応答を増強する。一実施態様において、本方法は、細胞性免疫応答、特に細胞傷害性T細胞応答を増強する。 別の実施態様において、細胞性免疫応答はTヘルパー細胞応答である。さらに別の実
施態様において、免疫応答はサイトカイン産生、特にIL−2産生である。
規化、例えば白血球数、赤血球(red blood cell)数、血小板数、赤血球(erythrocyte)沈降速度、及び種々の酵素レベルが含まれる。さらに、臨床医は、検出可能な腫瘍マーカーの減少を観察し得る。あるいは、超音波画像、核磁気共鳴検査及び陽電子放出検査のような他の試験を使用して、客観的改善を評価することができる。いくつかの実施態様において、本結合分子は、本開示により提供されるOX40R抗体又はその抗原結合フラグメント
である。さらなる実施態様において、本結合分子は抗体11D4若しくは18D8、又はいずれかの抗体の抗原結合フラグメントである。さらなる実施態様において、哺乳動物はヒトである。
様において、本結合分子は抗体11D4若しくは18D8、又はいずれかの抗体の抗原結合フラグメントである。さらなる実施態様において、哺乳動物はヒトである。
んは本開示により提供される方法を用いて処置又は予防され得る。このようながんの例としては、肺がん、例えば気管支原性がん(例えば、扁平上皮細胞がん、小細胞がん、大細
胞がん、及び腺がん)、肺胞上皮がん、気管支腺腫、軟骨性過誤腫(非がん性)、及び肉腫(がん性);心臓のがん、例えば粘液腫、線維腫、及び横紋筋腫;骨のがん、例えば骨軟骨
腫、軟骨腫(condromas)、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫、類骨骨腫、巨細胞腫、軟骨
肉腫、多発性骨髄腫、骨肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、ユーイング腫瘍(ユーイ
ング肉腫)、及び細網肉腫;脳のがん、例えば神経膠腫(例えば、多形性膠芽腫)、未分化
星状細胞腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、髄芽細胞腫、脊索腫、神経鞘腫、上衣細胞腫、髄膜腫、下垂体腺腫、松果体腫、骨腫、血管芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脊索腫、胚細胞腫、奇形腫、皮様嚢腫、及び血管腫;消化器系におけるがん、例えば平滑筋腫、類表皮がん、腺がん、平滑筋肉腫、胃の腺がん、腸の脂肪腫、腸の神経線維腫、腸の線維腫、大腸におけるポリープ、及び結腸直腸のがん;肝臓のがん、例えば肝細胞腺腫、血管腫、肝細胞がん、線維層板がん、胆管がん、肝芽腫、及び血管肉腫;腎臓のがん、例えば腎臓の腺がん、腎細胞がん、副腎腫、及び腎盂の移行上皮がん;膀胱がん;血液のがん、例えば急性リンパ球性 (リンパ芽球性)白血病、急性骨髄性(myeloid)(骨髄球性、骨髄性(myelogenous)、骨髄芽球性、骨髄単球性)白血病、慢性リンパ性白血病(例えば、セザリー症候群及びヘアリー細胞白血病)、慢性骨髄球性(骨髄性(myeloid)、骨髄性(myelogenous)、顆粒球性)白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、B細胞リンパ腫、菌状息肉腫、
及び骨髄増殖性疾患(真性赤血球増加症、骨髄線維症、血小板血症、及び慢性骨髄球性白
血病のような骨髄増殖性疾患を含む);皮膚のがん、例えば基底細胞がん、扁平上皮細胞
がん、黒色腫、カポジ肉腫、及びパジェット病;頭部及び頸部のがん;眼関連がん、例えば網膜芽細胞腫及び眼球内(intraoccular)黒色がん;男性生殖器系のがん、例えば良性前立腺肥大、前立腺がん、及び精巣がん(例えば、精上皮腫、奇形腫、胎生期がん、及び
絨毛がん);乳がん;女性生殖器系のがん、例えば子宮がん(子宮内膜がん)、子宮頸がん
(cervical cancer)(子宮頸がん(cervical carcinoma))、卵巣のがん(卵巣がん)、外
陰がん、膣がん、卵管がん、及び胞状奇胎;甲状腺がん(乳頭、濾胞腺、未分化、又は髄
様がんを含む);褐色細胞腫(副腎);副甲状腺の非がん性増殖;膵臓がん;並びに血液の
がん、例えば白血病、骨髄腫、非ホジキン(non−Hodgekin’s)リンパ腫、及びホジキン(Hodgekin’s)リンパ腫が挙げられる。
を提供する。用語「さらなる療法」は、治療剤として本開示により提供される結合分子を使用しない療法を指す。用語「さらなる治療剤」は、本開示により提供される結合分子以外のあらゆる治療剤を指す。いくつかの実施態様において、結合分子は、抗体11D4若しくは18D8、又はいずれかの抗体の抗原結合フラグメントである。1つの特定の局面において、本開示は、 哺乳動物に、1つ又はそれ以上のさらなる治療剤と組み合わせて、治療有
効量の本開示により提供される結合分子を投与することを含む、哺乳動物においてがんを処置するための併用療法を提供する。さらなる実施態様において、哺乳動物はヒトである。
化学療法剤、(2)免疫療法剤、及び(3)ホルモン治療剤が挙げられる。
復、及び/若しくは機能を妨げることができる、化学的又は生物学的な物質を指す。化学療法剤の例としては、WO 2006/088639、WO 2006/129163、及びUS 20060153808(これらの開示は本明細書に参照により加入される)において開示されるものが挙げられる。特定の化学療法剤の例としては:(1)アルキル化剤、例えばクロラムブシル(LEUKERAN)、シク
ロホスファミド(mcyclophosphamide)(CYTOXAN)、イホスファミド(IFEX)、塩酸メクロレタミン(MUSTARGEN)、チオテパ(THIOPLEX)、ストレプトゾトシン(ZANOSAR)、カルムスチン(BICNU、GLIADEL WAFER)、ロムスチン(CEENU)、及びダカルバジン(DTIC−DOME);(2)細胞傷害性抗菌薬を含む、アルカロイド類又は植物ビンカアルカロイド類、例えばドキソルビシン(ADRIAMYCIN)、エピルビシン(ELLENCE、PHARMORUBICIN)、ダウノルビシン(CERUBIDINE、DAUNOXOME)、ネモルビシン(nemorubicin)、イダルビシン(IDAMYCIN PFS、ZAVEDOS)
、ミトキサントロン(DHAD、NOVANTRONE). ダクチノマイシン(actinomycin D、COSMEGEN)
、プリカマイシン(MITHRACIN)、マイトマイシン(MUTAMYCIN)、及びブレオマイシン(BLENOXANE)、酒石酸ビノレルビン(NAVELBINE))、ビンブラスチン(VELBAN)、ビンクリスチン(ONCOVIN)、及びビンデシン(ELDISINE);(3)代謝拮抗薬、例えばカペシタビン(XELODA)、シ
タラビン(CYTOSAR−U)、フルダラビン(FLUDARA)、ゲムシタビン(GEMZAR)、ヒドロキシ尿
素(HYDRA)、メトトレキサート(FOLEX、MEXATE、TREXALL)、ネララビン(ARRANON)、トリメトレキサート(NEUTREXIN)、及びペメトレキセド(ALIMTA);(4)ピリミジン系アンタゴニスト、例えば5−フルオロウラシル(5−FU);カペシタビン(XELODA)、ラルチトレキセド(TOMUDEX)、テガフール−ウラシル(UFTORAL)、及びゲムシタビン(GEMZAR);(5)タキサン類、
例えばドセタキセル(TAXOTERE)、パクリタキセル(TAXOL);(6)白金薬物、例えばシスプラチン(PLATINOL)及びカルボプラチン(PARAPLATIN)、及びオキサリプラチン(ELOXATIN);(7)トポイソメラーゼ阻害剤、例えばイリノテカン(CAMPTOSAR)、トポテカン(HYCAMTIN)、エトポシド(ETOPOPHOS、VEPESSID、TOPOSAR)、及びテニポシド(VUMON);(8)エピポドフィロトキシン(ポドフィロトキシン誘導体)、例えばエトポシド(ETOPOPHOS、VEPESSID、TOPOSAR);(9)葉酸誘導体、例えばロイコボリン(WELLCOVORIN);(10) ニトロソ尿素類、例えば
カルムスチン(BiCNU)、ロムスチン(CeeNU);(11)上皮増殖因子受容体(EGFR)、血管内皮増殖因子(VEGF)、インスリン受容体、インスリン様増殖因子受容体(IGFR)、肝細胞増殖因子受容体(HGFR)、及び血小板由来増殖因子受容体(PDGFR)を含む、受容体チロシンキナーゼ
の阻害剤、例えばゲフィチニブ(IRESSA)、エルロチニブ(TARCEVA)、ボルテゾミブ(VELCADE)、メシル酸イマチニブ(GLEEVEC)、ゲネフィチニブ(genefitinib)、ラパチニブ、ソラフェニブ、サリドマイド、スニチニブ(SUTENT)、アキシチニブ、リツキシマブ、 トラス
ツズマブ(HERCEPTIN)、セツキシマブ(ERBITUX)、ベバシズマブ(AVASTIN)、及びラニビズ
マブ(LUCENTIS)、lym−1(ONCOLYM)、WO2002/053596において開示されるインスリン様増
殖因子−1受容体(IGF−1R)に対する抗体);(12)血管新生阻害剤、例えばベバシズマブ(AVASTIN)、スラミン(GERMANIN)、アンジオスタチン、SU5416、サリドマイド、及びマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤(例えばバチマスタット及びマリマスタット)、及びWO2002055106において開示されるもの;並びに(13) プロテアソーム阻害剤、例えばボルテゾ
ミブ(VELCADE)が挙げられる。
ェロンのようなサイトカイン;MyVaxオーダーメイド免疫療法、Onyvax−P、オンコファージ、GRNVAC1、FavId、プロベンジ、GVAX、ロバキシンC、BiovaxID、GMXX、及びNeuVaxのようなワクチン;並びにアレムツズマブ (CAMPATH)、ベバシズマブ(AVASTIN)、セツキシ
マブ(ERBITUX)、ゲムツズマブ(gemtuzunab)オゾガマイシン(MYLOTARG)、イブリツモマ
ブチウキセタン(ZEVALIN)、パニツムマブ(VECTIBIX)、リツキシマブ(RITUXAN、MABTHERA)、トラスツズマブ(HERCEPTIN)、トシツモマブ(BEXXAR)、トレメリムマブ(tremelimumab
)、CAT−3888、及びWO2003/040170に開示されるCD40受容体に対するアゴニスト抗体の
ような抗体が挙げられる。
、タモキシフェン(NOLVADEX)、トレミフェン(Fareston)、フルベストラント(FASLODEX)、アナストロゾール(ARIMIDEX)、エキセメスタン(AROMASIN)、レトロゾール(FEMARA)、酢酸メゲストロール(MEGACE)、ゴセレリン(ZOLADEX)、及びロイプロリド(LUPRON)が挙げられ
る。本開示の結合分子はまた、非薬物ホルモン療法、例えば(1)ホルモンの産生に関与す
る器官又は腺、例えば卵巣、精巣、副腎、及び下垂体の全て又は一部を取り除く外科的方法、並びに(2)患者の器官又は腺が、標的のホルモンの産生を阻害又は排除するために十
分な量で放射線を受ける、放射線処置と組み合わせて使用され得る。
本開示により提供される結合分子及び組成物は、投与のあらゆる適切な経腸経路又は非経口経路を経由して投与され得る。用語投与の「経腸経路」は、胃腸管のいずれかの部分を経由する投与を指す。経腸経路の例としては、経口、粘膜、口腔及び直腸経路又は胃内経路が挙げられる。投与の「非経口経路」は、経腸経路以外の投与経路を指す。投与の非経口経路の例としては、静脈内、筋内、皮内、腹腔内、腫瘍内、膀胱内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、経気管、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外及び胸骨内、皮下、又は局所投与が挙げられる。本開示の抗体及び組成物は、あらゆる適切な方法を使用して、例えば経口摂取、経鼻胃管、胃造瘻チューブ、注射、注入、埋め込み型注入ポンプ、及び浸透圧ポンプにより投与され得る。投与の適切な経路及び方法は、多数の因子、例えば使用される特定の抗体、所望の吸収速度、使用される特定の剤形又は投薬形態、処置される障害の種類又は重篤度、特定の作用部位、及び患者の状態に依存して変更され得、そして当業者により容易に選択され得る。
。いくつかの実施態様において、OX40R抗体の治療有効量は、哺乳動物の体重の約0.1〜30mg/kgの範囲である。投与されるべき正確な投薬レベルは、当業者により容易に決定することができ、そして多数の因子、例えば処置される障害の種類及び重篤度、使用される特
定の結合分子、投与経路、投与の時間、処置の期間、使用される特定のさらなる療法、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全般的な健康及び以前の病歴、並びに医療技術分野で周知の同様の因子に依存する。
スケジュールの1つを使用して静脈内投与を介する1mg/体重1kg又は3mg/体重1kgが挙げられる:(i)6回の投薬について四週毎、次いで三カ月毎;(ii)三週毎;(iii)3mg/体重1kgを1回、続いて三週毎に1mg/体重1kg。
本開示に従う例となる抗体を、以下のように調製し、選択し、そしてアッセイを行った:
ヒトOX40Rに対する完全ヒトモノクローナル抗体を、ヒトIgトランスジェニックマウス
系統HCo7、HCo12、Hco17、及びHco27、さらにヒトトランス染色体(transchromosomal)
/トランスジェニック系統、KM(Medarex、Inc.)を使用して調製した。これらの系統は全
て、ヒトから単離された抗体と区別できない完全ヒト抗体を発現する。
遺伝子、KCo5を保有していた。対照的に、導入遺伝子系統はそれらのヒト重鎖遺伝子に関して異なっていた。HCo7系統は、米国特許第5,545,806号、同第5,625,825号、及び同第5,545,807号に記載されるように、HCo7 ヒト重鎖導入遺伝子を保有しており;HCo12系統は
、WO 01/09187の実施例2において記載されるように、HCo12ヒト重鎖導入遺伝子を保有
しており;Hco17系統は、Deshpande et al.、US 2005/0191293A1の実施例8に記載され
るようにHco17 ヒト重鎖導入遺伝子を保有しており;Hco27系統は、PCT/US2008/072640(2008年8月08日出願)の実施例5に記載されるように、Hco27ヒト重鎖導入遺伝子を保有していた。KM系統は、Ishida et al.、(2002)、Cloning and Stem Cells、4: 91−102に記載されるようにヒトミニ−染色体を、保有している。
したヒトOX40Rの細胞外ドメイン(アミノ酸1−220)の構築物である。投与は、腹腔内、皮下又は足蹠中への注射により3−28日の間隔で、合計10回までの免疫を行った。免疫応答を、以下に記載されるようなELISA及びFACSスクリーニングを介してモニタリングした
。
OX40Rに結合する抗体を産生するHuMabマウスを選択するために、免役したマウスから血液を採取し、精製ヒトOX40R組み換えタンパク質に対する特異的結合についてELISAにより分析し、そしてFACSにより、全長ヒトOX40Rを発現している細胞株に対する結合、及びOX40Rを発現していないコントロール細胞株に結合しないことについて分析した。
ナル抗体とともに1時間室温でインキュベートした。洗浄後、プレートをABTS基質(Moss Inc.、製品番号: ABTS−1000mg/ml)を用いて顕色させ、分光光度計でOD405にて分析し
た。
融合を行い、そしてハイブリドーマ上清を抗OX40R活性についてELISA及びFACSにより試験した。
前記の選択されたマウスを、OX40R−Igで3日静脈内に追加免疫し、次いで再び犠牲に
する前2日追加免疫し、そして脾臓及び/又はリンパ節を取り出した。
気融合(E−融合(E−fusion)、Cyto PulseTM技術、Cyto PulseTM Sciences、Inc.、Glen
Burnie、MD)を使用して、標準的な又は製造業者が推奨するプロトコルにしたがってSP2
/0非分泌マウス骨髄腫細胞(ATCC、CRL−1581)に融合した。手短には、免疫マウス由来
の脾細胞及び/又はリンパ節リンパ球の単細胞懸濁液を調製し、次いで同数のSP2/0非分泌マウス骨髄腫細胞と混合し;次いでE−融合を行った。
した約10〜14日後に、個々のウェルからの上清を、ヒトガンマ、カッパ抗体の存在についてスクリーニングした。次いでヒトガンマ、カッパについて陽性と採点された上清を、ELISA及びFACSにより(上記のプロトコールを使用して)ヒトOX40RモノクローナルIgG抗体に
ついてスクリーニングした。抗体を分泌しているハイブリドーマを24ウェルプレートに移
し、再度スクリーニングし、そしてヒトOX40R IgGモノクローナル抗体について陽性と確
認された場合、限界希釈により少なくとも2回サブクローニングした。次いで安定なサブクローンをインビトロで培養して、さらなる特徴付けのために組織培養培地中で少量の抗体を作成した。
A.インビトロ試験手順:
OX40Rの細胞外ドメインに対する結合:ヒトOX40−Ig融合タンパク質を、BupHTM炭酸緩
衝液、pH 9.4 (Pierce、Rockford、IL)で希釈し、96ウェルMaxisorbプレート(Nunc、Roskilde、Denmark)上に100μl/ウェル(0.25μg/ml)でコーティングし、そして終夜4℃で
インキュベートした。プレートをPBS (Sigma、St Louis、MO)で希釈した0.05% Tween20(Sigma、St Louis、MO)を含有する洗浄緩衝液で3回洗浄し、そしてPBS中0.5% BSA (Sigma、St Louis、MO)300μl/ウェルで1時間室温にてブロックした。次に、プレートを洗浄し、そしてブロッキング緩衝液で種々の濃度で希釈された抗ヒトOX40反応性抗体(100μl
/ウェル)とともにインキュベートし、そして1時間室温でインキュベートした。次いで
プレートを洗浄し、そして1時間室温で西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトカッパ鎖抗体(Bethyl Laboratories、Montgomery、TX)とともにブロッキング緩衝液中25ng/mlで
インキュベートした。最後に、アッセイプレートを洗浄し、そして100μl/ウェルの1−Step Turbo−TMB基質(Pierce、Rockford、IL)を30分間室温で加えた。等体積の2M H2SO4を加えることにより反応を停止させて、吸光度を450nmでMolecular Devices Spectra Max 340 (Molecular Devices、Sunnyvale、CA)にて読み取った。
の両方に対する結合を評価するために使用した。細胞を採取し、そして洗浄緩衝液を使用して室温で洗浄した(5×105/チューブ)。洗浄緩衝液は、PBS、2%熱不活化ウシ胎児血清(Hyclone、Logan、UT)及び0.02%アジ化ナトリウム(Sigma、St. Louis、MO)から構成されていた。次に、種々の濃度の抗体100μlを細胞に加え(30ug/mlで開始して3倍滴定(titration)を使用)、サイトコラシン(cytocholasin)B(Sigma、St. Louis、MO)0.005mg/mlを含有する洗浄緩衝液で希釈した。細胞を室温で3時間穏やかに振盪させた。次に、細胞を2回洗浄し、そして0.5ml/チューブで冷洗浄緩衝液を用いて再懸濁し、10,000イ
ベントを集めてBecton Dickinson FACSCalibur及びCellQuestソフトウエア(San Jose、CA)を使用して解析した。
変化として報告した。
’−(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドで媒介して0.05M N−ヒドロキシスクシン
イミドで7分間誘導体化することにより活性化した。10mM 酢酸Na(pH4.5)中500μg/mlの濃度でストレプトアビジン(Sigma S−4762)を3つの表面(Flow Cell−2、3及び4)上に
5μl/分の速度で注入して、フローセル表面に約2500RUで共有結合的に固定化した。10mM酢酸Na緩衝液35μlを、抗原の代わりに固定化の間Flow cell−1上に注入して、非特異的結合を測定するための活性化ブランク表面を作製した。四つのフローセル上の未反応のN
−ヒドロキシスクシンイミドエステルの不活化を、1Mエタノールアミン塩酸塩(pH 8.5)を使用して行った。固定化の後、フローセルから、安定なベースラインが達成されるまで
50mM NaOH 5μlを5回再生注入(regeneration injections)して、あらゆる未反応又は不十分に結合した細胞を清浄化した。
質移動(mass transport)制限結合及び解離中の再結合(両方とも、表面密度により影響を受け、避けられなければならないアーチファクトである)の可能性をモニタリングするために調製した。
、3mM EDTA、0.005%ポリソルベート20(v/v))で半対数で666nM〜66pMの濃度範囲にわたって調製した。流量を5μl/分に設定し、注入される抗体の各濃度間の50mM NaOH 5μlを再生注入と共に各濃度点サンプル25μlをセンサーチップ上に注入した。解離時間は5
分であった。このデータをBIAevaluation 3.0グローバルフィット(global fit)ソフト
ウエアを使用して解析した(各濃度点の別々の解析)。
−CD40融合構築物を発現している300−19細胞を抗体エピトープ解析に使用した。OX40−CD40発現細胞株を、10%ウシ胎児血清(Hyclone、Logan、UT)、10mM hepes、1%ペニシリ
ン−ストレプトマイシン、2mM L−グルタミン、 0.1mM非必須アミノ酸及び0.05mM 2−メルカプトエタノール(Gibco、Grand Island、NY)を補充したRPMI培地(Gibco、Grand Island、NY)中で増殖させた。300−19.hCD134.2細胞(5×105/チューブ)を冷洗浄緩衝液(PBS
、2% FBS及び0.02%アジ化ナトリウム)3mlで1回洗浄した。細胞上清を吸引し、そし
て一次非結合OX40反応性抗体300μg/mlを含有する洗浄緩衝液100μlを細胞ペレットに加え、混合し、そして30分間4℃でインキュベートした。次に、蛍光色素で標識した二次抗体をチューブに加え、混合し、そしてさらに30分間4℃でインキュベートした。OX40反応性蛍光色素標識抗体は、フィコエリトリン(PE)標識Ber Act 35(Caltag Laboratories、Burlingame、CA.)、PE標識L106(BD Pharmingen、San Jose、CA)又はAlexa Fluor 647結合OX40R抗体のいずれか10μlを含んでいた。OX40R抗体に、Alex Fluor 647タンパク質標
識キットを使用して製造業者(Molecular Probes、Eugene、OR)によって記載されているように蛍光色素を標識した。次いで染色後に、細胞を洗浄緩衝液で3回洗浄し、冷洗浄緩衝液に再懸濁し、そして10,000イベントを集め、そしてBecton Dickinson FACSCalibur及びCellQuestソフトウエア(San Jose、CA)を使用して解析した。抗体は、一次抗体が二次蛍
光色素標識抗体の染色を80%より多くブロックした場合に、同じエピトープに結合するものとして落された(demeaned)。
シン(Gibco、Grand Island、NY)を補充したRPMI培地(Gibco、Grand Island、NY)中で増殖させた。OX40−ヒトIgG1融合タンパク質は、細胞外OX40タンパク質の最初の220個のアミ
ノ酸を含む。この融合タンパク質を、Nunc Maxisorbプレート(Nunc、Roskilde、Denmark)上に100μ/ウェル(5μg/ml)でコーティング緩衝液(BupH、炭酸−重炭酸緩衝液、Pierce、Rockford、IL)にてコーティングし、そして終夜4℃でインキュベートした。次に、プレートをペーパータオル上でブロットして液体を除き、200μl/ウェルでブロッキング緩衝液(PBSで希釈された5% Carnation Milk)を用いてブロックし、そして室温で2時間イ
ンキュベートした。プレートをPBSで洗浄し、次いでPBSで希釈された種々の希釈の抗体をアッセイプレートに加えて(50μl/ウェル)、室温で30分インキュベートした。次に、PBS中の細胞50μl/ウェルを6×105/ウェルで、抗体を含有するウェルに加え、そしてさらに60分間37℃で5%CO2加湿チャンバー内でインキュベートした。プレートをPBSで2回穏やかに洗浄して、付着していない細胞を除去し、そしてウェルにおける細胞活性を、20ug/mlフルオレセインジアセタート(Sigma、St. Louis、MO)PBS溶液200μlを各ウェルに
加えることにより測定した。プレートを37℃で5%CO2加湿チャンバー中で90分間インキ
ュベートし、そして分光光度計を使用して490で読み取った(Spectra Max 340、Molecular
Devices、Sunnyvale、CA)。
ヒトTNFα受容体ファミリーメンバー融合タンパク質100μlでコーティングし、そして終
夜4℃でインキュベートした。試験した選択性受容体融合タンパク質は、CD40−Ig(Alexis Biochemicals、San Diego、CA)、CD137−Ig(R&D Systems、Minneapolis、MN)及びCD271−Ig (Alexis Biochemicals、San Diego、CA)を含んでいた。また、各アッセイでのポジ
ティブコントロールとして、OX40−Ig融合タンパク質(社内構築物、Bioexpress、97/2117)も含まれていた。次いでプレートを、PBSで希釈された0.05% Tween20(Sigma、St Louis、MO)を含有する洗浄緩衝液で3回洗浄し、そしてPBS(Sigma、St Louis、MO)中0.5%BSA(Sigma、St Louis、MO)300μlで1時間室温にてブロックした。次に、プレートを洗浄し
、そして100μl/ウェルの抗ヒトOX40反応性抗体を種々の濃度でプレートに加え、そして1時間室温でインキュベートした。プレートを十分に3回洗浄し、そしてOX40R抗体結合
を、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトカッパ鎖抗体(Bethyl Laboratories、Montgomery、TX)を用いて25ng/mlで1時間室温にて検出した。次いでプレートを3回洗浄し、
続いて100μl/ウェルの1−Step Turbo−TMB基質(Pierce、Rockford、IL)を30分間室温で加えた。等体積の2M H2SO4を加えることにより反応を停止させた。吸光度をMolecular Devices Spectra Max 340 (Molecular Devices、Sunnyvale、CA)で450nmにて読み取った。
を、抗ヒトCD3抗体クローンUCTH1(R & D Systems、Minneapolis、MN )でPBS中5μg/ml
でプレコーティングした24ウェルプレートのウェルに加えた。T細胞培養を フローサ
イトメトリーによりヒトOX40交差反応性について試験する前3日間刺激した。
層にした。これらのチューブを1000xgで45分間室温にて回転させて単核PBMC界面を採取し、PBS中で1回洗浄し、そしてACK溶解緩衝液(Biosource、Rockville、MD)を用いて2分間室温で再懸濁させてあらゆるRBCを除去した。PBS洗浄後、PBMCを計数し、そして組織培養培地(TCM)中1×106/mlに再調整した。TCMは、10%ウシ胎仔血清(Hyclone、Logan、UT)
及びL−グルタミン(2mM)、Hepes (10mM)、ペニシリン(100 U/ml)、ストレプトマイシン
(50ug/ml)(Gibco(Grand Island、NY)から購入)を補充したRPMI 1640 (Sigma、St Louis、MO)からなっていた。次に、抗ヒトCD28交差反応性抗体(クローンCD28.2、BD Biosciences、San Diego、CA)を含有するPBMC標本2mlを、抗サルCD3抗体(クローンFN18、Biosource、Camarillo、CA)でPBS中10μg/mlでプレコーティングした 24ウェルプレート(Costar、Corning、NY)のウェルに加えた。PBMC培養をフローサイトメトリーによりヒトOX40交
差反応性について試験する前4日間刺激した。
、PBSで2回洗浄し、そしてPHAを10ng/mlで含有するTCM(Remel、Lenexa、KS)中に再懸濁して2×106/mlとした。細胞を24〜48時間培養した。
のConA(Sigma、St. Louis、MO)で48時間刺激した。
、Westbury、NY)上で注意深く層にした。これらのチューブを20分間1500RPMで遠心分離した。PBMC界面を集め、2回洗浄し、そして細胞ペレットをTCM中2×106/mlに再調整した。細胞2mlを、24ウェルプレートの各ウェルに加え、そしてフローサイトメトリー染色の前に、PHA(Remel、Lenexa、KS)で24−48時間10ng/mlにて刺激した。
ギ、イヌ、及びカニクイザルのPBMC及びカニクイザルOX40受容体を発現している300−19
細胞株を、ヒトOX40抗体種交差反応性を試験するために使用した。活性化Tリンパ球を発現しているヒトOX40及びOX40形質導入300−19細胞をポジティブコントロールとして使用
した。細胞(5.0×105/チューブ)を冷洗浄緩衝液(PBS、2%FBS及び0.02%アジ化ナトリ
ウム)で1回洗浄し、そして100μl/チューブのAlexa Fluor 647結合コントロール又はOX40反応性抗体5ug/mlを各チューブに加えた。Alex Fluor 647タンパク質標識キットを使用して製造業者(Molecular Probes、Eugene、OR)により記載されているように抗体を標識した。細胞を暗所で蛍光色素抗体とともに氷上で30分間インキュベートし、3回洗浄し、そして0.5ml洗浄緩衝液中に分析のために再懸濁した。抗体染色を測定し、Becton Dickinson FACSCalibur及びCellQuestソフトウエア(San Jose、CA)を使用して解析した。
の細胞外ドメイン及びCD40の細胞内ドメインを含む293T細胞を調製した。細胞を採取し
、洗浄し、そしてフェノールレッドを含まない完全培地(10%ウシ胎仔血清、HEPES緩衝液、非必須アミノ酸及びL−グルタミンを含有するDMEM)中に0.5X106細胞/mlの濃度で再懸
濁した。80ulの細胞を96ウェルプレート(PerkinElmer、部品番号6005680)の各アッセイウェルにプレートした。試験抗体を各ウェルに単独で、又は架橋抗体Fab’ヤギ抗ヒトIgG(Jackson ImmunoResearch、West Grove、PA)の存在下で加えた。プレートを終夜37Cでインキュベートした。100ulのルシフェラーゼ(Promega、Bright−glo luciferassay システム、カタログ番号E2620)を翌日に加え、そしてルシフェラーゼ活性の量をシンチレーションカウンター(TopCount、Packard −NXT)を使用して測定した。
に採取し、Accuspinチューブ(Sigma;St. Louis、MO)上で層にして、15分間2000rpmで遠
心分離した。バフィーコートを集め、PBS(Sigma、St. Louis、MO)で洗浄し、そして赤血
球を水で溶解した。T細胞をヒトCD3+富化カラム(R&D;Minneapolis、MN)により分離し、計数し、そして10%ウシ胎仔血清 (Hyclone;Logan、UT)、10mM hepes、1%ペニシリン
−ストレプトマイシン、2mM L−グルタミン及び0.1mM非必須アミノ酸(全てGibco)を含有するRPMI培地(Gibco;Grand Island、NY)中1×106/mlに調整した。同時に、ヒト抗−CD3εクローン#UCHT1(R&D systems、Minneapolis、MN)を PBS中2.5μgs/mlで24ウェルプレート(Costar;Corning、NY)中に入れて、2時間37℃でインキュベートした。プレートをPBSで3回洗浄し、そして以下をウェルに加えた:1×106/ウェルのT細胞、OX40抗体(又はIgG2 KLHコントロール)の連続希釈及び架橋するためのF(ab’)2ヤギ抗ヒトIgG Fcγ(2.5ug/mLで添加)。上清を48時間及び72時間目に抜き取り、IL−2レベルをELISA(R&D)によ
り評価した。
し、そして赤血球を水で溶解した。細胞を1×106/mlに調整し、そして種々の濃度のサ
ル抗CD3クローンFN−18 (Biosource;Camarillo、CA)で37℃で2時間プレコーティングされた24ウェルプレートに加えた。OX40抗体(又はIgG2KLHコントロール)の連続希釈、さら
にはF(ab’)2ヤギ抗ヒトIgGFcγ(2.5 ug/mL)をウェルに加えた。上清を24時間及び48時間目に採取し、そしてIL−2レベルをELISA(Biosource、Camarillo、CA)により評価した。
トマイシンcで処理した同種異系腫瘍細胞(Raji)とともに3−4日間インキュベートした。次いでT細胞を採取し、洗浄し、そして11D4で刺激する前に新鮮な培地中に1日間静置した。IL−2のレベルを24時間後にELISA(R&D systems、Minneapolis、MN)により評価した。
ヒトT細胞及び樹状細胞を移植したマウスを使用するSCID−ベージュヒト腫瘍モデル:
SCID−ベージュマウス(Taconic #CBSBG−MM)を、到着後、使用前に5〜7日間馴化させ
た。以下の腫瘍細胞株を使用した: RAJI、ATCC #CCL−86;BT−474、ATCC #HTB−20;PC−3、ATCC#−1435;及びLoVo、ATCC# CCL−229。
で5%CO2下にてインキュベートした。非付着細胞を集めて保存した(以下を参照のこと)。付着細胞を含むフラスコを、10ng/mlのIL−4(R&D)及び100ng/mlのGM−CSF(R&D)を補
充したRPMI完全培地(10%ウシ胎仔血清含有)20mlと共にインキュベートした。次いで培養物を6〜7日間37℃で加湿インキュベーター中にて5%CO2下でインキュベートした。次
いで樹状細胞由来の非付着単球を、デカントしてフラスコをRPMI完全培地で数回すすぐこ
とにより集めた。
高親和性ネガティブ選択を介してT細胞を精製するために使用した。精製されたT細胞をRecovery−Cell Culture Medium中107/mlで冷凍保存し、使用まで液体窒素で保存した。腫瘍細胞(1×107)を、T細胞(1×106)及び同じドナーからの単球由来樹状細胞(5×105)とともに、0.2mL/マウスで皮下(SC)注射した。腫瘍増殖をカリパスで経時的にモニタリングした。
(1)インビトロ試験:
インビトロ試験からの抗体11D4の特定の特性を表3にまとめる。
抗体11D4はOX40Rに対して高親和性で結合する。
このことは、OX40Rの細胞外ドメインを含むIgG1融合タンパク質を、そして全細胞(OX40R+トランスフェクトされた細胞及び活性化された初代(primary)T細胞)に対して使用することで実証された。IgG1融合タンパク質を使用する実施例において、11D4はOX40Rの細
胞外ドメインに0.5 +/− 0.18μg/mL(3.5nM)のEC50で結合した。この結合は、OX40Rの全長細胞外ドメインを発現している300−19プレB細胞で確認された(親300−19細胞では
結合は観察されなかった)。OX40Rトランスフェクト細胞に対する結合のEC50は0.2 +/−
0.16μg/mL(1.7nM)であった。 結合が初代T細胞で観察されることを確認するために、末梢血T細胞を、複数のヒトドナーから単離し、そして抗CD3及び抗CD28で2日間刺激し
てOX40Rの発現を上方調節した。これらのT細胞に関する飽和結合データは、11D4が0.6
+/−1.0μg/mLのEC50(4.0nM、N=17ドナー)で結合することを示していた。これらのデータは、11D4がOX40Rに非常に強く結合することを示す。
否かも決定した。OX40R IgG1融合タンパク質に対する競合結合データは、11D4がOX40リガンドを発現している細胞との結合を競合することを示し、11D4が受容体のリガンド結合領域において相互作用するという証拠を提供した。さらに、11D4は、FACS分析により評価して、2つの市販のOX40R抗体、BerAct35及びL106とは、T細胞に対する結合に関して交差
競合しない。非競合検出抗体を使用するFACS分析は、OX40Rが、初代活性化T細胞を11D4
とともに30分間プレインキュベーションした後に内部に移行しないことを指示した。固定化リガンドとしてOX40R細胞外ドメイン融合タンパク質を使用するBiacore分析により決定されたその結合親和性は、11D4の結合に関する平衡解離定数(KD)が0.48nMであることを示していた。またこれらの分析により、11D4の解離速度(off rate)定数(kd)が5.72 E−05 1/秒であると推定された。したがって、11D4は、OX40Rのリガンド結合領域に高親
和性で結合し、遅い解離速度定数を有し、そして結合後に受容体の内部に移行しない。
合タンパク質構築物に関連するデータを使用して、TNFRスーパーファミリーの他のメンバーに対して評価した。これらの受容体は、CD40受容体、4−1BB受容体(CD137)及び神経成
長因子受容体(CD271)を含んでいた。全ての場合において、これらの受容体に対して100μg/mL(700nM)までの濃度では有意な結合は観察されなかった。OX40R融合タンパク質(EC50
= 0.5ug/ml)に対して観察された結合と比較した場合、これらのデータは、11D4が、試験した他の関連ファミリーメンバーに対して、OX40Rに関して>100倍選択的であることを実証した(図1a及び1bを参照のこと)。
11D4の機能的活性を、OX40R+トランスフェクト細胞及び初代T細胞の両方に対して実
証した。これらのアッセイにおいて、二次抗体、F(ab’)2ヤギ抗ヒトIgG Fcγを用いても用いなくても細胞に添加された場合に、11D4はアゴニスト活性 を示した。
4日間インキュベートした。次いでT細胞を採取し、洗浄し、そして11D4で刺激する前に新鮮な培地中で1日間静置した。FACS分析は、静置した後でもこれらの細胞での高レベルのOX40R発現を指示した。11D4は、これらの細胞により高レベルのIL−2を誘導し、いくつかの場合には100ng/mLを超えていた(図3)。2つの別々のサンプルからのこの反応につ
いての平均EC50は0.008 +/− 0.006mg/mLであった。11D4が存在しない場合、最小レベルのIL−2しかこれらの細胞により分泌されなかった。
び抗CD3により生成されるIL−2の量に依存して、抗CD3単独に対して2.3〜57倍の範囲に及んだ。2.5μg/mLの抗CD3で刺激された初代ヒトT細胞によるIL−2産生に対する11D4の効果を図4に示す(1:3希釈を用いた8点濃度曲線を使用)。8点濃度反応曲線を使用したデータから算出した平均EC50は、0.042 +/− 0.01μg/mLであった(表4を参照のこと)。
に)を用いて刺激したサル細胞を使用してアッセイを行った。結果を図5及び表5において示す。これらのデータは、11D4についてのEC50はサル細胞とヒト細胞との間で類似している(0.022対ヒト細胞について0.042μg/mL)が、抗CD3単独を上回って誘導されるIL−2
の規模が、カニクイザルT細胞を使用すると有意に低い(約35倍、ヒト細胞について5762 +/− 4748 pg/mL IL−2(N=21)であるのに対し、サル細胞について261 +/− 294 pg/mL IL−2(N=9))ことを示した。
11D4を、複数の種由来のT細胞に結合するその能力について評価した。T細胞をマウス、ラット、ウサギ、イヌ及びサルから単離し、そして抗CD3+抗CD28又はマイトジェンの
いずれかを用いて活性化した。マウス、ラット、ウサギ、又はイヌの細胞においてFACS分析で指示されているように、結合は観察されなかった。マウスOX40Rに対する結合がない
ことは、マウスOX40Rの細胞外ドメインを含む市販の融合タンパク質を使用してELISAでも確認された。対照的に、11D4は、FACSによる飽和結合アッセイにおいて決定して、カニクイザルT細胞に結合した。種々のサルを使用して得られるEC50値の範囲を図6に示す。比較のために、ヒト細胞を使用して得られるEC50値の範囲を図7に示す。変動しやすいが、EC50値の範囲はサル細胞とヒト細胞の間に類似している(平均値はサル細胞について0.354
μg/mLに対してヒト細胞について0.566μg/mLである)。
マウスOX40Rとの11D4の交差反応性がないことにより、重症複合免疫不全(SCID)ベージ
ュマウスを使用する異種間腫瘍モデルの開発が必要とされた。SCID−ベージュマウスは、マウスT及びBリンパ球、及びNK細胞を欠失しており、それによりヒト免疫細胞の移植及びヒト腫瘍の増殖のための理想的なレシピエントとなっている。さまざまな腫瘍の型を代表する4つの腫瘍細胞株をこのインビボモデルにおいて試験した。腫瘍株はどれもOX40R
を発現していなかった。全ての場合において、腫瘍細胞(1×107)を、同じドナー由来の
T細胞(1×106)及び単球誘導樹状細胞(5×105)とともに皮下(SC)注射した。腹腔内(IP)注射により投与された11D4 は、表6にまとめられているように、これらのモデルにおい
て98%まで腫瘍増殖を阻害した。投与のIP経路は、その投与の容易さ及び末梢血中への速い伝搬という理由から11D4のために選択された。
SCID−ベージュマウスに、ヒトT細胞及び単球誘導樹状細胞とともにバーキットB細胞リンパ腫、RajiをSC注射した。マウスに、11D4又はアイソタイプコントロール抗体(IgG2
抗KLH)のいずれかを腫瘍注射時に単回IP注射した。図8に示されるように、11D4は、処置された動物において腫瘍増殖の速度を減少させた。各個々の動物(N=10)におけるチャレ
ンジ21日後での腫瘍サイズを図9に示し、これは、10mg/kgの用量レベルによって腫瘍増殖の64%阻害を示す。T細胞及び樹状細胞が存在しない場合は活性は観察されなかった。
SCID−ベージュマウスに、ヒトT細胞及び単球誘導樹状細胞とともに、前立腺腺がんPC−3をSC注射した。マウスに、11D4又はアイソタイプコントロール抗体(IgG2抗KLH)のいずれかを、腫瘍注射時に単回IP注射した。その結果(図10に示される)は、11D4処置が腫瘍増殖の用量依存性阻害を生じたことを示す。この試験からのチャレンジ27日後における各個々の動物(N=10)における腫瘍サイズ は図11に示されており、これは、動物に1.0mg/kgの11D4の単回注射を投与した場合の腫瘍増殖の70%阻害、及び10mg/kgの用量での90%阻害を示している。これらの動物において27日目に測定された11D4の血漿レベルは、1.0mg/kg用量レベルで6.2μg/mLであった。
SCID−ベージュマウスに、ヒトTリンパ球及び自己単球誘導樹状細胞とともに、結腸直腸腺がんLoVoをSC注射した。マウスに、11D4又はコントロール抗体(IgG2抗KLH)のいずれ
かを腫瘍注射時に単回IP注射した。その結果(図12に示される)は、11D4がこれらの動物において用量依存的に腫瘍増殖を減少させたことを示す。チャンレンジ27日後におけるこの研究からの各個々の動物(N=10)における腫瘍サイズを図13に示し、これは1.0mg/kgの単回用量を使用した腫瘍増殖の64%阻害、及び10.0mg/kgの用量レベルでの腫瘍増殖の87%阻害を示す。
SCID−ベージュマウスに、ヒトTリンパ球及び自己単球誘導樹状細胞とともに、乳がん腫BT474 をSC注射した。マウスに、11D4又はコントロール抗体(IgG2抗KLH)を、腫瘍注射
時及び30日後に再び、2回注射(IP)した。その結果(図14に示される)は、11D4がこれらの動物において腫瘍増殖を減少させたことを示す。この研究からの各動物(N=10)に
おけるチャンレンジ85日後の腫瘍サイズを図15に示し、これは、10.0 mg/kgの用量
レベルでの腫瘍増殖の98%阻害、及び1mg/kgの用量での85%阻害を示している。
(1)インビトロ試験:
抗体18D8についてのインビトロ試験からの結果を表7にまとめる。
種々のドナー由来の初代ヒトT細胞による抗CD3誘導IL−2産生に対する抗体18D8の効果もまた表8に示す。
SCID−ベージュマウスモデルにおけるB細胞リンパ腫に対する18D8の有効性
SCID−ベージュマウスに、ヒトTリンパ球及び自己単球誘導樹状細胞とともに、バーキットB細胞リンパ腫、RajiをSC注射した。マウスに、18D8又はアイソタイプコントロール
抗体(IgG2抗KLH)のいずれかを腫瘍注射時に単回IP注射した。1群10匹の動物を各試験において使用した。2つの試験からの結果を表9に示す。その結果は、18D8が1.0mg/kg
及び10mg/kgの用量において有意な抗腫瘍有効性を生じたことを示す。T細胞及び樹状細胞が存在しない場合は活性は観察されず、この抗腫瘍効果が免疫仲介され得ることを示唆している。
SCID−ベージュマウスに、ヒトT細胞及び自己単球誘導樹状細胞とともに前立腺腺がんPC−3をSC注射した。マウスに、18D8又はアイソタイプコントロール抗体(IgG2抗KLH)のいずれかを腫瘍注射時に単回IP注射した。1群10匹の動物を試験において使用した。結果を表9に示す。その結果は、18D8処置が、それぞれ0.1mg/kg、1.0mg/kg、及び10mg/kgの用量において腫瘍増殖の42%、90%、及び88%阻害を生じたことを示す。
出願人らは、抗体11D4の重鎖をコードするプラスミドを含むE.coli DHα5の培養株及び抗体11D4の軽鎖をコードするプラスミドを含むE.coli DHα5の培養株を、American Type Culture collections (ATCC)、10801 University Boulevard、Manassas、VA 20110−2209に2007年7月10日に寄託し、これらはそれぞれ寄託番号PTA−8524及びPTA−8525が付与さ
れている。これらの寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約及びそれに基づく規則(ブダペスト条約)の規定の下でなされた。これらの寄託物は、30年間、又は最新の分譲請求から5年間、又は特許の有効存続期間の間のいずれか最長の期間、ATCC寄託機関において制限無く維持され、その期間の間に寄託物が生存しなくなった場合、差し替えられる。寄託された試料の可能性は、いずれかの政府の権限下でその特許法に従って認められる権利に抵触して発明の実施許諾と解釈すべきではない。
:3希釈での用量−反応曲線からのものである。他の全ての値は対数希釈曲線を表す。1:3希釈を使用する曲線から誘導されたEC50は0.022 +/− 0.01;N=3であった。
Claims (5)
- ヒトOX40Rに結合する単離された結合分子を製造するインビトロの方法であって、
該方法は、該結合分子のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む一つ又はそれ以上の発現ベクターを含む宿主細胞中で該結合分子の該アミノ酸配列を発現することを含み、
ここで、該結合分子は、
A.
(a)配列番号1のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1;
(b)配列番号2のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2;
(c)配列番号3のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3;
(d)配列番号4のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1;
(e)配列番号5のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2;及び
(f)配列番号6のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;又は
B.
(a)配列番号7のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;及び
(b)配列番号8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;又は
C.
(a)配列番号13のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1;
(b)配列番号14のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2;
(c)配列番号15のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3;
(d)配列番号16のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1;
(e)配列番号17のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2;及び
(f)配列番号18のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3:又は
D.
(a)配列番号19のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;及び
(b)配列番号20のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含み、
該結合分子は:(a)1×10 -6 M又はそれ以下のK D でヒトOX40Rに結合し;及
び
(b)ヒトOX40Rに対してアゴニスト活性を有する、上記方法。 - 前記結合分子がヒト抗体である、請求項1に記載の方法。
- 前記結合分子がキメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項1に記載の方法。
- 前記抗体が100×10 -9 M又はそれ以下のKDでヒトOX40Rに結合する、請求項2に記載の方法。
- ヒトOX40Rに結合する単離されたモノクローナル抗体を製造する方法であって、
該方法は、該モノクローナル抗体をコードするDNAを含む発現ベクターを含む宿主細胞を培養することを含み、
ここで、該モノクローナル抗体は:
(i)配列番号9のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号10のアミノ酸配列を含む軽鎖;又は
(ii)配列番号21のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号22のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、上記方法。
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