ES2628093T3 - Moléculas de unión al receptor OX40 humano - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo monoclonal aislado que se une a OX40R humano, que comprende: (a) una CDR1 de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1; una CDR2 de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 2; y una CDR3 de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 3; o (b) una CDR1 de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 13; una CDR2 de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 14; y una CDR3 de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 15, en el que dicho anticuerpo monoclonal aislado comprende 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos conservativas en una o más secuencias de CDR de la cadena pesada; y en el que dicho anticuerpo monoclonal aislado: (a) se une al OX40R humano con una KD de 5 x 10-9 M o menos; y (b) tiene actividad agonista en OX40R humano.

Description

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DESCRIPCION

Moleculas de union al receptor OX40 humano Acuerdo de investigacion conjunta

La descripcion y las reivindicaciones de la presente memoria son el resultado de las actividades emprendidas dentro del alcance de un acuerdo de investigacion conjunta entre Pfizer Inc. y Medarex Inc. que se llevo a efecto en o antes de la fecha en la que se hizo la invencion reivindicada.

Antecedentes

La presente descripcion se refiere a anticuerpos, y en particular a anticuerpos que se unen al receptor OX40.

La estimulacion de la funcion de las celulas T anti-tumorales representa una aproximacion potente y nueva para el tratamiento del cancer. Los componentes cruciales implicados en la generacion de una respuesta eficaz de celulas T anti-tumorales incluyen la estimulacion de la actividad de las celulas T auxiliares CD4+ para favorecer la generacion de celulas T citolfticas anti-tumorales, y proporcionar senales de supervivencia para las celulas T efectoras y de memoria. Un receptor clave que se ha demostrado que actua como mediador en estas respuestas es el receptor OX40. Sugamura, K., Ishii, N., Weinberg, A. Therapeutic targeting of the effector T-cell co-stimulatory molecule OX40. Nature Rev. Imm. 4: 420-431 (2004); Hori, T. Roles of OX40 in the pathogenesis and control of diseases. Intn. J. Hematology. 83: 17-22 (2006).

El receptor OX40 (OX40R) (tambien conocido como CD134, TNFRSF4, ACT-4, ACT35, y TXGP1L) es un miembro de la superfamilia de receptores de TNF. Se ha descubierto que el OX40R se expresa en las celulas T CD4+ activadas. Se ha demostrado que hay un numero elevado de celulas T OX40R+ en tumores (linfocitos infiltrantes de tumores) y en los nodulos linfaticos de drenaje de pacientes de cancer (Vetto, J.T. et al. 1997. Presence of the T-cell activation marker OX-40 on tumor infiltrating lymphocytes and draining lymph nodes cells from patients with melanoma and head and neck cancers. Am. J. Surg. 174: 258-265; Weinberg, A. D. et al. Engagement of the OX-40 receptor in vivo enhances antitumor immunity. J. Immunol. 164: 2160-69 (2000); Petty, J.K., et al. Survival in human colorectal cancer correlates with expression of the T-cell costimulatory molecule OX-40 (CD134). Am. J. Surg. 183: 512-518 (2002)). Se demostro en los modelos de tumores en ratones que la activacion del OX40R in vivo durante la sensibilizacion de los tumores retraso y previno significativamente la aparicion de los tumores en comparacion con los ratones tratados con el control (Weinberg et al., 2000). Por lo tanto, se ha considerado estimular la respuesta inmunitaria de un mairnfero hacia un antfgeno activando el OX40R por medio del uso de un agente de union a OX40R (documento WO 99/42585; Weinberg et al., 2000). El documento WO 03/106498 describe moleculas agonistas de union a OX40R humano.

Sumario

La invencion se define en las reivindicaciones adjuntas. La presente descripcion proporciona moleculas de union aisladas que se unen al OX40R humano, que incluyen anticuerpos hacia OX40R, fragmentos de union al antfgeno de los anticuerpos hacia OX40R, y derivados de los anticuerpos hacia OX40R. En ciertas realizaciones, la molecula de union se une al OX40R humano con una Kd de 1 x 10-7 M o menos, y tiene actividad agonista sobre el OX40R humano. En ciertas realizaciones adicionales, la molecula de union es un anticuerpo monoclonal humano que se une de manera espedfica al OX40R humano con una Kd de 100 nM o menos.

La presente descripcion tambien proporciona una composicion que comprende una o mas de las moleculas de union y un vehfculo farmaceuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, la molecula de union es un anticuerpo monoclonal hacia OX40R humano o un fragmento de union al antfgeno del mismo. La composicion puede comprender ademas agentes farmaceuticos adicionales, tales como agentes quimioterapeuticos, agentes inmunoterapeuticos, y agentes terapeuticos hormonales.

La presente descripcion proporciona ademas metodos terapeuticos y de diagnostico mediante el uso de las moleculas de union. En ciertas realizaciones, la descripcion proporciona un metodo para tratar o prevenir el cancer en un mam^era, que comprende administrar al mam^era una cantidad terapeuticamente eficaz de una molecula de union o una composicion que comprende una molecula de union. En algunas otras realizaciones, la descripcion proporciona un metodo para estimular una respuesta inmunitaria en un mamffero, que comprende administrar al mamffero una cantidad terapeuticamente eficaz de una molecula de union o una composicion que comprende una molecula de union. En ciertas realizaciones particulares, la molecula de union usada en los metodos es un anticuerpo monoclonal hacia OX40R humano o un fragmento de union al antfgeno del mismo.

La presente descripcion proporciona ademas moleculas de acido nucleico que codifican una secuencia de aminoacidos de una molecula de union, vectores que comprenden tales acidos nucleicos, celulas hospedadoras que comprenden los vectores, y metodos para preparar las moleculas de union.

La descripcion tambien proporciona otros aspectos, que seran evidentes a partir de la descripcion completa, lo que incluye las reivindicaciones.

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Breve descripcion de los dibujos

Las Figuras 1a y 1b son graficos que muestran que el anticuerpo 11D4 se une de manera espedfica al OX40R;

La Figura 2 es un grafico que muestra el efecto del anticuerpo entrecruzado 11D4 sobre la actividad de luciferasa estimulada por OX40R;

La Figura 3 es un grafico que muestra el efecto del anticuerpo 11D4 sobre la produccion de IL-2 por celulas T sensibilizadas con aloantigeno;

La Figura 4 es un grafico que muestra el efecto del anticuerpo 11D4 sobre la produccion de IL-2 inducida por anti- CD3 por celulas T primarias;

La Figura 5 es un grafico que muestra el efecto del anticuerpo 11D4 sobre la produccion de IL-2 inducida por anti- CD3 por celulas T primarias de cynomolgus;

La Figura 6 muestra las curvas de union de saturacion con anticuerpo 11D4 mediante el uso de PBMCs de cynomolgus de 14 donantes estimuladas con anti-CD3 y anti-CD28;

La Figura 7 muestra las curvas de union de saturacion con anticuerpo 11D4 mediante el uso de PBMCs humanas de 17 donantes estimuladas con anti-CD3 y anti-CD28;

La Figura 8 es un grafico que muestra el efecto del anticuerpo 11D4 sobre el crecimiento del linfoma de celulas B Raji en ratones SCID;

La Figura 9 es un grafico que muestra el efecto del anticuerpo 11D4 sobre el crecimiento del linfoma de celulas B Raji 21 dfas tras la inyeccion del tumor;

La Figura 10 es un grafico que muestra el efecto de una unica inyeccion de anticuerpo 11D4 sobre el crecimiento del tumor de prostata PC-3 en ratones SCID;

La Figura 11 es un grafico que muestra el efecto del anticuerpo 11D4 sobre el crecimiento del tumor de prostata PC- 3 en ratones SCID 27 dfas tras la inyeccion del tumor;

La Figura 12 es un grafico que muestra el efecto del anticuerpo 11D4 sobre el crecimiento del carcinoma de colon LOVO en ratones SCID;

La Figura 13 es un grafico que muestra el efecto del anticuerpo 11D4 sobre el crecimiento del carcinoma de colon LOVO en ratones SCID 25 dfas tras la inyeccion del tumor;

La Figura 14 es un grafico que muestra el efecto del anticuerpo 11D4 sobre el crecimiento del tumor de mama BT474 en ratones SCID; y

La Figura 15 es un grafico que muestra el efecto del anticuerpo 11D4 sobre el crecimiento del tumor de mama BT474 en ratones SCID.

Descripcion detallada

Definiciones

El termino "agonista" se refiere a una molecula de union, como se define en la presente memoria, que tras la union al OX40R, (1) estimula o activa el OX40R, (2) estimula, incrementa, favorece, induce, o prolonga una actividad, funcion, o presencia del OX40R, o (3) estimula, incrementa, favorece, o induce la expresion del OX40R.

El termino "anticuerpo" se refiere a una molecula de inmunoglobulina que esta compuesta en general de dos pares identicos de cadenas polipeptfdicas, y cada par tiene una cadena "ligera" (L) y una cadena "pesada" (H). Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alfa, o epsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA, e IgE, respectivamente. En las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes estan unidas por una region "J" de alrededor de 12 o mas aminoacidos, y la cadena pesada tambien incluye una region "D" de alrededor de 3 o mas aminoacidos. Cada cadena pesada esta compuesta de una region variable de la cadena pesada (abreviada en la presente memoria como HCVR o Vh) y una region constante de la cadena pesada. La region constante de la cadena pesada esta compuesta de tres dominios, Ch1, Ch2 y Ch3. Cada cadena ligera esta compuesta de una region variable de la cadena ligera (abreviada en la presente memoria como LCVR o Vl) y una region constante de la cadena ligera. La region constante de la cadena ligera esta compuesta de un dominio, CL. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la union de la inmunoglobulina a tejidos o factores del hospedador, que incluyen diversas celulas del sistema inmunitario (p.ej., celulas efectoras) y el primer componente (C1q) del sistema del complemento clasico. Las regiones Vh y Vl se pueden subdividir adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones

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que estan mas conservadas, denominadas regiones estructurales (FR). Cada Vh y Vl esta compuesta por tres CDRs y cuatro FRs, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de cada par de cadenas pesada/ligera (Vh y Vl), respectivamente, forman el sitio de union del anticuerpo. La asignacion de los aminoacidos a cada region o dominio esta de acuerdo con las definiciones de las Secuencias de Protemas de Interes Inmunologico de Kabat (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al. (1989) Nature 342:878-883. El termino "anticuerpo" abarca un anticuerpo que es parte de un multimero de anticuerpos (una forma multimerica de anticuerpos), tales como dfmeros, tnmeros, o multimeros de orden superior de anticuerpos monomericos. Tambien abarca un anticuerpo que esta enlazado o unido a, o ffsicamente o funcionalmente asociado de otra manera a, un resto que no es un anticuerpo. Ademas, el termino "anticuerpo" no esta limitado por ningun metodo particular de produccion del anticuerpo. Por ejemplo, incluye, entre otros, anticuerpos recombinantes, anticuerpos monoclonales, y anticuerpos policlonales.

La expresion "derivado de anticuerpo" o "derivado" de un anticuerpo se refiere a una molecula que es capaz de unirse al mismo antfgeno (p.ej., OX40R) al que se une el anticuerpo, y comprende una secuencia de aminoacidos del anticuerpo unida a una entidad molecular adicional. La secuencia de aminoacidos del anticuerpo que esta contenida en el derivado de anticuerpo puede ser el anticuerpo de longitud completa, o puede ser cualquier porcion o porciones de un anticuerpo de longitud completa. La entidad molecular adicional puede ser una molecula qmmica o biologica. Los ejemplos de entidades moleculares adicionales incluyen grupos qmmicos, aminoacidos, peptidos, protemas (tales como enzimas, anticuerpos), y compuestos qmmicos. La entidad molecular adicional puede tener cualquier utilidad, tal como para el uso como un agente de deteccion, etiqueta, marcador, agente farmaceutico o terapeutico. La secuencia de aminoacidos de un anticuerpo se puede unir o enlazar a la entidad adicional mediante acoplamiento qmmico, fusion genetica, asociacion no covalente o de otra manera. La expresion "derivado de anticuerpo" tambien abarca los anticuerpos quimericos, anticuerpos humanizados, y moleculas que derivan de modificaciones de las secuencias de aminoacidos de un anticuerpo hacia OX40R, tales como sustituciones, adiciones e inserciones de aminoacidos conservados.

La expresion "fragmento de union al antigeno" de un anticuerpo se refiere a una o mas porciones de un anticuerpo de longitud completa que conservan la capacidad de unirse al mismo antfgeno (p.ej., OX40R) al que se une el anticuerpo. La expresion "fragmento de union al antigeno" tambien abarca la porcion de un anticuerpo que es parte de una molecula mayor formada mediante asociacion covalente o no covalente de la porcion del anticuerpo con una o mas entidades moleculares adicionales. Los ejemplos de entidades moleculares adicionales incluyen aminoacidos, peptidos, o protemas, tales como la region central de estreptavidina, que se pueden usar para producir una molecula scFv tetramerica (Kipriyanov et al., (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101), un residuo de cistema, un peptido marcador, o una etiqueta de polihistidina C-terminal, que se puede usar para producir moleculas scFv bivalentes y biotiniladas (Kipriyanov et al., (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058).

La expresion "molecula de union" abarca un (1) anticuerpo, (2) fragmento de union al antfgeno de un anticuerpo, y (3) derivado de un anticuerpo, cada uno como se define en la presente memoria.

La expresion "se une a OX40R" o "union a OX40R" se refiere a la union de una molecula de union, como se define en la presente memoria, al OX40R en un ensayo in vitro, tal como un ensayo BIAcore. La union significa una afinidad de union (Kd) de 1 x 10'6 M o menos.

La expresion "anticuerpo quimerico" se refiere a un anticuerpo que comprende secuencias de aminoacidos derivadas de dos o mas anticuerpos diferentes. Los dos o mas anticuerpos diferentes pueden ser de la misma especie o de dos o mas especies diferentes.

La expresion "sustitucion conservativa de aminoacidos" se refiere a la sustitucion de un residuo de aminoacido por otro residuo de aminoacido, en la que los grupos R de las cadenas laterales de los dos residuos de aminoacidos tienen propiedades qmmicas similares (p.ej., carga o hidrofobicidad). Los ejemplos de grupos de aminoacidos que tienen cadenas laterales con propiedades qmmicas similares incluyen 1) cadenas laterales alifaticas: glicocola, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales hidroxi-alifaticas: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amidas: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromaticas: fenilalanina, tirosina y triptofano; 5) cadenas laterales basicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadenas laterales acidas: acido aspartico y acido glutamico; y 7) cadenas laterales que contienen azufre: cistema y metionina. Los grupos de las sustituciones conservativas de aminoacidos pueden ser, por ejemplo, valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato, y asparagina-glutamina.

El termino "epftopo" se refiere a la parte de un antfgeno que es capaz de producir una union espedfica a un anticuerpo, o receptor de celulas T, o de interaccionar de otra manera con una molecula. "Epftopo" tambien se conoce en la tecnica como "determinante antigenico". Un epftopo consiste en general en agrupamientos superficiales qmmicamente activos de moleculas tales como aminoacidos o carbohidratos o cadenas laterales de carbohidratos, y en general tienen caractensticas estructurales tridimensionales espedficas, asf como caractensticas espedficas de cargas. Un epftopo puede ser "lineal" o "conformacional". Una vez que se determina un epftopo deseado en un antfgeno, se pueden generar anticuerpos hacia ese epftopo, p.ej., mediante el uso de las tecnicas descritas en la presente memoria. La generacion y caracterizacion de anticuerpos tambien puede proporcionar

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informacion sobre los epftopos deseables. A partir de esta informacion, es posible cribar de manera competitiva anticuerpos en funcion de la union al mismo epftopo. Una aproximacion para conseguir esto es llevar a cabo estudios de competicion cruzada para hallar anticuerpos que se unen de manera competitiva entre sf, es decir, los anticuerpos compiten por la union al antigeno. Un proceso de alto rendimiento para "clasificar" anticuerpos basandose en su competicion cruzada se describe en la publicacion PCT N° WO 03/48731.

La expresion "lmea germinal" se refiere a las secuencias de nucleotidos de los genes de anticuerpos y de los segmentos genicos tal como pasan de los padres a la descendencia por medio de las celulas germinales. La secuencia de la lmea germinal se distingue de las secuencias de nucleotidos que codifican los anticuerpos en las celulas B maduras que se han alterado por la recombinacion y los eventos de hipermutacion durante el transcurso de la maduracion de las celulas B.

La expresion "celula hospedadora" se refiere a una celula en la que se ha introducido un vector de expresion. La expresion abarca no solamente la celula individual particular, sino tambien la progenie de tal celula. Debido a que se pueden dar ciertas modificaciones en las generaciones sucesivas debido a mutaciones o influencias ambientales, tal progenie puede no ser identica a la celula original, pero todavfa se incluye dentro del alcance de la expresion "celula hospedadora". La expresion "anticuerpo humano" se refiere a un anticuerpo que consiste en secuencias de aminoacidos de secuencias de inmunoglobulinas humanas solamente. Un anticuerpo humano puede contener cadenas de carbohidratos murinas si se produce en un raton, en una celula de raton o en un hibridoma derivado de una celula de raton. Se pueden preparar anticuerpos humanos de una diversidad de maneras conocidas en la tecnica.

La expresion "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo quimerico que contiene residuos de aminoacidos derivados de secuencias de anticuerpos humanos. Un anticuerpo humanizado puede contener algunas o todas las CDRs de un anticuerpo animal no humano, mientras la region estructural y las regiones constantes del anticuerpo contienen residuos de aminoacidos derivados de secuencias de anticuerpos humanos.

El termino "mairnfero" se refiere a cualquier especie animal de la clase Mammalia. Los ejemplos de mairnferos incluyen: seres humanos; animales de laboratorio tales como ratas, ratones, simios y conejillos de Indias; animales domesticos tales como gatos, perros, conejos, ganado bovino, ovejas, cabras, caballos, y cerdos; y animales salvajes capturados tales como leones, tigres, elefantes, y similares.

La expresion "acido nucleico aislado" se refiere a una molecula de acido nucleico de origen genomico, cADN, o sintetico, o una combinacion de las mismas, que esta separada de otras moleculas de acido nucleico presentes en la fuente natural del acido nucleico. Por ejemplo, con respecto al ADN genomico, el termino "aislado" incluye las moleculas de acido nucleico que estan separadas del cromosoma con el que el ADN genomico esta asociado de manera natural. Preferiblemente, un acido nucleico "aislado" esta exento de las secuencias que flanquean de manera natural al acido nucleico (es decir, las secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del acido nucleico de interes) en el ADN genomico del organismo del cual procede el acido nucleico.

La expresion "anticuerpo aislado" o "molecula de union aislada" se refiere a un anticuerpo o una molecula de union que: (1) no esta asociada a componentes asociados de manera natural que la acompanan en su estado nativo; (2) esta exenta de otras protemas de la misma especie; (3) es expresada por una celula de una especie diferente; o (4) no se da en la naturaleza. Los ejemplos de anticuerpos aislados incluyen un anticuerpo hacia OX40R que se ha purificado por afinidad mediante el uso de OX40R, un anticuerpo hacia OX40R que se ha generado mediante hibridomas u otra lmea celular in vitro, y un anticuerpo hacia OX40R humano derivado de un animal transgenico.

El termino "Kd" se refiere a la constante de disociacion en equilibrio de una interaccion anticuerpo-antfgeno particular, y se usa para describir la afinidad de union entre un ligando (tal como un anticuerpo) y una protema (tal como el OX40R). Cuanto menor sea la constante de disociacion en equilibrio, mas fuertemente estara unido el ligando, o mayor sera la afinidad entre el ligando y la protema. Una Kd se puede medir mediante resonancia de plasmones superficiales, por ejemplo mediante el uso del sistema BIACORE™. Se describe un procedimiento de ensayo mediante el uso del sistema BIACORE™ (ensayo BIAcore) en la seccion de Ejemplos de esta descripcion.

La expresion "velocidad de disociacion" o "kd" se refiere a la constante de la velocidad de disociacion de una interaccion anticuerpo-antfgeno particular. Una constante de la velocidad de disociacion se puede medir mediante resonancia de plasmones superficiales, por ejemplo mediante el uso del BIACORE™.

La expresion "anticuerpo hacia OX40R" se refiere a un anticuerpo, como se define en la presente memoria, capaz de unirse al OX40R humano.

Las expresiones "receptor OX40" y "OX40R" se usan de manera intercambiable en la presente solicitud, e incluyen el OX40R humano, asf como las variantes, isoformas, y homologos de especie del mismo. Por lo tanto, las moleculas de union humanas descritas en la presente memoria tambien se pueden unir, en ciertos casos, al OX40R de especies distintas de la humana. En otros casos, las moleculas de union pueden ser completamente espedficas para el OX40R humano, y pueden no exhibir reactividad cruzada de especie o de otro tipo.

La expresion "se une de manera espedfica al OX40R humano", en referencia a la interaccion de una molecula de

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union, p.ej. un anticuerpo, con su pareja de union, p.ej. un antigeno, significa que la Kd de una molecula de union para la union a CD40, CD137, o CD271 es mayor de 100 veces la Kd para su union al OX40R humano, tal como se determina en un ensayo in vitro.

El termino "vector" se refiere a una molecula de acido nucleico capaz de transportar otra molecula de acido nucleico a una celula hospedadora. Los ejemplos de vectores incluyen plasmidos, vectores virales, ADN desnudo o vectores de expresion de ARN, cosmidos o vectores de fagos. Algunos vectores pueden llevar a cabo una replicacion autonoma en una celula hospedadora en la que se introducen (p.ej., vectores bacterianos que tienen un origen de replicacion bacteriano y vectores episomicos de mairnferos). Algunos vectores se pueden integrar en el genoma de una celula hospedadora tras la introduccion en la celula hospedadora, y por lo tanto se replican junto con el genoma del hospedador (p.ej., vectores no episomicos de mamfferos). Algunos vectores son capaces de dirigir la expresion de los genes a los que estan unidos de forma operable, y por lo tanto se pueden denominar "vectores de expresion".

Tal como se usa en la presente memoria, los veinte aminoacidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Vease Immunology - A Synthesis (2a Edicion, E.S. Golub y D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, MA (1991)).

Moleculas de union que se unen al OX40R humano

La presente descripcion proporciona moleculas de union aisladas que se unen al OX40R humano, que incluyen anticuerpos hacia OX40R, fragmentos de union al antfgeno de los anticuerpos hacia OX40R, y derivados de los anticuerpos hacia OX40R. Las moleculas de union se caracterizan por al menos una de las propiedades funcionales siguientes: (a) se unen al OX40R humano con una Kd de 1 x 10"6 M o menos; (b) tienen actividad agonista sobre el OX40R humano; (c) no se unen al receptor CD40 a una concentracion de hasta 500 nM; (d) no se unen al receptor CD137 a concentraciones de hasta 500 nM; (e) no se unen al receptor CD271 a concentraciones de hasta 500 nM; (f) son capaces de estimular la produccion de IL-2 por las celulas T humanas aisladas; (g) son capaces de estimular una respuesta inmunitaria; (h) son capaces de inhibir el crecimiento de celulas tumorales; y (i) tienen un efecto terapeutico sobre un cancer. En ciertas realizaciones, la molecula de union se une al OX40R humano con una Kd de 1 x 10"7 M o menos, o 1 x 10"8 M o menos, o 5 x 1 x 10"9 M o menos.

Anticuerpos hacia OX40R humanos

En un primer aspecto, la presente descripcion proporciona un anticuerpo humano que se une al OX40R humano. En ciertas realizaciones, el anticuerpo humano es un anticuerpo monoclonal que se une de manera espedfica al OX40R humano con una Kd de 100 nM o menos, preferiblemente 10 nM o menos, y tiene actividad agonista sobre el OX40R humano. Un ejemplo de tales anticuerpos humanos es el anticuerpo monoclonal humano 11D4. La secuencia de aminoacidos de la cadena pesada y la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada (Vh) del anticuerpo 11D4 se muestran en SEQ ID N°s: 9 y 7, respectivamente. La secuencia de aminoacidos de la cadena ligera y la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena ligera (Vl) del anticuerpo 11D4 se muestran en SEQ ID N°s: 10 y 8, respectivamente. Los isotipos del anticuerpo 11D4 son IgG2 para la cadena pesada y Kappa para la cadena ligera. Los alotipos del anticuerpo 11D4 son G2(n-) para la cadena pesada y Km3 para la cadena ligera. Las secuencias de aminoacidos de las cadenas pesada y ligera maduras derivan de la traduccion conceptual de las secuencias de ADN en las construcciones de expresion. El anticuerpo 11D4 no contiene mutaciones de la region estructural en la cadena pesada o la cadena ligera, pero contiene una mutacion en la CDR2 de la cadena pesada.

Otro anticuerpo ilustrativo de la descripcion es el anticuerpo monoclonal humano 18D8. La secuencia de aminoacidos de la region Vh y de la region Vl del anticuerpo 18D8 se muestran en SEQ ID N°s: 19 y 20, respectivamente. La secuencia de aminoacidos de la cadena pesada y de la cadena ligera se muestran en sEq ID N°s: 21 y 22, respectivamente.

Dado que 11D4 y 18D8 se unen al OX40R, las secuencias Vh y Vl de cada uno de ellos se pueden "mezclar y acoplar" con otros anticuerpos hacia OX40R para crear anticuerpos adicionales. La union de tales anticuerpos "mezclados y acoplados" al OX40R se puede ensayar mediante el uso de los ensayos de union conocidos en la tecnica, que incluyen un ensayo descrito en los Ejemplos. En un caso, cuando se mezclan y se acoplan las regiones Vh y Vl, se sustituye una secuencia Vh de un emparejamiento Vh/Vl particular con una secuencia Vh estructuralmente similar. De forma similar, en otro caso se sustituye una secuencia Vl de un emparejamiento Vh/Vl particular con una secuencia Vl estructuralmente similar.

Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la descripcion proporciona un anticuerpo hacia OX40R aislado que comprende: (1) una region variable de la cadena pesada del anticuerpo 11D4 o 18D8, (2) una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos de SEQ ID N°s: 7 o 19, o (3) una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acido nucleico de SEQ ID N°s: 11 o 23. En algunas otras realizaciones, la descripcion proporciona un anticuerpo hacia OX40R aislado que comprende: (1) una region variable de la cadena ligera del anticuerpo 11D4 o 18D8, (2) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos de SEQ ID N°s: 8 o 20, o (3) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acido nucleico de

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SEQ ID N°s: 12 o 24.

En otro aspecto, la descripcion proporciona anticuerpos que comprenden las CDR1, CDR2, y CDR3 de la region variable de la cadena pesada (Vh) y CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de 11D4 o 11D8. Las secuencias de aminoacidos de la cDr1 de Vh, CdR2 de Vh, y CDR3 de Vh de 11D4 se muestran en SEQ ID N°s: 1, 2, y 3, respectivamente. Las secuencias de aminoacidos de la CDR1 de Vl, CDR2 de Vl, y CDR3 de Vl del anticuerpo 1lD4 se muestran en SEQ ID N°s: 4, 5, y 6, respectivamente. Las secuencias de aminoacidos de la CDR1 de Vh, CDR2 de Vh, y CDR3 de Vh del anticuerpo 18D8 se muestran en SEQ ID N°s: 13, 14, y 15, respectivamente. Las secuencias de aminoacidos de la CDR1 de Vl, CDR2 de Vl, y CDR3 de Vl del anticuerpo 18D8 se muestran en SEQ ID N°s: 16, 17, y 18, respectivamente. Las regiones CDR se definen mediante el uso del sistema de Kabat (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edicion, Departamento de Salud y Servicios Sociales de EE.UU., publicacion del NIH N° 91-3242).

Dado que 11D4 y 18D8 se unen al OX40R humano y que la especificidad de union al antigeno se proporciona principalmente por las regiones CDR1, CDR2, y cDr3, las secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de Vh y las secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de Vl se pueden "mezclar y acoplar" para crear anticuerpos hacia OX40R adicionales. Por ejemplo, las CDRs de diferentes anticuerpos hacia OX40R se pueden mezclar y acoplar, aunque cada anticuerpo contendra en general una CDR1, CDR2, y CDR3 de Vh y una CDR1, CDR2, y CDR3 de Vl. La union de tales anticuerpos "mezclados y acoplados" al OX40R se puede ensayar mediante el uso de los ensayos de union descritos anteriormente y en los Ejemplos (p.ej., ELISAs, analisis Biacore). En un caso, cuando se mezclan y acoplan las secuencias de cDr de Vh, la secuencia CDR1, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia Vh particular se sustituye con secuencia(s) de CDR estructuralmente similar(es). De forma similar, cuando se mezclan y acoplan las secuencias de CDR de Vl, la secuencia de CDR1, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia Vl particular se sustituye en general con secuencia(s) de CDR estructuralmente similar(es). Sera facilmente evidente para un tecnico experto que se pueden crear secuencias Vh y Vl nuevas sustituyendo una o mas secuencias de regiones de CDR de Vh y/o Vl con secuencias estructuralmente similares a partir de las secuencias de CDR descritas en la presente memoria.

Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la descripcion proporciona (1) un anticuerpo monoclonal aislado que comprende al menos una CDR seleccionada de CDR1 de Vh, CDR2 de Vh, o CDR3 de Vh del anticuerpo 11D4 o 18D8. En algunas otras realizaciones, la descripcion proporciona un anticuerpo monoclonal aislado que comprende al menos una CDR seleccionada de CDR1 de Vl, CDR2 de Vl o CDR3 de Vl del anticuerpo 11D4 o 18D8. En ciertas realizaciones adicionales, la descripcion proporciona un anticuerpo monoclonal aislado que comprende al menos una CDR seleccionada de: una CDR1 de Vh que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID N°s: 1 o 13, o una secuencia que difiere de SEQ ID N°s: 1 o 3 en 1, 2, 3, o 4 sustituciones conservativas de aminoacidos; una CDR2 de Vh que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID N°s: 2 o 14 o una secuencia que difiere de SEQ ID N°s: 2 o 14 en 1, 2, 3, o 4 sustituciones conservativas de aminoacidos; y una CDR3 de Vh que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID N°s: 3 o 15 o una secuencia que difiere de SEQ ID N°s: 3 o 15 en 1, 2, 3, o 4 sustituciones conservativas de aminoacidos.

En ciertas realizaciones adicionales, la descripcion proporciona un anticuerpo monoclonal aislado que comprende al menos una CDR seleccionada de: una CDR1 de Vl que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID N°s: 4 o 16 o una secuencia que difiere de SEQ ID N°s: 4 o 16 en 1, 2, 3, o 4 sustituciones conservativas de aminoacidos; una CDR2 de Vl que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID N°s: 5 o 17 o una secuencia que difiere de SEQ ID N°s: 5 o 17 en 1, 2, 3, o 4 sustituciones conservativas de aminoacidos; y una CDR3 de Vl que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID N°s: 6 o 18 o una secuencia que difiere de SEQ ID N°s: 6 o 18 en 1, 2, 3, o 4 sustituciones conservativas de aminoacidos.

En ciertos casos, la lisina C-terminal de la cadena pesada de un anticuerpo hacia OX40R esta escindida (Harris R. J., J. of Chromatography, 705: 129-134 (1995)). La(s) cadena(s) pesada(s) y/o ligera(s) de los anticuerpos hacia OX40R pueden incluir opcionalmente una secuencia senal.

La clase (p.ej., IgG, IgM, IgE, IgA, o IgD) y la subclase (p.ej., IgG1, IgG2, IgG3, o IgG4) de los anticuerpos hacia OX40R se pueden determinar mediante cualquier metodo adecuado. En general, la clase y la subclase de un anticuerpo se pueden determinar mediante el uso de anticuerpos que son espedficos para una clase y subclase particular de anticuerpo. Tales anticuerpos estan disponibles comercialmente. La clase y la subclase se pueden determinar mediante ELISA o transferencia de Western, asf como con otras tecnicas. De manera alternativa, la clase y la subclase se pueden determinar secuenciando todo o una porcion de los dominios constantes de las cadenas pesadas y/o ligeras de los anticuerpos, comparando sus secuencias de aminoacidos con las secuencias de aminoacidos conocidas de diversas clases y subclases de inmunoglobulinas, y determinando la clase y la subclase de los anticuerpos. Los anticuerpos hacia OX40R pueden ser una molecula de IgG, una IgM, una IgE, una IgA, o una IgD. Por ejemplo, los anticuerpos hacia OX40R pueden ser una IgG que es una subclase IgG1, IgG2, IgG3, o IgG4. Asf, otro aspecto de la descripcion proporciona un metodo para convertir la clase o la subclase de un anticuerpo hacia OX40R en otra clase o subclase. En algunos casos, una molecula de acido nucleico que codifica una Vl o Vh que no incluye secuencias que codifican Cl o Ch se afsla mediante el uso de metodos muy conocidos en la tecnica. La molecula de acido nucleico se une despues de forma operable a una secuencia de acido nucleico que codifica una Cl o Ch de una clase o subclase de inmunoglobulina deseada. Esto se puede llevar a cabo mediante el uso de un vector o molecula de acido nucleico que comprende una cadena Cl o Ch, como se describio anteriormente. Por

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ejemplo, a un anticuerpo hacia OX40R que era en principio IgM se le puede cambiar la clase a una IgG. Ademas, el cambio de clase se puede usar para convertir una subclase de IgG en otra, p.ej., de IgG1 a IgG2. Otro metodo para producir un anticuerpo que comprende un isotipo deseado comprende las etapas de aislar un acido nucleico que codifica una cadena pesada de un anticuerpo hacia OX40R y un acido nucleico que codifica una cadena ligera de un anticuerpo hacia OX40R, aislar la secuencia que codifica la region Vh, ligar la secuencia de Vh a una secuencia que codifica un dominio constante de la cadena pesada del isotipo deseado, expresar la construccion del gen de la cadena ligera y de cadena pesada en una celula, y recoger el anticuerpo hacia OX40R con el isotipo deseado.

Fragmentos de union al antigeno

En otro aspecto, la presente descripcion proporciona fragmentos de union al antfgeno de cualquiera de los anticuerpos hacia OX40R humanos como se describio anteriormente en la presente memoria. En ciertas realizaciones, el fragmento de union al antfgeno se selecciona de: (1) una cadena ligera de un anticuerpo hacia OX40R; (2) una cadena pesada de un anticuerpo hacia OX40R; (3) una region variable de la cadena ligera de un anticuerpo hacia OX40R; (4) una region variable de la cadena pesada de un anticuerpo hacia OX40R; (5) una o mas CDRs (dos, tres, cuatro, cinco, o seis CDRs) de un anticuerpo hacia OX40R; o (6) tres CDRs de la cadena ligera y tres CDRs de la cadena pesada de un anticuerpo hacia OX40R. En ciertas realizaciones particulares, la descripcion proporciona un fragmento de union al antfgeno del anticuerpo 11D4 o 18D8. En algunas otras realizaciones particulares, los fragmentos de union al antfgeno de un anticuerpo hacia OX40R incluyen: (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios Vl, Vh, Cl y Ch1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la region de la bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios Vh y Ch1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios Vl y Vh de un unico brazo de un anticuerpo; (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio Vh; (vi) una CDR aislada, y (vii) un anticuerpo de cadena simple (scFv), que es un polipeptido que comprende una region VL de un anticuerpo unida a una region VH de un anticuerpo. Bird et al., (1988) Science 242:423-426 y Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883. Un fragmento de union al antfgeno puede comprender tambien dos o mas fragmentos mas cortos, de la misma cadena pesada o de la misma cadena ligera, o de cadenas diferentes. Los fragmentos de union al antfgeno, tales como los fragmentos Fab y F(ab')2, se pueden preparar a partir de anticuerpos completos mediante el uso de tecnicas convencionales, tales como digestion con papama o pepsina, respectivamente, de anticuerpos completos. Tambien se pueden obtener mediante el uso de tecnicas de ADN recombinante, como se describe en la presente memoria.

Derivados de anticuerpos

En ciertos aspectos adicionales, la presente descripcion proporciona derivados de cualquiera de los anticuerpos hacia OX40R como se describio anteriormente en la presente memoria.

En un aspecto particular, el derivado de anticuerpo deriva de modificaciones de las secuencias de aminoacidos de 11D4 o 18D8. Se pueden modificar las secuencias de aminoacidos de cualquier region de las cadenas de anticuerpos, tales como las regiones estructurales, las regiones CDR, o las regiones constantes. Las modificaciones se pueden introducir mediante metodos habituales conocidos en la tecnica, tales como la mutagenesis dirigida y la mutagenesis aleatoria mediada por PCR, y pueden comprender aminoacidos naturales y no naturales.

Los tipos de modificaciones incluyen sustituciones, inserciones, deleciones, o combinaciones de las mismas, de uno o mas aminoacidos de un anticuerpo hacia OX40R. En ciertas realizaciones, el derivado de anticuerpo comprende 1, 2, 3, o 4 sustituciones de aminoacidos en las CDRs de la cadena pesada y/o una sustitucion de aminoacidos en las CDRs de la cadena ligera. En ciertas realizaciones, un derivado de un anticuerpo hacia OX40R comprende una o mas sustituciones de aminoacidos respecto de la secuencia de aminoacidos de la lmea germinal del gen humano. En una realizacion particular, una o mas de esas sustituciones de la lmea germinal estan en la region CDR2 de la cadena pesada. En otra realizacion particular, las sustituciones de aminoacidos respecto de la lmea germinal estan en una o mas de las mismas posiciones que las sustituciones respecto de la lmea germinal en los anticuerpos 11D4 o 18D8. En otra realizacion, la sustitucion de aminoacidos es el cambio de una o mas cistemas en un anticuerpo por otro residuo, tal como, sin limitacion, alanina o serina. La cistema puede ser una cistema canonica o no canonica. La sustitucion se puede hacer en una CDR o una region estructural de un dominio variable o en el dominio constante de un anticuerpo. Otro tipo de sustitucion de aminoacidos es eliminar pares asparagina-glicocola, que forman sitios de desamidacion potenciales, alterando uno o ambos residuos. Aun en otras realizaciones, la sustitucion de aminoacidos es una sustitucion conservativa de aminoacidos. En una realizacion, el derivado de anticuerpo tiene 1, 2, 3, o 4 sustituciones conservativas de aminoacidos en las regiones CDR de la cadena pesada respecto de las secuencias de aminoacidos de 11D4 o 18D8.

Otro tipo de modificacion de un anticuerpo hacia OX40R es la alteracion del patron de glicosilacion original del anticuerpo. El termino "alteracion" se refiere a la delecion de uno o mas restos de carbohidratos hallados en el anticuerpo, y/o la adicion de uno o mas sitios de glicosilacion que no estan presentes en el anticuerpo. La glicosilacion de los anticuerpos se da en general con union en N. La union en N se refiere a la union del resto de carbohidrato en la cadena lateral de un residuo de asparagina. La adicion de sitios de glicosilacion al anticuerpo se lleva a cabo de manera conveniente alterando la secuencia de aminoacidos de forma que contenga una o mas de las secuencias de tripeptidos anteriormente descritas (para los sitios de glicosilacion con union en N).

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Aun otro tipo de modificacion implica la extraccion de cualquier resto de carbohidrato presente en el anticuerpo, que se puede llevar a cabo qmmicamente o enzimaticamente. La desglicosilacion qmmica requiere la exposicion del anticuerpo a un compuesto, tal como acido trifluorometanosulfonico, o un compuesto equivalente. Este tratamiento da como resultado la escision de la mayor parte o de todos los carbohidratos excepto el carbohidrato de union (N- acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), y al mismo tiempo deja el anticuerpo intacto. La desglicosilacion qmmica se describe en Sojahr, H. T., y Bahl, O. P., Arch. Biochem. Biophys. 259 (1987) 52-57 y en Edge, A. S., et al. Anal. Biochem. 118 (1981) 131-137. La escision enzimatica de los restos de carbohidrato en los anticuerpos se puede llevar a cabo mediante el uso de una diversidad de endo- y exo-glicosidasas como describio Thotakura, N. R., y Bahl, O. P., Meth. Enzymol. 138 (1987) 350-359.

Los ejemplos de otras modificaciones incluyen acetilacion, acilacion, amidacion, entrecruzamiento, ciclacion, formacion de enlaces disulfuro, desmetilacion, formacion de entrecruzamientos covalentes, formacion de cistina, formilacion, hidroxilacion, yodacion, metilacion, miristoilacion, oxidacion, pegilacion, procesamiento proteolttico, fosforilacion, prenilacion, y sulfatacion.

En un aspecto adicional, se proporciona un derivado de anticuerpo que comprende un anticuerpo hacia OX40R, o un fragmento de union al antfgeno del mismo, como se describe en la presente memoria, unido a una entidad molecular adicional. Los ejemplos de entidades moleculares adicionales incluyen agentes farmaceuticos, peptidos o protemas, y agentes de deteccion o marcadores. Los ejemplos espedficos de agentes farmaceuticos que se pueden unir a un anticuerpo hacia OX40R incluyen agentes citotoxicos u otros agentes terapeuticos del cancer, e isotopos radiactivos. Los ejemplos espedficos de peptidos o protemas que se pueden unir a un anticuerpo hacia OX40R incluyen anticuerpos, que pueden ser el mismo anticuerpo hacia OX40R o un anticuerpo diferente. Los ejemplos espedficos de agentes de deteccion o marcadores que se pueden unir a un anticuerpo hacia OX40R incluyen (1) compuestos fluorescentes, tales como fluorescema, isotiocianato de fluorescema, rodamina, cloruro de 5-dimetilamin-1- naftalenosulfonilo, ficoeritrina, y sustancias fosforescentes de lantanidos; (2) enzimas, tales como peroxidasa de rabano, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina, y glucosa oxidasa; (3) biotina; (4) un epftopo polipeptfdico predeterminado reconocido por un indicador secundario, tales como secuencias de pares de cremalleras de leucina, sitios de union para anticuerpos secundarios, dominios de union de metales, y etiquetas de epftopos. En una realizacion particular, el derivado de anticuerpo es un multfmero de anticuerpos hacia OX40R, que es una forma multimerica de un anticuerpo hacia OX40R, tal como dfmeros de anticuerpos, tnmeros, o multfmeros de orden superior de anticuerpos monomericos. Los monomeros individuales en un multfmero de anticuerpos pueden ser identicos o diferentes, es decir, pueden ser multfmeros de anticuerpos heteromericos u homomericos. Los anticuerpos individuales en un multimero pueden tener especificidades de union iguales o diferentes. La multimerizacion de anticuerpos se puede llevar a cabo por medio de la agregacion natural de anticuerpos. Por ejemplo, cierto porcentaje de preparaciones de anticuerpos purificados (p.ej., moleculas IgG1 purificadas) forman espontaneamente agregados de protemas que contienen homodfmeros de anticuerpos, y otros multfmeros de orden superior de anticuerpos. De manera alternativa, los homodfmeros de anticuerpos se pueden formar por medio de metodos de union qmmica conocidos en la tecnica, tal como por medio del uso de agentes de entrecruzamiento heterobifuncionales. Los entrecruzadores adecuados incluyen los que son heterobifuncionales, que tienen dos grupos reactivos diferentes separados por un espaciador adecuado (tal como ester de m-maleimidobenzoil-N- hidroxisuccinimida, 4-(maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo, y S-acetiltio-acetato de N- succinimidilo) u homobifuncionales (tal como suberato de disuccinimidilo). Tales entrecruzadores estan disponibles comercialmente de Pierce Chemical Company, Rockford, IL. Los anticuerpos se pueden producir tambien para multimerizar por medio de metodos de ADN recombinante conocidos en la tecnica.

En otro aspecto, el derivado de anticuerpo es un anticuerpo quimerico, que comprende una secuencia de aminoacidos de un anticuerpo hacia OX40R humano descrito anteriormente en la presente memoria. En un ejemplo, se combina una o mas CDRs de un anticuerpo hacia OX40R humano con CDRs de un anticuerpo de un animal no humano, tal como raton o rata. En otro ejemplo, todas las CDRs del anticuerpo quimerico derivan de anticuerpos hacia OX40R humanos. En otro ejemplo, las CDRs de mas de un anticuerpo hacia OX40R humano se combinan en un anticuerpo quimerico. Ademas, un anticuerpo quimerico puede comprender las regiones estructurales derivadas de un anticuerpo hacia OX40R humano y una o mas CDRs de uno o mas anticuerpos humanos diferentes. Se pueden generar anticuerpos quimericos mediante el uso de metodos convencionales conocidos en la tecnica. En ciertas realizaciones particulares, el anticuerpo quimerico comprende una, dos, o tres CDRs de la region variable de la cadena pesada o de la region variable de la cadena ligera de un anticuerpo seleccionado del anticuerpo 11D4 o 18D8.

Los ejemplos de otros derivados de anticuerpos proporcionados por la presente descripcion incluyen anticuerpos de cadena simple, diacuerpos, anticuerpos de un dominio, nanocuerpos, y unicuerpos. Un "anticuerpo de cadena simple" (scFv) consiste en una cadena polipeptfdica simple que comprende un dominio Vl unido a un dominio Vh en el que el dominio Vl y el dominio Vh estan emparejados para formar una molecula monovalente. Se puede preparar un anticuerpo de cadena simple segun el metodo conocido en la tecnica (vease, por ejemplo, Bird et al., (1988) Science 242:423-426 y Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Un "diacuerpo" consiste en dos cadenas, y cada cadena comprende una region variable de la cadena pesada conectada a una region variable de la cadena ligera en la misma cadena polipeptfdica conectadas mediante un ligador peptfdico corto, en el que las dos regiones de la misma cadena no se emparejan entre sf, sino con los dominios complementarios de la otra

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cadena para formar una molecula biespedfica. Los metodos para preparar diacuerpos se conocen en la tecnica (Vease, p.ej., Holliger P. et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, y Poljak R. J. et al., (1994) Structure 2:1121-1123). Los anticuerpos de un dominio (dAbs) son unidades de union funcionales pequenas de anticuerpos, que corresponden a las regiones variables de las cadenas pesadas o ligeras de los anticuerpos. Los anticuerpos de un dominio se expresan en sistemas de celulas bacterianas, de levadura, y de mairnfero. Se conocen en la tecnica los detalles adicionales sobre los anticuerpos de un dominio y los metodos de produccion de los mismos (vease, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N°s 6.291.158; 6.582.915; 6.593.081; 6.172.197; 6.696.245; las patentes europeas 0368684 y 0616640; los documentos WO05/035572, WO04/101790, WO04/081026, WO04/058821, WO04/003019 y WO03/002609. Los nanocuerpos derivan de las cadenas pesadas de un anticuerpo. Un nanocuerpo comprende en general un unico dominio variable y dos dominios constantes (CH2 y CH3) y conserva la capacidad de union al antigeno del anticuerpo original. Los nanocuerpos se pueden preparar mediante metodos conocidos en la tecnica (Vease, p.ej., la patente de EE.UU. N° 6.765.087, patente de EE.UU. N° 6.838.254, el documento WO 06/079372). Los unicuerpos consisten en una cadena ligera y una cadena pesada de un anticuerpo IgG4. Los unicuerpos se pueden producir mediante la extraccion de la region bisagra de los anticuerpos IgG4. Se pueden hallar detalles adicionales sobre los unicuerpos y los metodos para prepararlos en el documento WO2007/059782.

Metodos de produccion de las moleculas de union

Las moleculas de union como se describen en la presente memoria se pueden producir mediante metodos conocidos en la tecnica, que incluyen la metodologfa convencional de anticuerpos monoclonales, p.ej., la tecnica de hibridacion de celulas somaticas estandar de Kohler y Milstein (Nature 256: 495, (1975)), asf como otras tecnicas, tales como transformacion viral u oncogenica de linfocitos B.

Inmunizacion de animales no humanos

La descripcion tambien proporciona un metodo para producir anticuerpos hacia OX40R o fragmentos de union al antfgeno de los mismos, que comprende inmunizar un animal no humano que comprende loci de inmunoglobulinas humanas con un antfgeno de OX40R, y aislar el anticuerpo del animal inmunizado o de las celulas derivadas del animal inmunizado.

Los ejemplos de animales no humanos adecuados incluyen un animal transgenico o transcromosomico, tales como HuMAb Mouse®, KM Mouse®, "ratones TC", y Xenomouse™. El HuMAb Mouse® (Medarex, Inc.) contiene miniloci de genes de inmunoglobulinas humanas que codifican secuencias de inmunoglobulinas de la cadena pesada (|j y y) y ligera k humanas sin reordenar, junto con mutaciones seleccionadas que inactivan los loci de las cadenas j y k endogenas (vease p.ej., Lonberg, et al. (1994) Nature 368: 856-859). Por lo tanto, los ratones exhiben una expresion reducida de IgM o k de raton, y en respuesta a la inmunizacion, los transgenes de las cadenas pesada y ligera humanas introducidas experimentan un cambio de clase y una mutacion somatica para generar anticuerpos monoclonales IgGK humanos de afinidad elevada (Vease, p.ej., Harding, F. y Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546). La preparacion y el uso del HuMAb Mouse®, y las modificaciones genomicas portadas por tales ratones, se conocen bien en la tecnica (Vease, p.ej., Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851). Los ratones KM™ portan un transgen de la cadena pesada humana y un transcromosoma de la cadena ligera humana, y se describen con detalle en el documento WO 02/43478. El Xenomouse™ (Abgenix, Inc.) contiene fragmentos grandes de los loci de inmunoglobulinas humanas y carecen de produccion de anticuerpos de raton. Este modelo animal se conoce bien en la tecnica (Veanse, p.ej., las patentes de EE.UU. N°s: 5.939.598; 6.075.181; 6.114.598; 6.150.584; y 6.162.963). Los "ratones TC" tambien son ratones modificados que portan tanto un transcromosoma de la cadena pesada humana como un transcromosoma de la cadena ligera humana. Tales ratones se describen en Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727.

El antfgeno de OX40R para el uso para inmunizar al animal puede ser OX40R aislado y/o purificado, y es preferiblemente un OX40R humano. En una realizacion, el antfgeno de OX40R es un fragmento del OX40R humano, preferiblemente el dominio extracelular del OX40R. En otra realizacion, el antfgeno de OX40R es un fragmento que comprende al menos un epftopo del OX40R humano. En otra realizacion, el antfgeno de OX40R es una celula que expresa OX40R en su superficie celular, mas en particular una celula que sobreexpresa el OX40R en su superficie celular. La inmunizacion de los animales se puede llevar a cabo mediante cualquier metodo adecuado conocido en la tecnica. (Vease, p.ej., Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Press, 1990). Los metodos particulares para inmunizar animales no humanos tales como ratones, ratas, ovejas, cabras, cerdos, ganado bovino y caballos se conocen bien en la tecnica (Vease, p.ej., Harlow y Lane (1990); pat. de EE.UU. n° 5.994.619). El Ejemplo 1 proporciona un metodo para inmunizar ratones HuMab.

Tras la inmunizacion del animal con un antfgeno de OX40R, se pueden obtener anticuerpos y/o celulas que producen anticuerpos del animal. En una realizacion, se obtiene suero del animal y se puede obtener una fraccion de inmunoglobulinas a partir del suero, o se pueden purificar los anticuerpos hacia OX40R a partir del suero.

Los anticuerpos hacia OX40R se pueden producir tambien mediante el uso de celulas inmortalizadas que producen anticuerpos preparadas a partir de celulas aisladas del animal inmunizado. Tras la inmunizacion, se recogen las celulas B de los nodulos linfaticos y/o esplenicas del animal y se inmortalizan mediante medios adecuados. Los metodos para inmortalizar celulas incluyen, pero sin limitacion, transfectarlas con oncogenes, infectarlas con un virus

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oncogenico y cultivarlas en condiciones que seleccionan las celulas inmortalizadas, someterlas a compuestos carcinogenos o mutagenos, fusionarlas con una celula inmortalizada, p.ej., una celula de mieloma, e inactivarlas con un gen inhibidor de tumores (Vease, p.ej., Harlow y Lane, anteriormente mencionados). En una realizacion particular, las celulas B esplenicas recogidas del animal inmunizado se fusionan con celulas de mieloma inmortalizadas para formar hibridomas inmortalizados que producen anticuerpos. Las celulas de mieloma preferiblemente no secretan polipeptidos de inmunoglobulinas (una lmea celular no secretora). Los hibridomas inmortalizados se criban mediante el uso del antigeno de OX40 (p.ej., el OX40R, una porcion del mismo, o una celula que expresa el OX40R). El cribado inicial se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante el uso de un inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA) o un radioinmunoensayo. Un ejemplo de cribado mediante ELISA se describe en el documento WO 00/37504.

Las celulas que producen anticuerpos hacia OX40R, p.ej. hibridomas, se seleccionan, se clonan, y se criban adicionalmente en busca de caractensticas deseables, que incluyen un crecimiento robusto, una produccion elevada de anticuerpos, y caractensticas de los anticuerpos deseables, tal como se discute adicionalmente mas adelante. Los hibridomas se pueden expandir in vivo en animales singenicos, en animales que carecen de sistema inmunitario, p.ej., ratones atfmicos, o en cultivo celular in vitro.

As^ se proporcionan metodos para producir una celula que produce un anticuerpo monoclonal humano hacia OX40R o un fragmento de union al antigeno del mismo, que comprende: (a) inmunizar un animal transgenico no humano con un antfgeno de OX40R; (b) permitir que el animal genere una respuesta inmunitaria hacia el antfgeno de OX40R; (c) aislar las celulas que producen anticuerpos del animal; y (d) inmortalizar las celulas que producen anticuerpos. En una realizacion, el metodo comprende ademas (e) crear poblaciones monoclonales individuales de las celulas que producen anticuerpos inmortalizadas; y (f) cribar las celulas que producen anticuerpos inmortalizadas que producen un anticuerpo hacia OX40R deseado.

Acidos nucleicos, vectores, celulas hospedadoras, y metodos recombinantes para producir anticuerpos hacia OX40R

Otro aspecto de la descripcion proporciona una molecula de acido nucleico aislada que codifica una secuencia de aminoacidos de una molecula de union que se une al OX40R humano. La secuencia de aminoacidos codificada por la molecula de acido nucleico puede ser cualquier porcion de un anticuerpo intacto, tal como una CDR, una secuencia que comprende una, dos o tres CDRs, o una region variable de una cadena pesada o de una cadena ligera, o puede ser una cadena pesada o cadena ligera de longitud completa. En ciertas realizaciones, la molecula de acido nucleico codifica una secuencia de aminoacidos que comprende (1) una region CDR3, en particular una region CDR3 de la cadena pesada, de los anticuerpos 11D4 o 18D8; (2) una region variable de una cadena pesada o una region variable de una cadena ligera de los anticuerpos 11D4 o 18D8; o (3) una cadena pesada o una cadena ligera de los anticuerpos 11D4 o 18D8. En otras realizaciones, la molecula de acido nucleico codifica un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID N°s: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, y 22. En otras realizaciones, la molecula de acido nucleico se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N°s: 11, 12, 23, y 24.

Las moleculas de acido nucleico proporcionadas por la descripcion se pueden obtener de cualquier fuente que produzca un anticuerpo hacia OX40R. El mARN de las celulas que producen anticuerpos hacia OX40R se puede aislar mediante tecnicas habituales, se puede clonar y/o amplificar mediante el uso de PCR y tecnicas de construccion de bibliotecas, y se puede cribar mediante el uso de protocolos habituales para obtener moleculas de acido nucleico que codifican una secuencia de aminoacidos de un anticuerpo hacia OX40R. El mARN se puede usar para producir cADN para el uso en la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) o para la clonacion de cADN de genes de anticuerpos. En una realizacion, la molecula de acido nucleico se obtiene de un hibridoma que expresa un anticuerpo hacia OX40R, como se describio anteriormente, preferiblemente un hibridoma que tiene como una de sus parejas de fusion una celula de animal transgenico no humano que expresa genes de inmunoglobulinas humanas. En otra realizacion, el hibridoma deriva de un animal no transgenico no humano.

Se puede construir una molecula de acido nucleico que codifica la cadena pesada de un anticuerpo hacia OX40R fusionando una molecula de acido nucleico que codifica la region variable pesada con una molecula de acido nucleico que codifica una region constante de una cadena pesada. De forma similar, se puede construir una molecula de acido nucleico que codifica la cadena ligera de un anticuerpo hacia OX40R fusionando una molecula de acido nucleico que codifica la region variable de la cadena ligera con una molecula de acido nucleico que codifica una region constante de una cadena ligera. Las moleculas de acido nucleico que codifican las cadenas VH y VL se pueden convertir en genes de anticuerpos de longitud completa insertandolos en vectores de expresion que ya codifican las regiones constantes de la cadena pesada y las regiones constantes de la cadena ligera, respectivamente, de forma que el segmento VH esta unido de forma operable a el/los segmento(s) de la region constante de la cadena pesada (CH) en el vector y el segmento VL esta unido de forma operable al segmento de la region constante de la cadena ligera (CL) en el vector. De manera alternativa, las moleculas de acido nucleico que codifican las cadenas VH o VL se convierten en genes de anticuerpos de longitud completa mediante la union, p.ej., ligadura, de la molecula de acido nucleico que codifica una cadena VH a una molecula de acido nucleico que codifica una cadena CH mediante el uso de tecnicas de biologfa molecular habituales. Esto mismo se puede llevar a cabo mediante el uso de moleculas de acido nucleico que codifican las cadenas VL y CL. Las secuencias de los genes de la region constante de las cadenas pesadas y ligeras humanas se conocen en la tecnica. Vease, p.ej., Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., publ. del NIH N° 91-3242, 1991. Las moleculas

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de acido nucleico que codifican las cadenas pesadas y/o ligeras de longitud completa se pueden expresar entonces a partir de una celula en la que se han introducido, y se puede aislar el anticuerpo hacia OX40R.

Las moleculas de acido nucleico se pueden usar para expresar de manera recombinante grandes cantidades de anticuerpos hacia OX40R, como se describe mas adelante. Las moleculas de acido nucleico se pueden usar tambien para producir otras moleculas de union proporcionadas por la descripcion, tales como anticuerpos quimericos, anticuerpos de cadena simple, inmunoadhesinas, diacuerpos, anticuerpos mutados, y derivados de anticuerpos, como se describe en otra parte en la presente memoria. En una realizacion, se usa una molecula de acido nucleico como sonda o cebador de PCR para secuencias espedficas de anticuerpos. Por ejemplo, se puede usar una sonda de molecula de acido nucleico en metodos de diagnostico o se puede usar un cebador de PCR de molecula de acido nucleico para amplificar regiones de ADN que se podnan usar, entre otros, para aislar secuencias de acido nucleico para el uso en la produccion de regiones variables de los anticuerpos hacia OX40R.

Una vez que se obtienen moleculas de ADN que codifican los segmentos Vh y Vl de un anticuerpo hacia OX40R, estas moleculas de ADN se pueden manipular adicionalmente mediante tecnicas de ADN recombinante, por ejemplo para convertir los genes de la region variable en genes de cadenas de anticuerpos de longitud completa, en genes de fragmentos Fab, o en un gen de scFv. En estas manipulaciones, una molecula de ADN que codifica Vl o Vh se une de forma operable a otra molecula de ADN que codifica otro polipeptido, tal como una region constante de anticuerpo o un ligador flexible. La expresion "unido de forma operable," tal como se usa en este contexto, significa que las dos moleculas de ADN estan unidas de forma que las secuencias de aminoacidos codificadas por las dos moleculas de ADN permanecen en el marco de lectura.

La molecula de ADN aislada que codifica la region Vh se puede convertir en un gen de la cadena pesada de longitud completa uniendo de forma operable la molecula de ADN que codifica Vh a otra molecula de aDn que codifica las regiones constantes de la cadena pesada (CH1, CH2 y CH3). Las secuencias de genes de la region constante de la cadena pesada humana se conocen en la tecnica (vease, p.ej., Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edicion, Departamento de Salud y Servicios Sociales de EE.UU., publicacion del NIH N° 91-3242) y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones se pueden obtener mediante amplificacion por PCR estandar. La region constante de la cadena pesada puede ser una region constante de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM o IgD, pero lo mas preferiblemente es una region constante de IgG1 o IgG2. La secuencia de la region constante de IgG1 puede ser cualquiera de los diversos alelos o alotipos que se sabe que se dan entre individuos diferentes, tales como Gm(1), Gm(2), Gm(3), y Gm(17). Estos alotipos representan sustituciones de aminoacidos que se dan de manera natural en las regiones constantes de IgG1. Para un gen de la cadena pesada del fragmento Fab, el ADN que codifica VH se puede unir de forma operable a otra molecula de ADN que codifica solamente la region constante CH1 de la cadena pesada. La region constante de la cadena pesada CH1 puede derivar de cualquiera de los genes de las cadenas pesadas.

La molecula de ADN aislada que codifica la region Vl se puede convertir en un gen de la cadena ligera de longitud completa (asf como un gen de la cadena ligera de Fab) uniendo de forma operable la molecula de ADN que codifica Vl a otra molecula de ADN que codifica la region constante de la cadena ligera, Cl. Las secuencias de genes de la region constante de la cadena ligera humana se conocen en la tecnica (vease p.ej., Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edicion, Departamento de Salud y Servicios Sociales de EE.UU., publicacion del NIH N° 91-3242) y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones se pueden obtener mediante amplificacion por PCR estandar. La region constante de la cadena ligera puede ser una region constante kappa o lambda. La region constante kappa puede ser cualquiera de los diversos alelos que se sabe que se dan entre individuos diferentes, tales como Inv(1), Inv(2), e Inv(3). La region constante lambda puede derivar de cualquiera de los tres genes lambda.

Para crear un gen de scFv, los fragmentos de ADN que codifican Vh y Vl se unen de forma operable a otro fragmento que codifica un ligador flexible, p.ej., que codifica la secuencia de aminoacidos (Gly4 -Ser)3, de forma que las secuencias Vh y Vl se pueden expresar como una protema de cadena simple contigua, con las regiones Vl y Vh unidas por el ligador flexible (Vease p.ej., Bird et al., (1988) Science 242:423-426; Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554). El anticuerpo de cadena simple puede ser monovalente, si solamente se usa una unica Vh y Vl, bivalente, si se usan dos Vh y Vl, o polivalente, si se usan mas de dos Vh y Vl. Se pueden generar anticuerpos biespedficos o polivalentes que se unen de manera espedfica a OX40R y a otra molecula.

En otro aspecto, la presente descripcion proporciona un vector que comprende una molecula de acido nucleico descrita anteriormente en la presente memoria. La molecula de acido nucleico puede codificar una porcion de una cadena ligera o cadena pesada (tal como una CDR o una region variable), una cadena ligera o pesada de longitud completa, un polipeptido que comprende una porcion o longitud completa de una cadena pesada o ligera, o una secuencia de aminoacidos de un derivado de anticuerpo o fragmento de union al antfgeno. Para expresar una molecula de union, se inserta una molecula de ADN que codifica una molecula de union de longitud parcial o completa en un vector de expresion de forma que la molecula de ADN esta unida de forma operable a secuencias de control transcripcionales y traduccionales. En este contexto, el termino "unido de forma operable" pretende significar que la molecula de ADN se liga en un vector de forma que las secuencias de control transcripcionales y traduccionales del vector cumplen su funcion deseada de regular la transcripcion y la traduccion de la molecula de

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ADN. El vector de expresion y las secuencias de control de la expresion se eligen para que sean compatibles con la celula hospedadora de expresion usada. Los vectores de expresion incluyen, por ejemplo, plasmidos, retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociados (AAV), virus vegetales tales como virus del mosaico de la coliflor, virus del mosaico del tabaco, cosmidos, YACs, y episomas derivados de EBV. La molecula de ADN que codifica una secuencia de aminoacidos de la cadena ligera y la molecula de ADN que codifica una secuencia de aminoacidos de la cadena pesada se pueden insertar en vectores diferentes o en el mismo vector. La molecula de ADN se inserta en el vector de expresion mediante cualquier metodo adecuado (p.ej., ligadura de sitios de restriccion complementarios del fragmento genico del anticuerpo y del vector, o ligadura de extremos romos si no hay presentes sitios de restriccion).

Un ejemplo de un vector de expresion adecuado es uno que codifica una secuencia de inmunoglobulina Ch o Cl humana funcionalmente completa, con sitios de restriccion adecuados modificados de forma que se puede insertar y expresar cualquier secuencia Vh o Vl. El vector de expresion tambien puede codificar un peptido senal que facilita la secrecion de la secuencia de aminoacidos de la cadena de anticuerpo desde una celula hospedadora. El ADN que codifica la secuencia de aminoacidos de una cadena de anticuerpo se puede clonar en el vector de forma que el peptido senal esta unido en el marco de lectura al extremo amino de la secuencia de aminoacidos de la cadena de anticuerpo. El peptido senal puede ser un peptido senal de inmunoglobulina o un peptido senal heterologo (es decir, un peptido senal de una protema que no es una inmunoglobulina).

Ademas de la secuencia de acido nucleico que codifica una secuencia de aminoacidos de un anticuerpo hacia OX40R (genes de las cadenas del anticuerpo), los vectores de expresion portan secuencias reguladoras que controlan la expresion de los genes de las cadenas del anticuerpo en una celula hospedadora. El diseno del vector de expresion, que incluye la seleccion de las secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la eleccion de la celula hospedadora a transformar, el nivel de expresion de la protema deseada, etc. Las secuencias reguladoras para la expresion en una celula hospedadora de mairnfero incluyen elementos virales que dirigen niveles elevados de expresion proteica en las celulas de mamffero, tales como promotores y/o potenciadores derivados de LTRs retrovirales, citomegalovirus (CMV) (tales como el promotor/potenciador de CMV), Virus simio 40 (SV40) (tal como el promotor/potenciador de SV40), adenovirus, (p.ej., el promotor tardm principal de adenovirus (AdMLP)), polioma y promotores de mamffero potentes tales como los promotores nativos de inmunoglobulinas y actina. Para una descripcion adicional de los elementos reguladores virales, y las secuencias de los mismos, veanse, p.ej., las patentes de EE.UU. N°s 5.168.062, 4.510.245, y 4.968.615.

Ademas de las secuencias de acido nucleico de las cadenas de los anticuerpos y las secuencias reguladoras, los vectores de expresion recombinantes pueden portar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicacion del vector en las celulas hospedadoras y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la seleccion de las celulas hospedadoras en las que se ha introducido el vector (veanse, p.ej., las patentes de EE.UU. N°s 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017). Los genes marcadores seleccionables incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para el uso en celulas hospedadoras dhfr- con seleccion/amplificacion con metotrexato), el gen de neomicina fosfotransferasa (para la seleccion de G418), y el gen de glutamato sintetasa. El diseno del vector de expresion, que incluye la seleccion de las secuencias reguladoras, puede depender de varios factores, tales como la eleccion de la celula hospedadora a transformar, el nivel de expresion de la protema deseada, etc. Las moleculas de acido nucleico que codifican las moleculas de union y los vectores que comprenden estas moleculas de acido nucleico se pueden usar para la transformacion de una celula hospedadora adecuada para la produccion recombinante de una molecula de union. Una celula hospedadora adecuada se transforma con uno o mas vectores de expresion que portan las moleculas de acido nucleico que codifican una secuencia de aminoacidos de una molecula de union de forma que la secuencia de aminoacidos se expresa en la celula hospedadora y, en general, se secreta en el medio en el que se cultiva la celula hospedadora, y del que se puede recuperar la secuencia de aminoacidos. La transformacion de las celulas hospedadoras se puede llevar a cabo mediante cualquier metodo adecuado conocido en la tecnica, tales como los descritos en las patentes de EE.UU. N°s 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461, y 4.959.455.

La celula hospedadora puede ser una celula de mamffero, insecto, planta, bacteria, o levadura. Los ejemplos de lmeas celulares de mamffero adecuadas como celulas hospedadoras incluyen las celulas de ovario de hamster chino (CHO), celulas NSO, celulas SP2, celulas HEK-293T, celulas NIH-3T3, celulas HeLa, celulas de rinon de cna de hamster (BHK), celulas de rinon de mono verde africano (COS), celulas de carcinoma hepatocelular humano (p.ej., Hep G2), celulas A549, y otras diversas lmeas celulares. Los ejemplos de lmeas celulares de insecto incluyen las celulas Sf9 o Sf21. Los ejemplos de celulas hospedadoras vegetales incluyen Nicotiana, Arabidopsis, lenteja de agua, mafz, trigo, patata, etc. Las celulas hospedadoras bacterianas incluyen E. coli y la especie Streptomyces. Los ejemplos de celulas hospedadoras de levadura incluyen Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae, y Pichia pastoris.

Las secuencias de aminoacidos de una molecula de union expresada por lmeas celulares diferentes o en animales transgenicos pueden tener una glicosilacion diferente. Sin embargo, todas las moleculas de union codificadas por las moleculas de acido nucleico proporcionadas en la presente memoria o que comprenden las secuencias de aminoacidos proporcionadas en la presente memoria son parte de la presente descripcion, independientemente de la glicosilacion de las moleculas de union.

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En otro aspecto, la presente descripcion proporciona un metodo para producir un anticuerpo hacia OX40R o fragmento de union al antigeno del mismo mediante el uso de expresion en fago. El metodo comprende (a) sintetizar una biblioteca de anticuerpos humanos en un fago, (b) cribar la biblioteca con el OX40R o una porcion del mismo, (c) aislar del fago que se une al OX40R o a una porcion del mismo, y (d) obtener el anticuerpo del fago. Un metodo ejemplar para preparar la biblioteca de anticuerpos comprende la etapa de: (a) inmunizar a un animal no humano que comprende loci de inmunoglobulinas humanas con OX40R o una porcion antigenica del mismo para crear una respuesta inmunitaria; (b) extraer las celulas que producen anticuerpos del animal inmunizado; (c) aislar el ARN que codifica las cadenas ligeras y pesadas de los anticuerpos hacia OX40R de las celulas extrafdas; (d) transcribir inversamente el ARN para producir cADN; (e) amplificar el cADN; y (f) insertar el cADN en un vector de expresion en fago de forma que se expresen los anticuerpos en el fago. Los anticuerpos hacia OX40R humanos recombinantes o los fragmentos de union al antfgeno de los mismos se pueden aislar mediante el cribado de una biblioteca de anticuerpos combinatoria recombinante. La biblioteca puede ser una biblioteca de expresion en fago de scFv, generada mediante el uso de cADNs de Vl y Vh humanos preparados a partir del mARN aislado de celulas B. Los metodos para preparar y cribar tales bibliotecas se conocen en la tecnica. Los equipos para generar bibliotecas de expresion en fago estan disponibles comercialmente (p.ej., el Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, n° de catalogo 27-9400-01; y el equipo de expresion en fago Stratagene SurfZAP™, n° de catalogo 240612).

En un caso, para aislar y producir anticuerpos hacia OX40R humanos con las caractensticas deseadas, primero se usa un anticuerpo hacia OX40R humano como se describe en la presente memoria para seleccionar secuencias de la cadena pesada y ligera humanas que tienen una actividad de union similar hacia OX40R mediante el uso de metodos conocidos en la tecnica, tales como los metodos de injerto de epttopos descritos en el documento WO 93/06213. Las bibliotecas de anticuerpos usadas en este metodo pueden ser bibliotecas de scFv preparadas y cribadas como se describio en el documento WO 92/01047, McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); y Griffiths et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). Las bibliotecas de anticuerpos scFv se pueden cribar mediante el uso de CCR2 humano como antfgeno.

Una vez que se seleccionan las regiones Vl y Vh humanas iniciales, se llevan a cabo experimentos de "mezcla y acoplamiento", en los que se criban diferentes pares de los segmentos Vl y Vh seleccionados inicialmente en funcion de la union a OX40R para seleccionar las combinaciones de pares Vl/Vh. Ademas, para mejorar adicionalmente la calidad del anticuerpo, los segmentos Vl y Vh de el/los par(es) Vl/Vh se pueden mutar aleatoriamente, en la region CDR3 de Vh y/o Vl, en un proceso analogo al proceso de mutacion somatica in vivo responsable de la maduracion de la afinidad de los anticuerpos durante una respuesta inmunitaria natural. Esta maduracion de la afinidad in vitro se puede llevar a cabo amplificando los dominios Vh y Vl mediante el uso de cebadores de PCR complementarios a la CDR3 de Vh o la CDR3 de Vl, respectivamente, en cuyos cebadores se ha "anadido" una mezcla aleatoria de las cuatro bases nucleotidicas en ciertas posiciones de forma que los productos de PCR resultantes codifican segmentos Vh y Vl en los que se han introducido mutaciones aleatorias en las regiones CDR3 de Vh y/o Vl. Estos segmentos Vh y Vl mutados aleatoriamente se pueden volver a cribar en funcion de la union a OX40R.

Tras el cribado y el aislamiento de un anticuerpo hacia OX40R o una porcion de union al antfgeno de una biblioteca de expresion de inmunoglobulinas recombinantes, los acidos nucleicos que codifican la molecula de union seleccionada se pueden recuperar del paquete de expresion (p.ej., del genoma del fago) y subclonarlos en otros vectores de expresion mediante tecnicas de ADN recombinante. Si se desea, el acido nucleico se puede manipular adicionalmente para crear otras formas de anticuerpos, como se describe mas adelante. Para expresar un anticuerpo humano recombinante aislado mediante cribado de una biblioteca combinatoria, el ADN que codifica el anticuerpo se clona en un vector de expresion recombinante y se introduce en celulas hospedadoras de mairnfero, como se describio anteriormente.

Composiciones farmaceuticas

En otro aspecto, la presente descripcion proporciona una composicion, p.ej., una composicion farmaceutica, que contiene una o una combinacion de moleculas de union proporcionadas por la descripcion, y opcionalmente un vehfculo farmaceuticamente aceptable. Las composiciones se pueden preparar mediante metodos convencionales conocidos en la tecnica.

En ciertas realizaciones, la composicion comprende un anticuerpo hacia OX40R o un fragmento de union al antfgeno del mismo. En una realizacion particular, la composicion comprende el anticuerpo 11D4 o el anticuerpo 18D8, o un fragmento de union al antfgeno de cualquiera de los dos anticuerpos. En otras realizaciones, la composicion comprende un derivado del anticuerpo 11D4 o del anticuerpo 18D8.

La expresion "vetnculo farmaceuticamente aceptable" se refiere a cualquier sustancia inactiva que es adecuada para el uso en una formulacion para la administracion de una molecula de union. Un vehfculo puede ser un antiadherente, aglutinante, revestimiento, disgregante, relleno o diluyente, conservante (tal como agente antioxidante, antibacteriano, o antifungico), edulcorante, agente retardante de la absorcion, agente humectante, agente emulsionante, tampon, y similares. Los ejemplos de vehfculos farmaceuticamente aceptables adecuados incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilen glicol, polietilen glicol, y similares) dextrosa, aceites vegetales (tales como aceite de oliva), solucion salina, tampon, solucion salina tamponada, y agentes isotonicos tales como carbohidratos, polialcoholes, sorbitol, y cloruro sodico.

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Las composiciones pueden estar en cualquier forma adecuada, tales como formas farmaceuticas Kquidas, semi- solidas, y solidas. Los ejemplos de formas farmaceuticas Kquidas incluyen la solucion (p.ej., soluciones inyectables e infundibles), microemulsion, liposoma, dispersion, o suspension. Los ejemplos de formas farmaceuticas solidas incluyen un comprimido, pfldora, capsula, microcapsula, y polvo. Una forma particular de la composicion adecuada para administrar una molecula de union es un lfquido esteril, tal como una solucion, suspension, o dispersion, para inyeccion o infusion. Las soluciones esteriles se pueden preparar incorporando el anticuerpo en la cantidad necesaria en un vehnculo adecuado, seguido de esterilizacion mediante microfiltracion. En general, las dispersiones se preparan incorporando el anticuerpo en un vetnculo esteril que contiene un medio de dispersion basico y otros vehnculos. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de un lfquido esteril, los metodos de preparacion incluyen el secado a vado y la liofilizacion para proporcionar un polvo del ingrediente activo mas cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una disolucion previamente esterilizada mediante filtracion del mismo. Las diversas formas farmaceuticas de las composiciones se pueden preparar mediante metodos convencionales conocidos en la tecnica.

La cantidad relativa de una molecula de union incluida en la composicion variara dependiendo de varios factores, tales como la molecula de union espedfica y los vehnculos usados, la forma farmaceutica, y las caractensticas de liberacion y farmacocineticas deseadas. La cantidad de una molecula de union en una forma farmaceutica simple sera en general la cantidad que produzca un efecto terapeutico, pero puede ser tambien una cantidad menor. En general, esta cantidad oscilara de alrededor del 0,01 por ciento a alrededor del 99 por ciento, de alrededor del 0,1 por ciento a alrededor del 70 por ciento, o de alrededor del 1 por ciento a alrededor del 30 por ciento respecto del peso total de la forma farmaceutica.

Ademas de la molecula de union, se pueden incluir uno o mas agentes terapeuticos adicionales en la composicion. Los ejemplos de los agentes terapeuticos adicionales se describen mas adelante en la presente memoria. La cantidad adecuada del agente terapeutico adicional a incluir en la composicion puede ser seleccionada facilmente por una persona experta en la tecnica, y variara dependiendo de varios factores, tales como el agente particular y los vehnculos usados, la forma farmaceutica, y las caractensticas de liberacion y farmacodinamicas deseadas. La cantidad del agente terapeutico adicional incluido en una forma farmaceutica simple sera en general la cantidad del agente que produzca un efecto terapeutico, pero tambien puede ser una cantidad menor.

Uso de las moleculas de union y las composiciones farmaceuticas

Las moleculas de union y las composiciones farmaceuticas que comprenden una molecula de union proporcionada por la presente descripcion son utiles para fines terapeuticos, diagnosticos, u otros fines, tales como estimular una respuesta inmunitaria, tratar un cancer, aumentar la eficacia de otra terapia del cancer, o aumentar la eficacia de una vacuna, y tienen varias utilidades, tales como para el uso como medicamentos o agentes de diagnostico. Asf, en otro aspecto, la presente descripcion proporciona metodos de uso de las moleculas de union o las composiciones farmaceuticas.

En un aspecto particular, se proporcionan metodos para estimular una respuesta inmunitaria en un mairnfero, que comprenden administrar al mamffero una cantidad terapeuticamente eficaz de una molecula de union proporcionada por la descripcion. En ciertas realizaciones, la molecula de union es un anticuerpo hacia OX40R o un fragmento de union al antfgeno del mismo, y el mamffero es un ser humano. En una realizacion adicional, la molecula de union es el anticuerpo 11D4 o el anticuerpo 18D8, o un fragmento de union al antfgeno de cualquiera de los dos anticuerpos. La expresion "estimular una respuesta inmunitaria", o sus variaciones gramaticales, significa estimular, provocar, incrementar, mejorar, o aumentar cualquier respuesta del sistema inmunitario de un mamffero. La respuesta inmunitaria puede ser una respuesta celular (es decir, mediada por celulas, tal como mediada por linfocitos T citotoxicos) o una respuesta humoral (es decir, respuesta mediada por anticuerpos), y puede ser una respuesta inmunitaria primaria o secundaria. Los ejemplos de estimulacion de la respuesta inmunitaria incluyen una actividad de celulas T auxiliares CD4+ incrementada y la generacion de celulas T citolfticas. La estimulacion de una respuesta inmunitaria se puede determinar mediante el uso de varias medidas in vitro o in vivo conocidas para los expertos en la tecnica, que incluyen, pero sin limitacion, ensayos de linfocitos T citotoxicos, liberacion de citocinas (por ejemplo produccion de IL-2), remision de tumores, supervivencia de animales que albergan tumores, produccion de anticuerpos, proliferacion de celulas inmunitarias, expresion de marcadores de la superficie celular, y citotoxicidad. En general, los metodos de la descripcion estimulan la respuesta inmunitaria de un mai^ero en comparacion con la respuesta inmunitaria de un mai^ero sin tratar o de un animal sin tratar mediante el uso de los metodos reivindicados. En una realizacion, el metodo estimula una respuesta inmunitaria celular, en particular una respuesta de celulas T citotoxicas. En otra realizacion, la respuesta inmunitaria celular es una respuesta de celulas T auxiliares. En otra realizacion, la respuesta inmunitaria es una produccion de citocinas, en particular la produccion de IL-2.

En otro aspecto particular, la presente descripcion proporciona un metodo para tratar un cancer en un mai^ero, que comprende administrar al mai^ero una cantidad terapeuticamente eficaz de una molecula de union proporcionada por la descripcion. La expresion "tratar un cancer" o "tratamiento de un cancer" se refiere a provocar un efecto deseable o beneficioso en un mai^ero al que se le ha diagnosticado un cancer. El efecto deseable o beneficioso puede incluir la inhibicion del crecimiento o de la proliferacion adicional de las celulas cancerosas, la muerte las celulas cancerosas, la inhibicion de la reaparicion del cancer, la reduccion del dolor asociado al cancer, o una supervivencia mejorada del animal. La inhibicion de la reaparicion del cancer contempla la localizacion del cancer y

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el tejido circundante que se han tratado previamente mediante radiacion, quimioterapia, cio^a, u otras tecnicas. El efecto puede ser subjetivo u objetivo. Por ejemplo, si el animal es humano, el humano puede notar un vigor o vitalidad mejorada o un dolor disminuido como smtomas subjetivos de la mejora o respuesta a la terapia. De manera alternativa, el medico puede notar una disminucion del tamano del tumor o de la masa tumoral basandose en un examen ffsico, parametros de laboratorio, marcadores tumorales o hallazgos radiograficos. Algunos indicios de laboratorio que el medico puede observar para la respuesta al tratamiento incluyen la normalizacion de ensayos, tales como el recuento de leucocitos, el recuento de eritrocitos, el recuento de plaquetas, la velocidad de sedimentacion de eritrocitos, y diversas concentraciones de enzimas. Ademas, el medico puede observar una disminucion de un marcador tumoral detectable. De manera alternativa, se pueden usar otros ensayos para determinar una mejora objetiva, tales como sonogramas, pruebas de resonancia magnetica nuclear y pruebas de emision de positrones. En ciertas realizaciones, la molecula de union es un anticuerpo hacia OX40R o un fragmento de union al antigeno del mismo proporcionado por la descripcion. En una realizacion adicional, la molecula de union es el anticuerpo 11D4 o 18D8, o un fragmento de union al antigeno de cualquiera de los dos anticuerpos. En una realizacion adicional, el mairnfero es un ser humano.

En otro aspecto particular, la presente descripcion proporciona un metodo para prevenir un cancer en un mamftero, que comprende administrar al mamffero una cantidad terapeuticamente eficaz de una molecula de union proporcionada por la descripcion. Las expresiones "prevenir un cancer" o "prevencion de un cancer" se refieren a retrasar, inhibir, o prevenir el inicio de un cancer en un mamfero en el que el inicio de la oncogenesis o tumorigenesis no se ha demostrado, pero se ha identificado una predisposicion al cancer, determinada mediante cribado genetico, por ejemplo, o de otra manera. La expresion tambien abarca tratar a un mamffero que tiene afecciones premalignas para detener la progresion, o provocar la regresion, de las afecciones premalignas hacia la neoplasia maligna. Los ejemplos de afecciones premalignas incluyen hiperplasia, displasia, y metaplasia. En ciertas realizaciones, la molecula de union es un anticuerpo hacia OX40R o un fragmento del mismo proporcionado por la descripcion. En una realizacion adicional, la molecula de union es el anticuerpo 11D4 o 18D8, o un fragmento de union al antfgeno de cualquiera de los dos anticuerpos. En una realizacion adicional, el mam^era es un ser humano.

Se puede tratar o prevenir una diversidad de canceres, ya sean malignos o benignos y ya sean primarios o secundarios, con un metodo proporcionado por la descripcion. Los ejemplos de tales canceres incluyen canceres de pulmon tales como carcinoma broncogenico (p.ej., carcinoma de celulas escamosas, carcinoma de celulas pequenas, carcinoma de celulas grandes, y adenocarcinoma), carcinoma de celulas alveolares, adenoma bronquial, hamartoma condromatoso (no canceroso), y sarcoma (canceroso); cancer de corazon tal como mixoma, fibromas, y rabdomiomas; canceres oseos tales como osteocondromas, condromas, condroblastomas, fibromas condromixoides, osteomas osteoides, tumores de celulas gigantes, condrosarcoma, mieloma multiple, osteosarcoma, fibrosarcomas, histiocitomas fibrosos malignos, tumor de Ewing (sarcoma de Ewing), y sarcoma de celulas reticulares; cancer de cerebro tal como gliomas (p.ej., glioblastoma multiforme), astrocitomas anaplasicos, astrocitomas, oligodendrogliomas, meduloblastomas, cordoma, Schwannomas, ependimomas, meningiomas, adenoma de hipofisis, pinealoma, osteomas, hemangioblastomas, craniofaringiomas, cordomas, germinomas, teratomas, quistes dermoides, y angiomas; canceres del sistema digestivo tales como leiomioma, carcinoma epidermoide, adenocarcinoma, leiomiosarcoma, adenocarcinomas de estomago, lipomas intestinales, neurofibromas intestinales, fibromas intestinales, polipos del intestino grueso, y canceres colorrectales; canceres hepaticos tales como adenomas hepatocelulares, hemangioma, carcinoma hepatocelular, carcinoma fibrolamelar, colangiocarcinoma, hepatoblastoma, y angiosarcoma; canceres de rinon tales como adenocarcinoma renal, carcinoma de celulas renales, hipernefroma, y carcinoma de celulas de transicion de la pelvis renal; canceres de vejiga; canceres hematologicos tales como leucemia linfodtica aguda (linfoblastica), leucemia mieloide aguda (mielodtica, mielogena, mieloblastica, mielomonodtica), leucemia linfodtica cronica (p.ej., smdrome de Sezary y tricoleucemia), leucemia mielocftica cronica (mieloide, mielogena, granulocftica), linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma de celulas B, micosis fungoide, y trastornos mieloproliferativos (que incluyen trastornos mieloproliferativos tales como policitemia vera, mielofibrosis, trombocitemia, y leucemia mielocftica cronica); canceres cutaneos tales como carcinoma de celulas basales, carcinoma de celulas escamosas, melanoma, sarcoma de Kaposi, y enfermedad de Paget; canceres de cabeza y cuello; canceres relacionados con los ojos, tales como retinoblastoma y melanocarcinoma intraocular; canceres del sistema reproductor masculino, tales como hiperplasia prostatica benigna, cancer de prostata, y canceres testiculares (p.ej., seminoma, teratoma, carcinoma embrionario, y coriocarcinoma); cancer de mama; canceres del sistema reproductor femenino, tales como cancer uterino (carcinoma endometrial), cancer de cuello del utero (carcinoma de cuello del utero), cancer de ovario (carcinoma ovarico), carcinoma vulvar, carcinoma vaginal, cancer de trompas de Falopio, y mola hidatidiforme; cancer de tiroides (que incluye cancer papilar, folicular, anaplasico, o medular); feocromocitomas (glandula suprarrenal); crecimientos no cancerosos de las glandulas paratiroides; canceres pancreaticos; y canceres hematologicos tales como leucemias, mielomas, linfomas no Hodgkin, y linfomas de Hodgkin.

Al poner en practica los metodos terapeuticos, las moleculas de union se pueden administrar solas como monoterapia, o se pueden administrar en combinacion con uno o mas agentes terapeuticos o terapias adicionales. Asf, en otro aspecto, la presente descripcion proporciona una terapia de combinacion, que comprende una molecula de union proporcionada por la descripcion en combinacion con una o mas terapias o agentes terapeuticos adicionales. La expresion "terapia adicional" se refiere a una terapia que no emplea una molecula de union proporcionada por la descripcion como agente terapeutico. La expresion "agente terapeutico adicional" se refiere a

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cualquier agente terapeutico distinto de una molecula de union proporcionada por la descripcion. En ciertas realizaciones, la molecula de union es el anticuerpo 11D4 o 18D8, o un fragmento de union al antfgeno de cualquiera de los dos anticuerpos. En un aspecto particular, la presente descripcion proporciona una terapia de combinacion para tratar el cancer en un mairnfero, que comprende administrar al mairnfero una cantidad terapeuticamente eficaz de una molecula de union proporcionada por la descripcion en combinacion con uno o mas agentes terapeuticos adicionales. En una realizacion adicional, el mairnfero es un ser humano.

Se puede usar una amplia diversidad de agentes terapeuticos del cancer en combinacion con una molecula de union. Alguien de experiencia habitual en la tecnica reconocera la presencia y el desarrollo de otras terapias del cancer que se pueden usar en combinacion con los metodos y moleculas de union de la presente descripcion, y no se limitara a las formas de terapia expuestas en la presente memoria. Los ejemplos de categonas de agentes terapeuticos adicionales que se pueden usar en la terapia de combinacion para tratar el cancer incluyen (1) agentes quimioterapeuticos, (2) agentes inmunoterapeuticos, y (3) agentes terapeuticos hormonales.

La expresion "agente quimioterapeutico" se refiere a una sustancia qmmica o biologica que puede provocar la muerte de celulas cancerosas, o interferir con el crecimiento, la division, la reparacion, y/o la funcion de las celulas cancerosas. Los ejemplos de agentes quimioterapeuticos incluyen los que se describen en los documentos WO 2006/088639, WO 2006/129163, y US 20060153808. Los ejemplos de agentes quimioterapeuticos particulares incluyen: (1) agentes alquilantes, tales como clorambucilo (LEUKERAN), ciclofosfamida (CYTOXAN), ifosfamida (IFeX), hidrocloruro de mecloretamina (MUSTARGEN), tiotepa (THIOPLEX), estreptozotocina (ZANOSAR), carmustina (BICNU, OBLEA GLIADEL), lomustina (CEENU), y dacarbazina (DTIC-DoME); (2) alcaloides o alcaloides de la vinca, que incluyen antibioticos citotoxicos, tales como doxorrubicina (ADRIAMYCIN), epirrubicina (ELLENCE, PHARMORUBICIN), daunorrubicina (CERUBIDINE, DAUNOXOME), nemorrubicina, idarrubicina (IDAMYCIN PFS, ZAVEDOS), mitoxantrona (DHAD, NOVANTRONE). dactinomicina (actinomicina D, COSMEGEN), plicamicina (MITHRACIN), mitomicina (MUTAMYCIN), y bleomicina (BLENOXANE), tartrato de vinorelbina (NAVELBINE)), vinblastina (VELBAN), vincristina (ONCOVIN), y vindesina (ELDISINE); (3) antimetabolitos, tales como capecitabina (XELODA), citarabina (CYTOSAR-U), fludarabina (FLUDARA), gemcitabina (GEMZAR), hidroxiurea (HYDRA), metotrexato (FOLEX, MEXATE, TREXALL), nelarabina (ARRANON), trimetrexato (NEUTREXIN), y pemetrexed (ALIMTA); (4) Antagonistas de pirimidina, tales como 5-fluorouracilo (5-FU); capecitabina (XELODA), raltitrexed (TOmUdEx), tegafur-uracilo (UFTORAL), y gemcitabina (GEMZAR); (5) taxanos, tales como docetaxel (TAXOTERE), paclitaxel (TAXOL); (6) farmacos de platino, tales como cisplatino (PLATINOL) y carboplatino (PARAPLATIN), y oxaliplatino (ELOXATIN); (7) inhibidores de topoisomerasas, tales como irinotecano (CAMPTOSAR), topotecano (HYCAMTIN), etoposido (ETOPOPHOS, VEPESSID, TOPOSAR), y teniposido (vUMON); (8) epipodofilotoxinas (derivados de podofilotoxina), tales como etoposido (ETOPOPhOs, VEpEsSID, TOPOSAR); (9) derivados de acido folico, tales como leucovorina (WELLCOVORIN); (10) nitrosoureas, tales como carmustina (BiCNU), lomustina (CeeNU); (11) inhibidores de tirosina quinasas de receptores, que incluyen el receptor de factor de crecimiento epidermico (EGFR), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), receptor de insulina, receptor de factor de crecimiento similar a insulina (IGFR), receptor de factor de crecimiento de hepatocitos (HGFR), y receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), tales como gefitinib (IRESSA), erlotinib (TARCEVA), bortezomib (VELCADE), mesilato de imatinib (GLEEVEC), genefitinib, lapatinib, sorafenib, talidomida, sunidadinib (SUTENT), axitinib, rituximab, trastuzumab (HERCEPTIN), cetuximab (ERBITUX), bevacizumab (AVASTIN), y ranibizumab (LUCENTIS), lym-1 (ONCOLYM), anticuerpos hacia el receptor -1 del factor de crecimiento similar a insulina (IGF-1R) que se describen en el documento WO2002/053596); (12) inhibidores de la angiogenesis, tales como bevacizumab (AVASTIN), suramina (GERMANIN), angiostatina, SU5416, talidomida, e inhibidores de metaloproteinasas de la matriz (tales como batimastat y marimastat), y los que se describen en el documento WO2002055106; y (13) inhibidores del proteosoma, tales como bortezomib (VELCADE).

La expresion "agentes inmunoterapeuticos" se refiere a una sustancia qmmica o biologica que puede estimular una respuesta inmunitaria de un mairnfero. Los ejemplos de agentes inmunoterapeuticos incluyen: bacilo de Calmette- Guerin (BCG); citocinas tales como interferones; vacunas tales como la inmunoterapia personalizada MyVax, Onyvax-P, Oncophage, GRNVAC1, FavId, Provenge, GVAX, Lovaxin C, BiovaxID, GMXX, y NeuVax; y anticuerpos tales como alemtuzumab (CAMPATH), bevacizumab (AVASTIN), cetuximab (ERBITUX), gemtuzunab ozogamicina (MYLOTARG), ibritumomab tiuxetan (ZEVALIN), panitumumab (VECTIBIX), rituximab (RITUXAN, MABTHERA), trastuzumab (HERCEPTIN), tositumomab (BEXXAR), tremelimumab, CAT-3888, y anticuerpos agonistas hacia el receptor CD40 que se describen en el documento WO2003/040170.

La expresion "agente terapeutico hormonal" se refiere a una sustancia qmmica o biologica que inhibe o elimina la produccion de una hormona, o inhibe o contrarresta el efecto de una hormona sobre el crecimiento y/o la supervivencia de las celulas cancerosas. Los ejemplos de tales agentes adecuados para los metodos de la presente memoria incluyen los que se describen en el documento US20070117809. Los ejemplos de agentes terapeuticos hormonales particulares incluye tamoxifeno (NOLVADEX), toremifeno (Fareston), fulvestrant (FASLODEX), anastrozol (aRiMIDEX), exemestano (AROMASiN), letrozol (FEMARA), acetato de megestrol (MEGACE), goserelina (ZOLADEX), y leuprolida (LUPRON). Las moleculas de union de esta descripcion se pueden usar tambien en combinacion con terapias hormonales no farmacologicas tales como (1) metodos quirurgicos que eliminan todo o parte de los organos o glandulas que participan en la produccion de la hormona, tales como los ovarios, los testfculos, la glandula suprarrenal, y la hipofisis, y (2) tratamiento con radiacion, en el que los organos o glandulas

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del paciente se someten a radiacion en una cantidad suficiente para inhibir o eliminar la produccion de la hormona seleccionada como objetivo.

La terapia de combinacion para tratar el cancer tambien abarca la combinacion de una molecula de union proporcionada por la descripcion con cirugfa para extraer un tumor. La molecula de union se puede administrar al mairnfero antes, durante, o despues de la cirugfa.

La terapia de combinacion para tratar el cancer tambien abarca la combinacion de una molecula de union proporcionada por la descripcion con la radioterapia, tal como la radioterapia ionizante (electromagnetica) (p.ej., rayos X o rayos gamma) y la radioterapia de haces de partfculas (p.ej., radiacion de energfa lineal elevada). La fuente de radiacion puede ser externa o interna al mai^ero. La molecula de union se puede administrar al marnffero antes, durante, o despues de la radioterapia.

Administracion de las moleculas de union y composiciones

Las moleculas de union y composiciones proporcionadas por la presente descripcion se pueden administrar por medio de cualquier via enteral o via parenteral adecuada de administracion. El termino "via enteral" de administracion se refiere a la administracion por medio de cualquier parte del tracto gastrointestinal. Los ejemplos de vfas enterales incluyen la via oral, mucosa, bucal, y rectal, o la via intragastrica. "Via parenteral" de administracion se refiere a una via de administracion distinta de la via enteral. Los ejemplos de vfas parenterales de administracion incluyen la administracion intravenosa, intramuscular, intradermica, intraperitoneal, intratumoral, intravesical, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, transtraqueal, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal, subcutanea, o topica. Los anticuerpos y las composiciones de la descripcion se pueden administrar mediante el uso de cualquier metodo adecuado, tal como mediante ingestion oral, tubo nasogastrico, tubo de gastrostom^a, inyeccion, infusion, bomba de infusion implantable, y bomba osmotica. La via y el metodo adecuado de administracion puede variar dependiendo de varios factores tales como el anticuerpo espedfico que se va a usar, la velocidad de absorcion deseada, la formulacion espedfica o la forma farmaceutica usada, el tipo o gravedad del trastorno que se va a tratar, el sitio espedfico de accion, y las afecciones del paciente, y pueden ser seleccionados facilmente por una persona experta en la tecnica

La expresion "cantidad terapeuticamente eficaz" de una molecula de union se refiere a una cantidad que es eficaz para un proposito terapeutico deseado. Por ejemplo, en el contexto de la estimulacion de una respuesta inmunitaria, una "cantidad terapeuticamente eficaz" es cualquier cantidad que es eficaz para estimular, provocar, incrementar, mejorar, o aumentar cualquier respuesta de un sistema inmunitario de un mamffero. En el contexto del tratamiento del cancer, una "cantidad terapeuticamente eficaz" es cualquier cantidad que es suficiente para provocar cualquier efecto deseable o beneficioso en el mamffero a tratar, tal como la inhibicion del crecimiento o la proliferacion adicional de las celulas cancerosas, la muerte de las celulas cancerosas, la inhibicion de la reaparicion del cancer, la reduccion del dolor asociado al cancer, o una supervivencia mejorada del mamffero. En un metodo para prevenir el cancer, una "cantidad terapeuticamente eficaz" es cualquier cantidad que es eficaz para retrasar, inhibir, o prevenir el inicio de un cancer en el mamffero al que se le administra la molecula de union. La cantidad terapeuticamente eficaz de una molecula de union normalmente oscila de alrededor de 0,001 a alrededor de 500 mg/kg, y mas normalmente alrededor de 0,05 a alrededor de 100 mg/kg, del peso corporal del mam^era. Por ejemplo, la cantidad puede ser de alrededor de 0,3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 50 mg/kg, o l00 mg/kg del peso corporal del mamffero. En deltas realizaciones, la cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo hacia OX40R esta en el intervalo de alrededor de 0,1 - 30 mg/kg del peso corporal del marnffero. El nivel de dosis precisa a administrar puede ser determinado facilmente por una persona experta en la tecnica, y dependera de varios de factores, tales como el tipo y la gravedad del trastorno a tratar, la molecula de union particular empleada, la via de administracion, el momento de la administracion, la duracion del tratamiento, la terapia adicional particular empleada, la edad, el sexo, el peso, la afeccion, la salud general y el historial medico anterior del paciente que se va a tratar, y factores similares muy conocidos en las tecnicas medicas.

Una molecula de union o composicion se administra normalmente en multiples ocasiones. Los intervalos entre las dosis unicas pueden ser, por ejemplo, semanales, mensuales, cada tres meses o anuales. Un regimen de tratamiento ejemplar implica la administracion una vez cada semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez cada mes, una vez cada 3 meses o una vez cada tres a 6 meses. Los regfmenes de dosis tfpicos para un anticuerpo hacia OX40R incluyen 1 mg/kg de peso corporal o 3 mg/kg de peso corporal por medio de administracion intravenosa, mediante el uso de uno de los siguientes calendarios de dosificacion: (i) cada cuatro semanas para seis dosis, entonces cada tres meses; (ii) cada tres semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corporal una vez seguido de 1 mg/kg de peso corporal cada tres semanas.

Ejemplos

Ejemplo 1: Preparacion de anticuerpos hacia OX40R

Se prepararon anticuerpos ilustrativos de acuerdo con la descripcion, se seleccionaron, y se ensayaron como sigue:

Inmunizacion con el antfgeno de OX40R y seleccion de los ratones que producen anticuerpos monoclonales hacia OX40R:

Se prepararon anticuerpos monoclonales completamente humanos hacia OX40R humano mediante el uso de las cepas de ratones transgenicos de Ig humana HCo7, HCo12, Hco17, y Hco27, as^ como la cepa transcromosomica/transgenica humana, KM (Medarex, Inc.). Todas estas cepas expresan anticuerpos completamente humanos que son indistinguibles de los anticuerpos aislados de humanos.

5 En las cepas transgenicas, tanto el gen de la cadena ligera kappa de raton endogeno como el gen de la cadena pesada de raton endogeno se alteraron de manera homocigota como se describe en Chen et al. (1993) EMBO J. 12:821-830 y en el Ejemplo 1 del documento WO 01/09187, respectivamente. Ademas, portan un transgen de la cadena ligera kappa humana, KCo5, como se describe en Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851. En contraste, las cepas transgenicas son distintas con respecto a sus genes de la cadena pesada humana. La cepa 10 HCo7 porta el transgen de la cadena pesada humana HCo7 como se describe en las patentes de EE.UU. N°s: 5.545.806, 5.625.825, y 5.545.807; la cepa HCo12 porta el transgen de la cadena pesada humana HCo12 como se describe en el Ejemplo 2 del documento WO 01/09187; la cepa Hco17 porta el transgen de la cadena pesada humana Hco17 como se describe en el Ejemplo 8 de Deshpande et al., documento US 2005/0191293A1; la cepa Hco27 porta el transgen de la cadena pesada humana Hco27 como se describe en el Ejemplo 5 del documento 15 PCT/US2008/072640 presentado el 08 de agosto de 2008. La cepa KM porta un minicromosoma humano como se

describe en Ishida et al., (2002), Cloning and Stem Cells, 4: 91-102.

Los esquemas de inmunizacion generales para los ratones HuMab se describen en Lonberg et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851; y en la publicacion PCT WO 98/24884.

Los ratones HuMab de las cepas HCo7, HCo12, Hco17, Hco27 y KM se inmunizaron comenzando a las 6-16 20 semanas de edad con 15-25 |jg de protema OX40R-Ig recombinante humana purificada y la lmea de celulas pre-B murina, 300-19 (Reth, M. G. et al., Nature 312 29: 418-42, 1984; Alt, F. et al., Cell 27: 381-390, 1981), transfectada para expresar OX40R humano en adyuvante de Ribi. La protema OX40R-Ig recombinante humana purificada es una construccion del dominio extracelular (aminoacidos 1-220) de OX40R humano fusionado a la region constante de IgG1 humana. La administracion fue por medio de inyeccion intra-peritoneal, de manera subcutanea o en la planta 25 de la pata a intervalos de 3-28 dfas, hasta un total de 10 inmunizaciones. La respuesta inmunitaria se monitorizo por medio de ELISA y cribado FACS como se describe mas adelante.

Seleccion de ratones HuMab que producen anticuerpos hacia OX40R:

Para seleccionar los ratones HuMab que producen anticuerpos que se unen al OX40R, se obtuvo sangre de los ratones inmunizados y se analizaron mediante ELISA con respecto a la union espedfica a la protema recombinante 30 OX40R humana purificada, y mediante FACS con respecto a la union a una lmea celular que expresaba OX40R humano de longitud completa, y no a una lmea celular de control que no expresaba OX40R.

El ensayo de union mediante ELISA fue como describio Fishwild et al. (1996), Nature Biotechnology 14: 845-851. Brevemente, se revistieron placas de microtitulacion mediante el uso de 50 jl/pocillo de una disolucion de OX40R-Ig recombinante purificada que contema 1 jg/ml en PBS, y se incubo durante la noche a 4 °C. Los pocillos se 35 bloquearon despues mediante el uso de 200 jl/pocillo de un 5% de suero de pollo en PBS/Tween (0,05%). Se anadieron diluciones de plasma de ratones inmunizados con OX40R a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron con PBS/Tween y despues se incubaron con un anticuerpo policlonal anti-Fc de IgG humana de cabra conjugado con peroxidasa de rabano (HRP) durante 1 hora a temperatura ambiente. Despues de lavar, las placas se revelaron con sustrato ABTS (Moss Inc., n° de producto: ABTS-1000 40 mg/ml) y se analizaron mediante un espectrofotometro a DO a 405.

El ensayo FACS se llevo a cabo segun los procedimientos convencionales. Brevemente, se incubaron celulas 30019 que expresaban OX40R con suero de ratones inmunizados diluidos a 1:20. Las celulas se lavaron, y se detecto la union del anticuerpo espedfico con Ab anti-IgG humana marcado con FITC. Los analisis de citometna de flujo se llevaron a cabo en un instrumento de citometna de flujo FACS (Becton Dickinson, San Jose, CA).

45 Los ratones que desarrollaron los tttulos mas altos de anticuerpos hacia OX40R se usaron para las fusiones. Las fusiones se llevaron a cabo como se describe mas adelante, y los sobrenadantes de los hibridomas se ensayaron con respecto a la actividad anti-OX40R mediante ELISA y FACS.

Generacion de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos hacia OX40R:

A los ratones seleccionados anteriormente se les aplico un refuerzo de manera intravenosa con OX40R-Ig a los 3 50 dfas, y despues otra vez a los 2 dfas antes del sacrificio y la extraccion del bazo y/o los nodulos linfaticos.

Los esplenocitos y/o los linfocitos de los nodulos linfaticos aislados a partir de los ratones HuMab o KM inmunizados se fusionaron a celulas de mieloma de raton no secretoras SP2/0 (ATCC, CRL-1581) mediante el uso de electrofusion (E-fusion, tecnologfa Cyto Pulse™, Cyto Pulse™ Sciences, Inc., Glen Burnie, MD), segun los protocolos habituales o recomendados por el fabricante. Brevemente, se prepararon suspensiones de celulas 55 individuales de esplenocitos y/o linfocitos de los nodulos linfaticos de los ratones inmunizados y despues se combinaron con un numero igual de celulas de mieloma de raton no secretoras SP2/0; despues se llevo a cabo la E- fusion.

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Despues, las celulas se colocaron en placas a 2x104 celulas/pocillo en placas de microtitulacion de fondo plano, y se incubaron durante 10-14 dfas en medio selectivo que contema un 10% de suero bovino fetal, 10% de medio acondicionado P388D1 (ATCC, CRL-TIB-63), 3-5% (IGEN) en DMEM (Mediatech, Herndon, VA, N° de cat. CRL 10013, con glucosa elevada, L-glutamina y piruvato sodico), HEPES 7 mM, 2-mercaptoetanol 0,055 mM, 0,1 UI/mL de penicilina - 0,1 mg/mL de estreptomicina, y 1x HAT (Sigma, N° de cat. CRL -P-7185).

Despues de 1-2 semanas, las celulas se cultivaron en medio en el que el HAT se sustituyo por HT. Aproximadamente 10-14 dfas despues de la colocacion en placas de las celulas, los sobrenadantes de los pocillos individuales se cribaron con respecto a la presencia de anticuerpos gamma, kappa humanos. Los sobrenadantes que dieron positivo para gamma, kappa humanos se cribaron despues mediante ELISA y FACS (con el uso del protocolo descrito anteriormente) en busca de anticuerpos IgG monoclonales hacia OX40R humano. Los hibridomas que secretaban anticuerpos se transfirieron a placas de 24 pocillos, se cribaron de nuevo y, si se confirmo que fueron positivos para anticuerpos monoclonales IgG hacia OX40R humano, se subclonaron al menos dos veces mediante dilucion limitante. Los subclones estables se cultivaron despues in vitro para generar pequenas cantidades de anticuerpo en un medio de cultivo de tejidos para la caracterizacion adicional.

Ejemplo 2: Ejemplos biologicos/farmacologicos

A. Procedimientos de estudio in vitro:

Union al dominio extracelular del OX40R: Se diluyo una protema de fusion OX40-Ig humana en tampon carbonato BupH™, pH 9,4 (Pierce, Rockford, IL), se revistio sobre placas Maxisorb de 96 pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca) a 100 |jl/ pocillo (0,25 jg/ml) y se incubaron durante la noche a 4 °C. Las placas se lavaron tres veces con tampon de lavado que contema un 0,05% de Tween 20 (Sigma, St Louis, MO) diluido en PBS (Sigma, St Louis, MO) y se bloquearon con 300 jl/pocillo de 0,5% de BSA (Sigma, St Louis, MO) en PBS durante 1 hora a TA. A continuacion, las placas se lavaron y se incubaron con anticuerpos reactivos anti-OX40 humano diluidos en tampon de bloqueo a diversas concentraciones (100 jl/pocillo) y se incubaron durante 1 hora a TA. Las placas se lavaron despues y se incubaron durante una hora a TA con un anticuerpo anti-cadena kappa humana marcado con peroxidasa de rabano (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) a 25 ng/ml en tampon de bloqueo. Finalmente, las placas de ensayo se lavaron y se anadieron 100 jl/pocillo de sustrato 1-Step Turbo-TMB (Pierce, Rockford, IL) durante 30 minutos a TA. La reaccion se paro anadiendo un volumen igual de H2SO4 2 M, y se leyo la absorbancia a 450 nm en un Molecular Devices Spectra Max 340 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Union basada en FACS a OX40R de la superficie celular: Se usaron lmeas celulares que expresaban OX40R (vease mas adelante) o celulas mononucleares de sangre periferica primarias activadas (vease mas adelante) para estudiar la union a los receptores OX40 tanto humanos como de cynomolgus. Se recogieron las celulas y se lavaron (5 x 105 celulas/tubo) mediante el uso de tampon de lavado a TA. El tampon de lavado consistio en PBS, 2% de suero bovino fetal inactivado termicamente (Hyclone, Logan, UT) y 0,02% de azida sodica (Sigma, St. Louis, MO). A continuacion, se anadieron 100 jl de diversas concentraciones de anticuerpo a las celulas (comenzando a 30 pg/ml y con el uso de una titulacion a un tercio) diluido en tampon de lavado que contema 0,005 mg/ml de citocolasina B (Sigma, St. Louis, MO). Las celulas se agitaron suavemente a TA durante 3 horas. A continuacion, las celulas se lavaron dos veces y se resuspendieron en 0,5 ml/tubo con tampon de lavado fno y se recogieron 10.000 eventos y se analizaron mediante el uso de los programas informaticos FACSCalibur y CellQuest de Becton Dickinson (San Jose, CA).

Ensayo Biacore: El instrumento de analisis de interacciones bioespedficas con biosensores (BIAcore 2000) usa la resonancia de plasmones superficiales para medir interacciones moleculares en un chip sensor CM5. Los cambios en los indices de refraccion entre dos medios, vidrio y dextrano carboximetilado, provocados por la interaccion de moleculas en el lado de dextrano del chip sensor, se miden y se informan como cambios en unidades de reflectancia arbitrarias (UR) tal como se detalla en las notas de aplicacion del fabricante.

Las superficies de dextrano carboximetilado de un chip sensor CM5 se activaron mediante derivatizacion con N- hidroxisuccinimida 0,05 M mediada por N-etil-N'-(dimetilaminopropil) carbodiimida 0,2 M durante 7 min. Se inyecto estreptavidina (Sigma S-4762) a una concentracion de 500 jg/ml, en acetato de Na 10 mM, pH 4,5, en tres superficies (Celda de Flujo 2, 3 y 4) a un caudal de 5 jl/min y se inmovilizo de manera covalente en las superficies de la celda de flujo con aproximadamente 2500 URs. Se inyectaron 35 jl de tampon de acetato de Na 10 mM en la celda de flujo-1 durante la inmovilizacion en lugar de antfgeno para producir una superficie de blanco activado para medir la union inespedfica. La desactivacion de los esteres de N-hidroxisuccinimida sin reaccionar en las cuatro celdas de flujo se llevo a cabo mediante el uso de hidrocloruro de etanolamina 1 M, pH 8,5. Tras la inmovilizacion, las celdas de flujo se lavaron del material sin reaccionar o unido debilmente con 5 inyecciones de regeneracion de 5 jl de NaOH 50 mM hasta que se alcanzo una lmea base estable.

Se inyecto manualmente CD134-muIg biotinilado (Ancell 513-030), a una concentracion de 10 jg/ml a un caudal de 5 jl/min en las celdas de flujo-2, 3 y 4 para conseguir 3 densidades superficiales: Fc-2=150 UR, Fc-3=375 UR y Fc- 4=580 UR. Las superficies de densidades diferentes se prepararon para monitorizar la posibilidad de la union limitada por el transporte de masas durante la fase de asociacion y re-union durante la disociacion, ambos artefactos que se ven influidos por la densidad superficial que se deben evitar.

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Se preparo una serie de diluciones de los anticuerpos hacia OX40R a lo largo de un intervalo de concentraciones de 666 nM a 66 pM semilogarftmicamente en tampon de funcionamiento (HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, 0,005% de polisorbato 20 (v/v)). El caudal se ajusto a 5 pl/min, y se inyectaron 25 pl de cada muestra de punto de concentracion en el chip sensor con una inyeccion de regeneracion de 5 pl de NaOH 50 mM entre cada concentracion de anticuerpo inyectada. El tiempo de disociacion fue de 5 min. Los datos se analizaron mediante el uso del programa informatico BIAevaluation 3.0 de ajuste global (analisis por separado de cada punto de concentracion).

Caracterizacion de epftopos: Se usaron celulas 300-19 que expresaban una construccion de fusion OX40-CD40 humana recombinante correspondiente a la secuencia de aminoacidos 1-235 de OX40 (dominio extracelular y transmembrana) y la secuencia de aminoacidos 216-278 de CD40 (dominio intracelular) para el analisis de epftopos del anticuerpo. La lrnea celular que expresaba OX40-CD40 se cultivo en medio RPMI (Gibco, Grand Island, NY) complementado con un 10% de suero bovino fetal (Hyclone, Logan, UT), hepes 10 mM, 1% de penicilina- estreptomicina, L-glutamina 2 mM, 0,1 mM de aminoacidos no esenciales y 2-mercaptoetanol 0,05 mM (Gibco, Grand Island, NY). Se lavaron celulas 300-19.hCD134.2 (5x105 celulas/tubo) una vez en 3 ml de tampon de lavado fno (PBS, 2% de FBS y 0,02% de azida sodica). El sobrenadante de las celulas se aspiro y se anadieron 100 pl de tampon de lavado que contema 300 pg/ml de anticuerpo reactivo con OX40 sin conjugar primario al sedimento celular, se mezclo y se incubo durante 30 minutos a 4 °C. A continuacion, se anadio un anticuerpo secundario marcado con fluorocromo al tubo, se mezclo y se incubo durante otros 30 minutos a 4 °C. Los anticuerpos marcados con fluorocromo reactivos hacia OX40 incluyeron 10 pl de Ber Act 35 marcado con ficoeritrina (PE) (Caltag Laboratories, Burlingame, CA.), L106 marcado con PE (Bd Pharmingen, San Jose, CA) o anticuerpo hacia OX40R conjugado con Alexa Fluor 647. El anticuerpo hacia OX40R se marco con un fluorocromo mediante el uso del equipo de marcaje de protemas Alex Fluor 647 como describio el fabricante (Molecular Probes, Eugene, OR). Tras la tincion, las celulas se lavaron 3 veces con tampon de lavado, se resuspendieron en tampon fno y se recogieron 10.000 eventos y se analizaron mediante el uso de los programas informaticos FACSCalibur y CellQuest de Becton Dickinson (San Jose, CA). Los anticuerpos dejaron de considerarse con union al mismo epftopo cuando el anticuerpo primario bloqueo la tincion del anticuerpo secundario marcado con el fluorocromo en mas de un 80%.

Ensayo de inhibicion de ligando OX40-OX40R con anticuerpo: Los anticuerpos se ensayaron con respecto a su capacidad de bloquear la union de las celulas 300-19 humanas que expresan el ligando OX40 (L) a placas revestidas con la protema de fusion OX40-IgG1 humana. La lrnea celular 300-19-OX40L se cultivo en medio RPMI (Gibco, Grand Island, NY) complementado con un 10% de suero bovino fetal (Hyclone, Logan, UT), HEPES 10 mM, 1% de penicilina-estreptomicina, L-glutamina 2 mM, 0,1 mM de aminoacidos no esenciales, 2-mercaptoetanol 0,05 mM y 0,5 mg/ml de Geneticina (Gibco, Grand Island, NY). La protema de fusion OX40-IgG1 humana contiene los primeros 220 aminoacidos de la protema OX40 extracelular. La protema de fusion se revistio en placas Nunc Maxisorb (Nunc, Roskilde, Dinamarca) a 100 p/pocillo (5 pg/ml) en tampon de revestimiento (BupH, tampon carbonato-bicarbonato, Pierce, Rockford, IL) y se incubaron durante la noche a 4 °C. A continuacion, las placas se secaron sobre una toalla de papel para eliminar el ftquido, se bloquearon con 200 pl/pocillo con tampon de bloqueo (5% de leche evaporada diluida en PBS) y se incubaron a TA durante dos horas. Las placas se lavaron con pBs y despues se anadieron diversas diluciones de anticuerpo diluido en PBS (50 pl/pocillo) a la placa de ensayo y se incubaron a TA durante 30 minutos. A continuacion, se anadieron 50 pl/pocillo de celulas en PBS a 6x105 celulas/pocillo a los pocillos que conteman anticuerpo y se incubaron durante otros 60 minutos a 37 °C en una camara humidificada con un 5% de CO2. Las placas se lavaron suavemente 2 veces con PBS para eliminar las celulas no adherentes y se midio la actividad celular en los pocillos anadiendo 200 pl de una disolucion en PBS de 20 pg/ml de Diacetato de Fluorescema (Sigma, St. Louis, MO) a cada pocillo. Las placas se incubaron a 37 °C en una camara humidificada con un 5% de CO2 durante 90 minutos y se leyeron mediante el uso de un espectrofotometro a 490 (Spectra Max 340, Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Ensayo de selectividad del anticuerpo hacia OX40R (ELISA): Se revistieron placas de 96 pocillos Maxisorb (Nunc, Roskilde, Dinamarca) con 100 pl de protemas de fusion con miembros de la familia de receptores de TNFa humano a 0,25 pg/ml diluidas en tampon carbonato BupH™, pH 9,4 (Pierce, Rockford, IL) y se incubaron durante la noche a 4 °C. Las protemas de fusion con receptores de selectividad ensayadas incluyeron CD40-Ig (Alexis Biochemicals, San Diego, CA), CD137-Ig (R&D Systems, Minneapolis, MN) y CD271-Ig (Alexis Biochemicals, San Diego, CA). Tambien se incluyo como control positivo con cada ensayo la protema de fusion OX40-Ig (construccion propia, Bioexpress, 97/2117). Las placas se lavaron despues tres veces con tampon de lavado que contema un 0,05% de Tween 20 (Sigma, St Louis, MO) diluido en PBS y se bloquearon con 300 pl de un 0,5% de BSA (Sigma, St Louis, MO) en PBS (Sigma, St Louis, MO) durante 1 hora a TA. A continuacion, las placas se lavaron y se anadieron 100 pl/pocillo de anticuerpos reactivos anti-OX40 humano a las placas a diversas concentraciones y se incubaron durante 1 hora a TA. Las placas se lavaron a fondo tres veces y se detecto la union del anticuerpo hacia OX40R con un anticuerpo anti-cadena kappa humana marcado con peroxidasa de rabano (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) a 25 ng/ml durante 1 hora a TA. Las placas se lavaron despues tres veces, lo cual fue seguido por la adicion de 100 pl/pocillo de sustrato 1-Step Turbo-TMB (Pierce, Rockford, IL) durante 30 minutos a TA. La reaccion se paro mediante la adicion de un volumen igual de H2SO4 2 M. La absorbancia se leyo a 450 nm en un Molecular Devices Spectra Max 340 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Reactividad cruzada entre especies: Lmeas celulares que expresan OX40R: La lrnea celular 300-19 que expresa

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una construccion de fusion OX40-CD40 humana recombinante que corresponde a 1-235 de OX40R (dominio extracelular y transmembrana) y 216-278 de CD40 (dominio intracelular) o la protema OX40R completa de cynomolgus.

Preparacion de linfocitos T humanos: Se recogio sangre completa humana en jeringas heparinizadas (Baxter; Deerfield, IL) y despues se transfirio inmediatamente a tubos Sigma Accuspin (Sigma, St. Louis, MO) para el aislamiento de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) como describio el fabricante. Las PBMC se lavaron dos veces con DPBS y se aislaron los linfocitos T mediante el uso de una columna de purificacion de celulas T como describio el fabricante (R & D Systems, Minneapolis, MN). Brevemente, las PBMCs se resuspendieron en 2 ml de tampon de columna y se cargaron en una columna de aislamiento de celulas T pre-lavada. Las PBMCs se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente y se eluyeron las celulas T con tampon de columna, se lavaron una vez y se resuspendieron en MCT a 2x106 celulas/ml que consistfa en RPMI 1640 (Sigma, St Louis, MO) complementado con un 10% de suero bovino fetal (Hyclone, Logan, UT) y L-glutamina (2 mM), Hepes (10 mM), penicilina (100 U/ml), estreptomicina (50 pg/ml) (Gibco, Grand Island, NY.). Se anadio un volumen de 2 ml de celulas T que conteman un anticuerpo anti-CD28 humano a 1 pg/ml (clon 37407, R & D Systems, Minneapolis, MN) a los pocillos de una placa de 24 pocillos pre-revestida con un clon con anticuerpo anti-CD3 humano UCTH1 (R & D Systems, Minneapolis, MN) a 5 pg/ml en PBS. Los cultivos de celulas T se estimularon durante 3 dfas antes de analizar la reactividad cruzada de OX40 humano mediante citometna de flujo.

Preparacion de PBMCs de cynomolgus: Se obtuvo sangre completa de cynomolgus mediante el uso de tubos Vacutainer heparinizados (BD; Franklin Lakes, NJ) y se diluyo 1:4 en PBS. La sangre completa diluida se mezclo, y se depositaron cuidadosamente en capas 15 ml sobre un volumen igual de Histopaque 1077 (Sigma, St Louis, MO). Los tubos se centrifugaron a 1000 x g durante 45 minutos a TA y la interfase de PBMC mononucleares se recogio, se lavo una vez en PBS y se resuspendio durante 2 minutos a TA con tampon de lisis ACK (Biosource, Rockville MD) para eliminar las rBcs. Despues de un lavado con PBS, las PBMCs se contaron y se reajustaron a 1x106 celulas/ml en medio de cultivo de tejidos (MCT). El MCT consistio en RPMI 1640 (Sigma, St Louis, MO) complementado con un 10% de suero bovino fetal (Hyclone, Logan, UT) y L-glutamina (2 mM), Hepes (10 mM), penicilina (100 U/ml), estreptomicina (50 pg/ml) adquirida de Gibco (Grand Island, NY). A continuacion, se anadieron 2 ml de la preparacion de PBMC que conteman un anticuerpo con reactividad cruzada anti-CD28 humano (clon CD28.2, BD Biosciences, San Diego, CA) a los pocillos de una placa de 24 pocillos (Costar, Corning, NY) pre- revestida con un anticuerpo anti-CD3 de mono (clon FN18, Biosource, Camarillo, CA) a 10 pg/ml en PBS. Los cultivos de PBMCs se estimularon durante 4 dfas antes de analizar la reactividad cruzada de OX40 humano mediante citometna de flujo.

Preparacion de PBMCs de conejo: Se extrajo sangre completa de conejo en tubos Vacutainer heparinizados (BD; Franklin Lakes, NJ) y se diluyo inmediatamente 1:3 con HBSS caliente (Gibco, Grand Island, NY). Despues de mezclar, se depositaron cuidadosamente en capas 5 ml de la sangre diluida sobre un volumen igual de Lympholyte- Rabbit (Cedarlane Laboratories, Westbury, NY) y se centrifugaron durante 30 minutos a 25 °C. La interfase de PBMC se recogio, se lavo dos veces con PBS y se resuspendio a 2x106 celulas/ml en MCT que contema PHA a 10 ng/ml (Remel, Lenexa, KS). Las celulas se cultivaron durante 24-48 horas.

Preparacion de PBMCs caninas: Se recogio sangre completa canina mediante el uso de tubos Vacutainer heparinizados (BD; Franklin Lakes, NJ). A continuacion, la sangre se mezclo con un volumen igual de HBSS caliente (Gibco, Grand Island, NY). Se depositaron lentamente en capas cuatro ml de sangre diluida sobre 3 ml de Lympholyte-M (Cedarlane Laboratories, Westbury, NY) en tubos conicos de 15 ml. Los tubos se centrifugaron durante 20 minutos a 800 x g y se recogio la interfase de PBMC, se lavo dos veces con HBSS y se resuspendio en MCT a 2 x 106 celulas/ml. Se anadieron PBMCs a los pocillos de una placa de 24 pocillos (2 ml/pocillo) y las celulas se estimularon con 2 pg/ml de ConA (Sigma, St. Louis, MO) durante 48 horas.

Preparacion de PBMCs murinas y de rata: La sangre completa de rata recogida en jeringas heparinizadas se diluyo 1:3 en HBSS caliente. A continuacion, se depositaron cuidadosamente en capas 5 ml sobre un volumen igual de Lympholyte-Rat (Cedarlane Laboratories, Westbury, NY). Los tubos se centrifugaron durante 20 minutos a 1500 RPM. Se recogio la interfase de PBMCs, se lavo dos veces y el sedimento celular se re-ajusto a 2x106 celulas/ml en MCT. Se anadieron dos ml de celulas a cada pocillo de una placa de 24 pocillos y se estimularon durante 24-48 horas con PHA (Remel, Lenexa, KS) a 10 ng/ml antes de la tincion de citometna de flujo.

Tincion de citometna de flujo para la reactividad cruzada entre especies: Se usaron PBMCs estimuladas de raton, rata, conejo, perro y cynomolgus y la lmea celular 300-19 que expresa el receptor OX40 de cynomolgus para analizar la reactividad cruzada entre especies del anticuerpo hacia OX40 humano. Se usaron linfocitos T activados que expresaban OX40 humano y celulas 300-19 transducidas con OX40 como controles positivos. Las celulas (5,0x105 celulas/tubo) se lavaron una vez en tampon de lavado fno (PBS, 2% de FBS y 0,02% de azida sodica) y se anadieron 100 pl/tubo de control conjugado a Alexa Fluor 647 o anticuerpos reactivos hacia OX40 a 5 pg/ml a cada tubo. Los anticuerpos se marcaron mediante el uso de un equipo de marcaje de protemas Alex Fluor 647 como describio el fabricante (Molecular Probes, Eugene, OR). Las celulas se incubaron en la oscuridad con anticuerpos con fluorocromo en hielo durante 30 minutos, se lavaron tres veces y se resuspendieron en 0,5 ml de tampon de lavado para el analisis. Se midio la tincion de anticuerpos y se analizo mediante el uso del programa informatico FACSCalibur y CellQuest de Becton Dickinson (San Jose, CA).

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Ensayo de actividad de luciferasa: Se prepararon celulas 293T que conteman el dominio extracelular de OX40 y el dominio intracelular de CD40 fusionados a un indicador de NfkB que contema luciferasa. Las celulas se recogieron, se lavaron y se resuspendieron en medio completo sin rojo fenol (DMEM que contema un 10% de suero bovino fetal, tampon HEPES, aminoacidos no esenciales y L-glutamina) a una densidad de 0,5 X 106 celulas/ml. Se colocaron en placas 80 ul de celulas en cada pocillo de ensayo de una placa de 96 pocillos (PerkinElmer, numero de pieza 6005680). Los anticuerpos de ensayo se anadieron a cada pocillo solos o en presencia de un anticuerpo de entrecruzamiento Fab' anti-IgG humana de cabra (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). La placa se incubo durante la noche a 37 °C. Se anadieron 100 ul de luciferasa (Promega, sistema de ensayo de luciferasa Bright-Glo, n° de cat. E2620) al siguiente dfa y se midio la cantidad de actividad de luciferasa mediante el uso de un contador de centelleo (TopCount, Packard -NXT).

Ensayo de aCD3 IL-2 humano: Se recogio sangre completa humana en jeringas heparinizadas (Baxter; Deerfield, IL), se deposito por capas en tubos Accuspin (Sigma; St. Louis, MO) y se centrifugo durante 15 minutos a 2000 rpm. Se recogio la capa leucocitaria, se lavo con PBS (Sigma, St. Louis, MO), y los eritrocitos se lisaron con agua. Las celulas T se separaron con columnas de enriquecimiento de CD3+ humano (R&D Minneapolis, MN), se contaron y se ajustaron a 1 x 106 celulas/ml en medio RPMl (Gibco; Grand Island, NY) que contema: 10% de suero bovino fetal (Hyclone; Logan, UT), hepes 10 mM, 1% de penicilina-estreptomicina, L-glutamina 2 mM y 0,1 mM de aminoacidos no esenciales (todos de Gibco). Al mismo tiempo, el clon anti-CD3e humano #UCHT1 (R&D systems, Minneapolis, MN) se coloco a 2,5 pg/ml en PBS en placas de 24 pocillos (Costar; Corning, NY) y se incubaron durante 2 horas a 37 °C. Las placas se lavaron 3x con PBS y se anadio lo siguiente a los pocillos: celulas T a 1 x 106 celulas/pocillo, diluciones en serie de anticuerpos hacia OX40 (o control de IgG2 KLH) y F(ab')2 anti-FcY de IgG humana de cabra para el entrecruzamiento (anadido a 2,5 pg/mL). Los sobrenadantes se extrajeron a las 48 y 72 horas y se determinaron los niveles de IL-2 mediante ELISA (R&D).

Ensayo de aCD3 IL-2 de cynomolgus: Se recogio sangre completa de mono cynomolgus en tubos heparinizados (BD; Franklin Lakes, NJ), se diluyo 1:4 en PBS, se deposito por capas sobre Histopaque 1077 (Sigma, St Louis, MO) y se centrifugo durante 45 minutos a 2200 rpm. Se recogio la capa leucocitaria, se lavo con PBS, y se lisaron los eritrocitos con agua. Las celulas se ajustaron a 1 x 106 celulas/ml y se anadieron a placas de 24 pocillos que se habfan pre-revestido durante 2 horas con concentraciones variables de anti-CD3 de mono, clon FN-18 (Biosource; Camarillo, CA) a 37 °C. Se anadieron diluciones en serie de anticuerpo hacia OX40 (o control de IgG2 KLH), asf como F(ab')2 anti-FcY de IgG humana de cabra a 2,5 pg/mL a los pocillos. Los sobrenadantes se recogieron a las 24 y 48 horas y se determinaron los niveles de IL-2 mediante ELISA (Biosource, Camarillo, CA).

Ensayo de celulas T sensibilizadas con aloantfgeno: Se incubaron celulas T humanas recien aisladas (vease anteriormente) con celulas tumorales alogenicas tratadas con mitomicina c (Raji) durante 3-4 dfas. Despues se recogieron las celulas T, se lavaron, y se dejaron en reposo durante 1 dfa en medio nuevo antes de estimularlas con 11D4. Se determino el nivel de IL-2 24 horas mas tarde mediante ELISA (R&D systems, Minneapolis, MN).

B. Procedimientos de estudio in vivo

Modelos de tumores humanos SCID-beige mediante el uso de ratones con injertos de celulas T y celulas dendnticas humanas: Se aclimataron ratones SCID-beiges (Taconic #CBSBG-MM) durante 5-7 dfas despues de su llegada, antes del uso. Se usaron las siguientes lmeas celulares tumorales: RAJI, ATCC #CCL-86; BT-474, ATCC #HTB-20; PC-3, ATCC#-1435; y LoVo, ATCC# CCL-229.

Se prepararon linfocitos T purificados (celulas T) y celulas dendnticas derivadas de monocitos a partir de sangre humana como sigue: Se recogieron las celulas mononucleares humanas a partir de sangre heparinizada mediante el uso de tubos Sigma Accuspin #A7054. Las celulas se recogieron, se colocaron en un matraz T75, y se incubaron durante 3 hrs a 37 °C en un incubador humidificado con un 5% de CO2. Las celulas no adherentes se recogieron y se guardaron (vease mas adelante). El matraz que contema las celulas adherentes se incubo con 20 ml de medio completo RPMI (que contema un 10% de suero bovino fetal) complementado con IL-4 (R&D) a 10 ng/ml y GM-CSF (R&D) a 100 ng/ml. El cultivo se incubo despues durante 6-7 dfas a 37 °C en un incubador humidificado con un 5% de CO2. Las celulas dendnticas derivadas de monocitos no adherentes se recogieron despues mediante decantacion y lavado del matraz varias veces con medio completo RPMI.

Las celulas mononucleares no adherentes iniciales se usaron para purificar celulas T por medio de seleccion negativa de afinidad elevada mediante el uso de columnas de enriquecimiento de celulas T (R&D) segun las instrucciones del fabricante. Las celulas T purificadas se crio-conservan en medio de cultivo celular de recuperacion a 107 celulas/ml y se almacenan en nitrogeno lfquido hasta su uso. Las celulas tumorales (1 x 107) se inyectaron de manera subcutanea (SC) con celulas T (1 x 106) y celulas dendnticas derivadas de monocitos (5 x 105) del mismo donante, a 0,2 mL/raton. Se monitorizo el crecimiento tumoral a lo largo del tiempo con un calibre.

C. Resultados para el anticuerpo 11D4 (1) Estudios in vitro:

Ciertas propiedades del anticuerpo 11D4 de los estudios in vitro se resumen en la Tabla 3.

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El anticuerpo 11D4 se une al OX40R con afinidad elevada.

Esto se demostro mediante el uso de una protema de fusion de IgG1 que contema el dominio extracelular del OX40R y en celulas completas (celulas transfectadas OX40R+ y celulas T primarias activadas). En los ejemplos que usan la protema de fusion de IgG1, 11D4 se unio al dominio extracelular del OX40R con una CE50 de 0,5 +/- 0,18 |jg/mL (3,5 nM). Esta union se confirmo en celulas pre-B 300-19 que expresaban el dominio extracelular de longitud completa del OX40R (no se observo union en las celulas 300-19 originarias). La CE50 para la union a celulas transfectadas con OX40R fue 0,2 +/- 0,16 jg/mL (1,7 nM). Para confirmar que la union se observo en celulas T primarias, se aislaron celulas T de sangre periferica de multiples donantes humanos y se estimularon con anti-CD3 y anti-CD28 durante 2 dfas para aumentar la expresion del OX40R. Los datos de union de saturacion en estas celulas T indicaron que 11D4 se une con una CE50 de 0,6 +/-1,0 jg/mL (4,0 nM, N = 17 donantes). Estos datos demuestran que 11D4 se une con avidez al OX40R.

Para caracterizar adicionalmente esta union, se recogieron datos para determinar la region del dominio extracelular del OX40R en la que interacciona 11D4, y tambien para determinar si el receptor fue transportado al interior tras la union. Los datos de union competitiva a la protema de fusion OX40R-IgG1 indicaron que 11D4 compite por la union con las celulas que expresan el ligando OX40, lo que proporciona pruebas de que 11D4 interacciona en la region de union al ligando del receptor. Ademas, 11D4 no compite de manera cruzada con dos anticuerpos hacia OX40R disponibles comercialmente, BerAct35 y L106, por la union a celulas T tal como se determina mediante analisis FACS. El analisis FACS mediante el uso de anticuerpos de deteccion no competitivos indico que el OX40R no se transporto al interior tras la pre-incubacion de celulas T primarias activadas con 11D4 durante 30 minutos. Su afinidad de union, determinada mediante analisis Biacore con el uso de la protema de fusion del dominio extracelular de OX40R como ligando inmovilizado, indico que la constante de disociacion en equilibrio (KD) de 11D4 para la union fue 0,48 nM. Estos analisis tambien estimaron que la constante de velocidad de disociacion (kd) de 11D4 fue de 5,72 E-05 1/s. Por lo tanto, 11D4 se une con una afinidad elevada a la region de union al ligando del OX40R, tiene una constante de disociacion lenta, y no transporta al interior el receptor tras la union.

El anticuerpo 11D4 se une selectivamente al OX40R.

La selectividad de 11D4 por el OX40R se determino frente a otros miembros de la superfamilia de TNFR mediante el uso de datos relacionados con las construcciones de protemas de fusion de IgG1 que contienen el dominio extracelular respectivo del receptor relacionado. Estos receptores incluyeron el receptor CD40, el receptor 4-1BB (CD137) y el receptor del factor de crecimiento neuronal (CD271). En todos los casos, no se observo una union significativa a concentraciones de hasta 100 jg/mL (700 nM) en estos receptores. Cuando se comparo con la union observada a la protema de fusion de OX40R (CE50 = 0,5 pg/ml), estos datos demuestran que 11D4 es >100 veces selectivo para OX40R frente a otros miembros de la familia relacionados analizados. (Veanse las Figuras 1a y 1b).

Actividad funcional del anticuerpo 11D4:

La actividad funcional de 11D4 se demostro tanto en celulas transfectadas OX40R+ como en celulas T primarias. En estos ensayos, 11D4 demostro una actividad agonista cuando se anadio a las celulas con o sin un anticuerpo secundario, F(ab')2 anti-FcY de IgG humana de cabra.

En el primer grupo de experimentos, se determino la actividad agonista de 11D4 mediante el uso de celulas 293 transfectadas con el dominio extracelular y transmembrana del OX40R fusionado al dominio intracelular de CD40 con un indicador de luciferasa con NFkB. En este ensayo, 11D4 aumento la senalizacion a traves del OX40R con una CE50 media de 0,33 jg/mL (2,2 nM, N = 4). Se muestra una curva concentracion-respuesta representativa para la induccion de luciferasa por 11D4 en la Figura 2. En ausencia del anticuerpo secundario F(ab')2, la magnitud de la actividad de luciferasa se redujo 4 veces junto con la CE50.

Como prueba adicional de la actividad agonista de 11D4, se generaron celulas T espedficas del antfgeno. Se incubaron celulas T humanas recien aisladas con celulas tumorales alogenicas tratadas con mitomicina c (Raji) durante 3-4 dfas. Despues se recogieron las celulas T, se lavaron, y se dejaron en reposo durante 1 dfa en medio nuevo antes de estimularlas con 11D4. El analisis FACS indico un nivel elevado de expresion de OX40R en estas celulas incluso despues del reposo. 11D4 indujo niveles elevados de IL-2 en estas celulas, que en algunos casos superaron 100 ng/mL (Figura 3). La CE50 media para esta respuesta de 2 ejemplos distintos fue 0,008 +/- 0,006 jg/mL. En ausencia de 11D4, solamente se secretaron niveles mmimos de IL-2 en estas celulas.

11D4 tambien aumenta la produccion de IL-2 por las celulas T humanas primarias estimuladas mediante anti-CD3. Aunque la proporcion senal-ruido en este ensayo fue baja en ciertos ensayos debido a la induccion de IL-2 mediante anti-CD3 solo, 11D4 aumento la produccion de IL-2 cuando se anadio con F(ab')2 anti-FcY de IgG humana de cabra. No se observo actividad para 11D4 en celulas T recien aisladas en ausencia de anti-CD3. La magnitud del aumento de IL-2 mediante 11D4 oscilo de 2,3 a 57 veces frente a anti-CD3 solo dependiendo del donante y de la cantidad de IL-2 generada por anti-CD3. El efecto de 11D4 sobre la produccion de IL-2 por las celulas T humanas primarias estimuladas con 2,5 jg/mL de anti-CD3 se representa en la Figura 4 (mediante el uso de una curva de concentraciones de 8 puntos con diluciones 1:3). La CE50 media calculada a partir de esos datos que usaron las curvas concentracion-respuesta de 8 puntos fue 0,042 +/- 0,01 jg/mL (vease la Tabla 4).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

La actividad funcional de 11D4 sobre la produccion de IL-2 se ensayo tambien mediante el uso de celulas de mono estimuladas con anti-CD3 y 11D4 (junto con el anticuerpo secundario F(ab')2). Los resultados se representan en la Figura 5 y en la Tabla 5. Estos datos indicaron que la CE50 para 11D4 fue similar entre las celulas de mono y humanas (0,022 frente a 0,042 pg/mL para las celulas humanas), pero la magnitud de la IL-2 inducida por encima de la de anti-CD3 solo fue significativamente menor con el uso de celulas T de Cynomolgus (aprox. 35 veces, 5762 +/- 4748 pg/mL de IL-2 para las celulas humanas (N = 21) frente a 261 +/- 294 pg/mL de IL-2 para las celulas de mono (N = 9).

Reactividad cruzada entre especies:

Se determino la capacidad de 11D4 de unirse a celulas T de multiples especies. Se aislaron celulas T de raton, rata, conejo, perro, y mono y se activaron con anti-CD3 mas anti-CD28 o mitogeno. No se observo union a celulas de raton, rata, conejo o perro tal como se indica mediante analisis FACS. La ausencia de union a OX40R de raton tambien se confirmo mediante ELISA con el uso de una protema de fusion disponible comercialmente que contema el dominio extracelular del OX40R murino. En contraste, 11D4 se une a celulas T de mono Cynomolgus tal como se determino en un ensayo de union de saturacion mediante FACS. El intervalo de valores de CE50 obtenidos mediante el uso de diferentes monos se muestra en la Figura 6. Como comparacion, el intervalo de valores de CE50 obtenidos mediante el uso de celulas humanas se muestra en la Figura 7. Aunque variable, el intervalo de valores de CE50 fue similar entre celulas de mono y humanas (los valores medios son 0,354 pg/mL para celulas de mono frente a 0,566 pg/mL para celulas humanas).

(2) Estudios in vivo:

La ausencia de reactividad cruzada de 11D4 con el OX40R murino requirio el desarrollo de un modelo de tumor xenogenico con el uso de ratones beiges con inmunodeficiencia combinada grave (SCID). Los ratones SCID-beiges carecen de linfocitos T y B murinos y celulas NK, lo que les hace receptores ideales para el injerto de celulas inmunitarias humanas y el crecimiento de tumores humanos. Se ensayaron cuatro lmeas celulares tumorales que representan diversos tipos de tumores en este modelo in vivo. Ninguna de las lmeas tumorales expresaron OX40R. En todos los casos, las celulas tumorales (1 x 107) se inyectaron de manera subcutanea (SC) con celulas T (1 x 106) y celulas dendnticas derivadas de monocitos (5 x 105) del mismo donante. El 11D4 administrado mediante inyeccion intraperitoneal (IP) inhibio el crecimiento tumoral hasta en un 98% en estos modelos como se resume en la Tabla 6. La via de administracion IP se eligio para 11D4 debido a su facilidad de administracion y diseminacion rapida hacia la sangre periferica.

Eficacia de 11D4 contra un linfoma de celulas B en ratones SCID-beiges:

Se inyecto SC a ratones SCID-beiges el linfoma de celulas B de Burkitt, Raji, junto con celulas T humanas y celulas dendnticas derivadas de monocitos. Los ratones recibieron una unica inyeccion IP de 11D4 o un anticuerpo de control de isotipo (IgG2 anti-KLH) en el momento de la inyeccion del tumor. Como se muestra en la Figura 8, 11D4 disminuyo la velocidad de crecimiento tumoral en los animales tratados. El tamano del tumor en cada animal individual (N = 10) en el dfa 21 tras la exposicion se muestra en la Figura 9, que ilustra una inhibicion del 64% del crecimiento tumoral con un nivel de dosis de 10 mg/kg. No se observo actividad en ausencia de celulas T y celulas dendnticas.

Eficacia de 11D4 en un modelo de tumor de prostata:

Se inyecto SC a ratones SCID-beiges el adenocarcinoma de prostata PC-3 junto con celulas T humanas y celulas dendnticas derivadas de monocitos. Los ratones recibieron una unica inyeccion IP de 11D4 o un anticuerpo de control de isotipo (IgG2 anti-KLH) en el momento de la inyeccion del tumor. Los resultados, que se representan en la Figura 10, muestran que el tratamiento con 11D4 dio como resultado una inhibicion dependiente de la dosis del crecimiento tumoral. El tamano de los tumores en cada animal individual (N = 10) de este estudio en el dfa 27 tras la exposicion se muestra en la Figura 11, que ilustra una inhibicion del 70% del crecimiento tumoral cuando se administro a los animales una unica inyeccion de 1,0 mg/kg de 11D4, y una inhibicion del 90% a una dosis de 10 mg/kg. Los niveles plasmaticos de 11D4 determinados en el dfa 27 en estos animales fueron 6,2 pg/mL al nivel de dosis de 1,0 mg/kg.

Eficacia de 11D4 en un modelo de tumor de carcinoma de colon:

Se inyecto SC a ratones SCID-beiges el adenocarcinoma colorrectal LoVo junto con linfocitos T humanos y celulas dendnticas derivadas de monocitos autologos. Los ratones recibieron una unica inyeccion IP de 11D4 o un anticuerpo de control (IgG2 anti-KLH) en el momento de la inyeccion del tumor. Los resultados, que se representan en la Figura 12, demuestran que la dosis de 11D4 disminuyo de manera dependiente el crecimiento tumoral en estos animales. El tamano de los tumores en cada animal individual (N = 10) de este estudio en el dfa 27 tras la exposicion se muestra en la Figura 13, que ilustra una inhibicion del 64 % del crecimiento tumoral mediante el uso de una unica dosis de 1,0 mg/kg y una inhibicion del 87 % del crecimiento tumoral a un nivel de dosis de 10,0 mg/kg.

Eficacia de 11D4 en un modelo de tumor de carcinoma mamario

Se inyecto SC a ratones SCID-beiges el carcinoma mamario BT474 junto con linfocitos T humanos y celulas dendnticas derivadas de monocitos autologos. Los ratones recibieron dos inyecciones (IP) de 11D4 o un anticuerpo de control (IgG2 anti-KLH) en el momento de la inyeccion del tumor y de nuevo 30 dfas mas tarde. Los resultados, que se representan en la Figura 14, demuestran que 11D4 disminuyo el crecimiento tumoral en estos animales. El 5 tamano de los tumores en cada animal individual (N = 10) de este estudio en el dfa 85 tras la exposicion se muestra en la Figura 15 que ilustra una inhibicion del 98% del crecimiento tumoral a un nivel de dosis de 10,0 mg/kg y una inhibicion del 85% a una dosis de 1 mg/kg.

D. Resultados para el anticuerpo 18D8

(1) Estudios in vitro:

10 Los resultados de los estudios in vitro para el anticuerpo 18D8 se resumen en la Tabla 7.

El efecto del anticuerpo 18D8 sobre la produccion de IL-2 inducida por anti-CD3 por las celulas T humanas primarias de diferentes donantes tambien se muestra en la Tabla 8.

(2) Estudios in vivo:

Eficacia de 18D8 contra el linfoma de celulas B en un modelo de ratones SCID-beiges

15 Se inyecto SC a ratones SCID-beiges el linfoma de celulas B de Burkitt, Raji, junto con linfocitos T humanos y celulas dendnticas derivadas de monocitos autologos. Los ratones recibieron una unica inyeccion IP de 18D8 o un anticuerpo de control de isotipo (IgG2 anti-KLH) en el momento de la inyeccion del tumor. Se usaron diez animales por grupo en cada estudio. Los resultados de dos estudios se presentan en la Tabla 9. Los resultados demuestran que 18D8 produjo una eficacia anti-tumoral significativa a las dosis de 1,0 mg/kg y 10 mg/kg. No se observo 20 actividad en ausencia de celulas T y celulas dendnticas, lo que sugiere que este efecto anti-tumoral puede estar mediado por el sistema inmunitario.

Eficacia de 18D8 contra el tumor de prostata en un modelo de ratones SCID-beiges

Se inyecto SC a ratones SCID-beiges el adenocarcinoma de prostata PC-3 junto con celulas T humanas y celulas dendnticas derivadas de monocitos autologos. Los ratones recibieron una unica inyeccion IP de 18D8 o un 25 anticuerpo de control de isotipo (IgG2 anti-KLH) en el momento de la inyeccion del tumor. Se usaron diez animales por grupo en el estudio. Los resultados se presentan en la Tabla 9. Los resultados demuestran que el tratamiento con 18D8 dio como resultado una inhibicion del 42%, 90%, y 88% del crecimiento tumoral a las dosis de 0,1 mg/kg, 1,0 mg/kg, y 10 mg/kg, respectivamente.

Informacion de deposito

30 Los solicitantes han depositado un cultivo de E. coli DHa5 que contiene un plasmido que codifica la cadena pesada del anticuerpo 11D4 y un cultivo de E. coli DHa5 que contiene un plasmido que codifica la cadena ligera del anticuerpo 11D4 en la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 201102209, el 10 de julio de 2007, a los que se les han asignado los numeros de deposito PTA-8524 y PTA-8525, respectivamente. Estos depositos se hicieron en virtud de las estipulaciones del Tratado de Budapest sobre el 35 Reconocimiento Internacional del Deposito de Microorganismos a los Fines del Procedimiento en Materia de Patentes y las normas allf expuestas (Tratado de Budapest). Estos depositos se mantendran sin limitacion en el almacen de la ATCC durante un periodo de 30 anos, o 5 anos despues de la peticion mas reciente, o durante la vida eficaz de la patente, lo que sea mas largo, y se sustituira si los depositos dejan de ser viables durante ese periodo. La disponibilidad de los materiales depositados no se debe considerar como una licencia para poner en practica la 40 invencion en contravencion de los derechos concedidos bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patentes.

Tabla 1. Identificadores de secuencia para los anticuerpos 11D4 y 18D8

SEQ ID N°:

Anticuerpo Secuencia

1

11D4 Aminoacidos de CDR1 de Vh

2

11D4 Aminoacidos de CDR2 de Vh

3

11D4 Aminoacidos de CDR3 de Vh

4

11D4 Aminoacidos de CDR1 de Vl

5

11D4 Aminoacidos de CDR2 de Vl

6

11D4 Aminoacidos de CDR3 de Vl

SEQ ID N°:

Anticuerpo Secuencia

7

11D4 Aminoacidos de Vh

8

11D4 Aminoacidos de Vl

9

11D4 Aminoacidos de la Cadena Pesada

10

11D4 Aminoacidos de la Cadena Ligera

11

11D4 Acido Nucleico de Vh

12

11D4 Acido Nucleico de VL

13

18D8 Aminoacidos de CDR1 de Vh

14

18D8 Aminoacidos de CDR2 de Vh

15

18D8 Aminoacidos de CDR3 de VH

16

18D8 Aminoacidos de CDR1 de Vl

17

18D8 Aminoacidos de CDR2 de Vl

18

18D8 Aminoacidos de CDR3 de VL

19

18D8 Aminoacidos de Vh

20

18D8 Aminoacidos de Vl

21

18D8 Aminoacidos de la Cadena Pesada

22

18D8 Aminoacidos de la Cadena Ligera

23

18D8 Acido Nucleico de Vh

24

18D8 Acido Nucleico de Vl

Tabla 2A. Secuencias de aminoacidos para el anticuerpo 11D4

DESCRIPCION

SECUENCIA (Region variable en mayusculas, region constante en minusculas, CDRs subrayadas)

Cadena Pesada

EVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVROAP GKGLEWVSYISSSSSTIDYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLOMN SLRDEDTAVYYCARESGWYLFDYWGOGTLVTVSSastkeDsvfDl a apcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslsswtvpssnfg tqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtc vwdvshedpevqfhwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltwhqdwlngkeykc kvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesn gqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg k

DESCRIPCION

SECUENCIA (Region variable en mayusculas, region constante en minusculas, CDRs subrayadas)

Cadena Ligera

DIOMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASOGISSWLAWYOOKPEK APKSLIYAASSLOSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATY YCOOYNSYPPTFGGGTKVEIKrtvaaDSvfifbDsdealksetaswcllnnfV preakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglss pvtksfnrgec

Tabla 2B. Secuencias de aminoacidos para el anticuerpo 18D8

DESCRIPCION

SECUENCIA (Region variable en mayusculas, region constante en minusculas, CDRs subrayadas)

Cadena Pesada

EVOLVESGGGLV OPGRSLRLSC AASGFTFDD Y AMHWVROAP GKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLOM NSLRAEDTALYYCAKDOSTADYYFYYGMDVWGOGTTVTVS Sastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglysl sswtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappvagpsvflfppkpk dtlmisrtpevtcvwdvshedpevqfnwyv'dgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvh qdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgf ypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealh nhytqkslslspgk

Cadena Ligera

EIVVTOSPATLSLSPGERATLSCRASOSVSSYLAWYOOKPGOA PRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYY COORSN WPTF GOGTKVEIKrtvaapsvfifppsdeq lksgtas wcilnnfVpre akvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvt ksfnrgec

Tabla 3. Resumen de ciertas propiedades in vitro del anticuerpo 11D4

Parametro

Actividad qg/ml (nM)

Afinidad por OX40R: (Biacore) Kd Velocidad de disociacion (kd)

0,07 0,48 5,7E-05 1/s

Parametro

Actividad pg/ml (nM)

Union a OX40R:

Dominio extracelular de la protema de fusion

0,5 +/- 0,18 3,50

Union de saturacion (CE50):

Celulas T estimuladas con CD3/CD28 (N = 17)

0,6 +/- 1,00 4,00

Celulas 300-19 OX40R+ (N = 5)

0,2 +/- 0,16 1,70

Estimulacion in vitro de celulas transfectadas OX40R+ (luciferasa) (CE50; N = 4)

0,33 +/- 0,22 2,20

Aumento de la actividad de celulas T:

- Produccion de IL-2 inducida por CD3 (N = 12)

0,042 +/- 0,01 0,30

- Estimulacion de la produccion de IL-2 por celulas sensibilizadas con antfgeno (N = 2)

0,008 +/- 0,006 0,04

Selectividad (union) (CD40, CD137, CD271)

> 100 pg/mL >700,00

Los valores representan la media +/- una DE

Tabla 4. Efecto del anticuerpo 11D4 sobre la produccion de IL-2 inducida por anti-CD3 por celulas T humanas primarias

CE50 (pg/mL)

IL-2 Max (pg/mL) CEmax (pg/mL) indice de Estimulacion Donante

0,008

4831 0,05 3,8 1

0,011

5450 0,05 2,6 2

0,014

6571 0,5 2,3 3

0,014

7271 0,05 5,9 4

0,011

6313 0,05 9,1 5

ND

ND

ND

7,0 6

0,010

1006 0,05 4,8 7

ND

ND

ND

5,9 8

ND

ND

ND

25,4 9

ND

ND

ND

57,0 10

ND

ND

ND

8,3 11

ND

ND

ND

5,1 12

ND

ND

ND

2,7 13

ND

ND

ND

4,6 14

0,014

4687 0,05 6,0 15

0,014

3012 0,05 35,2 16

CE50 (Hg/mL)

IL-2 Max (pg/mL) CEmax (Hg/mL) indice de Estimulacion Donante

ND

ND

ND

21,4 17

0,029

2796 0,125 3,8 18

0,052

1718 0,125 5,5 19

0,020

14190 0,56 16,8 20

0,068

1611 1,67 7,9 21

IL-2 Max: Cantidad de IL-2 producida con 11D4 a la CEmax con anti-CD3 solo

CEmax: Concentracion de 11D4 que produce el nivel maximo de IL-2 con anti-CD3 solo

fndice de Estimulacion: Proporcion del nivel maximo de IL-2 producido con 11D4 frente a la cantidad de IL-2 producida con anti-CD3 solo

ND = no determinado.

Los valores para los ultimos cuatro donantes (18-21) son de la curva dosis-respuesta hecha en diluciones 1:3 o 1:4 de 8 puntos; todos los demas valores representan curvas de dilucion logantmica. La CE50 de las curvas de concentracion 1:3 y 1:4 fue 0,042 +/- 0,01 ug/mL, N = 4.

Tabla 5. Efecto del anticuerpo 11D4 sobre la produccion de IL-2 inducida por anti-CD3 por celulas T de cynomolgus

CE50 (Hg/mL)

IL-2 Max Inducida (pg/mL) CEmax (Hg/mL) indice de Estimulacion Donante

0,007

376 0,05 3,5x 32750

0,002

116 0,05 2,2x 2325

ND

ND

ND

2,0x 32405

0,007

167 0,05 34,4 32081

0,011

978 0,005 5,6x 32842

ND

ND

ND

6,3x 2325

0,008

40 0,021 2,7x 33081

0,031

168 0,062 5,0x 33080

0,028

128 0,062 3,8x 33062

IL-2 Max: Cantidad de IL-2 producida con 11D4 a la CEmax con anti-CD3 solo

CEmax: Concentracion de 11D4 que produce el nivel maximo de IL-2 con anti-CD3 solo

fndice de Estimulacion: Proporcion de IL-2 maxima producida con 11D4 sobre la cantidad producida con anti-CD3 solo

ND = no determinado

Los valores para los ultimos tres donantes (33081, 33080, y 33062) en la Tabla 6 son de una curva dosis-respuesta hecha en diluciones 1:3 de 8 puntos. Todos los demas valores representan curvas de diluciones logantmicas. La

CE50 derivada de esas curvas mediante el uso de diluciones 1:3 fue 0,022 +/-0,01; N = 3.

Tabla 6. Inhibicion del crecimiento de tumores humanos mediante el anticuerpo 11D4 en ratones SCID-beiges a los

que se les injertaron celulas T y celulas dendnticas humanas

Tipo de Tumor

Dosificacion de11D4 Duracion del estudio 10 mg/kg 1,0 mg/kg 0,1 mg/kg 0,01 mg/kg

Raji: linfoma de celulas B

Dfa 1 21 dfas 64% 42% 27% nd

Raji: linfoma de celulas B

Dfa 1 21 dfas nd 75% 42% 8%

Lovo: carcinoma de colon

Dfa 1 25 d^as 76% 44% 20% nd

Lovo: carcinoma de colon

Dfa 1 25 d^as 87% 64% 15% nd

PC3: prostata

Dfa 1 27 dfas 90% 77% 45% nd

PC3: prostata

Dfa 1 27 d^as 90% 70% 50% nd

BT474: mama

Dfa 1 y 30 85 dfas 98% 85% 46% nd

Valores = % de inhibicion del crecimiento tumoral determinado al final del estudio nd = no detectado

Tabla 7. Resultados de los estudios in vitro con el anticuerpo 18D8

Actividad

Parametro

pg/ml (nM)

Afinidad por OX40R (Biacore):

Kd

0,49 3,38

Velocidad de disociacion (kd)

2,9E-04 1 /s

Union a OX40R (CE50):

-Dominio extracelular de la protema de fusion

0,034 +/- 0,01 0,23

-Union de saturacion:

Celulas T estimuladas con CD3/CD28 (N = 4)

1,06 +/- 0,51 7,30

Celulas 300-19 OX40R+ (N=2)

0,24 +/- 0,09 1,66

Aumento de la Actividad de Celulas T (CE50):

- Produccion de IL-2 inducida por CD3 (N = 4)

0,049 +/- 0,06 0,33

- Estimulacion de la produccion de IL-2 por celulas sensibilizadas con antfgeno (N = 1)

0,014 +/- 0 0,10

Selectividad (Union a CD40, CD137, CD271):

> 100 pg/mL >700,00

Los valores de actividad expresados en pg/ml representan la media +/- una DE.

TABLA 8. Efecto del Anticuerpo 18D8 sobre la Produccion de IL-2 Inducida por Anti-CD3 por Celulas T Humanas Primarias

CE50 (Hg/mL)

IL-2 Max (pg/mL) CEmax (Hg/mL) indice de Estimulacion Donante

0,013

1120 0,05 13,7 LC

0,024

4334 0,5 5,1 TH

0,024

2280 0,5 5,4 KO

0,135

1356 0,5 2,4 RN

IL-2 Max: Cantidad de IL-2 producida con 18D8 a la CEmax con anti-CD3 solo

CEmax: Concentracion de 18D8 que produce el nivel maximo de IL- 2 con anti-CD3 solo

fndice de Estimulacion: Proporcion de IL-2 maxima producida con 18D8 sobre la cantidad producida con anti-CD3 solo

Los valores representan las curvas de diluciones logantmicas.

Tabla 9. Inhibicion del crecimiento de tumores humanos mediante el anticuerpo 18D8

en ratones SCID-beiges

Tipo de Tumor

Dosificacion de 18D8 Duracion del estudio Nivel de Dosis de 18D8 (mg/kg)

10

1.0 0.1 0.01

Raji: linfoma de celulas B

Dfa 1 23 dfas 73% 73% 11% nd

Raji: linfoma de celulas B

Dfa 1 24 dfas 54% 59% nd nd

PC3: prostata

Dfa 1 24 dfas 88% 90% 42% nd

Valores = % de inhibicion del crecimiento tumoral determinado al final del estudio nd = no determinado

5

Claims (11)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   REIVINDICACIONES

   1. Un anticuerpo monoclonal aislado que se une a OX40R humano, que comprende:

   (a) una CDR1 de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos de SEQ ID N°: 1; una CDR2 de

   la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos de SEQ ID N°: 2; y una CDR3 de la cadena

   pesada que comprende una secuencia de aminoacidos de SEQ ID N°: 3; o

   (b) una CDR1 de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos de SEQ ID N°: 13; una CDR2 de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos de SEQ ID N°: 14; y una CDR3 de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos de SEQ ID N°: 15,

   en el que dicho anticuerpo monoclonal aislado comprende 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoacidos conservativas en una o mas secuencias de CDR de la cadena pesada; y en el que dicho anticuerpo monoclonal aislado:

   (a) se une al OX40R humano con una Kd de 5 x 10-9 M o menos; y

   (b) tiene actividad agonista en OX40R humano.
2. 2. El anticuerpo segun la reivindicacion 1, que comprende ademas:

   (a) una cadena ligera que comprende una CDR1 de la cadena ligera que comprende una secuencia de

   aminoacidos de SEQ ID N°: 4; una CDR2 de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos de SEQ ID N°: 5; y una CDR3 de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos de SEQ ID N°: 6; o

   (b) una cadena ligera que comprende una CDR1 de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos de SEQ ID N°: 16; una CDR2 de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos de SEQ ID N°: 17; y una CDR3 de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos de SEQ ID N°: 18.
3. 3. El anticuerpo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que es un anticuerpo humano, o un anticuerpo quimerico o humanizado.
4. 4. Una composicion que comprende un anticuerpo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y opcionalmente un vehuculo farmaceuticamente aceptable.
5. 5. El anticuerpo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o la composicion segun la reivindicacion 4, para el uso en la prevencion o el tratamiento del cancer en un mairnfero que lo necesita, preferiblemente en el que el cancer se selecciona del grupo que consiste en carcinoma hepatocelular, carcinoma de celulas escamosas, cancer de cabeza y cuello, carcinoma de celulas renales, melanoma, cancer de mama, cancer de prostata, cancer colorrectal, cancer de pulmon, y cancer hematologico.
6. 6. El anticuerpo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o la composicion segun la reivindicacion 4, para el uso en la estimulacion de una respuesta inmunitaria en un mairnfero.
7. 7. Una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un anticuerpo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
8. 8. Un vector que comprende la molecula de acido nucleico de la reivindicacion 7.
9. 9. El vector segun la reivindicacion 8, que comprende ademas una secuencia de control de la expresion unida de forma operable a la molecula de acido nucleico.
10. 10. Una celula hospedadora que comprende el vector segun la reivindicacion 8 o la reivindicacion 9.
11. 11. Un metodo in vitro para inhibir el crecimiento de celulas tumorales, que comprende poner en contacto las celulas tumorales con un anticuerpo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o con una composicion que comprende un anticuerpo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo esta en una cantidad eficaz para inhibir el crecimiento de las celulas tumorales.

    11D4 se une especificamente al OX40R

    imagen1

    -a— Cantral + OX40R-lg —«— Control + CD271-lg -*-11D4 + 0X4DR-lg —q—11D4 + CD271-lg

    Figura 1b.

    imagen2

    Efecto del anticuerpo entrecruzado 11D4 sobre la actividad de luciferasa estimulada por OX40R

    imagen3

    Concentracion de 11D4 (pg/ml)

    Figura 3.

    El anticuerpo 11D4 aumenta la production de IL-2 por las celulas T sensibilizadas con aloantigeno

    imagen4

    Concentracion de 11D4 (pg/ml)

    Figura 4.

    El anticuerpo 11D4 aumenta la production de IL-2 inducida por anti-CD3 por las celulas T primarias

    imagen5

    Figura 5.

    imagen6

    Curvas de union de saturacion con anticuerpo 11D4 mediante el uso de PBMCs de Cynomolgus de 14 donantes estimuladas con

    anti-CD3 y anti-CD28

    imagen7

    Figura 7.

    imagen8

    imagen9

    Figura 9.

    imagen10

    Efecto de una unica inyeccion de anticuerpo 11D4 sobre el crecimiento del tumor de prostata PC-3 en ratones SCID

    imagen11

    Figura 11.

    Efecto del anticuerpo 11D4 sobre el crecimiento del tumor de prostata PC-3 en ratones SCID 27 dias tras la inyeccion del tumor

    imagen12

    Efecto del anticuerpo 11D4 sobre el crecimiento del carcinoma de colon LOVO en ratones SCID

    imagen13

    Figura 13.

    Efecto del anticuerpo 11D4 sobre el crecimiento del carcinoma de colon LOVO en ratones SCID 25 dias tras la inyeccion del tumor

    imagen14

    Efecto de una unica inyeccion de anticuerpo 11D4 sobre el crecimiento del tumor de mama BT474 en ratones SCID

    imagen15

    Figura 15.

    Efecto del anticuerpo 11D4 sobre el crecimiento del tumor de mama BT474 en ratones SCID: Tamano del tumor en cada animal individual en el dia 85

    imagen16