JP2021509586A - 腫瘍抗原特異的t細胞について濃縮されたtil製品を生成するためのプロセス - Google Patents
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Abstract
Description
[0001] 本出願は、2018年1月8日に提出された米国仮特許出願第62/614,887号、2018年4月27日に提出された米国仮特許出願第62/664,034号、2018年5月9日に提出された米国仮特許出願第62/669,319号、2018年7月13日に提出された米国仮特許出願第62/697,921号、2018年9月21日に提出された米国仮特許出願第62/734,868号及び2018年11月30日に提出された米国仮特許出願第62/773,715号に対する優先権を主張し、これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
[0002] 本出願は、ASCII形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体は、参照により本明細書に組み込まれる。前記ASCIIの写しは、2019年1月7日に作成され、116983-5034-WO_ST25.txtという名称であり、122キロバイトのサイズである。
[0003] 腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の養子移植を用いたかさ高い抵抗性の癌の処置は、予後不良の患者に対する治療への強力なアプローチとなる。Gattinoni, et al., Nat. Rev. Immunol. 2006, 6, 383-393。免疫療法の成功には多量のTILが必要であり、商業化に向けてロバストで信頼性のある方法が求められている。これは、細胞拡大培養に伴う技術上、物流上及び規制上の問題に起因して実現が課題となっている。IL−2ベースのTIL拡大培養、それに続く「急速拡大培養法」(REP)は、その速さ及び効率から、TIL拡大培養に好ましい方法となりつつある。Dudley, et al., Science 2002, 298, 850-54;Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-57;Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-39;Riddell, et al., Science 1992, 257, 238-41;Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42。REPは、14日の期間でTILの1,000倍の拡大をもたらすことができるが、それには、フィーダー細胞として、多くの場合に複数のドナーからの大過剰の(例えば、200倍の)照射した同種異系末梢血単核球(PBMC、単核球(MNC)としても知られる)並びに抗CD3抗体(OKT3)及び高用量のIL−2が必要である。Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42。REP手順を経たTILは、黒色腫患者において宿主免疫抑制後に養子細胞療法の成功をもたらしている。現行の注入適合パラメータは、TILの組成(例えば、CD28、CD8又はCD4陽性)の読み取り並びにREP産物の拡大倍数及び生存率に依存するものである。
[0005] 本発明は、TILを拡大培養し、且つ治療用TIL集団を生じさせるための改善及び/又は短縮された方法を提供する。
、第3のTIL集団は、第2のTIL集団よりも数において少なくとも100倍多く、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために少なくとも14日間にわたって実施され、第3のTIL集団は、治療用TIL集団である、生じさせること;及び(iv)第2及び/又は第3のTIL集団を、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に曝露することであって、TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び/又は治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の変化を提供する、曝露することを含む。
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL−2を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約3〜14日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(b)からステップ(c)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(d)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL−2、OKT−3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7〜14日間にわたって実施され、第3のTIL集団は、治療用TIL集団であり、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2及び/又は第3のTIL集団を、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に曝露することであって、TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び/又は治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の変化を提供する、曝露すること;
(f)ステップ(d)から得られた治療用TIL集団を回収することであって、ステップ(d)からステップ(e)への移行は、系を開放することなく行われる、回収すること;及び
(g)ステップ(e)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(e)から(f)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと
を含む方法も提供する。
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、対象から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL−2を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約3〜14日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(b)からステップ(c)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(d)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL−2、OKT−3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7〜14日間にわたって実施され、第3のTIL集団は、治療用TIL集団であり、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2及び/又は第3のTIL集団を、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に曝露することであって、TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の増加した発現及び/又は治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の増加を提供する、曝露すること;
(f)ステップ(d)から得られた治療用TIL集団を回収することであって、ステップ(d)からステップ(e)への移行は、系を開放することなく行われる、回収すること;及び
(g)ステップ(e)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(e)から(f)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;
(h)任意選択により、凍結保存プロセスを使用して、ステップ(f)からの回収されたTIL集団を含む輸注バッグを凍結保存すること;及び
(i)ステップ(g)における輸注バッグから治療有効投与量の第3のTIL集団を患者に投与すること
を含む、拡大培養された腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を投与することを含む方法も提供する。
(a)第1のTIL集団を得るために、患者から切除された腫瘍から処理された腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(b)IL−2を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約3〜14日間行われ、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(a)からステップ(b)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(c)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL−2、OKT−3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7〜14日間にわたって実施され、第3のTIL集団は、治療用TIL集団であり、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(b)からステップ(c)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(d)ステップ(c)から得られた治療用TIL集団を回収することであって、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、回収すること;及び
(e)ステップ(d)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(d)から(e)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと
を含む。
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、対象から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL−2を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約3〜14日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(b)からステップ(c)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(d)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL−2、OKT−3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7〜14日間にわたって実施され、第3のTIL集団は、治療用TIL集団であり、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2及び/又は第3のTIL集団を、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に曝露することであって、TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の増加した発現及び/又は治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の増加を提供する、曝露すること;
(f)ステップ(d)から得られた治療用TIL集団を回収することであって、ステップ(d)からステップ(e)への移行は、系を開放することなく行われる、回収すること;及び
(g)ステップ(e)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(e)から(f)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(h)任意選択により、凍結保存プロセスを使用して、ステップ(f)からの回収されたTIL集団を含む輸注バッグを凍結保存すること
を含む方法によって得ることができる第3のTIL集団である。
(i)予め拡大培養された第1のTIL集団を得ること;
(ii)IL−2を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせること;及び
(iii)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL−2、OKT−3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第3のTIL集団は、第2のTIL集団よりも数において少なくとも100倍多く、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために少なくとも14日間にわたって実施され、第3のTIL集団は、生存率について更にアッセイされる、生じさせること
を含む。
(iv)第3のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL−2、追加のOKT−3及び追加のAPCを補充することにより、追加の第2の拡大培養を実施することであって、追加の第2の拡大培養は、ステップ(iii)で得られたよりも大きいTIL集団を得るために少なくとも14日間にわたって実施され、第3の集団は、生存率について更にアッセイされる、実施すること
を更に含む。
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL−2を含み、且つ任意選択により4−1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2〜5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)第1のTIL集団を少なくとも1つのsd−RNAと接触させることであって、sd−RNAは、0.1μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、0.5μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、0.75μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、1μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、1.25μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、1.5μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、2μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、5μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地又は10μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地の濃度で添加され、sd−RNAは、PD−1、LAG−3、TIM−3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること;
(e)任意選択により、第1のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも1つのsd−RNAの移動を媒介する、実施すること;
(f)OKT−3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1〜3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(f)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(g)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(h)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL−2、任意選択によりOKT−3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7〜11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(h)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(i)ステップ(h)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(h)からステップ(i)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;
(j)ステップ(i)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(i)から(j)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(k)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含む。
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL−2を含み、且つ任意選択により4−1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2〜5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)第1のTIL集団を少なくとも1つのsd−RNAと接触させることであって、sd−RNAは、0.1μM sd−RNA/10,000TIL、0.5μM sd−RNA/10,000TIL、0.75μM sd−RNA/10,000TIL、1μM sd−RNA/10,000TIL、1.25μM sd−RNA/10,000TIL、1.5μM sd−RNA/10,000TIL、2μM sd−RNA/10,000TIL、5μM sd−RNA/10,000TIL又は10μM sd−RNA/10,000TILの濃度で添加され、sd−RNAは、PD−1、LAG−3、TIM−3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること;
(e)任意選択により、第1のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも1つのsd−RNAの移動を媒介する、実施すること;
(f)OKT−3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1〜3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(f)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(g)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(h)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL−2、任意選択によりOKT−3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7〜11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(g)からステップ(h)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(i)ステップ(h)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(h)からステップ(i)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;
(j)ステップ(i)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(i)から(j)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(k)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含む。
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL−2を含み、且つ任意選択により4−1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2〜5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT−3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1〜3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(f)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL−2、任意選択によりOKT−3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7〜11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(f)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(g)ステップ(d)、(e)及び/又は(f)のいずれかの間に第2のTIL集団を少なくとも1つのsd−RNAと接触させることであって、sd−RNAは、0.1μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、0.5μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、0.75μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、1μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、1.25μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、1.5μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、2μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、5μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地又は10μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地の濃度で添加され、sd−RNAは、PD−1、LAG−3、TIM−3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること;
(h)任意選択により、第2のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも1つのsd−RNAの移動を媒介する、実施すること;
(i)ステップ(g)又は(h)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(g)からステップ(i)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;
(j)ステップ(i)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(i)から(j)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(k)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含む。
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL−2を含み、且つ任意選択により4−1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2〜5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT−3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1〜3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(f)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL−2、任意選択によりOKT−3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7〜11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(e)からステップ(f)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(g)ステップ(d)、(e)及び/又は(f)のいずれかの間に第2のTIL集団を少なくとも1つのsd−RNAと接触させることであって、sd−RNAは、0.1μM sd−RNA/10,000TIL、0.5μM sd−RNA/10,000TIL、0.75μM sd−RNA/10,000TIL、1μM sd−RNA/10,000TIL、1.25μM sd−RNA/10,000TIL、1.5μM sd−RNA/10,000TIL、2μM sd−RNA/10,000TIL、5μM sd−RNA/10,000TIL又は10μM sd−RNA/10,000TILの濃度で添加され、sd−RNAは、PD−1、LAG−3、TIM−3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること;
(h)任意選択により、第2のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも1つのsd−RNAの移動を媒介する、実施すること;
(i)ステップ(g)又は(h)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(e)からステップ(h)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;
(j)ステップ(i)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(h)から(i)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(k)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含む。
i.PD−1及びLAG−3、
ii.PD−1及びTIM−3、
iii.PD−1及びCISH、
iv.PD−1及びCBLB、
v.LAG−3及びTIM−3、
vi.LAG−3及びCISH、
vii.LAG−3及びCBLB、
viii.TIM−3及びCISH、
ix.TIM−3及びCBLB、及び
x.CISH及びCBLB
からなる群から選択される。
[00189] 配列番号1は、ムロモナブの重鎖のアミノ酸配列である。
[00190] 配列番号2は、ムロモナブの軽鎖のアミノ酸配列である。
[00191] 配列番号3は、組換えヒトIL−2タンパク質のアミノ酸配列である。
[00192] 配列番号4は、アルデスロイキンのアミノ酸配列である。
[00193] 配列番号5は、組換えヒトIL−4タンパク質のアミノ酸配列である。
[00194] 配列番号6は、組換えヒトIL−7タンパク質のアミノ酸配列である。
[00195] 配列番号7は、組換えヒトIL−15タンパク質のアミノ酸配列である。
[00196] 配列番号8は、組換えヒトIL−21タンパク質のアミノ酸配列である。
[00197] 配列番号9は、ヒト4−1BBのアミノ酸配列である。
[00198] 配列番号10は、マウス4−1BBのアミノ酸配列である。
[00199] 配列番号11は、4−1BBアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ(PF−05082566)の重鎖である。
[00200] 配列番号12は、4−1BBアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ(PF−05082566)の軽鎖である。
[00201] 配列番号13は、4−1BBアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ(PF−05082566)の重鎖可変領域(VH)である。
[00202] 配列番号14は、4−1BBアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ(PF−05082566)の軽鎖可変領域(VL)である。
[00203] 配列番号15は、4−1BBアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ(PF−05082566)の重鎖CDR1である。
[00204] 配列番号16は、4−1BBアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ(PF−05082566)の重鎖CDR2である。
[00205] 配列番号17は、4−1BBアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ(PF−05082566)の重鎖CDR3である。
[00206] 配列番号18は、4−1BBアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ(PF−05082566)の軽鎖CDR1である。
[00207] 配列番号19は、4−1BBアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ(PF−05082566)の軽鎖CDR2である。
[00208] 配列番号20は、4−1BBアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ(PF−05082566)の軽鎖CDR3である。
[00209] 配列番号21は、4−1BBアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ(BMS−663513)の重鎖である。
[00210] 配列番号22は、4−1BBアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ(BMS−663513)の軽鎖である。
[00211] 配列番号23は、4−1BBアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ(BMS−663513)の重鎖可変領域(VH)である。
[00212] 配列番号24は、4−1BBアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ(BMS−663513)の軽鎖可変領域(VL)である。
[00213] 配列番号25は、4−1BBアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ(BMS−663513)の重鎖CDR1である。
[00214] 配列番号26は、4−1BBアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ(BMS−663513)の重鎖CDR2である。
[00215] 配列番号27は、4−1BBアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ(BMS−663513)の重鎖CDR3である。
[00216] 配列番号28は、4−1BBアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ(BMS−663513)の軽鎖CDR1である。
[00217] 配列番号29は、4−1BBアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ(BMS−663513)の軽鎖CDR2である。
[00218] 配列番号30は、4−1BBアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ(BMS−663513)の軽鎖CDR3である。
[00219] 配列番号31は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のFcドメインである。
[00220] 配列番号32は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00221] 配列番号33は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00222] 配列番号34は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00223] 配列番号35は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00224] 配列番号36は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00225] 配列番号37は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00226] 配列番号38は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00227] 配列番号39は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00228] 配列番号40は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00229] 配列番号41は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00230] 配列番号42は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のFcドメインである。
[00231] 配列番号43は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00232] 配列番号44は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00233] 配列番号45は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00234] 配列番号46は、4−1BBリガンド(4−1BBL)アミノ酸配列である。
[00235] 配列番号47は、4−1BBLポリペプチドの可溶性部分である。
[00236] 配列番号48は、4−1BBアゴニスト抗体4B4−1−1バージョン1の重鎖可変領域(VH)である。
[00237] 配列番号49は、4−1BBアゴニスト抗体4B4−1−1バージョン1の軽鎖可変領域(VL)である。
[00238] 配列番号50は、4−1BBアゴニスト抗体4B4−1−1バージョン2の重鎖可変領域(VH)である。
[00239] 配列番号51は、4−1BBアゴニスト抗体4B4−1−1バージョン2の軽鎖可変領域(VL)である。
[00240] 配列番号52は、4−1BBアゴニスト抗体H39E3−2の重鎖可変領域(VH)である。
[00241] 配列番号53は、4−1BBアゴニスト抗体H39E3−2の軽鎖可変領域(VL)である。
[00242] 配列番号54は、ヒトOX40のアミノ酸配列である。
[00243] 配列番号55は、マウスOX40のアミノ酸配列である。
[00244] 配列番号56は、OX40アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ(MEDI−0562)の重鎖である。
[00245] 配列番号57は、OX40アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ(MEDI−0562)の軽鎖である。
[00246] 配列番号58は、OX40アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ(MEDI−0562)の重鎖可変領域(VH)である。
[00247] 配列番号59は、OX40アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ(MEDI−0562)の軽鎖可変領域(VL)である。
[00248] 配列番号60は、OX40アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ(MEDI−0562)の重鎖CDR1である。
[00249] 配列番号61は、OX40アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ(MEDI−0562)の重鎖CDR2である。
[00250] 配列番号62は、OX40アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ(MEDI−0562)の重鎖CDR3である。
[00251] 配列番号63は、OX40アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ(MEDI−0562)の軽鎖CDR1である。
[00252] 配列番号64は、OX40アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ(MEDI−0562)の軽鎖CDR2である。
[00253] 配列番号65は、OX40アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ(MEDI−0562)の軽鎖CDR3である。
[00254] 配列番号66は、OX40アゴニストモノクローナル抗体11D4の重鎖である。
[00255] 配列番号67は、OX40アゴニストモノクローナル抗体11D4の軽鎖である。
[00256] 配列番号68は、OX40アゴニストモノクローナル抗体11D4の重鎖可変領域(VH)である。
[00257] 配列番号69は、OX40アゴニストモノクローナル抗体11D4の軽鎖可変領域(VL)である。
[00258] 配列番号70は、OX40アゴニストモノクローナル抗体11D4の重鎖CDR1である。
[00259] 配列番号71は、OX40アゴニストモノクローナル抗体11D4の重鎖CDR2である。
[00260] 配列番号72は、OX40アゴニストモノクローナル抗体11D4の重鎖CDR3である。
[00261] 配列番号73は、OX40アゴニストモノクローナル抗体11D4の軽鎖CDR1である。
[00262] 配列番号74は、OX40アゴニストモノクローナル抗体11D4の軽鎖CDR2である。
[00263] 配列番号75は、OX40アゴニストモノクローナル抗体11D4の軽鎖CDR3である。
[00264] 配列番号76は、OX40アゴニストモノクローナル抗体18D8の重鎖である。
[00265] 配列番号77は、OX40アゴニストモノクローナル抗体18D8の軽鎖である。
[00266] 配列番号78は、OX40アゴニストモノクローナル抗体18D8の重鎖可変領域(VH)である。
[00267] 配列番号79は、OX40アゴニストモノクローナル抗体18D8の軽鎖可変領域(VL)である。
[00268] 配列番号80は、OX40アゴニストモノクローナル抗体18D8の重鎖CDR1である。
[00269] 配列番号81は、OX40アゴニストモノクローナル抗体18D8の重鎖CDR2である。
[00270] 配列番号82は、OX40アゴニストモノクローナル抗体18D8の重鎖CDR3である。
[00271] 配列番号83は、OX40アゴニストモノクローナル抗体18D8の軽鎖CDR1である。
[00272] 配列番号84は、OX40アゴニストモノクローナル抗体18D8の軽鎖CDR2である。
[00273] 配列番号85は、OX40アゴニストモノクローナル抗体18D8の軽鎖CDR3である。
[00274] 配列番号86は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu119−122の重鎖可変領域(VH)である。
[00275] 配列番号87は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu119−122の軽鎖可変領域(VL)である。
[00276] 配列番号88は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu119−122の重鎖CDR1である。
[00277] 配列番号89は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu119−122の重鎖CDR2である。
[00278] 配列番号90は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu119−122の重鎖CDR3である。
[00279] 配列番号91は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu119−122の軽鎖CDR1である。
[00280] 配列番号92は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu119−122の軽鎖CDR2である。
[00281] 配列番号93は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu119−122の軽鎖CDR3である。
[00282] 配列番号94は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu106−222の重鎖可変領域(VH)である。
[00283] 配列番号95は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu106−222の軽鎖可変領域(VL)である。
[00284] 配列番号96は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu106−222の重鎖CDR1である。
[00285] 配列番号97は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu106−222の重鎖CDR2である。
[00286] 配列番号98は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu106−222の重鎖CDR3である。
[00287] 配列番号99は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu106−222の軽鎖CDR1である。
[00288] 配列番号100は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu106−222の軽鎖CDR2である。
[00289] 配列番号101は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu106−222の軽鎖CDR3である。
[00290] 配列番号102は、OX40リガンド(OX40L)アミノ酸配列である。
[00291] 配列番号103は、OX40Lポリペプチドの可溶性部分である。
[00292] 配列番号104は、OX40Lポリペプチドの代替的可溶性部分である。
[00293] 配列番号105は、OX40アゴニストモノクローナル抗体008の重鎖可変領域(VH)である。
[00294] 配列番号106は、OX40アゴニストモノクローナル抗体008の軽鎖可変領域(VL)である。
[00295] 配列番号107は、OX40アゴニストモノクローナル抗体011の重鎖可変領域(VH)である。
[00296] 配列番号108は、OX40アゴニストモノクローナル抗体011の軽鎖可変領域(VL)である。
[00297] 配列番号109は、OX40アゴニストモノクローナル抗体021の重鎖可変領域(VH)である。
[00298] 配列番号110は、OX40アゴニストモノクローナル抗体021の軽鎖可変領域(VL)である。
[00299] 配列番号111は、OX40アゴニストモノクローナル抗体023の重鎖可変領域(VH)である。
[00300] 配列番号112は、OX40アゴニストモノクローナル抗体023の軽鎖可変領域(VL)である。
[00301] 配列番号113は、OX40アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域(VH)である。
[00302] 配列番号114は、OX40アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域(VL)である。
[00303] 配列番号115は、OX40アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域(VH)である。
[00304] 配列番号116は、OX40アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域(VL)である。
[00305] 配列番号117は、ヒト化OX40アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域(VH)である。
[00306] 配列番号118は、ヒト化OX40アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域(VH)である。
[00307] 配列番号119は、ヒト化OX40アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域(VL)である。
[00308] 配列番号120は、ヒト化OX40アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域(VL)である。
[00309] 配列番号121は、ヒト化OX40アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域(VH)である。
[00310] 配列番号122は、ヒト化OX40アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域(VH)である。
[00311] 配列番号123は、ヒト化OX40アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域(VL)である。
[00312] 配列番号124は、ヒト化OX40アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域(VL)である。
[00313] 配列番号125は、OX40アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域(VH)である。
[00314] 配列番号126は、OX40アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域(VL)である。
I.序論
[00315] 急速拡大培養プロトコル(REP)によってエキソビボで培養したTILを利用する養子細胞療法は、黒色腫患者において宿主免疫抑制後に養子細胞療法の成功をもたらしている。現行の注入適合パラメータは、TILの組成(例えば、CD28、CD8又はCD4陽性)の読み取り並びにREP産物の拡大倍数及び生存率の数値に依存している。
[00319] 他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及される全ての特許及び刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
[00368] 一部の実施形態において、本発明の拡大培養されたTILは、タンパク質発現を変化させるために、それぞれ本明細書で提供されるように、閉鎖無菌製造プロセス中を含む、拡大培養ステップ前、その間又はその後に更に操作される。一部の実施形態において、一過性に変化したタンパク質発現は、一過性の遺伝子編集によるものである。一部の実施形態において、本発明の拡大培養されたTILは、転写因子(TF)及び/又はTILにおけるタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子で処置される。一部の実施形態において、TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び/又はTIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の変化を提供する。
(i)患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得るステップ;
(ii)IL−2及び任意選択によりOKT−3を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせること;
(iii)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL−2、OKT−3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第3のTIL集団は、第2のTIL集団よりも数において少なくとも100倍多く、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために少なくとも14日間にわたって実施され、第3のTIL集団は、治療用TIL集団である、生じさせること;及び
(iv)第2及び/又は第3のTIL集団を、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に曝露することであって、TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び/又は治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の変化を提供する、曝露すること
を含む。
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL−2を含み、且つ任意選択により4−1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2〜5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT−3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1〜3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも1つの短鎖干渉RNA又は1つのメッセンジャーRNAの移動を媒介する、実施すること;
(f)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(g)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL−2、任意選択によりOKT−3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7〜11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(f)からステップ(g)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(h)ステップ(g)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(g)からステップ(g)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;
(i)ステップ(e)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(e)から(f)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(j)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含み、滅菌エレクトロポレーションステップは、PD−1、LAG−3、TIM−3、CTLA−4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するための短鎖干渉RNAの送達を含む。
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL−2を含み、且つ任意選択により4−1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2〜5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT−3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1〜3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2のTIL集団に対してSQZマイクロ流体膜破壊ステップを実施することであって、SQZマイクロ流体膜破壊ステップは、少なくとも1つの短鎖干渉RNA又は1つのメッセンジャーRNAの移動を媒介する、実施すること;
(f)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(g)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL−2、任意選択によりOKT−3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7〜11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(f)からステップ(g)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(h)ステップ(g)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(g)からステップ(g)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;
(i)ステップ(e)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(e)から(f)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(j)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含み、SQZマイクロ流体膜破壊ステップは、PD−1、LAG−3、TIM−3、CTLA−4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するための短鎖干渉RNAの送達を含む。
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL−2を含み、且つ任意選択により4−1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2〜5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT−3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1〜3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップ又はSQZマイクロ流体膜破壊ステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップ又はSQZマイクロ流体膜破壊ステップは、少なくとも1つの短鎖干渉RNA又は1つのメッセンジャーRNAの移動を媒介する、実施すること;
(f)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(g)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL−2、任意選択によりOKT−3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7〜11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(f)からステップ(g)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(h)ステップ(g)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(g)からステップ(g)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;
(i)ステップ(e)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(e)から(f)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(j)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含み、エレクトロポレーションステップは、PD−1、LAG−3、TIM−3、CTLA−4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を一過性に阻害するための短鎖干渉RNAの送達を含み、更に、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1及びそれらの組み合わせからなる群から選択される接着分子は、ガンマレトロウイルス又はレンチウイルス方法により、第1のTIL集団、第2のTIL集団又は回収されたTIL集団に挿入される。
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL−2を含み、且つ任意選択により4−1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2〜5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT−3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1〜3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL−2、1つ以上の自己送達RNA(sd−RNA)、任意選択によりOKT−3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7〜11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(f)からステップ(g)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(h)ステップ(g)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(g)からステップ(g)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;
(i)ステップ(e)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(e)から(f)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(j)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含み、1つ以上のsd−RNAは、PD−1、LAG−3、TIM−3、CTLA−4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を一過性に阻害する。
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL−2を含み、且つ任意選択により4−1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2〜5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT−3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1〜3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL−2、1つ以上の自己送達RNA(sd−RNA)、任意選択によりOKT−3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7〜11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(f)からステップ(g)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(h)ステップ(g)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(g)からステップ(g)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;
(i)ステップ(e)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(e)から(f)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(j)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含み、1つ以上のsd−RNAは、PD−1、LAG−3、TIM−3、CTLA−4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を一過性に阻害し、更に、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1及びそれらの組み合わせからなる群から選択される接着分子は、ガンマレトロウイルス又はレンチウイルス方法により、第1のTIL集団、第2のTIL集団又は回収されたTIL集団に挿入される。
[00400] 本明細書に記載されるように、siRNAの化学修飾に基づく自己送達可能なRNAi技術を本発明の方法と共に使用して、sd−RNAを問題なくTILに送達することができる。骨格修飾と非対称siRNA構造及び疎水性リガンドとの組み合わせ(例えば、Ligtenberg, et al., Mol. Therapy, 2018及び米国特許出願公開第20160304873号並びに本明細書の図36及び図37を参照されたい)は、sd−RNAのヌクレアーゼ安定性を利用して、培養培地に単純に添加することにより、追加の製剤及び及び方法なしで、sd−RNAを培養した哺乳動物細胞に浸透させることを可能にする。この安定性は、単に培地中のsd−RNAの活性濃度を維持することで、RNAiを介した標的遺伝子活性の一定レベルの低減のサポートを可能にする。理論に拘束されるものではないが、sd−RNAの骨格安定化は、非分裂細胞において数ヶ月間続き得る、遺伝子発現効果の長期低減を提供する。
a.sd−RNAオリゴヌクレオチドの構造
[00403] 低分子干渉RNA(siRNA)は、短鎖干渉RNA又はサイレンシングRNAとして知られる場合もあり、一般に長さが19〜25塩基対の二本鎖RNA分子である。siRNAは、相補的なヌクレオチド配列を有する特定の遺伝子の発現に干渉するRNA干渉(RNAi)で使用される。
[00406] 一部の実施形態において、本発明で使用するための1つ以上のsd−RNAは、線状二本鎖DNAテンプレートから生成することができる。一部の実施形態において、1つ以上のsd−RNAを生成するための線状二本鎖DNAテンプレートは、米国特許第8,859,229号及び以下で説明されているものである。
[00412] 安定性及び/又は翻訳効率を促進する能力を備えた化学構造も使用され得る。RNAは、好ましくは、5’及び3’UTRを有する。以下の例は、44塩基対の5’UTRをPCRテンプレートに含めることで、6塩基対の5’UTRのみを含むPCRテンプレートと比較して、転写されたCFP RNAの翻訳効率が向上したことを示す。例は、113塩基対の3’UTRを付加することで、11塩基対の3’UTRのみを含むPCRテンプレートと比較して、転写されたGFP RNAの翻訳効率が向上することも示す。一般に、3’UTRの長さは、100ヌクレオチドを超えるため、100ヌクレオチドより長い3’UTRが好ましい。一実施形態において、3’UTR配列は、100〜5000ヌクレオチドである。5’UTRの長さは、3’UTRの長さほど重要ではなく、より短いことができる。一実施形態において、5’UTRは、0〜3000ヌクレオチド長である。コード領域に付加される5’及び3’UTR配列の長さは、UTRの異なる領域にアニーリングするPCRのためのプライマーの設計を含むが、これに限定されない異なる方法で変更することができる。このアプローチを使用して、当業者は、転写されたRNAのトランスフェクション後に最適な翻訳効率を達成するために必要な5’及び3’UTRの長さを変更することができる。
[00415] 遺伝子クローニングを必要とせずにDNAテンプレートからRNAを合成できるようにするには、転写される配列の上流のDNAテンプレートに転写のプロモーターが付加されるべきである。バクテリオファージRNAポリメラーゼプロモーター配列は、DNAライゲーションなどの異なる遺伝子工学的方法によってSt UTRに付加され得るか、又は標的DNAに実質的に相補的な配列のフォワードプライマー(5’)に付加され得る。RNAポリメラーゼのプロモーターとして機能する配列がフォワードプライマーの5’末端に付加されると、RNAポリメラーゼプロモーターは、転写されるオープンリーディングフレームの上流のPCR産物に組み込まれる。好ましい一実施形態において、プロモーターは、上記のように、T7ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターには、T3及びSP6 RNAポリメラーゼプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。T7、T3及びSP6プロモーターのコンセンサスヌクレオチド配列は、当技術分野で公知である。
[00416] 好ましい実施形態において、mRNAは、5’末端のキャップと、細胞内のリボソーム結合、翻訳開始及び安定性mRNAを決定する3’ポリ(A)テールとの両方を有する。環状DNAテンプレート、例えばプラスミドDNAでは、RNAポリメラーゼは、真核細胞での発現に適さない長いコンカテマー産物を産生する。3’UTRの末端で線状化されたプラスミドDNAの転写は、転写後にポリアデニル化されたとしても真核生物のトランスフェクションに効果的でない通常サイズのmRNAをもたらす。
す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd−RNA配列は、約7.0μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd−RNA配列は、約8.0μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd−RNA配列は、約9.0μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd−RNA配列は、約10.0μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。
[00424] 一部の実施形態において、オリゴヌクレオチド剤は、治療剤の安定性及び/又は有効性を増加させ、処置される細胞又は組織へのオリゴヌクレオチドの効率的な送達をもたらすための1つ以上の修飾を含む。そのような修飾は、2’−O−メチル修飾、2’−O−フルオロ修飾、ジホスホロチオエート修飾、2’F修飾ヌクレオチド、2’−O−メチル修飾及び/又は2’デオキシヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、例えば、ステロール、コレステロール、ビタミンD、ナフチル、イソブチル、ベンジル、インドール、トリプトファン及び/又はフェニルを含む1つ以上の疎水性修飾を含むように修飾される。更なる特定の実施形態において、化学修飾されたヌクレオチドは、ホスホロチオエート、2’−O−メチル、2’デオキシ、疎水性修飾及びホスホロチオエートの組み合わせである。一部の実施形態において、糖は、修飾され得、修飾された糖は、D−リボース、2’−O−アルキル(2’−O−メチル及び2’−O−エチルを含む)、即ち2’−アルコキシ、2’−アミノ、2’−S−アルキル、2’−ハロ(2’−フルオロを含む)、T−メトキシエトキシ、2’−アリルオキシ(−OCH2CH=CH2)、2’−プロパルギル、2’−プロピル、エチニル、エテニル、プロペニル及びシアノなどを含み得るが、これらに限定されない。一実施形態において、糖部分は、ヘキソースであり得、記載されるようにオリゴヌクレオチドに組み込まれる(Augustyns, K., et al., Nucl. Acids. Res., 18:4711 (1992))。
[00437] 自己送達可能なRNAi技術は、追加の製剤又は技術を必要とすることなく、RNAi剤で細胞を直接トランスフェクションする方法を提供する。トランスフェクションが困難な細胞株をトランスフェクトする能力、高いインビボ活性及び使用の単純さは、従来のsiRNAベースの手法に比べて有意な機能的利点を提供する組成物及び方法の特徴であり、したがって、sd−RNA法は、本発明のTILにおける標的遺伝子の発現を低減する方法に関するいくつかの実施形態において使用される。sd−RNAi法により、化学合成された化合物をエクスビボ及びインビボの両方で広範な初代細胞及び組織に直接送達することが可能となる。本明細書の本発明の一部の実施形態に記載されているsd−RNAは、Advirna LLC, Worcester, MA, USAから市販されている。
[00446] 一部の実施形態において、標的遺伝子の発現を低減するために2つ以上のsd−RNAが使用される。一部の実施形態において、PD−1、TIM−3、CBLB、LAG3及び/又はCISHを標的とするsd−RNAの1つ以上が一緒に使用される。一部の実施形態において、PD−1 sd−RNAは、2つ以上の遺伝子標的の発現を低減するためにTIM−3、CBLB、LAG3及び/又はCISHの1つ以上と共に使用される。一部の実施形態において、LAG3 sd−RNAは、CISH標的とするsd−RNAと組み合わせて使用されて、両方の標的の遺伝子発現を低減する。一部の実施形態において、本明細書のPD−1、TIM−3、CBLB、LAG3及び/又はCISHの1つ以上を標的とするsd−RNAは、Advirna LLC, Worcester, MA, USAから市販されている。一部の実施形態において、PD−1、TIM−3、CBLB、LAG3及び/又はCISHの1つ以上を標的とするsd−RNAは、図36又は図37に示される構造を有する。
[00448] 追加の実施形態によると、TIL拡大培養方法中のTILのタンパク質発現の変化は、1つ以上の免疫チェックポイント遺伝子の発現を治療用TIL集団の少なくとも一部において増強することも可能にすることができる。例えば、タンパク質発現を変化させると、刺激受容体の発現が増強され得、これは、遺伝子改変されていない刺激受容体の発現と比較して、それが過剰発現されることを意味する。本発明のTILにおけるタンパク質発現を一過性に変化させることにより発現の増強を示し得る免疫チェックポイント遺伝子の非限定的な例には、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL−2、IL−4、IL−7、IL−10、IL−15、IL−21、NOTCH 1/2細胞内ドメイン(ICD)及び/又はNOTCHリガンドmDLL1などの特定のケモカイン受容体及びインターロイキンが含まれる。
[00449] 養子T細胞免疫療法を有効にするには、T細胞をケモカインによって腫瘍に適切に輸送する必要がある。腫瘍細胞によって分泌されるケモカイン、末梢に存在するケモカイン及びT細胞によって発現されるケモカイン受容体間の一致は、T細胞の腫瘍床への輸送の成功に重要である。
(i)患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得るステップ;
(ii)IL−2及び任意選択によりOKT−3を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせること;
(iii)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL−2、OKT−3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第3のTIL集団は、第2のTIL集団よりも数において少なくとも100倍多く、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために少なくとも14日間にわたって実施され、第3のTIL集団は、治療用TIL集団である、生じさせること;及び
(iv)第2及び/又は第3のTIL集団を、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に曝露することであって、TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び/又は治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の変化を提供し、発現の変化は、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、CCL2(MCP−1)、CCL3(MIP−1α)、CCL4(MIP1−β)、CCL5(RANTES)、CXCL1、CXCL8及び/又はCCL22の1つ以上の発現の増加である、曝露すること
を含む。
[00454] 追加の実施形態によれば、本発明の遺伝子編集方法は、IL−2、IL−4、IL−7、IL−10、IL−15及びIL−21の1つ以上などの特定のインターロイキン並びにNOTCH 1/2細胞内ドメイン(ICD)の発現を増加させるために使用され得る。特定のインターロイキンは、T細胞のエフェクター機能を増強し、腫瘍制御を媒介することが示されている。
(i)患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得るステップ;
(ii)IL−2及び任意選択によりOKT−3を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせること;
(iii)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL−2、OKT−3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第3のTIL集団は、第2のTIL集団よりも数において少なくとも100倍多く、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために少なくとも14日間にわたって実施され、第3のTIL集団は、治療用TIL集団である、生じさせること;及び
(iv)第2及び/又は第3のTIL集団を、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に曝露することであって、TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び/又は治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の変化を提供し、発現の変化は、IL−2、IL−4、IL−7、IL−10、IL−15及びIL−21並びにNOTCH 1/2細胞内ドメイン(ICD)の1つ以上の発現の増加である、曝露すること
を含む。
[00456] これらの特徴のいくつかを含むプロセス2Aとして知られるTILプロセスの例を図1に示し、プロセス1Cに対する本発明の本実施形態の利点のいくつかを図13及び14と同様に図2に示す。プロセス1Cを図3に比較のために示す。プロセス2Aに基づくTIL治療の2つの代替タイムラインを図4(細胞数が多い)及び図5(細胞数が少ない)に示す。プロセス2Aの実施形態を図6並びに図8に示す。図13及び図14は、例示的なプロセス1Cと比較した例示的なプロセス2Aを更に提供する。
[00461] 一般に、TILは、最初に患者腫瘍サンプルから得られ(「初代TIL」)、次に本明細書に記載される通りの更なる操作のためにより大きい集団に拡大培養され、任意選択により凍結保存され、本明細書に概説される通り再刺激され、且つ任意選択によりTILの健康の指標として表現型及び代謝パラメータが判定される。
[00474] 一部の実施形態において、本方法は、対象/患者への投与時に複製サイクルを増加させることができる幼若TILを得ることを提供し、従って成熟TIL(即ち被験者/患者への投与前に更に多くの回数の複製を受けたTIL)を超える追加の治療上の利点を提供し得る。幼若TILの特徴が、文献に記載されている。例えば、Donia, at al., Scandinavian Journal of Immunology, 75:157-167 (2012);Dudley et al., Clin Cancer Res, 16:6122-6131 (2010)、Huang et al., J Immunother, 28(3):258-267 (2005)、Besser et al., Clin Cancer Res, 19(17):OF1-OF9 (2013)、Besser et al., J Immunother 32:415-423 (2009)、Robbins, et al., J Immunol 2004;173:7125-7130、Shen et al., J Immunother, 30:123-129 (2007)、Zhou, et al., J Immunother, 28:53-62 (2005)及びTran, et al., J Immunother, 31:742-751 (2008)であり、これらは、全て全体として参照により本明細書に組み込まれる。
[00493] ある場合には、例えば図8に示されるように、例えばステップBから得られるTIL集団を含む、第1の拡大培養から得られるバルクTIL集団は、以下本明細書で考察されるプロトコルを使用して直ちに凍結保存され得る。代わりに、第2のTIL集団と称される第1の拡大培養から得られたTIL集団は、第2の拡大培養(REPと呼ばれることがある拡大培養を含み得る)に供し、その後、以下で考察するように凍結保存することができる。同様に、遺伝子修飾TILが治療に使用される場合、第1のTIL集団(バルクTIL集団と称されることもある)又は第2のTIL集団(一部の実施形態において、REP TIL集団と称される集団を含み得る)は、拡大培養前又は第1の拡大培養後で第2の拡大培養前に適切な処置のために遺伝子修飾に供することができる。
[00499] 本明細書に記載の拡大培養方法は、一般に、当技術分野において公知の通り、高用量のサイトカイン、特にIL−2を含む培養培地を使用する。
[00501] 一部の実施形態において、TIL細胞集団は、例えば、図8に記載の通り、ステップA及びステップB並びにステップCと称される移行後、回収及び初期バルク処理後、数が増加する。この更なる増加は、本明細書では第2の拡大培養と称され、これは、当技術分野で一般に急速拡大培養法と称される拡大培養プロセス(REP並びに図8のステップDに示されるプロセス)を含み得る。第2の拡大培養は、概して、フィーダー細胞、サイトカイン源及び抗CD3抗体を含め、幾つもの成分を含むガス透過性容器内の培養培地を使用して達成することができる。
[00526] 一実施形態において、本明細書に記載の第2の拡大培養手順(例えば、図8のステップDに記載された拡大培養並びにREPと称される拡大培養を含む)は、REP TIL拡大培養中及び/又は第2の拡大培養中に過剰量のフィーダー細胞が必要である。多くの実施形態において、フィーダー細胞は、健常供血者からの標準的な全血ユニットから得られる末梢血単核球(PBMC)である。PBMCは、Ficoll-Paque勾配分離などの標準方法を用いて得られる。
[00536] 本明細書に記載の拡大培養方法は、一般に、当技術分野において公知の通り、高用量のサイトカイン、特にIL−2を含む培養培地を使用する。
[00538] 第2の拡大培養ステップ後、細胞は回収することができる。一部の実施形態において、TILは、例えば、図8に提供される通り、1、2、3、4回又はそれ以上の拡大培養ステップ後に回収される。一部の実施形態において、TILは、例えば、図8に提供される通り、2つの拡大培養ステップ後に回収される。
[00544] 図8に例示的順序で提供される通りの、且つ上記及び本明細書に詳細に概説される通りのステップA〜Eが完了した後、細胞は患者への投与における使用のため容器に移される。一部の実施形態において、上記に記載される拡大培養方法を用いて治療上十分な数のTILが得られると、TILは患者への投与における使用のため容器に移される。
[00546] 一実施形態において、本開示の方法を使用して拡大培養したTILは医薬組成物として患者に投与される。一実施形態において、医薬組成物は滅菌緩衝液中のTILの懸濁液である。本開示のPBMCを使用して拡大培養したTILは、当技術分野において公知の通りの任意の好適な経路によって投与され得る。一部の実施形態において、T細胞は単回動脈内又は静脈内注入として投与され、これは好ましくは約30〜60分間継続される。他の適切な投与経路には、腹腔内投与、髄腔内投与及びリンパ管内投与が含まれる。
1.抗CD3抗体
[00561] 一部の実施形態において、本明細書に記載の拡大培養方法で使用される培養培地(REPと称されるものを含み、例えば図Aを参照されたい)は、抗CD3抗体も含む。抗CD3抗体をIL−2と併用すると、TIL集団においてT細胞活性化及び細胞分裂が誘導される。この効果は、完全長抗体並びにFab及びF(ab’)2断片で見ることができ、前者が概して好ましく;例えばTsoukas et al., J. Immunol. 1985, 135, 1719(参照により全体として本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
[00563] 一実施形態において、TNFRSFアゴニストは、4−1BB(CD137)アゴニストである。4−1BBアゴニストは、当技術分野で公知の任意の4−1BB結合分子であり得る。4−1BB結合分子は、ヒト又は哺乳類4−1BBに結合できるモノクローナル抗体又は融合タンパク質であり得る。4−1BBアゴニスト又は4−1BB結合分子は、免疫グロブリン分子の任意のアイソタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及びIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2)又はサブクラスの免疫グロブリン重鎖を含み得る。4−1BBアゴニスト又は4−1BB結合分子は、重鎖及び軽鎖の両方を有し得る。本明細書で使用される場合、結合分子という用語は、抗体(全長抗体を含む)、モノクローナル抗体(全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体並びに抗体断片、例えばFab断片、F(ab’)断片、Fab発現ライブラリーにより産生される断片、上記のいずれかのエピトープ結合断片及び4−1BBに結合する抗体の操作された形態、例えばscFv分子も含む。一実施形態において、4−1BBアゴニストは、完全ヒト抗体である抗原結合タンパク質である。一実施形態において、4−1BBアゴニストは、ヒト化抗体である抗原結合タンパク質である。一部の実施形態において、本開示の方法及び組成物における使用のための4−1BBアゴニストは、抗4−1BB抗体、ヒト抗4−1BB抗体、マウス抗4−1BB抗体、哺乳動物抗4−1BB抗体、モノクローナル抗4−1BB抗体、ポリクローナル抗4−1BB抗体、キメラ抗4−1BB抗体、抗4−1BBアドネクチン、抗4−1BBドメイン抗体、単鎖抗4−1BB断片、重鎖抗4−1BB断片、軽鎖抗4−1BB断片、抗4−1BB融合タンパク質及びそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体若しくはバイオシミラーを含む。アゴニスト性抗4−1BB抗体は、強い免疫応答を誘導することが知られている。Lee, et al., PLOS One 2013, 8, e69677。好ましい実施形態において、4−1BBアゴニストは、アゴニスト性、抗4−1BBヒト化又は完全ヒトモノクローナル抗体(即ち単一細胞株に由来する抗体)である。一実施形態において、4−1BBアゴニストは、EU−101(Eutilex Co. Ltd.)、ウトミルマブ若しくはウレルマブ又はそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体若しくはバイオシミラーである。好ましい一実施形態において、4−1BBアゴニストは、ウトミルマブ又はウレルマブ又はそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体若しくはバイオシミラーである。
[00593] 一実施形態において、TNFRSFアゴニストは、OX40(CD134)アゴニストである。OX40アゴニストは、当技術分野で公知の任意のOX40結合分子であり得る。OX40結合分子は、ヒト又は哺乳類OX40に結合できるモノクローナル抗体又は融合タンパク質であり得る。OX40アゴニスト又はOX40結合分子は、免疫グロブリン分子の任意のアイソタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及びIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2)又はサブクラスの免疫グロブリン重鎖を含み得る。OX40アゴニスト又はOX40結合分子は、重鎖及び軽鎖の両方を有し得る。本明細書で使用される場合、結合分子という用語は、抗体(全長抗体を含む)、モノクローナル抗体(全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体並びに抗体断片、例えばFab断片、F(ab’)断片、Fab発現ライブラリーにより産生される断片、上記のいずれかのエピトープ結合断片及びOX40に結合する抗体の操作された形態、例えばscFv分子も含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、完全ヒト抗体である抗原結合タンパク質である。一実施形態において、OX40アゴニストは、ヒト化抗体である抗原結合タンパク質である。一部の実施形態において、本開示の方法及び組成物における使用のためのOX40アゴニストは、抗OX40抗体、ヒト抗OX40抗体、マウス抗OX40抗体、哺乳動物抗OX40抗体、モノクローナル抗OX40抗体、ポリクローナル抗OX40抗体、キメラ抗OX40抗体、抗OX40アドネクチン、抗OX40ドメイン抗体、単鎖抗OX40断片、重鎖抗OX40断片、軽鎖抗OX40断片、抗OX40融合タンパク質及びそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体若しくはバイオシミラーを含む。好ましい実施形態において、OX40アゴニストは、アゴニスト性、抗OX40ヒト化又は完全ヒトモノクローナル抗体(即ち単一細胞株に由来する抗体)である。
[00637] 任意選択により、ステップBの第1の拡大培養後、当技術分野において公知の標準アッセイを用いて細胞生存率アッセイを実施することができる。任意選択により、第1の拡大培養(初めのバルク拡大培養と称されることがある)後、当技術分野において公知の標準アッセイを用いて細胞生存率アッセイを実施することができる。例えば、バルクTILのサンプルに対してトリパンブルー色素排除アッセイを行うことができ、これは、死細胞を選択的に標識して生存率の評価を可能にするものである。生存率の試験に用いられる他のアッセイとしては、限定はされないが、アラマーブルーアッセイ;及びMTTアッセイを挙げることができる。
[00638] 一部の実施形態において、細胞数及び/又は生存率が測定される。限定はされないが、CD3、CD4、CD8及びCD56などのマーカー並びに本明細書に開示又は記載される任意の他のものの発現を抗体によるフローサイトメトリー、例えば、限定はされないが、FACSCanto(商標)フローサイトメーター(BD Biosciences)を使用してBD Bio-sciences(BD Biosciences、San Jose, CA)から市販されているものによって測定することができる。細胞は、ディスポーザブルc-chip血球計算盤(VWR、Batavia, IL)を使用して手動でカウントすることができ、及び生存率は、限定はされないがトリパンブルー染色を含め、当技術分野において公知の任意の方法を用いて評価することができる。
[00640] 一実施形態において、TILの拡大培養方法は、約5,000mL〜約25,000mLの細胞培養培地、約5,000mL〜約10,000mLの細胞培養培地又は約5,800mL〜約8,700mLの細胞培養培地を使用することを含み得る。一実施形態において、TIL数の拡大には1種類以下の細胞培養培地が使用される。任意の好適な細胞培養培地は、例えば、AIM-V細胞培養培地(L−グルタミン、50μM硫酸ストレプトマイシン及び10μM硫酸ゲンタマイシン)細胞培養培地(Invitrogen、Carlsbad CA)を使用し得る。この点に関して、本発明の方法では有利には、TIL数の拡大に必要な培地の量及び培地の種類の数が減少する。一実施形態において、TIL数の拡大は、2日又は3日おき以下の頻度で細胞に新鮮細胞培養培地を加える(細胞をフィードするとも称される)ことを含み得る。ガス透過性容器内の細胞数を増やすことは、細胞を拡大培養するのに必要なフィード頻度を減らすことによって細胞数を増やすのに必要な手順を単純化する。
[00645] 一部の実施形態において、TILは、任意選択により、限定はされないが、高親和性T細胞受容体(TCR)、例えばMAGE−1、HER2若しくはNY−ESO−1などの腫瘍関連抗原を標的とするTCR又は腫瘍関連細胞表面分子(例えば、メソテリン)若しくは系統限定的細胞表面分子(例えば、CD19)に結合するキメラ抗原受容体(CAR)を含め、追加の機能性を含むように遺伝子改変される。
[00646] 上記で考察し、且つ図8に提供されるステップA〜Eにおいて例示した通り、TIL拡大培養プロセス全体を通じて数々の時点で凍結保存を行うことができる。一部の実施形態において、(例えば、図8のステップDに従って提供される)第2の拡大培養後の拡大培養されたTIL集団は、凍結保存することができる。凍結保存は、概して、凍結溶液、例えば85%補体不活性化AB血清及び15%ジメチルスルホキシド(DMSO)中にTIL集団を置くことにより達成され得る。この溶液中の細胞を極低温バイアルに入れ、−80℃で24時間貯蔵し、任意選択により凍結保存のため気体窒素フリーザーに移す。Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986を参照されたい。一部の実施形態において、TILは、5%DMSO中に凍結保存される。一部の実施形態において、TILは、細胞培養培地+5%DMSO中に凍結保存される。一部の実施形態において、TILは、実施例8及び9に提供される方法に従って凍結保存される。
[00648] グランザイムB産生:グランザイムBは、TILが標的細胞を死滅させる能力の別の尺度である。CD3、CD28及びCD137/4−1BBに対する抗体を使用して上記に記載した通り再刺激した培地上清について、そのグランザイムBレベルも、Human Granzyme B DuoSet ELISA Kit(R & D Systems、Minneapolis, MN)を製造者の指示に従って使用して評価した。一部の実施形態において、第2の拡大培養TIL又は第2の追加の拡大培養TIL(例えば、reREP TILと称されるTILを含め、図8のステップDに記載されるものなど)は、グランザイムB産生が増加する。
(i)予め拡大培養された第1のTIL集団を得ること;
(ii)IL−2及び任意選択によりOKT−3を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせること;及び
(iii)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL−2、OKT−3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第3のTIL集団は、第2のTIL集団よりも数において少なくとも100倍多く、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために少なくとも14日間にわたって実施され、第3のTIL集団は、生存率について更にアッセイされる、生じさせること
を含む。
(iv)第3のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL−2、追加のOKT−3及び追加のAPCを補充することにより、追加の第2の拡大培養を実施することであって、追加の第2の拡大培養は、ステップ(iii)で得られたよりも大きいTIL集団を得るために少なくとも14日間にわたって実施され、第3の集団は、生存率について更にアッセイされる、実施すること
を更に含む。
(i)第1のTIL集団を得ること;
(ii)IL−2及び任意選択によりOKT−3を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせること;及び
(iii)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL−2、OKT−3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第3のTIL集団は、第2のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多い、生じさせること;
(iv)第3のTIL集団を回収し、洗浄し、且つ凍結保存すること;
(v)凍結保存TILを極低温で貯蔵すること;
(vi)第3のTIL集団を解凍して、解凍された第3のTIL集団を提供すること;及び
(vii)第3の集団の細胞培養培地にIL−2、OKT−3及びAPCを添加することにより、解凍された第3のTIL集団の一部の追加の第2の拡大培養を少なくとも3日の追加的拡大培養期間(reREP期間と称される場合もある)にわたって実施することであって、この第3の拡大培養は、第4のTIL集団を得るために実施され、第4のTIL集団中のTIL数は、比を求めるために第3のTIL集団中のTIL数と比較される、実施すること;
(viii)ステップ(vii)の比に基づき、解凍されたTIL集団が患者への投与に好適であるかどうかを決定すること;
(ix)ステップ(viii)において、第4のTIL集団中のTIL数と第3のTIL集団中のTIL数との比が5:1より大きいと決定されるとき、治療有効投与量の解凍された第3のTIL集団を患者に投与すること
を含む。
(i)第1の凍結保存TIL集団の一部を得ること;
(ii)第1の凍結保存TIL集団の一部を解凍すること;
(iii)IL−2、OKT−3及び抗原提示細胞(APC)を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団の一部を少なくとも3日の追加的拡大培養期間(reREP期間と称される場合もある)にわたって培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1のTIL集団からの一部は、比を求めるために第2のTIL集団と比較され、第2のTIL集団中のTIL数と第1のTIL集団の一部のTIL数との比は、5:1より大きいこと、生じさせること;
(iv)ステップ(iii)の比に基づき、第1のTIL集団が患者への治療的投与における使用に好適であるかどうかを決定すること;
(v)ステップ(iv)において、第2のTIL集団中のTIL数と第1のTIL集団中のTIL数との比が5:1より大きいと決定されるとき、第1のTIL集団が治療的投与における使用に好適であると決定すること
を含む。
[00690] 本発明は、TIL培養プロセス中の閉鎖系の使用を提供する。かかる閉鎖系は、微生物汚染の防止及び/又は削減を可能にし、使用するフラスコの数が少なくなり、コスト削減が可能となる。一部の実施形態において、閉鎖系は、2つの容器を使用する。
[00694] 滅菌接続装置(STCD)は、互換性のある2つの配管間に滅菌溶接を産生する。この手順により、様々な直径の容器及びチューブを滅菌接続できる。このガイダンスでは、これらの装置の使用に関する推奨管理基準及び手順について記載する。このガイダンスは、滅菌接続装置の製造業者がマーケティングの承認又は認可を得るためにFDAに提出しなければならないデータ又は情報は取り扱っていない。また、表示方法において許可されていない目的で承認又は認可された滅菌接続装置を使用すると、米連邦食品医薬品化粧品法下で装置が粗悪品及び不正表示品と見なされる可能性があることに注意することも重要である。
[00701] ある実施形態において、TILの拡大培養方法は、上記で考察され図8で例示されているものを含み、約5,000mL〜約25,000mLの細胞培養培地、約5,000mL〜約10,000mLの細胞培養培地又は約5,800mL〜約8,700mLの細胞培養培地を使用することを含み得る。一部の実施形態において、培地は、例えば、実施例21に記載されるように、無血清培地である。一部の実施形態において、第1の拡大培養の培地は、無血清である。一部の実施形態において、第2の拡大培養の培地は、無血清である。一部の実施形態において、第1及び第2の拡大培養の培地は、両方とも無血清である。ある実施形態において、TIL数の拡大には1種類以下の細胞培養培地が使用される。任意の好適な細胞培養培地、例えばAIM-V細胞培養培地(L−グルタミン、50μM硫酸ストレプトマイシン及び10μM硫酸ゲンタマイシン)細胞培養培地(Invitrogen、Carlsbad CA)を使用し得る。この点に関して、本発明の方法では、有利には、TIL数の拡大に必要な培地の量及び培地の種類の数が減少する。一実施形態において、TILの数を拡大することは、3日又は4日に1回以下の頻度で細胞にフィードすることを含み得る。ガス透過性容器内の細胞数を増やすことは、細胞を拡大培養するのに必要なフィード頻度を減らすことによって細胞数を増やすのに必要な手順を単純化する。
[00706] 一部の実施形態において、TILは、任意選択により、限定はされないが、高親和性T細胞受容体(TCR)、例えばMAGE−1、HER2若しくはNY−ESO−1などの腫瘍関連抗原を標的とするTCR又は腫瘍関連細胞表面分子(例えば、メソテリン)若しくは系統限定的細胞表面分子(例えば、CD19)に結合するキメラ抗原受容体(CAR)を含め、追加の機能性を含むように遺伝子改変される。
[00708] バルクTIL集団又は拡大培養されたTIL集団は、任意選択により凍結保存できる。一部の実施形態において、治療用TIL集団で凍結保存が行われる。一部の実施形態において、凍結保存は、第2の拡大培養後に回収されたTILで生じる。一部の実施形態において、図8の例示的ステップFのTILで凍結保存が行われる。一部の実施形態において、TILは輸注バッグ中に凍結保存される。一部の実施形態において、TILは、輸注バッグでの置換前に凍結保存される。一部の実施形態において、TILは、凍結保存されるが輸注バッグ中には置かれない。一部の実施形態において、凍結保存は凍結保存培地を使用して実施される。一部の実施形態において、凍結保存培地は、ジメチルスルホキシド(DMSO)を含有する。これは、概して、凍結溶液、例えば85%補体不活性化AB血清及び15%ジメチルスルホキシド(DMSO)中にTIL集団を入れることにより達成される。この溶液中の細胞を極低温バイアルに入れ、−80℃で24時間貯蔵し、任意選択により凍結保存のため気体窒素フリーザーに移す。Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986を参照されたい。
[00716] 処置方法は、最初のTIL収集及びTILの培養から始まる。かかる方法については、両方とも当技術分野において例えばJin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35(3):283-292(全体として参照により本明細書に組み込まれる)により記載されている。処置方法の実施形態は、実施例を含む以下のセクション全体で説明される。
[00725] 本明細書に記載の組成物及び方法は、疾患の処置方法で使用することができる。一実施形態において、それらは過剰成長性障害の処置に使用するためのものである。それらは、本明細書及び以下の段落に記載されている通り他の障害の処置にも使用され得る。
[00731] 一部の実施形態において、本明細書に記載されるように作製されるTIL(例えば、図8のステップA〜Fに記載される方法から得られたTILを含む)は、以下に記載する抗体など、1つ以上の免疫チェックポイント調節因子と併用して投与することができる。例えば、PD−1を標的とする、且つ本発明のTILと共投与し得る抗体としては、例えば、限定はされないが、ニボルマブ(BMS−936558、Bristol-Myers Squibb;Opdivo(登録商標))、ペンブロリズマブ(ランブロリズマブ、MK03475又はMK−3475、Merck;Keytruda(登録商標))、ヒト化抗PD−1抗体JS001(ShangHai JunShi)、モノクローナル抗PD−1抗体TSR−042(Tesaro, Inc.)、ピジリズマブ(抗PD−1 mAb CT−011、Medivation)、抗PD−1モノクローナル抗体BGB−A317(BeiGene)及び/又は抗PD−1抗体SHR−1210(ShangHai HengRui)、ヒトモノクローナル抗体REGN2810(Regeneron)、ヒトモノクローナル抗体MDX−1106(Bristol-Myers Squibb)及び/又はヒト化抗PD1 IgG4抗体PDR001(Novartis)が挙げられる。一部の実施形態において、PD−1抗体は、クローン:RMP1−14(ラットIgG)−BioXcellカタログ番号BP0146からのものである。本明細書に記載される通りのステップA〜Fにより作製されるTILとの共投与方法における使用に好適な他の好適な抗体は、米国特許第8,008,449号(参照により本明細書に組み込まれる)に開示される抗PD−1抗体である。一部の実施形態において、抗体又はその抗原結合部分はPD−L1に特異的に結合し、PD−1とのその相互作用を阻害し、それにより免疫活性を増加させる。PD−L1に結合してPD−1とPD−L1との間の相互作用を破壊し、且つ抗腫瘍免疫応答を刺激する当技術分野において公知の任意の抗体が、本明細書に記載される通りのステップA〜Fにより作製されるTILとの共投与方法における使用に好適である。例えば、PD−L1を標的とする臨床試験中の抗体としては、BMS−936559(Bristol-Myers Squibb)及びMPDL3280A(Genentech)が挙げられる。PD−L1を標的とする他の好適な抗体は、米国特許第7,943,743号(参照により本明細書に組み込まれる)に開示される。当業者は、PD−1又はPD−L1に結合し、PD−1/PD−L1相互作用を破壊し、且つ抗腫瘍免疫応答を刺激する任意の抗体が、本明細書に記載される通りのステップA〜Fにより作製されるTILとの共投与方法における使用に好適であることを理解するであろう。一部の実施形態において、ステップA〜Fにより作製されるTILの組み合わせを投与される対象は、患者が抗PD−1抗体単独の投与に不応性の癌型を有するとき抗PD−1抗体と共投与される。一部の実施形態において、患者が難治性黒色腫を有するとき、患者はTILを抗PD−1と併用して投与される。一部の実施形態において、患者が非小細胞肺癌(NSCLC)を有するとき、患者はTILを抗PD−1と併用して投与される。
[00732] 一実施形態において、本発明は、TIL集団で癌を処置する方法を含み、ここで患者は本開示に係るTILの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。一実施形態において、本発明は、骨髄非破壊的化学療法で前処置された患者の癌処置に使用するためのTILの集団を含む。一実施形態において、TILの集団は注入による投与用である。一実施形態において、骨髄非破壊的化学療法は、2日間(TIL注入の27日前及び26日前)のシクロホスファミド60mg/kg/日及び5日間(TIL注入の27〜23日前)のフルダラビン25mg/m2/日である。一実施形態において、骨髄非破壊的化学療法及び本開示に係るTIL注入(0日目)後、患者は生理学的忍容量まで8時間毎に静脈内に720,000IU/kgのIL−2(アルデスロイキン、PROLEUKINとして市販)の静脈内注入を受ける。特定の実施形態において、TILの集団は、IL−2と組み合わせて癌を処置するのに使用され、IL−2はTILの集団後に投与される。
4.IL−2レジメン
[00742] 養子細胞移入(ACT)は、非常に有効な形態の免疫療法であり、抗腫瘍活性を有する免疫細胞を癌患者に移入することを含む。ACTは、抗腫瘍活性を有するリンパ球のインビトロ同定、それらの細胞の数を増やすインビトロ拡大培養及び癌担持宿主へのその注入を伴う治療手法である。養子移入に使用されるリンパ球は、切除された腫瘍の間質に由来し得る(腫瘍浸潤リンパ球又はTIL)。ACTのためのTILは、本明細書に記載される通り調製することができる。一部の実施形態において、TILは、例えば、図8に記載される通りの方法により調製される。TILは、抗腫瘍T細胞受容体(TCR)又はキメラ抗原受容体(CAR)を発現するように遺伝子改変されている場合に血液からも誘導され得るか、混合リンパ球腫瘍細胞培養物(MLTC)でエンリッチされ得るか、又は自己抗原提示細胞及び腫瘍由来ペプチドを使用してクローニングされ得る。注入される癌担持宿主にリンパ球が由来するACTは、自己ACTと称される。米国特許出願公開第2011/0052530号は、主に転移性黒色腫に罹患している患者の治療に向けた、癌退縮を促進するため養子細胞療法を実施する方法に関する(これらの方法に関して全体として参照により組み込まれる)。一部の実施形態において、TILは、本明細書に記載される通り投与することができる。一部の実施形態において、TILは単回用量で投与することができる。そのような投与は、注射、例えば静脈内注射によるものであり得る。一部の実施形態において、TIL及び/又は細胞傷害性リンパ球は複数回用量で投与され得る。投与は、1年に1回、2回、3回、4回、5回、6回又は6回を超え得る。投与は、月に1回、2週間に1回、週に1回又は隔日に1回であり得る。TIL及び/又は細胞傷害性リンパ球の投与は必要な限り継続され得る。
[00743] 一部の実施形態において、本開示は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)集団によって癌を処置する方法を提供し、この方法は、(a)患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得るステップ;(b)第1の細胞培養培地中で第1のTIL集団の初期拡大培養を実施することにより、第2のTIL集団を得るステップであって、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも5倍多く、第1の細胞培養培地は、IL−2を含む、ステップ;(c)第2の細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞(骨髄系aAPC)集団を使用して第2のTIL集団の急速拡大培養を実施することにより、第3のTIL集団を得るステップであって、急速拡大培養の開始から7日後、第3のTIL集団は、第2のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く;第2の細胞培養培地は、IL−2及びOKT−3を含む、ステップ;(d)癌を有する患者に治療上有効な分量の第3のTIL集団を投与するステップを含む。一部の実施形態において、本開示は、癌の処置における使用のための腫瘍浸潤リンパ球(TIL)集団であり、TIL集団は、(b)第1の細胞培養培地中において、患者から切除された腫瘍から得られた第1のTIL集団の初期拡大培養を実施することにより、第2のTIL集団を得るステップであって、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも5倍多く、第1の細胞培養培地は、IL−2を含む、ステップ;(c)第2の細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞(骨髄系aAPC)集団を使用して第2のTIL集団の急速拡大培養を実施することにより、第3のTIL集団を得るステップであって、急速拡大培養の開始から7日後、第3のTIL集団は、第2のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く;第2の細胞培養培地は、IL−2及びOKT−3を含む、ステップ;(d)癌を有する患者に治療上有効な分量の第3のTIL集団を投与するステップを含む方法によって得ることができる。一部の実施形態において、本方法は、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得る第1のステップ(a)を含む。一部の実施形態において、第2の細胞培養培地中において、IL−2は、約3000IU/mLの初期濃度で存在し、及びOKT−3抗体は、約30ng/mLの初期濃度で存在する。一部の実施形態において、第1の拡大培養は、14日以下の期間にわたって実施される。一部の実施形態において、第1の拡大培養は、ガス透過性容器を使用して実施される。一部の実施形態において、第2の拡大培養は、ガス透過性容器を使用して実施される。一部の実施形態において、急速拡大培養における第2のTIL集団とaAPC集団との比は、1:80〜1:400である。一部の実施形態において、急速拡大培養における第2のTIL集団とaAPC集団との比は、約1対300である。一部の実施形態において、処置される癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌(頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)を含む)、腎癌及び腎細胞癌からなる群から選択される。一部の実施形態において、処置される癌は、黒色腫、卵巣癌及び子宮頸癌からなる群から選択される。一部の実施形態において、処置される癌は、黒色腫である。一部の実施形態において、処置される癌は、卵巣癌である。一部の実施形態において、処置される癌は、子宮頸癌である。一部の実施形態において、癌の処置方法は、患者に第3のTIL集団を投与する前に骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンによって患者を処置するステップを更に含む。一部の実施形態において、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、60mg/m2/日の用量で2日間のシクロホスファミドの投与ステップと、それに続く25mg/m2/日の用量で5日間のフルダラビンの投与ステップを含む。一部の実施形態において、高用量IL−2レジメンは、忍容量まで8時間毎に15分ボーラス静脈内注入として投与される600,000又は720,000IU/kgのアルデスロイキン又はそのバイオシミラー若しくは変異体を含む。一部の実施形態において、処置に使用されるTILは、第1及び/又は第2の拡大培養、例えば図8のステップB、C及び/又はD中に細胞培養培地に添加され得るPD−1、LAG−3、TIM−3、CISH及びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd−RNAと接触しており、ここで、TIL及び他の薬剤は、0.1μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、0.5μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、0.75μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、1μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、1.25μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、1.5μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、2μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、5μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地又は10μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地からなる群から選択される量で添加され得る。一部の実施形態において、処置に使用されるTILは、第1及び/又は第2の拡大培養、例えば図8のステップB、C及び/又はD中、1日2回、1日1回、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎、6日毎又は7日毎にTIL培養物に添加され得る、PD−1、LAG−3、TIM−3、CISH及びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd−RNAと接触している。一実施形態において、処置に使用されるTILは、PD−1、LAG−3、TIM−3、CISH及びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd−RNAと接触しており、ここで、TIL及び他の薬剤は、0.1μM sd−RNA/10,000TIL、0.5μM sd−RNA/10,000TIL、0.75μM sd−RNA/10,000TIL、1μM sd−RNA/10,000TIL、1.25μM sd−RNA/10,000TIL、1.5μM sd−RNA/10,000TIL、2μM sd−RNA/10,000TIL、5μM sd−RNA/10,000TIL又は10μM sd−RNA/10,000TILからなる群から選択される量において、第1及び/又は第2の拡大培養、例えば図8のステップB、C及び/又はD中に添加され得る。一実施形態において、処置に使用されるTILは、PD−1、LAG−3、TIM−3、CISH及びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd−RNAと接触しており、ここで、TIL及び他の薬剤は、第1及び/又は第2の拡大培養、例えば図8のステップB、C及び/又はD中、1日2回、1日1回、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎、6日毎又は7日毎にTIL培養物に添加され得る。
[00744] ここで、本明細書に包含される実施形態は、以下の実施例を参照して説明される。これらの実施例は、説明のみを目的として提供され、本明細書に包含される開示は、決してこれらの実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ本明細書に提供される教示の結果として明らかになるあらゆる変形形態を包含すると解釈されるべきである。
[00745] 本明細書で考察されるように、閉鎖系で患者の腫瘍からTILを開発するためのプロトコル及びアッセイが開発された。
[00747] 高度な調製:0日目(最大36時間前に実施)、500mLのハンクス平衡塩類溶液に50μg/mLのゲンタマイシンを添加して、TIL分離洗浄バッファー(TIWB)を調製した。10mg/mLのゲンタマイシンストック溶液には、2.5mLをHBSSに移した。50mg/mLのストック溶液には、0.5mLをHBSSに移した。
[00751] 必要に応じて、以下の材料を無菌的にBSCに移し、以下の表16に従って表示を付した。
[00755] 必要に応じて、以下の材料を無菌的にBSCに移し、以下の表4に従って表示を付した。
[00759] GlutaMaxで6LのCM2を調製した。CM2の手順については、「プレREP及びREPの培地の調製」の参考検査手順を使用した。使用の1時間前に37℃で加温した。IL−2アリコートを解凍した:冷凍庫からIL−2アリコートを取り出し、4℃に置いた。
[00760] インキュベーターからG-REX-100Mフラスコを取り外し、BSC2に入れた。フラスコの底にある細胞を乱さなかった。GatherRex又は蠕動式ポンプを使用して、フラスコから約900mLの細胞培養上清を吸引した。フラスコを静かに旋回させてTILを再懸濁した。全ての細胞が膜から遊離していることが観察された。残留細胞懸濁液を適切なサイズの血液移送パック(300〜1000mL)に移した。断片が血液移送パックに移らないように注意した。移送パックに4インチ血漿移送セットを固定した。細胞懸濁液を混合し、3mLシリンジを使用して、細胞カウントのために1mLのTIL懸濁液を取り出した。使用する準備ができるまで移送パックをインキュベーターに入れた。
[00761] 培地を37℃で>1時間温めた。3mLの6×106IU/mLストックrhIL−2を6LのCM2に加え、最終濃度3,000IU/mL rhIL−2にした(「完全CM2」)。メスルアー付きの4インチ血漿移送セットを1L移送パックに滅菌溶接した。500mLの完全CM2を1L移送パックに移した。針付きの1.0mLシリンジを使用して、150μLの1mg/mL抗CD3(クローンOKT3)を吸い上げ、500mLの「完全CM2」に移した。使用するまで37℃で貯蔵した。
[00762] 4.5Lの「完全CM2」をG-REX-500Mフラスコに移し、準備ができるまでフラスコを37℃のインキュベーターに入れた。
[00763] 2人以上のドナーからの5.0×109の同種異系照射フィーダーを使用した。LN2冷凍庫からフィーダーを取り外した。フィーダーを37℃のインキュベーター又はビーズバスで解凍した。ほぼ完全に解凍されたが、依然として冷えているときにフィーダーを浴から取り出した。十分な数の照射細胞(5×109個の細胞、+/−20%)を確保するため、各フィーダーバッグをオープンG-Rex 500Mに直接加えた。500mLの「完全CM2」+OKT3を含む1L移送パックを取り外し、BSCに移した。フィーダーバッグの内容物全体をシリンジに引き込み、容積を記録し、5.0×109個の同種異系照射フィーダーを移送パックに分配した。
[00765] インキュベーターから調製済み培地を含むG-REX 500Mフラスコを取り外した。フィーダー移送パックをG-REX-500Mに取り付け、バッグの内容物を500Mに排出できるようにした。合計200×106の生細胞を達成するために追加するTIL懸濁液の量を計算した。
(TVC/mL)/200×106=mL
[00768] 50×106個未満のTILで開始した培養のためのAIM Vの10Lバッグ1つ、50×106個を超えるTILで開始したバッグ2つを37℃で少なくとも1時間又は使用する準備が整うまで温めた。
[00769] インキュベーターからG-REX 500Mフラスコを取り外し、フラスコの底にある細胞培養物を乱さないように注意した。G-REX-500Mフラスコから4Lの細胞培養培地を取り出し、滅菌容器に入れた。全てのTILが膜から再懸濁されるまでG-REX-500Mを旋回させた。細胞懸濁液を2L移送パックに移した。後で使用するために500Mフラスコを保持した。以下の式に従い、継代培養に必要なフラスコの総数を計算した。端数は切り上げた。
総生細胞/1.0×109=フラスコ数
[00770] 必要な500Mフラスコ2本毎に10LのAIM-Vバッグを準備した。必要に応じて追加の培地を温めた。AIM-Vが10L必要になる毎に100mLのGlutaMAXを加えてCM4を作成した。3,000IU/mL rhIL−2の最終濃度のためにCM4培地にrhIL−2を添加した。細胞培養を分割する。各G-REX-500Mを5Lまで充填した。計算した数のG-REX-500MでTIL量を均等に分配した。REPの22日目に回収するまでフラスコを37℃、5%CO2インキュベーターに入れた。
[00771] PlasmaLyte A 7.4の2つの1Lバッグのそれぞれに40mLの25%HSAを加え、2Lの1%HSA洗浄バッファーを調製した。LOVO補助バッグにプールする。600IU/mLのIL−2で200mLのCS10を添加した。4つの750mLアルミニウム冷凍庫キャニスターを4℃で予め冷却した。
[00772] 37℃のインキュベーターからG-REX 500Mフラスコを取り外し、フラスコの底にある細胞培養物を乱さないように注意した。各フラスコから細胞培養上清4.5Lを吸引して廃棄した。G-REX-500Mフラスコを旋回させて、TILを完全に再懸濁した。TILをバイオプロセスバッグに回収した。バッグをよく混合し、3mLシリンジを使用して、細胞カウントのために2×2mLのサンプルを採取した。バッグの重量を量り、初期重量と最終重量に差を発見した。以下の計算を使用して、細胞懸濁液の量を決定した。
細胞懸濁液の正味重量(mL)/1.03=容積(mL)
(細胞製品の容積×2)/100=必要バッグ数(切り捨て)
(細胞製品の容積×2)/必要バッグ数=各バッグに加える容積
[00778] LOVO最終物、CS10バッグルアーロック及び適切な数のクライオバッグが取り付けられた。必要なCS10容積は、LOVO最終物バッグの容積と同等であった。反転によりLOVO最終物バッグを混合した。
[00780] 速度を制御された冷凍庫の標準手順に従った。CRFを使用した後、液体窒素(LN2)にクライオバッグを貯蔵した。
[00781] 細胞は、7日目及びリンパ球減少前にカウントできる。最終細胞製品には、Plasma-Lyte A(商標)の最小50%のHypoThermosol(商標)(容積/容積)及び300IU/mLのIL2を含む最大0.5%HSA(ヒト注入に適合)で製剤化された最大約150×109個の生細胞が含まれる。最終産物は、注入のための2つの容積のいずれかで投与に使用できた。
1)回収された総TILが≦75×109個である場合、250mL(容量300mLの輸注バッグ内)、又は
2)回収された総TILが<150×109個である場合、500mL(容量600mLの輸注バッグ内)
[00783] この実施例では、実施例3〜6で説明した2Aプロセスの詳細な0日目のプロトコルについて説明する。
[00785] 腫瘍洗浄培地CM1及びIL−2は、有効期限内であることを確認した。インキュベーターにCM1(細胞培養培地1)を入れた。
[00786] 6000IU/mLのIL−2を含むTIL培地CM1を調整した:1LのCM1及び1mlのIL−2(6,000,000IU/mL)。G-REXに加えるときに断片に使用するため、25mlのCM1+IL2を50mlのコニカルに入れ、予温のため37℃のインキュベーターに入れた。
[00788] 腫瘍処理の開始時間を記録した。過剰な腫瘍断片のために、3〜5mLの腫瘍洗浄培地を1つの6ウェルプレートの各ウェルにピペットで入れた。50mLの腫瘍洗浄液をピペットで移し、皿1〜3と保持皿を洗浄した。2つの150mm剥離皿をバイオセーフティキャビネットに入れた。3本の滅菌50mLコニカルチューブをBSCに入れた。5〜20mLの腫瘍洗浄培地を各コニカルに追加した。腫瘍の洗浄及び剥離プロセス中、必要に応じて、鉗子及びメスを腫瘍洗浄媒体に浸した。
[00794] この実施例では、実施例3〜6で説明した2Aプロセスの詳細な11日目のプロトコルについて説明する。
処理の前日:
[00795] CM2は、処理が行われる前日に準備できた。4℃に置いた。
[00797] フィーダーセルハーネスを準備した。CTF-FORM-318毎に5mLの凍結保存培地を準備し、必要になるまで4℃に置く。
[00799] 1L移送パック(TP)の乾燥重量を記録した。重量で500mLのCM2をTPに注入した。37℃(+/−1℃)の水浴中でフィーダー細胞を解凍した。最終フィーダー配合物をよく混合した。5mLシリンジ及び不要なポートを使用して、1mlの細胞を確実にサンプリング及び除去できるようにポートを細胞溶液ですすぎ、カウントのための表示が付されたチューブに入れた。フィーダー細胞サンプル及び記録データに対して一度の細胞カウントを実施し、バッチ記録に生データのカウントを添付した。細胞数が<5×109である場合、より多くの細胞を解凍してカウントし、フィーダー細胞に加えた。フィーダーバッグの容積を再秤量し容積を計算した。取り除く細胞の容積を計算した。
[00801] 細胞をよく混合し、上記で計算した容積を取り除き、5.0×109個の細胞を達成した。不要な細胞を廃棄した。1mLシリンジと18G針を使用して、0.150mLのOKT3を吸引し、針を取り外し、メスルアーを介してフィーダーTPに移した。フィーダーバッグをG-Rex 500MCSの赤ラインに滅菌溶接した。ラインのクランプを外し、重力によりフィーダー細胞がフラスコに流れ込むようにした。G-Rex 500MCSをインキュベーターに戻し、時間を記録した。
[00803] インキュベーターからG-Rex 100MCSを慎重に取り出した。GatheRexを使用して、約900mLの培養上清を1L移送パックに移した。全ての細胞が膜から剥離するまでフラスコを旋回した。膜を確認し、全ての細胞が剥離していることを確認した。収集チューブから離してフラスコを傾け、腫瘍断片を縁に沿って沈降させた。断片がフラスコの反対側に残るように、収集チューブに向かってゆっくりとフラスコを傾けた。GatheRexを使用して、残留細胞懸濁液を、腫瘍断片を避けて300mLの移動パックに移した。全ての細胞が膜から離れたことを再確認した。必要に応じて、GatheRexのクランプを開放して逆洗し、重力によって一部の培地をG-Rex 100MCSフラスコに流入させた。フラスコを激しく叩いて細胞を遊離させ、300ml TPに注入した。収集が完了した後、赤ラインとヒートシールを閉じた。細胞懸濁液を含む300ml TPの記録質量(乾燥質量を含む)及び細胞懸濁液の容積を計算した。細胞をよく混合した。5mLシリンジドロー1mLを無菌的に取り付け、冷凍保存バイアルに入れた。第2のシリンジで繰り返した。これらは、細胞、生存率のカウントに使用された。インキュベーターに入れ、インキュベーターで時間及び場所を記録した。各サンプルに対して一度の細胞カウントを実施し、記録した。必要に応じて、総生細胞TIL密度を2×108個以下の生細胞に調整した。削除する容積を計算又は不要な調整を記録した。
[00806] 細胞に加える凍結培地の計算量:
[00808] この実施例では、実施例3〜6で説明した2Aプロセスの詳細な16日目のプロトコルについて説明する。
[00809] 50×106個未満のTILで開始した培養物のCM4の10Lバッグ1つを37℃のインキュベーターで少なくとも30分又は使用準備が整うまで温めた。インキュベーターからG-Rex 500MCSフラスコを取り出し、GatheRexを使用して、約4Lの培養上清を10LのLabtainerに移した。適切なGatheRex回収指示に従って回収した。
[00814] 記録データに対して一度の細胞カウントを実施し、バッチ記録に生データのカウントを添付した。文書化された希釈。Cellometerカウントプログラムを文書化した。正しい希釈がCellometerに入力されたことを確認した。継代培養に必要なフラスコの総数を計算した。
[00815] Aim Vの10LバッグをGlutamaxと共に配置した。5mLのIL−2をシリンジに吸い上げ(最終濃度は3000IU/ml)、IL−2をバッグに分配した。Aim Vの残りのバッグについても繰り返した。
フラスコに加えるCM4の量を決定した。フラスコ毎に加えられた細胞の容積及びCM4の5000mL−Aの容積を記録した。フラスコを37℃、5%CO2に入れた。
[00816] 細胞産物バッグを化学天秤に置き、G-REXフラスコにTILを加えた時間を記録した。細胞をよく混合した。全てのフラスコで細胞の移動を繰り返した。フラスコを37℃、5%CO2に置き、TILをG-REXフラスコに加えた時間を記録した。微生物学研究室へ沈降プレートの試験及び好気的及び嫌気的無菌性の試験の指示をした。
[00818] 必要な凍結培地の計算量:標的細胞濃度は、1×108/mlであった。除去されたセルの総量を記録した。標的細胞濃度は、1×108細胞/mLであった。加える凍結培地の総量を計算した。
[00820] この実施例では、実施例3〜6で説明した2Aプロセスの詳細な22日目のプロトコルについて説明する。
[00821] PlasmaLyte Aの3つの1LバッグをBSCに入れた。プールを準備し、PlasmaLyte Aバッグに1%HSAの表示を付した。25%の120mLを移送のために充填した。HSAを3LのPlasmaLyteバッグに移した。よく混合した。3リットルバッグの無針ポートから5mLの1%HSAのPlasmaLyteを取り出した。LOVO洗浄バッファーと表示し、日付を付した。
[00823] 5mLシリンジから表示が付された50mlの滅菌コニカルチューブにPlasmalyte/1%HSAを分配した。PlasmaLyteを含むチューブに0.05mLのIL−2ストックを加え、IL−2 6×104個と表示を付した。2〜8℃で保管した。
[00824] 37℃からG-REX 500Mフラスコを取り外した。GatheRexポンプを使用して、第1のフラスコの容積を減少させた。飛散又は泡立ちを避けながらTILが完全に再懸濁されるまで、G-REX 500Mフラスコを旋回させた。全ての細胞が膜から乖離していることを確認した。G-Rexフラスコを傾けて、細胞懸濁液が収集ストローのあるフラスコの側面に溜まるようにした。細胞懸濁液を収集するためにGatherRexを開始し、全ての細胞がフラスコから取り除かれるようにした。細胞がフラスコに残っている場合、100mLの上清をフラスコに戻し、旋回させて、細胞懸濁液バッグに集めた。追加のフラスコに対して繰り返した。ヒートシールし、LOVO原料バッグと表示を付した。乾燥重量を記録した。
[00826] 各サンプル及び記録データに対して一度の細胞カウントを実施し、バッチ記録に生データのカウントを添付した。Cellometerカウントプログラムを文書化した。正しい希釈がCellometerに入力されたことを確認した。有核細胞の総数を決定した。除去するTNCの数を決定し、LOVO処理のために=1.5×1011個の細胞を保持した。取り出した細胞を適切なサイズの容器に入れて廃棄した。
[00827] 事前準備で設定されたBaxter延長セットを備えた10LLabtainerは、LOVOキットに溶接された交換用ろ液バッグであった。LOVOディスプレイに従った。手順を開始するため、ドロップダウンメニューから「TIL G-Rex回収」プロトコルを選択し、指示に従った。
[00832] 原料バッグを排出させた後、LOVOが原料バッグに洗浄バッファーを加えバッグをすすいだ。設定量の洗浄バッファーが原料バッグに加えられた後、LOVOは自動的に一時停止し、原料すすぎ一時停止画面を表示した。
[00834] スピナを通過させる別の細胞を準備するため、IPバッグを洗浄バッファーで希釈した。IPバッグに洗浄バッファーを追加すると、LOVOは自動的に一時停止し、「IPバッグ混合」一時停止画面が表示された。
[00836] LOVO手順の最終洗浄サイクル中、細胞をIPバッグからスピナを介して保持液(最終産物)バッグに注入した。IPバッグが空になったら、10mLの洗浄バッファーをIPバッグの底部ポートに加え、バッグをすすいだ。すすぎ液を追加した後、LOVOは自動的に一時停止し、「IPの角を揉む」一時停止画面が表示された。
[00841] 最終的な製剤化された産物量を記録した。最終産物表から必要なIL−2の量を計算した。
[00843] 標的容積に印を付け、凍結保存バッグの数と産物の保持サンプルの容積の下の表を保持した。
[00847] 「最終製剤産物量」表で決定された冷CS10の量を汲み上げた。ゆっくりと穏やかに混合しながら、CS10(1:1、容積:容積)を細胞に加えた。
[00849] 各凍結バッグに入れる細胞の量に合わせて、シリンジを適切なサイズのシリンジに交換した。細胞産物を混合した。細胞産物バッグに通じるクランプを開放し、適切な量を引き出した。
[00850] 不要なポート及び適切なサイズのシリンジを使用して、事前に決定した保持量を調製した。「保持」と表示を付した50mLコニカルチューブに保持した。ハーネスに取り付けられたシリンジを使用して、細胞を約1インチまでチューブに吸い上げながらバッグから全ての空気を取り除いた。2〜8℃に置いた。細胞産物バッグ内の細胞を混合し、活栓上の新しいシリンジを使用して残りのCS750バッグに対してステップ3〜8を繰り返して、細胞を保持した。産物がCRFに入ったら、処理のために取っておいた。
[00851] 冷凍庫は、サンプルを追加する準備ができるまで4℃で保持された。CRFにサンプルを加えた。
必要に応じて、以下の材料を無菌的に移し、表25のQC及び保持に従って表示を付した。1−細胞カウントチューブ、1−エンドトキシンチューブ、1−マイコプラズマチューブ、1−グラム染色チューブ、1チューブ再刺激チューブ及び1−迅速な試験のためのQCへのフローチューブ。残りの複製チューブを制御速度フリーザーに入れた。
[00857] 各サンプル及び記録データに対し1度の細胞カウントを実施し、バッチ記録に生データのカウントを添付した。Cellometerカウントプログラムを文書化した。正しい希釈がCellometerに入力されたことを確認した。
[00860] 実施完了後にフリーザーを停止した。カセットからクライオバッグを取り外した。カセットを気相LN2に移した。
[00861] この実施例では、追加のT細胞成長因子として機能するIL−2、IL−15及びIL−21サイトカインの使用を、実施例1〜10のTILプロセスと組み合わせて説明する。
[00864] この第2段階の多施設3コホート研究は、転移性黒色腫患者のプロセス1C(本明細書に記載される通り)に従って製造されたTIL療法の安全性及び有効性を評価するよう設計されている。コホート1及び2は、それぞれ最大30人の患者を登録し、コホート3は最大10人の患者への第2のTIL注入のための再処置コホートである。第1の2つのコホートは、2つの異なる製造プロセス:プロセス1C及びプロセス2Aの実施形態(それぞれ実施例1〜10で説明)を評価している。コホート1の患者は新鮮な非凍結保存TILを受け取り、コホート2の患者は実施例1〜10で説明したプロセスで製造された産物を受け取り、凍結保存製品を産生する。研究設計を図26に示す。この研究は、転移性黒色腫患者のサブ集団の処置のための自己TILの安全性及び有効性を評価する第2段階、多施設、3コホート研究である。主要な選択基準には、測定可能な転移性黒色腫及びTIL生成のために切除可能な病変が≧1;全身療法の少なくとも1つの前の段階;年齢≧18歳;0〜1のECOGパフォーマンスステータス、が含まれる。処置コホートには、非凍結保存TIL産物(プロセス1Cを使用して調製)、凍結保存TIL産物(プロセス2Aの実施形態を使用して調製)及び無応答又は初期応答後に進行する患者に対するTIL産物による再処置が含まれる。プライマリエンドポイントは安全性であり、セカンダリエンドポイントは有効性であり、客観的奏効率(ORR)、完全寛解率(CRR)、無増悪生存率(PFS)、奏効期間(DOR)及び全生存期間(OS)で定義される。
[00865] 本実施例は、γ線照射した末梢単核球(PBMC、別名MNC)の個々のロットが本明細書に記載される例示的方法における同種異系フィーダー細胞としての使用に適格か判定するための新規簡略手順について説明する。
[00867] TILのREPには、γ線照射した拡大培養が止まったMNCフィーダー細胞が必要であった。REPフラスコ内でフィーダーMNC上の膜受容体が抗CD3(クローンOKT3)抗体に結合し、TILに架橋することにより、TILが拡大培養されるように刺激される。フィーダーロットは、個別のドナーから採取された全血の白血球アフェレーシスから調製した。白血球アフェレーシス産物をFicoll-Hypaqueで遠心に供し、洗浄し、照射し、且つGMP条件下で凍結保存した。
[00869] フィーダーロットは2つの基準で判定された。1)共培養においてTILを100倍超に拡大培養するその能力、及び2)その複製不能性。
−2/3日目、TIL株の解凍
[00873] CM2培地を調整した。37℃の水浴中でCM2を加温した。3000IU/ml IL−2を添加した40mlのCM2を調製した。使用時まで保温する。使用したTIL株の名前の表示を付した2つの50mlコニカルチューブの各々に、IL−2を含まない20mlの予め加温したCM2を入れた。LN2貯蔵庫から2つの指定のプレREP TIL株を取り出し、バイアルを組織培養室に移した。残りの氷が少量になるまでバイアルを37℃の水浴中の密封されたジッパー式貯蔵用バッグの内部に置くことにより、バイアルを解凍した。
[00877] 試験するフィーダーロットの数に十分なCM2培地を調製した(例えば、1回に4つのフィーダーロットを試験するために、800mlのCM2培地を調製した)。上記で調製したCM2の一部をアリコートに分け、細胞の培養のため、それに3000IU/ml IL−2を添加した(例えば、1回に4つのフィーダーロットを試験するために、500mlの3000IU/ml IL−2含有CM2培地を調製する)。
[00886] 4℃の冷蔵庫からOKT3のストック溶液(1mg/ml)を取り出し、BSCに置いた。ミニREPの培地中には30ng/ml OKT3の最終濃度を使用した。
[00889] 各フラスコに表示を付し、フィーダー細胞を調製する前にフラスコにCM2培地を充填した。フラスコを37℃の加湿された5%CO2インキュベーターに置くことにより、残りの構成成分を加えるまでの間、培地を保温した。フィーダー細胞を調製し終えたら、各フラスコ内のCM2に構成成分を加える。
[00890] 本プロトコルについては、試験した1ロットあたり最低78×106個のフィーダー細胞が必要であった。SDBBによって凍結された各1mlバイアルは、凍結時に100×106個の生細胞を有した。LN2貯蔵庫からの解凍時に50%回収率と仮定すると、各REPについて推定100×106個の生細胞を所与として、1ロットあたりフィーダー細胞の1mlバイアルを少なくとも2本解凍することが推奨された。代わりに、1.8mlバイアルで供給される場合、1本のバイアルのみで十分なフィーダー細胞が提供された。
[00894] TIL細胞を1.3×106細胞/ml〜1.3×105細胞/mlに希釈した。15mlコニカルチューブに4.5mlのCM2培地を加えた。インキュベーターからTIL細胞を取り出し、10ml血清用ピペットを使用して十分に再懸濁した。1.3×106細胞/ml TIL懸濁液から0.5mlの細胞を取り出し、15mlコニカルチューブ内の4.5mlの培地に加えた。TILストックバイアルをインキュベーターに戻した。十分に混合した。第2のTIL株について繰り返した。単一のフィーダーロットについての予め加温した培地が入ったフラスコをインキュベーターからBSCに移した。1mlピペットチップで上下に数回ピペッティングすることによりフィーダー細胞を混合し、1ml(1.3×107細胞)をそのフィーダーロットの各フラスコに移した。各フラスコに60μlのOKT3作業ストック(10μg/ml)を加えた。2つの対照フラスコをインキュベーターに戻した。
3000IU/mlのIL−2でCM2を調製した。各フラスコに10ml必要である。10mlピペットで、3000IU/ml IL−2を含む10ml温CM2を各フラスコに移した。フラスコをインキュベーターに戻し、7日目まで直立でインキュベートした。試験した全てのフィーダーロットについて繰り返した。
[00897] インキュベーターからフラスコを取り出してBSCに移し、且つフラスコの底にある細胞層を乱さないよう注意を払った。フラスコの底に成長する細胞を乱すことなく、各試験フラスコから10mlの培地及び対照フラスコの各々から15mlの培地を取り出した。
[00901] 7日目にフィーダー対照フラスコをカウントし終えた後、対照フラスコの各々に、3000IU/ml IL−2を含有する新鮮CM2培地15mlを加えた。対照フラスコをインキュベーターに戻し、14日目まで直立位置でインキュベートした。
[00902] インキュベーターからフラスコを取り出してBSCに移し、且つフラスコの底にある細胞層を乱さないよう注意を払った。フラスコの底に成長する細胞を乱すことなく、各対照フラスコから約17mlの培地を取り出した。5ml血清用ピペットを使用して、残りの培地に細胞を再懸濁し、十分に混合して細胞集塊を全て壊した。各フラスコの容積を記録した。
結果
[00905] γ線照射の線量はフィーダー細胞を複製不能にするのに十分であった。全てのロットが判定基準に適合するものと予想され、また、0日目と比較してREP培養の7日目に残る生存フィーダー細胞総数の減少も実証された。
[00908] フィーダー細胞の各ロットについて試験した各複製TIL株は、以下の適合基準を満たしていた。
[00913] MNCフィーダーロットが上記に概説される適合基準のいずれかを満たさなかった場合、その原因として単純な実験者エラーを排除するため以下のステップを行ってロットを再試験する。
[00916] 本実施例は、γ線照射末梢血単核球(PBMC)の個々のロットが本明細書に記載される例示的方法における同種異系フィーダー細胞としての使用に適格か判定するための新規簡略手順について記載する。本例は、臨床用TILロットの産生における使用に関する照射PBMC細胞ロットの判定プロトコルを提供する。個別のドナーから各照射PBMCロットを調製した。100を超える適格性判定プロトコルを通して、いずれの場合にも、SDBB(サンディエゴ血液バンク)からの照射PBMCロットはREPの7日目にTILを>100倍に拡大することが示された。この改良された適格性判定プロトコルは、受けたγ線線量がそれらを複製不能にするのに十分であったことを確認するため更に試験されたSDBBからの照射ドナーPBMCロットに適用することが意図された。それが14日間にわたって複製不能を維持することが実証されると、ドナーPBMCロットは、臨床用TILロットの産生への使用に「適格である」と見なした。
[00917] TILの現行の標準REPには、γ線照射した拡大培養が止まったPBMCが必要であった。培養下でPBMC上の膜受容体が抗CD3(クローンOKT3)抗体に結合し、TILに架橋することにより、TILが拡大するように刺激される。PBMCロットは、個別のドナーから採取された全血の白血球アフェレーシスから調製した。白血球アフェレーシス産物をFicoll-Hypaqueで遠心に供し、洗浄し、照射し、且つGMP条件下で凍結保存した。
[00919] 照射PBMCロットの判定基準はその複製不能性であった。
[00920] 直立T25組織培養フラスコを使用して、フィーダーロットをTILと共培養したかのようにミニREPフォーマットで試験した。対照ロット:歴史的に上記の基準に適合することが示されている照射PBMCの1つのロットを、対照として実験ロットと並行して実行した。試験する照射ドナーPBMCの各ロットについて、デュプリケートのフラスコを実行した。
0日目
[00921] 試験されるドナーPBMCの各ロットについて約90mlのCM2培地を調製した。CM2は37℃の水浴中に保温した。6×106IU/ml IL−2のアリコートを解凍した。CM2培地をBSCに戻し、70%EtOHで拭き取った後、フードに置いた。試験するPBMCの各ロットについて、約60mlのCM2を別個の滅菌ボトルに取り出した。解凍した6×106IU/mlストック溶液からのIL−2を3000IU/mlの最終濃度でこの培地に加えた。このボトルに「CM2/IL2」(又は類似)の表示を付して、それを無添加のCM2と区別した。
[00922] 4℃の冷蔵庫から抗CD3(OKT3)のストック溶液を取り出し、BSCに置いた。ミニREPの培地中には30ng/ml OKT3の最終濃度を使用した。1mg/mlストック溶液からの抗CD3(OKT3)の10μg/ml作業溶液を調製した。必要になるまで冷蔵庫に置いた。
[00924] 表示を付したT25フラスコに、1フラスコあたり19mlのCM2/IL−2を加え、細胞を調製する間、フラスコを37℃の加湿5%CO2インキュベーターに置いた。
[00925] 試験されるPBMCロットのバイアルをLN2貯蔵庫から取り出した。それらのバイアルは解凍時まで−80℃に置くか、又はドライアイス上に保った。解凍される各ロットについて30mlのCM2(IL−2の添加なし)を50mlコニカルチューブに入れた。各チューブに解凍されるPBMCの異なるロット番号の表示を付した。使用時まで、チューブのキャップを確実に閉めて37℃の水浴中に置いた。必要に応じて、50mlコニカルチューブをBSCに戻し、70%EtOHで拭き取った後、フードに置いた。
[00930] 2つの表示を付したT25フラスコを組織培養インキュベーターからBSCに戻した。抗CD3/OKT3の10μg/mlバイアルをBSCに戻した。フラスコに1mlの1.3×107PBMC細胞懸濁液を加えた。各フラスコに60μlの10μg/ml抗CD3/OKT3を加えた。キャップを閉めたフラスコを組織培養インキュベーターに戻し、手を加えることなく14日間成長させた。次のロットに必要になるまで抗CD3/OKT3バイアルを冷蔵庫に入れ戻した。判定されるPBMCのロット毎に繰り返した。
[00931] 複製したT25フラスコをBSCに戻した。各フラスコについて、新鮮な10ml血清用ピペットを使用してフラスコの各々から約17mlを取り出し、次に残りの培地を慎重に抜き取って、フラスコ内に残る容積を測定した。容積を記録した。
結果
[00934] γ線照射の線量はフィーダー細胞を複製不能にするのに十分であると予想された。全てのロットが判定基準に適合するものと予想され、0日目と比較してREP培養の14日目に残る生存フィーダー細胞総数の減少が実証された。
[00935] 試験した各照射ドナーPBMCロットについて、以下の適合基準が満たされた:「成長なし」 − 14日目の総生細胞数が、REPの0日目に培養を開始した初期生細胞数より少なかったことを意味した。
[00936] 照射ドナーPBMCロットが上記の適合基準を満たさなかった場合、その不適合の原因として単純な実験者エラーを排除するため以下のステップを行ってロットを再試験した。ロットのサテライトのバイアルが2つ以上残っていた場合、そのロットは再試験した。ロットのサテライトのバイアルが1つ残っているか又は残っていない場合、上記の適合基準に基づきそのロットは不適合とした。
[00938] この実施例は、精製され凍結乾燥された組換えヒトインターロイキン−2を、rhIL−2の使用を含むものを含む本出願及び実施例に記載されたものを全て含む更なる組織培養プロトコルでの使用に適したストックサンプルに溶解するプロセスを説明する。
[00939] 0.2%酢酸溶液(HAc)を調製した。29mL滅菌水を50mLコニカルチューブに移した。1mLの1N酢酸を50mLのコニカルチューブに加えた。チューブを2〜3回反転させることにより十分に混合した。Steriflipフィルターを使用してろ過することによりHAc溶液を滅菌した。
[00946] 本例は、限定はされないが、転移性黒色腫、頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)、卵巣癌、トリプルネガティブ乳癌及び肺腺癌を含めた様々な腫瘍型に由来する腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の培養が関わるプロトコルに用いられる組織培養培地の調製手順について説明する。本出願及び実施例に記載される任意のTILの調製にこの培地を使用することができる。
[00947] 低温貯蔵庫から以下の試薬を取り出し、37℃の水浴中で加温した:(RPMI1640、ヒトAB血清、200mML−グルタミン)。以下の表28に従い、ろ過される容積に適切な0.2μmフィルターユニットの上部に成分の各々を加えることによりCM1培地を調製した。4℃で保管する。
[00950] 冷蔵庫から調製済みのCM1を取り出したか、又は上記セクション7.3に従って新鮮CM1を調製する。AIM-V(登録商標)を冷蔵庫から取り出し、滅菌培地ボトル内に調製済みCM1を等容積のAIM-V(登録商標)と混合することにより、必要な量のCM2を調製した。使用当日、CM2培地に3000IU/ml IL−2を加えた。使用当日、十分な量の3000IU/ml IL−2含有CM2を作成した。CM2培地ボトルに、その名前、調製者のイニシャル、それがろ過/調製された日付、2週間の有効期限の表示を付し、組織培養に必要になるまで4℃で貯蔵した。
[00951] 使用が必要になった当日に、CM3を調製した。CM3はAIM-V(登録商標)培地と同じであり、使用当日に3000IU/ml IL−2を添加した。AIM-Vのボトル又はバッグにIL−2ストック溶液を直接加えることにより、実験の必要上十分な量のCM3を調製した。軽く振盪することにより十分に混合した。AIM-Vに加えた直後に、ボトルに「3000IU/ml IL−2」の表示を付す。過剰なCM3がある場合、これを培地名、調製者のイニシャル、培地の調製日及びその有効期限(調製後7日)を表示したボトルに4℃で貯蔵した。IL−2を添加した培地は4℃で7日間の貯蔵後に廃棄した。
[00952] CM4はCM3と同じであり、加えて2mMのGlutaMAX(商標)(最終濃度)を添加した。1LのCM3について10mlの200mM GlutaMAX(商標)を加えた。AIM-Vのボトル又はバッグにIL−2ストック溶液及びGlutaMAX(商標)ストック溶液を直接加えることにより、実験の必要上十分な量のCM4を調製した。軽く振盪することにより十分に混合した。AIM-Vに加えた直後に、ボトルに「3000IL/nil IL−2及びGlutaMAX」の表示を付した。過剰なCM4がある場合、これを培地名「G1utaMAX」及び有効期限(調整後7日)とボトルにラベル付けし、4℃で貯蔵した。IL−2を添加した培地は4℃で7日間の貯蔵後に廃棄した。
[00954] この実施例では、2Aプロセスで現在使用されている標準CM1、CM2及びCM4培地の代替としての無血清培地の有効性の評価を示すデータを提供する。この研究では、3つの段階の代替として利用可能な無血清培地(SFM)及び無血清代替品の有効性を試験した。
[00957] プレ及びポストREP培養で使用されている現在の培地の組み合わせは効果的であることが証明されているが、AIM-VではREP障害が発生する可能性がある。効果的な無血清代替物が特定された場合、使用する培地の種類の数を3から1に減らすことで、CMOで実施するプロセスをより容易且つ単純にすることができる。更に、SFMは、ヒト血清の使用を排除することにより、外因性疾患の可能性を減らす。この実施例は、2Aプロセスでの無血清培地の使用を裏付けるデータを提供する。
[00958] プレREP及びREPは、LAB-008で述べた通りに開始された。この3つの段階の実験概要を以下のチャートに示す。
[00963] 無血清培地を2Aプロセスで使用される標準と比較した場合、同等又は統計的に優れた細胞成長の結果が観察された。
プレ及びポストREP TIL拡大培養の無血清培地の有効性を試験する。
[00965] CTS Optimizer+SR(血清交換)は、増強したプレREP TIL拡大培養と同等のREP TIL拡大培養とを示した。CTS OpTimizer、X-Vivo 20及びPrime T-CDMは、3%CTS免疫CTS SRの有無にかかわらず追加され、標準条件に対して試験された。M1079及びL4026では、CTS OpTimizer+CSR条件は、標準条件(CM1、CM2、CM4)と比較した場合、プレREP TILの有意な増強(p<0.05)を示した。一方、CSRを使用しないCTS OptimizerはプレREP TILの拡大培養に役立たなかった(付録−1、2、3)。CTS Optimizer+CSRは、試験された3つの腫瘍の2つでポストREPに匹敵するTIL拡大培養を示した(図2B)。X-Vivo 20及びPrime T-CDM条件では、プレ及びポストREPで大きいばらつきが発生したが、CTS Optimizerは4組間で比較的一貫性があった。更に、血小板溶解物を加えたSFMは、標準と比較した場合、プレREP及びポストREP TILの拡大培養を促進しなかった。この調査結果は、当社の標準に匹敵する成長を提供するために血清置換が確かに必要であることを示唆しており、CTS optimizer+CSRが候補となり得る。
[00969] インターフェロンγELISA(Quantikine)。IFN−yの産生は、R&D SystemsのQuantikine ELISAキットを使用して測定した。CTS+SRは、標準条件と比較した場合、同量のIFNーyを産生した。
[00970] 自己腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を用いた養子T細胞療法は、転移性黒色腫及び子宮頸癌の患者で臨床的有効性を実証している。いくつかの研究では、より良い臨床結果では、注入された細胞の総数及び/又はCD8+T細胞の割合と正の相関を示している。現在のほとんどの産生レジメンでは、TILの成長を促進するためにIL−2のみを使用している。IL−15及びIL−21を含むレジメンを使用すると、リンパ球の成長が促進されることが報告されている。この研究では、最近診療所で実施された第2のジェネレーションIL−2 TILプロトコルにIL−15及びIL−21を加えることの前向きな効果について説明する。
[00971] TILを生成するプロセスには、1〜3mm3サイズの腫瘍断片を、IL−2を含む培地に配置する、プレ急速拡大培養プロトコル(プレREP)が含まれる。プレREP中、TILは腫瘍断片から移り、IL−2刺激に応じて拡大培養する。
[00983] この研究では、プロセス1Cで現在利用されているTILに対する100:1の同種異系フィーダー細胞のコントロールに対して、25:1及び50:1でTILの成長を試験した。
A.T細胞の容積(直径10μm):V=(4/3)πr3=523.6μm3
B.高さ40μm(4細胞)のG-Rex 100(M)の円柱フラスコ:V=(4/3)πr3=4×1012μm3
C.円柱フラスコBを満たすために必要な細胞数:4×1012μm3/523.6μm3=7.6×108μm3*0.64=4.86×108
D.4D空間で最適に活性化できる細胞数:4.86×108/24=20.25×106
E.G-Rex 500に外挿されたフィーダー及びTILの数:TIL:100×106及びフィーダー:2.5×109
(1) Jin, Jianjian, et.al., Simplified Method of the Growth of Human Tumor Infiltrating Lymphocytes (TIL) in Gas-Permeable Flasks to Numbers Needed for Patient Treatment. J Immunother. 2012 Apr; 35(3):283-292。
(2) Jaeger HM, Nagel SR. Physics of the granular state. Science. 1992 Mar 20; 255(5051):1523-31。
(3) O. R. Musin (2003). “The problem of the twenty-five spheres”. Russ. Math. Surv. 58 (4):794-795。
[00995] この実施例では、Iovance Biotherapeutics,IncのcGMP製造について説明する。現行のヒト細胞・組織医薬品の製造・品質管理基準並びに現行の医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理に関する基準に従ったG-RexフラスコでのTIL細胞療法プロセス。この資料は、米国FDA医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理に関する基準(21 CFR Part 210、211、1270及び1271)並びにフェーズIから商用資料まで適用されるICH Q7基準に基づいて製造される。
[00998] RPMI1640培地を調整した。BSCにおいて、適切なサイズのピペットを使用して、1000mL RPMI1640培地から100.0mLを取り出し、「廃棄物」とラベル付けされた適切なサイズの容器に入れた。
[001006] ゲンタマイシンをHBSSに追加した。BSCにおいて、5.0mLのゲンタマイシン(W3009832又はW3012735)を1×500mL HBSS培地(W3013128)ボトルに追加した。容積を記録した。ボトル毎の追加量:HBSS(500.0mL);硫酸ゲンタマイシン、50mg/ml(5.0mL)。試薬を完全に混合した。ステップ8.2.1で調整したゲンタマイシンを含むHBSSを1L 0.22ミクロンフィルターユニット(W1218810)でろ過した。ろ過された培地に無菌的に蓋をし、以下の情報をラベル付けした。
[001007] 腫瘍標本を入手し、腫瘍情報を処理及び記録するために直ちに2℃〜8℃の部屋に移した。3本の50mlコニカルチューブにラベルを付けた。1つ目は「鉗子」、2つ目は「メス」、3つ目は「新鮮な腫瘍洗浄培地」。5×100mmのペトリ皿に「洗浄1」、「洗浄2」、「洗浄3」、「保持」及び「良好でない」というラベルを付けた。1つの6ウェルプレートに「好ましい中間断片」というラベルを付けた。
[001024] インキュベーターをモニターした。インキュベーターのパラメータ:温度LEDディスプレイ:37.0±2.0℃;CO2パーセンテージ:5.0±1.5% CO2。1000mL RPMI1640培地(W3013112)ボトル3本及び1000mLAIM-V(W3009501)ボトル3本を、インキュベーターで30分以上温めた。時間を記録した。培地:RPMI1640及びAIM-V。後で使用するために、AIM-V培地(W3009501)の追加の1×1000mlボトルを室温で配置した。
[001036] インキュベーターのパラメータ:温度LEDディスプレイ:37.0±2.0℃;CO2パーセンテージ:5.0±1.5% CO2。G-Rex100MCSをインキュベーターから取り外す前に、インキュベーションパラメーターが満たされていることを確認するためのチェックを実行した。下限は上記と同じである。
[001048] 総生存TILセル数が4.0×107以上の場合、フローサイトメトリーのサンプルのために1.0×107個の細胞を得るために容積を計算した。フローサイトメトリーに必要な総生存細胞:1.0×107細胞。フローサイトメトリーに必要な細胞の容積:生存細胞濃度を1.0×107細胞で割った値。
[001050] 該当する場合:凍結保存のための容積を計算した。凍結保存のために1×107個の細胞を得るために必要な細胞の体積を計算した。
[001054] LN2フリーザーから少なくとも2つの異なるロット番号を持つフィーダー細胞のバッグを3つ入手した。解凍の準備ができるまで、ドライアイス上に細胞を置いた。フィーダー細胞情報を記録した。少なくとも2つの異なるロット番号のフィーダー細胞が得られたことを確認した。フィーダー細胞バッグをロット番号に基づいて個々のジップトップバッグに入れ、37.0±2.0℃の水浴若しくはサイトサーモを約3〜5分又は氷が消えるまで解凍した。
[001064] G-Rex500MCSのセットアップ。梱包からG-Rex500MCSを取り出し、フラスコに亀裂又はチューブにねじれがないか検査した。全てのルアー接続と閉鎖が確実であることを確認した。ベントフィルターラインを除くG-Rex500MCSラインの全てのクランプを閉じた。マーカーを使用して、4.5Lグラデーションで線を引いた。インキュベーターから「完全CM2 11日目培地」を取り出した。
[001070] 過剰なTILバイアルを冷凍した。制御速度冷凍庫(CRF)に入れられたバイアルの総数を記録及び検証した。冷却が完了したら、バイアルをCRFから適切な保管容器に移す。
[001071] 事前に温められたAIM-V培地。使用の少なくとも12時間前までに2〜8℃から3つのCTS AIM V 10L培地バッグを取り外し、遮光して室温に置いた。各バッグにラベルを付けた。温め開始時刻と日付の記録。全てのバッグが12〜24時間温められていることを確認した。
[001086] インキュベーターをモニターした。インキュベーターのパラメータ:温度LEDディスプレイ:37.0±2.0℃、CO2パーセンテージ:5.0±1.5% CO2。
[001127] 10LのLabtainerバッグを準備した。BSCで、ルアー接続を介して4インチプラズマ移送セットを10LのLabtainerバッグに取り付ける。「上清」、ロット番号及び初期/日付として10LのLabtainerバッグラベルを調整した。BSCから取り出し移す前に、全てのクランプを閉じた。注記:回収するG-Rex500MCSフラスコ2本毎に1つの10LのLabtainerバッグを準備した。
[001142] インキュベーターをモニターした。インキュベーターのパラメータ温度LEDディスプレイ:37±2.0℃、CO2パーセンテージ:5%±1.5%。
[001165] LOVOをオンにして、「TIL G-Rex回収」プロトコルを開始し、画面のプロンプトに従った。バッファータイプはPlasmaLyteであった。LOVOタッチスクリーンプロンプトに従った。
[001171] ろ液容量を入力した。既存のろ液バッグのオスルアーにLOVO補助バッグを溶接接続した。全てのクランプが開いており、流路が開いていることを確認した。ろ液容器容量入力欄に触れる。テンキーが表示される。新規合計ろ液容量(5,000mL)を入力する。ボタンに触れ、入力を受諾する。注記:推定ろ過量は5000mLを超えてはならない。
[001196] 標的容積/バッグ計算。下の表DDDから、充填するCS750バッグの数、バッグ毎の目標充填量、バッグ毎に参考品として取り除く量及び上記のLOVO保持液の量に対応するバッグ毎の最終目標量を選択した。
[001223] 制御速度冷凍庫を準備した。凍結する前にCRFがセットアップされたことを確認した。CRF機器を記録した。凍結保存が実行される。
[001228] 目標:治療活性が強化された腫瘍抗原特異的T細胞について濃縮されたTIL産物を生成すること。
[001229] 悪性病変に関連するT細胞は通常、機能不全であり、腫瘍の成長を制御/防止することができない(Schietinger et al.Immunity 2016)。この実施例における全ての参考文献は、全ての目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
[001238] SQZ細胞内TFタンパク質送達技術を使用して、治療活性を強化された腫瘍抗原特異的T細胞について濃縮されたTIL産物を生成するための様々な再プログラミング戦略の能力を比較することが提案されている。
1.腫瘍の種類
・黒色腫
2.最適な送達条件
・SQZヒトT細胞最適化プロトコル+追加条件
・送達効率のモニター
3.TFの選択
・TCF−1
・NOTCH1/2 ICD
・MYB
・+/−以前のiPSCカクテルで「完全な」再プログラミング?
4.TILを標的とする活性化/拡大培養ステージ
・REP0日目
・その他?
5.再プログラミングの速度論
・7日目、11日目、14日目、18日目…
6.標的とするTILサブセット
・最初のバルク
・後で比較するために分類分けした個々のサブセット(TCM、TEM、TEFF、TEMRA)。
7.培養培地への追加因子の必要性
・IL7
・RSPO3/WNT3A
・その他?
8.読み出し
・プレ及びポストREP TIL拡大培養表現型解析(修飾された?)パネル1、2及び3
・ポストREP TILエフェクター機能評価(サイトカイン及び/又は活性化マーカー産生アッセイ)
・ポストREP TIL腫瘍応答性評価(自己腫瘍細胞共培養アッセイ)
・TCRレパートリー分析(フローサイトメトリー及び/又はRNA−seq)
・タツノオトシゴなどの生細胞代謝アッセイ
・他の考慮事項
1.タンパク質TF産生
2.腫瘍の入手
3.物流管理(細胞の出荷)
[001240] この実施例では、CryoMed Controlled Rate Freezer、Model 7454(Thermo Scientific)を使用して、実施例16で説明した短縮閉鎖手順で調製したTILの凍結保存プロセス方法について説明する。
段階1a:効率的及び特異的サイレンシングのための1つの検証済みsd−RNAfmの調達
[001244] 最初の段階では、以下の3つの遺伝子:PD−1(PDCD1とも呼ばれる)、TIM3及びCBLBを効率的且つ特異的サイレンシングのために、1つの検証済みsd−RNAfmを調達する。
段階1b:LAG3及びCISHの強力なサイレンシングのための配列の同定
[001247] sd−RNA標的(PD−1、TIM3、CBLB、LAG3及びCISHを含む)を検証するために、最大6つの凍結黒色腫/他のプレREPラインが使用される。条件は、sd−RNA濃度、解凍後のタイミング、反復/逐次送達及び培養条件を試験する。読み出しは、フロー及び/又はqPCRにより評価された遺伝子サイレンシングの割合である。TILの成長及び経時的なサイレンシングの持続性についてのRNA送達の影響は、TILの拡大培養することにより評価される。
[001249] 遺伝子サイレンシングは、3〜6の研究スケールの新鮮なTIL調製物で最適化される。条件は、sd−RNA濃度、タイミング、反復/逐次送達及び培養条件を試験する。読み出しは、フロー及び/又はqPCRにより評価されたポストREP TILにおける遺伝子サイレンシングの割合である。TIL表現型及び機能に対する遺伝子サイレンシングの影響は、フローサイトメトリーアッセイを使用して評価される。効果の特異性(例えば、潜在的なオフターゲットサイレンシングの範囲と影響)を検証するために、任意選択によるレスキュー実験及び/又は遺伝子発現分析が行われた。今後の作業のために、少なくとも2つの標的/sd−RNAペアが選択される。その後、TIL表現型が特徴付けられる。対照TIL活性と同等以上の非特異的及び特異的なTIL活性を評価し、最適な標的/sd−RNAを決定する。
標的遺伝子毎に1つのフルスケールのTIL調製を行う。発売に必要な製品に加えて、段階3で定義された新しい特徴を持つTIL産物が開発される。
sd−RNAの設計
[001250] およそ2〜20のsd−RNA配列が所定の標的に対して生成される。場合により、sd−RNA配列は、500を超えるsd−RNA配列の機能的スクリーニングに基づいて設計された選択アルゴリズム(Advirna LLCから市販される、マサチューセッツ州ウースター、米国)に基づいて選択される。回帰分析を使用して、特定のヌクレオチドの出現頻度と、sd−RNA二重鎖の任意の特定の位置における修飾及び遺伝子抑制アッセイにおけるその機能性との間の相関関係を確立する。選択された配列は、0.2μmoleスケールで、商業的に合成され(例えば、TriLink Biotechnologiesによって)、注射のための滅菌RNase、DNaseフリーの水に溶解される(CalBiochemから市販される、4.86505)。二重鎖は、95℃で5分間加熱し、室温まで徐々に冷却することでアニールできる。
[001251] 本明細書に記載されているsd−RNA標的遺伝子を含むオリゴヌクレオチドは、無血清培地で希釈し、3回、96ウェル培養プレートに分注することができる。細胞は、指示された時間にわたり、予め希釈された化合物を含むプレートに還元型FBSを含む適切な培養培地に播種することができる。ヒーラ細胞は、10,000細胞/ウェルの3%FBSを含むEMEM培地でトランスフェクトできる。初代ヒトT細胞(AllCells、カリフォルニア州)は、500IU/ml IL2(ProSpec)を含むAIM-V(Gibco)完全培地で培養できる。細胞は、トランスフェクション前の少なくとも4日間、製造元の取扱説明書に従って抗CD3/CD28ダイナビーズ(Gibco、11131)で活性化することができる。T細胞は、特に明記されていない限り、ダイナビーズを取り出さずに100,000細胞/ウェルの5%FBSでトランスフェクトできる。トランスフェクション効率を確認するために、オリンパスBX−60顕微鏡を使用して、Cy3結合sd−RNAをトランスフェクトした生細胞から蛍光画像を入手できる。核染色は、トランスフェクトした細胞に添加したHoechst 33342(Molecular Probes、H1398)を30分間使用し、画像処理することにより入手できる。
[001252] 実施例18に記載のリードは、このプロトコルを使用して識別できる。ルシフェラーゼレポータープラスミドは、PDCD1標的領域をpsiCheck2プラスミド(Promega、C8021)下流ウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼ配列に挿入することにより構築することができる。比較のために、以前に検証されたMAP4K4 sd−RNA配列をポジティブコントロールとして挿入できる。
[001254] メーカーの推奨に従い、PureLinkTM Pro96精製キット(Invitrogen、12173−011A)を使用して、トランスフェクトされた細胞から総RNAを分離することができる。1:5及び1:25のトランスフェクトされていない(NT)細胞の希釈液を標準曲線作成について調製できる。20〜40ngの精製RNAをQuanta qScript RT-qPCR ToughMix(VWR、89236672)及びTaqmanプローブ−PDCD1-FAM(Taqman、Hs01550088_m1)並びにGAPDH-VIC(Applied Biosystems、4326317E)と同じ反応で混合して、ワンステップマルチプレックスqPCR 407で遺伝子発現を分析した。サンプルは、StepOnePlus qPCR機器(Applied Biosystems)でQuantaの推奨設定を使用して増幅することができる。PDCD1の発現は、GAPDHに正規化し、標準曲線に合わせて調整し、非標的対照(NTC)トランスフェクト細胞のパーセントとして表すことができる。
[001255] 本発明による拡大培養されたTILは、様々な用量のsd−RNAオリゴヌクレオチドで72時間トランスフェクトされ得る。細胞を洗浄し、1:10に希釈したCellTiter-Blue試薬(Promega、G808A)と37℃で1時間インキュベートした。プレートを室温に戻し、蛍光を530nm ex/590nm emで記録した。同一条件で2倍細胞希釈液を4系列プレーティングし、蛍光測定値をプロットすることで、直線範囲を確認できる。
[001256] 本明細書に記載されるように、腫瘍浸潤リンパ球は、例えば、図8及び図14に概説されるように調製することができる。
[001257] 本明細書に記載されるように、TILをフラスコに播種し、第1及び/又は第2の拡大培養ステップを行うことができる。第1の拡大培養中、例えばステップb、第1の拡大培養後、例えばステップC中、第2の拡大培養前又はその間、例えばステップD前又はその間、ステップD後且つステップEにおける回収前、ステップFの回収中又はその後、ステップFの最終的な製剤化及び/又は輸注バッグへの移動前又はその間及びステップFのいずれかの任意選択による凍結保存ステップ前にsd−RNAを添加することができる。更に、sd−RNAは、ステップFの任意の凍結保存ステップから解凍した後に添加することができる。
[001258] TILサンプルは、拡大培養ステップのいずれかで回収でき、2%ヒトAB血清を補充したCellGro培地の96ウェルプレート(104 443細胞/ウェル)に3回播種できる。1時間後、1μCi/ウェルの[メチル−3444 H]チミジン(PerkinElmer、ウォルサム、マサチューセッツ州)を各ウェルに添加し、4時間インキュベートすることができる。次に、細胞を回収し、Trilux1450microBeta液体シンチレーションカウンター(Wallac)で3H−チミジンの組み込みを測定して、TILの成長を調べることができる。
[001259] 刺激されたT細胞によるIFN−γの産生は、製造元の取扱説明書に従い、ヒトIFN−γELISA開発キット(Mabtech)を使用して上清中で測定できる。TILは、本明細書で提供されるように調製され、例えば2μM sd−RNAで数日間、場合により4日間処置することができる。この期間後、上清をELISA分析のために採取して、IFN−γ産生レベルを決定することができる。
[001260] sd−RNAで処置されたTILは、癌患者を治療する方法において本明細書に記載されているように使用することができる。
[001261] 本明細書に記載のいずれかの方法に従ってTILを調製した。次のトランスフェクション法がテストされる:リポフェクチン及びリポフェクタミンリポフェクション、短径波BTX ECM 830装置又はBio-Rad Gene Pulser IIを使用したエレクトロポレーション、エッペンドルフマルチポレーターを使用した指数関数的逓減波エレクトロポレーション及びAmaxaヌクレオフェクター。全ての方法は、最初は、必要に応じて変更される可能性がある製造元の推奨に基づいている。Amaxaヌクレオフェクターのプロトコルは、最大のトランスフェクション効率を与え得る。Amaxaの手順は、3つの溶液(V、R及びT)の1つ及びエレクトロポレーションの8つのプログラムの異なる組み合わせを使用して最適化される。また、米国特許出願公開第2016/0230188号及び米国特許第8,859,229号に記載された方法を参照されたい。これら両方が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。エレクトロポレーションは、Menger et al., Cancer Res., 2016 Apr 15; 76(8):2087-93によって記載された方法に従って実行され得、Agile Pulse BTXシステム(ハーバード装置(Harvard Apparatus))を使用し、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。エレクトロポレーションされた細胞は、本明細書の他の場所に記載されたプレREP及びREP法により拡大培養され得る。米国特許第6,010,613号及び同第6,078,490号(これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる)に記載のものなど、当技術分野で公知のエレクトロポレーション法を使用し得る。パルスエレクトロポレーションの最適化は、以下のプログラム又はその変更を使用して記述されている方法を使用して実行され得る。
[001263] この実施例の実験では、TIL改善戦略の2つの異なる効果を調べる。戦略1:IL−2又は膜結合型IL−15(mb−IL15)の一過性発現。戦略2:NOTCH媒介性TILの再プログラミング。いくつかの実施形態では、NOTCH媒介性再プログラミングは、NOTCH1又はNOTCH2の細胞内ドメイン(ICD)のmRNA発現を含む。いくつかの実施形態では、NOTCH媒介性再プログラミングは、NOTCHリガンドDLL1のmRNA発現を含む。
[001269] 送達条件は、ポストREP TILで対象のたんぱく質を高発現させるために必要に応じて設計される。凍結黒色腫プレREPサンプルをスクリーニング条件に使用する。最適化実験のために提供される試薬はGFP mRNAである。条件は、いくつかのTIL活性化方法及びエレクトロポレーションプロトコルを試験する。読み出しは、フローサイトメトリーで評価された、エレクトロポレーションされていない対照に対する細胞生存率及びGFP陽性細胞の割合である。選択条件は、利用可能な組織の新鮮なTIL調製物2〜3個で確認される。いくつかの実施形態では、トランスフェクション効率(ET)は、蛍光活性化細胞選別(FACS)によるトランスフェクションの約3時間、6時間、9時間、12時間、15時間及び/又は18時間後に決定することができる。一部の実験では、GFPがもはや検出できなくなるまで、トランスフェクタントを12時間〜24時間毎に更に分析できる。一部の実施形態では、細胞生存率は、トリパンブルー染色排除により決定することができる。このプロトコルは、80%を超える生存率及び70を超えるトランスフェクション効率をもたらすと予想される。
[001273] この実施例の実験は、5つの対象となる標的:PDCD1、TIM3、CBLB、LAG3及びCISHについてsd−rxRNA構築物に関するデータを提供する。
・%サイレンシング:80%以上が予想される
・サイレンシングの持続
・TILの成長:対照の10%以内が予想される
・TIL機能:サイトカイン産生の増加が予想される。
・3〜6の研究スケールの新鮮TIL調製物
・上記と同じ読み出し
・TIL表現型
・TIL腫瘍応答性
・今後の作業のために、少なくとも2つの標的/sd−rxRNAペアが選択される。
標的遺伝子毎に1つのフルスケール調製。
[001280] TMEでは、TILは、エフェクター機能を負に調節するいくつかの阻害分子を発現する。
[001284] 阻害経路をサイレンシングすることにより、TILエフェクター機能を再確立する。
[001285] 急速拡大培養プロトコル中のsd−rxRNAを使用した1)PDCD1、2)TIM3、3)CBLB、4)LAG3及び5)CISHの一過性のノックダウン。急速拡大培養プロトコル中のsd−rxRNAを使用したPD1の一過性のノックダウンに特に焦点を当てる。
[001286] REP’ed TILにおけるsd−rxRNA媒介遺伝子サイレンシングの検証(KDの効率及び持続性、T細胞の生存率)。
[001288] REP中の標的sd−rxRNAの追加は、5つの標的の3つで遺伝子KDが成功し、80%超え(>80%)のPD1ノックダウンが含まれた。
・PD1:>80%
・TIM3:約70%
・LAG3:約70%
・CISH:約40%
・CBLB:検出不可。
・0日目:プレREPが開始された。培地にIL−2を追加。
・11日目:REPは、IL−2とPBMCを含む培地を使用して、解凍/新鮮プレREP+sd−rxRNA(即ち第2の拡大培養開始)を開始した。
・14日目:培地交換+IL−2を含むsd−rxRNA(任意選択によりOKT3及びフィーダー(PBMC));ただし、IL−2のみを使用して実行した(例えば、IL−2培地を含むsd−rxRNA)。
・17日目:培地交換+sd−rxRNA(追加でsd−rxRNAの追加)(例えば、IL−2培地を含むsd−rxRNA)。
・21日目:培地交換+sd−rxRNA(追加でsd−rxRNAの追加)(例えば、IL−2培地を含むsd−rxRNA)。
・22日目:上記のように回収されたTIL。
・細胞数をカウントし、生存率を決定した。
・決定されたKD(ノックダウン)効率(Q−PCR、フロー)
・上記のように、TILを特徴付ける表現型アッセイを実施した。
・調査された活性化マーカー(CD107a、IFNγ)(例えば、図45、阻害/疲弊マーカー及び図46、IFNγを参照されたい)。
[001294] 実施例23で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてTILを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例23に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
(i)患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(ii)IL−2及び任意選択によりOKT−3を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせること;
(iii)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL−2、OKT−3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第3のTIL集団は、第2のTIL集団よりも数において少なくとも100倍多く、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために少なくとも14日間にわたって実施され、第3のTIL集団は、治療用TIL集団である、生じさせること;及び
(iv)第2及び/又は第3のTIL集団を、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に11日目〜21日目に曝露することであって、TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び/又は治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の変化を提供する、曝露すること;及び
(v)22日目以降にステップ(iv)から得られた治療用TIL集団を回収すること;及び
(vi)任意選択により、ステップ(v)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すこと
を含み得る。
[001304] 実施例23で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてTILを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例23に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL−2及び任意選択によりOKT−3を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約3〜14日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(b)からステップ(c)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(d)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL−2、OKT−3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7〜14日間にわたって実施され、第3のTIL集団は、治療用TIL集団であり、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2及び/又は第3のTIL集団を、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に11日目〜21日目に曝露することであって、TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び/又は治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の変化を提供する、曝露すること;
(f)ステップ(d)から得られた治療用TIL集団を22日目以降に回収することであって、ステップ(d)からステップ(e)への移行は、系を開放することなく行われる、回収すること;及び
(g)ステップ(e)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(e)から(f)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと
を含み得る。
[001314] 実施例23で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてTILを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例23に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
(a)患者象から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、対象から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL−2及び任意選択によりOKT−3を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約3〜14日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(b)からステップ(c)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(d)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL−2、OKT−3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7〜14日間にわたって実施され、第3のTIL集団は、治療用TIL集団であり、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2及び/又は第3のTIL集団を、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に11日目〜21日目に曝露することであって、TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の増加した発現及び/又は治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の増加を提供する、曝露すること;
(f)ステップ(d)から得られた治療用TIL集団を回収することであって、ステップ(d)からステップ(e)への移行は、系を開放することなく行われる、回収すること;及び
(g)ステップ(e)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(e)から(f)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;
(h)任意選択により、凍結保存プロセスを使用して、ステップ(f)からの回収されたTIL集団を含む輸注バッグを凍結保存すること;及び
(i)ステップ(g)における輸注バッグから治療有効投与量の第3のTIL集団を患者に投与すること
を含む、拡大培養された腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を投与することを含む。
[001324] 実施例23で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてTILを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例23に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、対象から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL−2及び任意選択によりOKT−3を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約3〜14日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(b)からステップ(c)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(d)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL−2、OKT−3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7〜14日間にわたって実施され、第3のTIL集団は、治療用TIL集団であり、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2及び/又は第3のTIL集団を、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に11日目〜21日目に曝露することであって、TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の増加した発現及び/又は治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の増加を提供する、曝露すること;
(f)ステップ(d)から得られた治療用TIL集団を回収することであって、ステップ(e)からステップ(f)への移行は、系を開放することなく行われる、回収すること;及び
(g)ステップ(e)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(f)から(g)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(h)任意選択により、凍結保存プロセスを使用して、ステップ(f)からの回収されたTIL集団を含む輸注バッグを凍結保存すること
を含む方法によって得ることができる第3のTIL集団である。
[001334] 実施例23で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてTILを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例23に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL−2を含み、且つ任意選択により4−1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2〜5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT−3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1〜3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(f)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL−2、任意選択によりOKT−3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7〜11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(f)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(g)11〜21日目を含む、ステップ(d)、(e)及び/又は(f)のいずれかの間に第2のTIL集団を少なくとも1つのsd−RNAと接触させることであって、sd−RNAは、0.1μM sd−RNA、0.5μM sd−RNA、0.75μM sd−RNA、1μM sd−RNA、1.25μM sd−RNA、1.5μM sd−RNA、2μM sd−RNA、5μM sd−RNA又は10μM sd−RNAの濃度で添加され、sd−RNAは、PD−1、LAG−3、TIM−3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること;
(h)任意選択により、第2のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも1つのsd−RNAの移動を媒介する、実施すること;
(i)ステップ(g)又は(h)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(g)からステップ(i)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;及び
(j)ステップ(i)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(i)から(j)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと
を含む、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法が提供される。
[001344] 実施例23で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてTILを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例23に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL−2を含み、且つ任意選択により4−1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2〜5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT−3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1〜3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(f)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL−2、任意選択によりOKT−3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7〜11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(f)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(g)11〜21日目を含む、ステップ(d)、(e)及び/又は(f)のいずれかの間に第2のTIL集団を少なくとも1つのsd−RNAと接触させることであって、sd−RNAは、2μM sd−RNAの濃度で添加され、sd−RNAは、PD−1、LAG−3、TIM−3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること;
(h)任意選択により、第2のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも1つのsd−RNAの移動を媒介する、実施すること;
(i)ステップ(g)又は(h)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(g)からステップ(i)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;及び
(j)ステップ(i)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(i)から(j)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと
を含む、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法が提供される。
[001354] 実施例23で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてTILを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例23に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL−2を含み、且つ任意選択により4−1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2〜5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT−3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1〜3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(f)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL−2、任意選択によりOKT−3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7〜11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(f)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(g)11〜21日目を含む、ステップ(d)、(e)及び/又は(f)のいずれかの間に第2のTIL集団を少なくとも1つのsd−RNAと接触させることであって、sd−RNAは、0.1μM sd−RNA、0.5μM sd−RNA、0.75μM sd−RNA、1μM sd−RNA、1.25μM sd−RNA、1.5μM sd−RNA、2μM sd−RNA、5μM sd−RNA又は10μM sd−RNAの濃度で添加され、sd−RNAは、PD−1、LAG−3、TIM−3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること;
(h)任意選択により、第2のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも1つのsd−RNAの移動を媒介する、実施すること;
(i)ステップ(g)又は(h)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(g)からステップ(i)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;
(j)ステップ(i)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(i)から(j)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(k)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含む、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法が提供される。
[001364] 実施例23で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてTILを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例23に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL−2を含み、且つ任意選択により4−1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2〜5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)11〜21日目に第1のTIL集団を少なくとも1つのsd−RNAと接触させることであって、sd−RNAは、0.1μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、0.5μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、0.75μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、1μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、1.25μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、1.5μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、2μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、5μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地又は10μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地の濃度で添加され、sd−RNAは、PD−1、LAG−3、TIM−3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること;
(e)任意選択により、第1のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも1つのsd−RNAの移動を媒介する、実施すること;
(f)OKT−3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1〜3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(f)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(g)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(h)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL−2、任意選択によりOKT−3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7〜11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(h)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(i)ステップ(h)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(h)からステップ(i)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;
(j)ステップ(i)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(i)から(j)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(k)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含む、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法が提供される。
[001374] 実施例23で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてTILを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例23に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL−2を含み、且つ任意選択により4−1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2〜5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)11〜21日目に第1のTIL集団を少なくとも1つのsd−RNAと接触させることであって、sd−RNAは、0.1μM sd−RNA/10,000TIL、0.5μM sd−RNA/10,000TIL、0.75μM sd−RNA/10,000TIL、1μM sd−RNA/10,000TIL、1.25μM sd−RNA/10,000TIL、1.5μM sd−RNA/10,000TIL、2μM sd−RNA/10,000TIL、5μM sd−RNA/10,000TIL又は10μM sd−RNA/10,000TILの濃度で添加され、sd−RNAは、PD−1、LAG−3、TIM−3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること;
(e)任意選択により、第1のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも1つのsd−RNAの移動を媒介する、実施すること;
(f)OKT−3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1〜3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(f)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(g)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(h)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL−2、任意選択によりOKT−3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7〜11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(g)からステップ(h)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(i)ステップ(h)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(h)からステップ(i)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;
(j)ステップ(i)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(i)から(j)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(k)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含む、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法が提供される。
[001384] 実施例23で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてTILを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例23に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL−2を含み、且つ任意選択により4−1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2〜5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT−3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1〜3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(f)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL−2、任意選択によりOKT−3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7〜11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(f)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(g)11〜21日目を含む、ステップ(d)、(e)及び/又は(f)のいずれかの間に第2のTIL集団を少なくとも1つのsd−RNAと接触させることであって、sd−RNAは、0.1μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、0.5μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、0.75μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、1μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、1.25μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、1.5μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、2μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、5μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地又は10μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地の濃度で添加され、sd−RNAは、PD−1、LAG−3、TIM−3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること;
(h)任意選択により、第2のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも1つのsd−RNAの移動を媒介する、実施すること;
(i)ステップ(g)又は(h)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(g)からステップ(i)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;
(j)ステップ(i)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(i)から(j)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(k)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含む、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法が提供される。
[001394] 実施例23で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてTILを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例23に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL−2を含み、且つ任意選択により4−1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2〜5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT−3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1〜3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(f)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL−2、任意選択によりOKT−3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7〜11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(f)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(g)11〜21日目を含む、ステップ(d)、(e)及び/又は(f)のいずれかの間に第2のTIL集団を少なくとも1つのsd−RNAと接触させることであって、sd−RNAは、0.1μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、0.5μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、0.75μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、1μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、1.25μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、1.5μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、2μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、5μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地又は10μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地の濃度で添加され、sd−RNAは、PD−1、LAG−3、TIM−3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること;
(h)任意選択により、第2のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも1つのsd−RNAの移動を媒介する、実施すること;
(i)ステップ(g)又は(h)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(g)からステップ(i)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;
(j)ステップ(i)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(i)から(j)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(k)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含む、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法が提供される。
[001404] 実施例23で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてTILを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例23に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL−2を含み、且つ任意選択により4−1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2〜5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT−3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1〜3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(f)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL−2、任意選択によりOKT−3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7〜11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(e)からステップ(f)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(g)11〜21日目を含む、ステップ(d)、(e)及び/又は(f)のいずれかの間に第2のTIL集団を少なくとも1つのsd−RNAと接触させることであって、sd−RNAは、0.1μM sd−RNA/10,000TIL、0.5μM sd−RNA/10,000TIL、0.75μM sd−RNA/10,000TIL、1μM sd−RNA/10,000TIL、1.25μM sd−RNA/10,000TIL、1.5μM sd−RNA/10,000TIL、2μM sd−RNA/10,000TIL、5μM sd−RNA/10,000TIL又は10μM sd−RNA/10,000TILの濃度で添加され、sd−RNAは、PD−1、LAG−3、TIM−3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること;
(h)任意選択により、第2のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも1つのsd−RNAの移動を媒介する、実施すること;
(i)ステップ(g)又は(h)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(e)からステップ(h)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;
(j)ステップ(i)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(h)から(i)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(k)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含む、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法が提供される。
Claims (70)
- 腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法であって、
(i)患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(ii)IL−2及び任意選択によりOKT−3を含む細胞培養培地中で前記第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせること;
(iii)前記第2のTIL集団の前記細胞培養培地に追加のIL−2、OKT−3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせること、ここで、前記第3のTIL集団は、前記第2のTIL集団よりも数において少なくとも100倍多く、前記第2の拡大培養は、前記第3のTIL集団を得るために少なくとも14日間にわたって実施され、前記第3のTIL集団は、治療用TIL集団である;及び
(iv)前記第2及び/又は第3のTIL集団を、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に曝露すること、ここで、前記TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び/又は前記治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の変化を提供する;
を含む方法。 - (v)前記第3のTIL集団の前記細胞培養培地に追加のIL−2、追加のOKT−3及び追加のAPCを補充することにより、追加の第2の拡大培養をステップ(iv)前又は後に実施することを更に含み、前記追加の第2の拡大培養は、ステップ(iii)で得られたよりも大きい治療用TIL集団を得るために少なくとも14日間にわたって実施され、前記より大きい治療用TIL集団は、腫瘍抗原特異的T細胞の数の変化を示す、請求項1に記載の方法。
- 腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法であって、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、前記患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)前記腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL−2及び任意選択によりOKT−3を含む細胞培養培地中で前記第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせること、ここで、前記第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、前記第1の拡大培養は、前記第2のTIL集団を得るために約3〜14日間にわたって実施され、前記第2のTIL集団は、前記第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(b)からステップ(c)への移行は、前記系を開放することなく行われる;
(d)前記第2のTIL集団の前記細胞培養培地に追加のIL−2、OKT−3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせること、ここで、前記第2の拡大培養は、前記第3のTIL集団を得るために約7〜14日間にわたって実施され、前記第3のTIL集団は、治療用TIL集団であり、前記第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、前記系を開放することなく行われる;
(e)前記第2及び/又は第3のTIL集団を、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に曝露すること、ここで、前記TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び/又は前記治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の変化を提供する;
(f)ステップ(d)から得られた前記治療用TIL集団を回収すること、ここで、ステップ(d)からステップ(e)への移行は、前記系を開放することなく行われる;及び
(g)ステップ(e)からの前記回収されたTIL集団を輸注バッグに移すこと、ここで、ステップ(e)から(f)への移行は、前記系を開放することなく行われる;
を含む方法。 - 凍結保存プロセスを使用して、ステップ(f)における前記回収されたTIL集団を含む前記輸注バッグを凍結保存するステップを更に含む、請求項3に記載の方法。
- 前記凍結保存プロセスは、回収されたTIL集団と凍結保存培地との1:1の比率を使用して実施される、請求項4に記載の方法。
- 前記抗原提示細胞は、末梢血単核球(PBMC)である、請求項4に記載の方法。
- 前記PBMCは、照射され、且つ同種異系である、請求項6に記載の方法。
- 前記PBMCは、ステップ(d)において9〜14日目のいずれかに細胞培養物に添加される、請求項6に記載の方法。
- 前記抗原提示細胞は、人工抗原提示細胞である、請求項6に記載の方法。
- ステップ(e)における前記回収は、膜ベースの細胞処理系を使用して実施される、請求項3に記載の方法。
- ステップ(e)における前記回収は、LOVO細胞処理系を使用して実施される、請求項3に記載の方法。
- 前記複数の断片は、約4〜約50個の断片を含み、各断片は、約27mm3の容積を有する、請求項3に記載の方法。
- 前記複数の断片は、約1300mm3〜約1500mm3の総容積を有する約30〜約60個の断片を含む、請求項3に記載の方法。
- 前記複数の断片は、約1350mm3の総容積を有する約50個の断片を含む、請求項13に記載の方法。
- 前記複数の断片は、約1グラム〜約1.5グラムの総質量を有する約50個の断片を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞培養培地は、Gコンテナ及びXuri細胞培養バッグからなる群から選択される容器内に提供される、請求項3に記載の方法。
- ステップ(d)における前記細胞培養培地は、IL−15及び/又はIL−21を更に含む、請求項3に記載の方法。
- IL−2濃度は、約10,000IU/mL〜約5,000IU/mLである、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
- IL−15濃度は、約500IU/mL〜約100IU/mLである、請求項17に記載の方法。
- IL−21濃度は、約20IU/mL〜約0.5IU/mLである、請求項17に記載の方法。
- ステップ(f)における前記輸注バッグは、HypoThermosol含有輸注バッグである、請求項3に記載の方法。
- 前記凍結保存培地は、ジメチルスルホキシド(DMSO)を含む、請求項5に記載の方法。
- 前記凍結保存培地は、7%〜10%のDMSOを含む、請求項22に記載の方法。
- ステップ(c)における第1の期間及びステップ(e)における第2の期間は、10日、11日又は12日の期間内にそれぞれ個別に実施される、請求項3に記載の方法。
- ステップ(c)における第1の期間及びステップ(e)における第2の期間は、11日の期間内にそれぞれ個別に実施される、請求項3に記載の方法。
- ステップ(a)〜(f)は、約10日〜約22日の期間内に実施される、請求項3に記載の方法。
- ステップ(a)〜(f)は、約20日〜約22日の期間内に実施される、請求項3に記載の方法。
- ステップ(a)〜(f)は、約15日〜約20日の期間内に実施される、請求項3に記載の方法。
- ステップ(a)〜(f)は、約10日〜約20日の期間内に実施される、請求項3に記載の方法。
- ステップ(a)〜(f)は、約10日〜約15日の期間内に実施される、請求項3に記載の方法。
- ステップ(a)〜(f)は、22日以下で実施される、請求項3に記載の方法。
- ステップ(a)〜(f)は、20日以下で実施される、請求項3に記載の方法。
- ステップ(a)〜(f)は、15日以下で実施される、請求項3に記載の方法。
- ステップ(a)〜(f)は、10日以下で実施される、請求項3に記載の方法。
- ステップ(a)〜(f)及び凍結保存は、22日以下で実施される、請求項5に記載の方法。
- ステップ(e)で回収された前記治療用TIL集団は、治療有効投与量の前記TILのために十分なTILを含む、請求項3〜35のいずれか一項に記載の方法。
- 治療有効投与量のために十分なTILの数は、約2.3×1010〜約13.7×1010個である、請求項36に記載の方法。
- ステップ(b)〜(e)は、単一の容器内で実施され、ステップ(b)〜(e)を単一の容器内で実施することは、ステップ(b)〜(e)を複数の容器内で実施することと比較して、切除された腫瘍毎のTIL収率の増加をもたらす、請求項3〜37のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗原提示細胞は、前記系を開放することなく、ステップ(d)における第2の期間中に前記TILに添加される、請求項3〜38のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(d)における前記第3のTIL集団は、対象に投与されたときに少なくとも5倍以上のインターフェロンγ産生を提供する、請求項3〜39のいずれか一項に記載の方法。
- 微生物汚染のリスクは、開放系と比較して低減される、請求項3〜40のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(f)又は(g)からの前記TILは、患者に注入される、請求項3〜41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の断片は、約4個の断片を含む、請求項3〜42のいずれか一項に記載の方法。
- 癌を有する対象を処置する方法であって、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、前記対象から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)前記腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL−2及び任意選択によりOKT−3を含む細胞培養培地中で前記第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせること、ここで、前記第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、前記第1の拡大培養は、前記第2のTIL集団を得るために約3〜14日間にわたって実施され、前記第2のTIL集団は、前記第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(b)からステップ(c)への移行は、前記系を開放することなく行われる;
(d)前記第2のTIL集団の前記細胞培養培地に追加のIL−2、OKT−3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせること、ここで、前記第2の拡大培養は、前記第3のTIL集団を得るために約7〜14日間にわたって実施され、前記第3のTIL集団は、治療用TIL集団であり、前記第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、前記系を開放することなく行われる;
(e)前記第2及び/又は第3のTIL集団を、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に曝露すること、ここで、前記TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の増加した発現及び/又は前記治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の増加を提供する;
(f)ステップ(d)から得られた前記治療用TIL集団を回収すること、ここで、ステップ(d)からステップ(e)への移行は、前記系を開放することなく行われる;及び
(g)ステップ(e)からの前記回収されたTIL集団を輸注バッグに移すこと、ここで、ステップ(e)から(f)への移行は、前記系を開放することなく行われる;
(h)任意選択により、凍結保存プロセスを使用して、ステップ(f)からの前記回収されたTIL集団を含む前記輸注バッグを凍結保存すること;及び
(i)ステップ(g)における前記輸注バッグから治療有効投与量の前記第3のTIL集団を前記患者に投与すること
を含む、拡大培養された腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を投与することを含む方法。 - 癌を有する対象の処置に使用するための拡大培養TIL集団であって、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、前記対象から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)前記腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL−2及び任意選択によりOKT−3を含む細胞培養培地中で前記第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせること、ここで、前記第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、前記第1の拡大培養は、前記第2のTIL集団を得るために約3〜14日間にわたって実施され、前記第2のTIL集団は、前記第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(b)からステップ(c)への移行は、前記系を開放することなく行われる;
(d)前記第2のTIL集団の前記細胞培養培地に追加のIL−2、OKT−3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせること、ここで、前記第2の拡大培養は、前記第3のTIL集団を得るために約7〜14日間にわたって実施され、前記第3のTIL集団は、治療用TIL集団であり、前記第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、前記系を開放することなく行われる;
(e)前記第2及び/又は第3のTIL集団を、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に曝露すること、ここで、前記TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の増加した発現及び/又は前記治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の増加を提供する;
(f)ステップ(d)から得られた前記治療用TIL集団を回収すること、ここで、ステップ(e)からステップ(f)への移行は、前記系を開放することなく行われる;及び
(g)ステップ(e)からの前記回収されたTIL集団を輸注バッグに移すこと、ここで、ステップ(f)から(g)への移行は、前記系を開放することなく行われる;及び
(h)任意選択により、凍結保存プロセスを使用して、ステップ(f)からの前記回収されたTIL集団を含む前記輸注バッグを凍結保存すること
を含む方法によって得ることができる第3のTIL集団である、拡大培養TIL集団。 - 前記方法は、請求項1〜43のいずれか一項に記載の特徴の1つ以上を更に含む、請求項44又は45に記載の癌を有する対象を処置するのに使用するためのTIL集団。
- 腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法であって、治療用TIL集団を生成するために、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子にTILを曝露することを含み、前記TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の増加した発現及び/又は前記治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の増加を提供する、方法。
- タンパク質発現の前記一過性の変化は、タンパク質発現の誘導をもたらす、請求項1〜47のいずれか一項に記載の方法。
- タンパク質発現の前記一過性の変化は、タンパク質発現の低減をもたらす、請求項1〜48のいずれか一項に記載の方法。
- 1つ以上のsd−RNAは、前記一過性のタンパク質発現を低減するために利用される、請求項49に記載の方法。
- 転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子を評価する方法であって、治療用TIL集団を生成するために、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子にTILを曝露して、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養することを含み、前記TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び/又は前記治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の変化を提供する、方法。
- タンパク質発現の前記一過性の変化は、PD−1、TGFBR2、CBLB(CBL−B)、CISH、CCR(キメラ共刺激受容体)、IL−2、IL−12、IL−15、IL−21、NOTCH 1/2 ICD、TIM3、LAG3、TIGIT、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2(MCP−1)、CCL3(MIP−1α)、CCL4(MIP1−β)、CCL5(RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1及びcAMPプロテインキナーゼA(PKA)からなる群から選択される遺伝子を標的とする、請求項1〜51のいずれか一項に記載の方法。
- 腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法であって、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、前記患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)前記腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL−2を含み、且つ任意選択により4−1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2〜5日間にわたって前記第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT−3を添加して第2のTIL集団を生じさせること、ここで、前記第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、前記第1の拡大培養は、前記第2のTIL集団を得るために約1〜3日間にわたって実施され、前記第2のTIL集団は、前記第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、前記系を開放することなく行われる;
(e)前記第2のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施すること、ここで、前記無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも1つの短鎖干渉RNA又は1つのメッセンジャーRNAの移動を媒介する;
(f)前記第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(g)前記第2のTIL集団の前記細胞培養培地に追加のIL−2、任意選択によりOKT−3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせること、ここで、前記第2の拡大培養は、前記第3のTIL集団を得るために約7〜11日間にわたって実施され、前記第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(f)からステップ(g)への移行は、前記系を開放することなく行われる;
(h)ステップ(g)から得られた前記治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供すること、ここで、ステップ(g)からステップ(h)への移行は、前記系を開放することなく行われ、前記回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である;
(i)ステップ(h)からの前記回収されたTIL集団を輸注バッグに移すこと、ここで、ステップ(h)から(i)への移行は、前記系を開放することなく行われる;及び
(j)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、前記回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含み、前記無菌エレクトロポレーションステップは、PD−1、LAG−3、TIM−3、CTLA−4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するための短鎖干渉RNAの送達を含む、方法。 - 腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法であって、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、前記患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)前記腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL−2を含み、且つ任意選択により4−1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2〜5日間にわたって前記第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT−3を添加して第2のTIL集団を生じさせること、ここで、前記第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、前記第1の拡大培養は、前記第2のTIL集団を得るために約1〜3日間にわたって実施され、前記第2のTIL集団は、前記第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、前記系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)前記第2のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップ又はSQZマイクロ流体膜破壊ステップを実施すること、ここで、前記無菌エレクトロポレーションステップ又はSQZマイクロ流体膜破壊ステップは、少なくとも1つの短鎖干渉RNA又は1つのメッセンジャーRNAの移動を媒介する;
(f)前記第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(g)前記第2のTIL集団の前記細胞培養培地に追加のIL−2、任意選択によりOKT−3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせること、前記第2の拡大培養は、前記第3のTIL集団を得るために約7〜11日間にわたって実施され、前記第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(f)からステップ(g)への移行は、前記系を開放することなく行われる;
(h)ステップ(g)から得られた前記治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供すること、ここで、ステップ(g)からステップ(h)への移行は、前記系を開放することなく行われ、前記回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である;
(i)ステップ(h)からの前記回収されたTIL集団を輸注バッグに移すこと、ここで、ステップ(h)から(i)への移行は、前記系を開放することなく行われる;及び
(j)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、前記回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含み、前記エレクトロポレーションステップは、PD−1、LAG−3、TIM−3、CTLA−4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するための短鎖干渉RNAの送達を含み、更に、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1及びそれらの組み合わせからなる群から選択される接着分子は、ガンマレトロウイルス又はレンチウイルス方法により、前記第1のTIL集団、第2のTIL集団又は回収されたTIL集団に挿入される、方法。 - 腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法であって、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、前記患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)前記腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL−2を含み、且つ任意選択により4−1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2〜5日間にわたって前記第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT−3を添加して第2のTIL集団を生じさせること、ここで、前記第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、前記第1の拡大培養は、前記第2のTIL集団を得るために約1〜3日間にわたって実施され、前記第2のTIL集団は、前記第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、前記系を開放することなく行われる;
(e)前記第2のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施すること、ここで、前記無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも1つの短鎖干渉RNA又は1つのメッセンジャーRNAの移動を媒介する;
(f)前記第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(g)前記第2のTIL集団の前記細胞培養培地に追加のIL−2、任意選択によりOKT−3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせること、ここで、前記第2の拡大培養は、前記第3のTIL集団を得るために約7〜11日間にわたって実施され、前記第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(f)からステップ(g)への移行は、前記系を開放することなく行われる;
(h)ステップ(g)から得られた前記治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供すること、ここで、ステップ(g)からステップ(h)への移行は、前記系を開放することなく行われ、前記回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である;
(i)ステップ(h)からの前記回収されたTIL集団を輸注バッグに移すこと、ここで、ステップ(h)から(i)への移行は、前記系を開放することなく行われる;及び
(j)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、前記回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含み、前記無菌エレクトロポレーションステップは、PD−1、LAG−3、TIM−3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するための短鎖干渉RNAの送達を含む、方法。 - 腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法であって、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、前記患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)前記腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL−2を含み、且つ任意選択により4−1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2〜5日間にわたって前記第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)前記第1のTIL集団を少なくとも1つのsd−RNAと接触させること、ここで、前記sd−RNAは、0.1μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、0.5μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、0.75μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、1μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、1.25μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、1.5μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、2μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、5μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地又は10μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地の濃度で添加され、前記sd−RNAは、PD−1、LAG−3、TIM−3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである;
(e)任意選択により、前記第1のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施すること、ここで、前記無菌エレクトロポレーションステップは、前記少なくとも1つのsd−RNAの移動を媒介する;
(f)OKT−3を添加して第2のTIL集団を生じさせること、ここで、前記第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、前記第1の拡大培養は、前記第2のTIL集団を得るために約1〜3日間にわたって実施され、前記第2のTIL集団は、前記第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(f)への移行は、前記系を開放することなく行われる;
(g)前記第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(h)前記第2のTIL集団の前記細胞培養培地に追加のIL−2、任意選択によりOKT−3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせること、ここで、前記第2の拡大培養は、前記第3のTIL集団を得るために約7〜11日間にわたって実施され、前記第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(h)への移行は、前記系を開放することなく行われる;
(i)ステップ(h)から得られた前記治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供すること、ステップ(h)からステップ(i)への移行は、前記系を開放することなく行われ、前記回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である;
(j)ステップ(i)からの前記回収されたTIL集団を輸注バッグに移すこと、ここで、ステップ(i)から(j)への移行は、前記系を開放することなく行われる;及び
(k)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、前記回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含む方法。 - 腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法であって、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、前記患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)前記腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL−2を含み、且つ任意選択により4−1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2〜5日間にわたって前記第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)前記第1のTIL集団を少なくとも1つのsd−RNAと接触させること、ここで、前記sd−RNAは、0.1μM sd−RNA/10,000TIL、0.5μM sd−RNA/10,000TIL、0.75μM sd−RNA/10,000TIL、1μM sd−RNA/10,000TIL、1.25μM sd−RNA/10,000TIL、1.5μM sd−RNA/10,000TIL、2μM sd−RNA/10,000TIL、5μM sd−RNA/10,000TIL又は10μM sd−RNA/10,000TILの濃度で添加され、前記sd−RNAは、PD−1、LAG−3、TIM−3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである;
(e)任意選択により、前記第1のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施すること、ここで、前記無菌エレクトロポレーションステップは、前記少なくとも1つのsd−RNAの移動を媒介する;
(f)OKT−3を添加して第2のTIL集団を生じさせること、ここで、前記第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、前記第1の拡大培養は、前記第2のTIL集団を得るために約1〜3日間にわたって実施され、前記第2のTIL集団は、前記第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(f)への移行は、前記系を開放することなく行われる;
(g)前記第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(h)前記第2のTIL集団の前記細胞培養培地に追加のIL−2、任意選択によりOKT−3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせること、ここで、前記第2の拡大培養は、前記第3のTIL集団を得るために約7〜11日間にわたって実施され、前記第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(g)からステップ(h)への移行は、前記系を開放することなく行われる;
(i)ステップ(h)から得られた前記治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供すること、ステップ(h)からステップ(i)への移行は、前記系を開放することなく行われ、前記回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である;
(j)ステップ(i)からの前記回収されたTIL集団を輸注バッグに移すこと、ここで、ステップ(i)から(j)への移行は、前記系を開放することなく行われる;及び
(k)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、前記回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含む方法。 - 腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法であって、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、前記患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)前記腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL−2を含み、且つ任意選択により4−1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2〜5日間にわたって前記第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT−3を添加して第2のTIL集団を生じさせること、ここで、前記第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、前記第1の拡大培養は、前記第2のTIL集団を得るために約1〜3日間にわたって実施され、前記第2のTIL集団は、前記第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、前記系を開放することなく行われる;
(e)前記第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(f)前記第2のTIL集団の前記細胞培養培地に追加のIL−2、任意選択によりOKT−3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせること、ここで、前記第2の拡大培養は、前記第3のTIL集団を得るために約7〜11日間にわたって実施され、前記第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(f)への移行は、前記系を開放することなく行われる;
(g)ステップ(d)、(e)及び/又は(f)のいずれかの間に前記第2のTIL集団を少なくとも1つのsd−RNAと接触させること、ここで、前記sd−RNAは、0.1μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、0.5μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、0.75μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、1μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、1.25μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、1.5μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、2μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地、5μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地又は10μM sd−RNA/10,000TIL/100μL培地の濃度で添加され、前記sd−RNAは、PD−1、LAG−3、TIM−3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである;
(h)任意選択により、前記第2のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施すること、ここで、前記無菌エレクトロポレーションステップは、前記少なくとも1つのsd−RNAの移動を媒介する;
(i)ステップ(g)又は(h)から得られた前記治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供すること、ここで、ステップ(g)からステップ(i)への移行は、前記系を開放することなく行われ、前記回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である;
(j)ステップ(i)からの前記回収されたTIL集団を輸注バッグに移すこと、ここで、ステップ(i)から(j)への移行は、前記系を開放することなく行われる;及び
(k)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、前記回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含む方法。 - 腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法であって、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、前記患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)前記腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL−2を含み、且つ任意選択により4−1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2〜5日間にわたって前記第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT−3を添加して第2のTIL集団を生じさせること、ここで、前記第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、前記第1の拡大培養は、前記第2のTIL集団を得るために約1〜3日間にわたって実施され、前記第2のTIL集団は、前記第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、前記系を開放することなく行われる;
(e)前記第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(f)前記第2のTIL集団の前記細胞培養培地に追加のIL−2、任意選択によりOKT−3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせること、ここで、前記第2の拡大培養は、前記第3のTIL集団を得るために約7〜11日間にわたって実施され、前記第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(e)からステップ(f)への移行は、前記系を開放することなく行われる;
(g)ステップ(d)、(e)及び/又は(f)のいずれかの間に前記第2のTIL集団を少なくとも1つのsd−RNAと接触させること、ここで、前記sd−RNAは、0.1μM sd−RNA/10,000TIL、0.5μM sd−RNA/10,000TIL、0.75μM sd−RNA/10,000TIL、1μM sd−RNA/10,000TIL、1.25μM sd−RNA/10,000TIL、1.5μM sd−RNA/10,000TIL、2μM sd−RNA/10,000TIL、5μM sd−RNA/10,000TIL又は10μM sd−RNA/10,000TILの濃度で添加され、前記sd−RNAは、PD−1、LAG−3、TIM−3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである;
(h)任意選択により、前記第2のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施すること、ここで、前記無菌エレクトロポレーションステップは、前記少なくとも1つのsd−RNAの移動を媒介する;
(i)ステップ(g)又は(h)から得られた前記治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供すること、ここで、ステップ(e)からステップ(h)への移行は、前記系を開放することなく行われ、前記回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である;
(j)ステップ(i)からの前記回収されたTIL集団を輸注バッグに移すこと、ここで、ステップ(h)から(i)への移行は、前記系を開放することなく行われる;及び
(k)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、前記回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含む方法。 - 前記sd−RNAは、第1の拡大培養期間中、1日2回、1日1回、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎、6日毎又は7日毎に前記第1の細胞集団に添加される、請求項56〜59のいずれか一項に記載の方法。
- 前記sd−RNAは、第1の拡大培養期間中、1日2回、1日1回、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎、6日毎又は7日毎に前記第2の細胞集団に添加される、請求項56〜59のいずれか一項に記載の方法。
- 2つのsd−RNAは、PD−1、LAG−3、TIM−3、CISH及びCBLBからなる群から選択される2つの分子の発現を阻害するために添加される、請求項56〜61のいずれか一項に記載の方法。
- 2つのsd−RNAは、2つの分子の発現を阻害するために添加され、前記2つの分子は、
i.PD−1及びLAG−3、
ii.PD−1及びTIM−3、
iii.PD−1及びCISH、
iv.PD−1及びCBLB、
v.LAG−3及びTIM−3、
vi.LAG−3及びCISH、
vii.LAG−3及びCBLB、
viii.TIM−3及びCISH、
ix.TIM−3及びCBLB、及び
x.CISH及びCBLB
からなる群から選択される、請求項56〜61のいずれか一項に記載の方法。 - 3つ以上のsd−RNAは、PD−1、LAG−3、TIM−3、CISH及びCBLBからなる群から選択される3つ以上の分子の発現を阻害するために添加される、請求項56〜62のいずれか一項に記載の方法。
- PD−1、LAG−3、TIM−3、CISH及びCBLBからなる群から選択される少なくとも1つの分子の発現は、前記少なくとも1つのsd−RNAと接触された前記TILにおいて少なくとも80%、85%、90%又は95%だけ低減される、請求項56〜64のいずれか一項に記載の方法。
- PD−1、LAG−3、TIM−3、CISH及びCBLBからなる群から選択される少なくとも1つの分子の発現は、前記少なくとも1つのsd−RNAと接触された前記TILにおいて少なくとも12時間、少なくとも24時間又は少なくとも48時間にわたって少なくとも80%、85%、90%又は95%だけ低減される、請求項56〜64のいずれか一項に記載の方法。
- 前記sd−RNAは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって得られ、且つ前記sd−RNAのインビトロ転写に適した線状二本鎖DNAテンプレートであって、前記二本鎖DNAのコード鎖上のRNAポリメラーゼプロモーター、3,000ヌクレオチド長未満であり、且つ真核細胞へのトランスフェクション後にmRNAを検出可能なポリペプチドに翻訳するのに有効な5’非翻訳領域、前記ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームであって、前記ポリペプチドは、トランスフェクトされる前記細胞に対して異種であり、前記ポリペプチドは、免疫細胞のリガンド又は受容体、免疫系の機能を刺激又は阻害するポリペプチド及び発癌性ポリペプチドの機能を阻害するポリペプチドからなる群から選択される、オープンリーディングフレーム、真核細胞へのトランスフェクション後にmRNAを検出可能なポリペプチドに翻訳するのに有効な3’非翻訳領域及び前記二本鎖DNAの前記コード鎖上の50〜5,000ヌクレオチドのポリ(A)ストレッチを5’から3’に含む線状二本鎖DNAテンプレートからのインビトロ転写を実施することを含む方法によって調製され、前記プロモーターは、前記オープンリーディングフレームに対して異種であり、前記DNAテンプレートは、DNAベクター内に含有されず、且つ前記ポリ(A)ストレッチの3’末端で終了する、請求項56〜64のいずれか一項に記載の方法。
- 前記RNAポリメラーゼプロモーターは、T7、T3又はSP6 RNAポリメラーゼからなる群から選択されるRNAポリメラーゼのためのコンセンサス結合配列を含む、請求項67に記載の方法。
- 前記オープンリーディングフレームは、PD−1、LAG−3、TIM−3、CISH及びCBLBからなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項67に記載の方法。
- 前記線状二本鎖DNAテンプレートは、内部リボソーム侵入部位を更に含む、請求項67に記載の方法。
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