JP2022546486A - 細胞凍結保存培地 - Google Patents

Abstract

【課題】 細胞のより強固な増殖及び細胞特性の保持を可能にする、凍結保存培地を含む細胞培地を提供する。【解決手段】 本明細書で提供されるのは、既製の細胞である養子細胞療法のための細胞を含む、あらゆる種類の細胞のための凍結保存組成物および方法である。凍結保存用の細胞は、キメラ抗原受容体を発現するＮＫ細胞を増殖させている可能性がある。特定の場合において、凍結保存培地は、ＤＭＳＯ、グリセロールまたはヒドロキシエチルデンプンなどの凍結防止剤；血清または血小板溶解物などの非血清代替物；天然、修飾、合成、または組換えのいずれかである１つまたは複数のサイトカインを含む。【選択図】図１

Description

本出願は、２０１９年８月２９日に出願された米国仮特許出願シリアル番号６２／８９３，５９７、及び２０２０年４月２２日に出願された米国仮特許出願シリアル番号６３／０１３，８２３に対する優先権を主張し、その両方が参照によりその全体において本明細書に組み込まれる。

本開示は、一般に、細胞生物学、分子生物学、生化学、免疫学、及び医学の分野に関するものである。

インビトロ研究またはヒトまたは動物への投与のためのエクスビボ培養のための細胞、例えば哺乳類細胞の培養は、ヒトの疾患の研究および治療のための重要なツールである。細胞培養は、ウイルスワクチン、モノクローナル抗体、ポリペプチド成長因子、ホルモン、酵素、腫瘍特異的抗原など、様々な生物学的活性産物の生産に広く用いられている。しかしながら、細胞を培養するために使用される培地または方法の多くは、細胞の増殖および／または培養中の細胞の維持に悪影響を及ぼす可能性のある成分を含んでいる。

さらに、現在、将来の医療利用のために細胞、例えばヒト胎盤幹細胞や臍帯幹細胞を保存する細胞バンクがいくつか存在する。また、例えばバイオリアクターで培養された細胞を、科学的な目的だけでなく医学的な治療のために保存する細胞バンクも存在する。すべての細胞バンクに共通するのは、細胞が通常液体窒素中で凍結保存されることである。本開示は、改良された凍結保存培地に対する当技術分野の必要性を満たすものである。

本開示は、開示された培地及び方法の非存在下で凍結保存された細胞と比較して、細胞のより強固な増殖及び細胞特性の保持を可能にする、凍結保存培地を含む細胞培地に関するものである。特定の実施形態において、細胞凍結保存培地は、「既製品」を使用することになる細胞の生存率を向上させることを可能にする。開示された培地中での凍結保存の後、解凍時の細胞は、直ちに使用されてもよいし、例えば、トランスフェクションを含む組換え技術に供するなど、さらに操作されてもよい。場合によっては、開示された培地中であるか否かにかかわらず、細胞は２回目以降の凍結保存を行い、２回目以降の凍結保存の前に、細胞は、例えばトランスフェクションを含む組換え技術に供するなど、さらに操作されてもよいし、操作されなくてもよい。

本開示の実施形態は、少なくとも１つの凍結保護剤、血清（ヒト血清又は動物血清）又は血清の非血清代替物（ヒト血清又は動物血清ではない）、並びに少なくとも１つのサイトカイン及び／又は少なくとも１つの成長因子を含む凍結保存培地組成物を提供する。いくつかの態様において、凍結保護剤は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセリン、グリセロール、ヒドロキシエトールスターチ、またはそれらの組合せである。非血清代替物は、少なくとも血小板溶解物及び／又は血液製剤溶解物（例えば、ヒト血清アルブミン）を含む、任意の種類のものであってよい。１つ以上（２つ以上を含む）のサイトカインが利用される組成物の実施形態では、サイトカインは、天然タンパク質または組換えタンパク質もしくは合成タンパク質であってよい。サイトカインの少なくとも１つは、食品医薬品局（ＦＤＡ）認可のサイトカインであってよい。サイトカイン及び成長因子の例としては、少なくともＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、インターフェロン、腫瘍壊死因子、幹細胞因子、ＦＬＴ３リガンド、ＡＰＲＩＬ、トロンボポエチン、エリスロポエチン又はそれらの組合せが挙げられる。血清の実施形態については、血清は、ヒト血清（ヒトＡＢ血清を含む）またはウシ血清などの動物由来の血清であってもよい。ＤＭＳＯおよび他の凍結保護剤は、利用される場合、組成物の４～１０％、４～６％、４～８％、５～１０％、５～８％、６～１０％、６～８％、８～１０％などを構成していてもよい。血清が採用される実施形態については、血清は、５－９９％、５－９５％、５－９０％、５－８５％、５－８０％、５－７５％、５－７０％、５－６５％、５－６０％、５－５５％、５－５０％、５－４５％、５－４０％、５－３５％、５－３０％、５－２５％、５－２０％から構成されてもよい。５－１５％， ５－１０％， １０－９９％， １０－９５％， １０－９０％， １０－８５％， １０－８０％， １０－７５％， １０－７０％， １０－６５％， １０－６０％， １０－５５％， １０－５０％， １０－４５％， １０－４０％， １０－３５％， １０－３０％， １０－２５％， １０－２０％， １０－１５％， ２０－９９％， ２０－９５％， ２０－９０％． ２０－８５％， ２０－８０％， ２０－７５％， ２０－７０％， ２０－６５％， ２０－６０％， ２０－５５％， ２０－５０％， ２０－４５％， ２０－４０％， ２０－３５％， ２０－３０％， ２０－２５％， ３０－９９％， ３０－９５％， ３０－９０％， ３０－８５％， ３０－８０％， ３０－７５％， ３０－７０％， ３０－６５％， ３０－６０％， ３０－５５％， ３０－５０％， ３０－４５％， ３０－４０％， ３０－３５％， ４０－９９％， ４０－９５％， ４０－９０％， ４０－８５％， ４０－８０％， ４０－７５％， ４０－７０％， ４０－６５％， ４０－６０％， ４０－５５％， ４０－５０％， ４０－４５％， ５０－９９％， ５０－９５％， ５０－９０％， ５０－８５％， ５０－８０％， ５０－７５％， ５０－７０％， ５０－６５％， ５０－６０％， ５０－５５％， ６０－９９％， ６０－９５％， ６０－９０％， ６０－８５％， ６０－８０％， ６０－７５％、６０－７０％、６０－６５％、７０－９９％、７０－９５％、７０－９０％、７０－８５％、７０－８０％、７０－７５％、８０－９９％、８０－９５％、８０－９０％、８０－８５％、９０－９９％、９０－９５％または９５－９９％である。組成物は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の血清からなることができる。特定の実施形態では、組成物は、組成物中の任意の濃度であってよい血小板溶解物を含むが、特定の実施形態では、血小板溶解物は、５－９９％、５－９５％、５－９０％、５－８５％、５－８０％、５－７５％、５－７０％、５－６５％、５－６０％から構成される。５－５５％， ５－５０％， ５－４５％， ５－４０％， ５－３５％， ５－３０％， ５－２５％， ５－２０％， ５－１５％， ５－１０％， １０－９９％， １０－９５％， １０－９０％， １０－８５％， １０－８０％， １０－７５％， １０－７０％， １０－６５％， １０－６０％， １０－５５％， １０－５０％， １０－４５％， １０－４０％， １０－３５％， １０－３０％， １０－２５％， １０－２０％， １０－１５％， ２０－９９％， ２０－９５％， ２０－９０％． ２０－８５％， ２０－８０％， ２０－７５％， ２０－７０％， ２０－６５％， ２０－６０％， ２０－５５％， ２０－５０％， ２０－４５％， ２０－４０％， ２０－３５％， ２０－３０％， ２０－２５％， ３０－９９％， ３０－９５％， ３０－９０％， ３０－８５％， ３０－８０％， ３０－７５％， ３０－７０％， ３０－６５％， ３０－６０％， ３０－５５％， ３０－５０％， ３０－４５％， ３０－４０％， ３０－３５％， ４０－９９％， ４０－９５％， ４０－９０％， ４０－８５％， ４０－８０％， ４０－７５％， ４０－７０％， ４０－６５％， ４０－６０％， ４０－５５％， ４０－５０％， ４０－４５％， ５０－９９％， ５０－９５％， ５０－９０％， ５０－８５％， ５０－８０％， ５０－７５％， ５０－７０％， ５０－６５％， ５０－６０％， ５０－５５％， ６０－９９％， ６０－９５％， ６０－９０％， ６０－８５％， ６０－８０％， ６０－７５％、６０－７０％、６０－６５％、７０－９９％、７０－９５％、７０－９０％、７０－８５％、７０－８０％、７０－７５％、８０－９９％、８０－９５％、８０－９０％、８０－８５％、９０－９９％、９０－９５％または９５－９９％である。組成物は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の血小板溶解物を少なくとも含んでいてもよいし、それ以下であってもよい。

組成物は、サイトカイン及び／又は成長因子を含む成分のある濃度を有していてもよい。特定の態様において、例えばＩＬ－２、ＩＬ－２１、及び／又はＩＬ－１５を含む任意のサイトカインが、特定の濃度で組成物中に存在する。ＩＬ－２は、例えば、１～５０００、１～１０００、１～５００、１～１００、１００～５０００、５００～５０００、５００～１０００、または１０００～５０００Ｕ／ｍＬの濃度で存在してもよい。具体的な態様では、ＩＬ－２は、組成物中に少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００Ｕ／ｍＬの濃度で存在する。特定の実施形態では、ＩＬ－２１は、１０－３０００、１０－２０００、１０－１０００、１０－５００、１０－１００、１００－３０００、１００－２０００、１００－１０００、５００－３０００、５００－２０００、５００－１０００、１０００－３０００、１０００－２０００、又は２０００－３０００ｎｇ／ｍＬの濃度で組成物中に存在する。ＩＬ－２１は、少なくとも、または１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、または３０００ｎｇ／ｍＬの組成物の濃度であってよい。ＩＬ－１５は、１～２０００、１～１０００、１～５００、１～１００、１００～２０００、１００～１０００、１００～５００、５００～２０００、５００～１０００、または１０００～２０００ｎｇ／ｍＬの濃度で組成物中に存在してもよい。ＩＬ－１５は、１０、５０、１００、５００、１０００、１５００、又は２０００ｎｇ／ｍＬの少なくとも又はそれ以下の濃度で組成物中に存在してもよい。

少なくとも１つの凍結保護物質、血清、または非血清の血清代替物、ならびに少なくとも１つのサイトカインおよび／または少なくとも１つの成長因子を含む本明細書中に包含されるような組成物は、複数の免疫細胞および／または幹細胞（各々が任意の種類である）をさらに含み得る。具体的な実施形態において、それらの細胞は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、成熟した骨髄もしくは末梢血細胞に由来するＮＫＴ細胞、腫瘍細胞株（例えば、ＮＫ９２または他のＮＫ株）などの細胞株、造血幹細胞、人工多能性幹細胞、ＭＳＣ（文献では「間葉系幹細胞」および「間葉系間質細胞」という別称の細胞集団）、または骨髄、末梢血、皮膚、脂肪組織もしくはそれらの組み合わせに由来し得るそれらの混合物である。ＮＫ細胞を使用する実施形態では、そのＮＫ細胞は、拡大されたＮＫ細胞であってもよいし、そうでなくてもよい。本開示の実施形態は、本開示の任意の組成物および好適な薬学的に許容され得るキャリアを含む薬学的組成物も包含する。

本開示の実施形態は、本開示の任意の組成物を作製する方法を含み、その方法は、細胞を有効量の凍結保存培地組成物に曝す工程を含む。その細胞は、免疫細胞および／または幹細胞であり得る。細胞の例としては、成熟末梢血、骨髄および／もしくは臍帯血細胞、腫瘍細胞株（例えば、ＮＫ９２または他のＮＫ株）などの細胞株、幹細胞、人工多能性幹細胞、または臍帯血、骨髄、末梢血、脂肪組織および／もしくは皮膚由来のＭＳＣに由来する、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞が挙げられる。その細胞は、拡大されたＮＫ細胞、または本明細書中に包含される細胞型のいずれかの拡大された画分であり得る。

本開示の実施形態は、本明細書中に包含される任意の方法に従って作製された細胞集団を含む。その集団は、好適な薬学的に許容され得るキャリア中に含められていてもよいし、そうでなくてもよい。その細胞は、任意の種類の免疫細胞および／または幹細胞であり得る。その細胞は、成熟細胞、腫瘍細胞株（例えば、ＮＫ９２または他のＮＫ株）などの細胞株、幹細胞または人工多能性幹細胞に由来する、ＮＫ細胞（拡大されているか否かを問わない）、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞であり得る。本明細書中に包含されるいずれの細胞も、拡大されていてもよいし、されていなくてもよい。本開示の実施形態は、被験体の免疫関連障害を処置する方法を含み、その方法は、有効量の本明細書中に包含される任意の解凍集団を投与する工程を含む。免疫関連障害の例としては、癌、自己免疫障害、移植片対宿主病、同種移植片拒絶、または細菌感染症、ウイルス感染症もしくは真菌感染症を含む炎症状態が挙げられる。その集団は、成熟細胞、幹細胞、人工多能性幹細胞またはＭＳＣに由来する、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞である細胞を含み得る。さらに、非免疫起源の癌細胞が、成熟細胞、幹細胞、人工多能性幹細胞および／またはＭＳＣに由来する、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞である細胞の集団で処置され得る。

本開示の実施形態は、凍結保存に敏感な細胞を保存する方法を含み、その方法は、凍結保存に敏感な細胞を有効量の本開示の凍結保存培地組成物に曝す工程を含む。その細胞は、例えば、成熟細胞、腫瘍細胞株（例えば、ＮＫ９２または他のＮＫ株）などの細胞株、幹細胞、人工多能性幹細胞またはＭＳＣに由来する、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞であり得る。その方法は、凍結保存培地組成物に曝される細胞を入手または提供する工程をさらに含んでもよいし、含まなくてもよい。その細胞の凍結保存および解凍の後、有効量の細胞が、それを必要とする被験体（例えば、癌、自己免疫障害、移植片対宿主病、同種移植片拒絶、または細菌感染症、ウイルス感染症もしくは真菌感染症を含む炎症状態を有する被験体）に送達され得る。その細胞は、被験体に対して同種異系または自己の細胞であり得る。さらに、凍結保存され、解凍された有効量の細胞（例えば、再生医療用のＭＳＣおよび／または人工多能性幹細胞を含む）が、器官（少なくとも心臓、肺、脳および／または腎臓を含む）に損傷を有する個体に投与され得る。

本開示の実施形態は、細胞集団の生存率をその集団の凍結保存の後に少なくとも５０％パーセント超で維持する方法を含み、その方法は、有効量の本明細書中に包含される凍結保存培地組成物にその集団を曝す工程、およびその集団を解凍する工程を含み、その集団の生存率は、解凍したとき、少なくとも５０％超である。いくつかの場合では、細胞集団の生存率は、その集団の凍結保存後、細胞を解凍したとき、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％超である。その細胞は、成熟細胞、腫瘍細胞株（例えば、ＮＫ９２または他のＮＫ株）などの細胞株、幹細胞、人工多能性幹細胞またはＭＳＣに由来する、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞を含む、免疫細胞および／または幹細胞であり得る。

細胞（例えば、免疫細胞および／または幹細胞）の集団を凍結保存した際に、その集団の有効期間を延長する方法が、本明細書中で企図され、その方法は、例えば、その集団を有効量の本開示の凍結保存培地組成物に曝す工程を含む。有効期間は、本開示の凍結保存培地組成物を使用しない場合の凍結保存細胞の有効期間と比べて、およそ１～４、１～２、１～３、２～４、２～３もしくは３～４週間、１～１２、２～１２、３～１２、４～１２、５～１２、６～１２、７～１２、８～１２、９～１２、１０～１２もしくは１１～１２ヶ月、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０年もしくはそれ以上、延長され得る。その細胞は、成熟細胞、腫瘍細胞株（例えば、ＮＫ９２または他のＮＫ株）などの細胞株、幹細胞、人工多能性幹細胞またはＭＳＣに由来する、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞であってもよいし、そうでなくてもよい。いくつかの方法が、その細胞を入手する工程をさらに含む。細胞の凍結保存および解凍の後、有効量の細胞が、それを必要とする被験体に送達され得る。その細胞は、被験体に対して同種異系の細胞であってもよいし、自己の細胞であってもよく、被験体は、癌、自己免疫障害、移植片対宿主病、同種移植片拒絶、または細菌感染症、ウイルス感染症もしくは真菌感染症を含む炎症状態を有し得る。被験体は、再生修復を必要とする、生命の維持に不可欠な重要な器官の損傷を有する場合もある。

本開示の実施形態は、本明細書中に包含される凍結保存培地組成物を用いて凍結保存されていた集団細胞を解凍する方法を含み、その方法は、その細胞集団を有効量の凍結保存培地組成物に曝露して、凍結保存集団を作製する工程；および凍結保存集団を好適な解凍条件に曝露する工程を含む。解凍条件は、当該分野において標準的な条件であり得る。例えば、凍結細胞を３７℃のウォーターバス内で急速に（＜１分で）解凍してもよいし、この後、必要に応じて、加温しておいた成長培地を用いて、解凍した細胞をゆっくり希釈してもよい。具体的な場合では、回収率を最適化するために、解凍した細胞を高密度でプレーティングする。

本開示のある特定の実施形態は、個体の標的部位または標的組織に細胞を送達する方法に関し、その方法は、細胞の解凍後、実質的に直ちにおよび／または実質的にすぐに、その細胞を静脈内に、局所に、髄腔内に、腹腔内に、皮下に有効量の細胞をその標的部位または標的組織に注入または投与する工程を含み、ここで、その細胞は、本開示の凍結保存培地組成物中で凍結保存されていた細胞である。具体的な実施形態において、標的部位または標的組織は、固形腫瘍であるなど、癌性である。

本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるだろう。しかしながら、この詳細な説明から当業者には本発明の趣旨および範囲内での様々な変更および改変が明らかになるので、その詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、単に例証として与えられることを理解するべきである。

以下の図面は、本明細書の一部を成し、本開示のある特定の態様をさらに実証するために含められる。本開示の主題は、本明細書中に提示される具体的な実施形態の詳細な説明と併せてこれらの図面の１つ以上を参照することによって、より理解される可能性がある。

図１は、異なるサイトカインの組み合わせを含む９つの異なる凍結培地配合物中で凍結保存されたＣＢ－ＮＫの生存率を示している（ｎ＝４）。

図２は、適正製造基準（ｇｏｏｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｒａｃｔｉｃｅ）（ＧＭＰ）凍結培地中で凍結保存されたＮＫ細胞が、新鮮なＮＫ細胞と比べて劣る細胞傷害性を解凍後にＫ５６２標的に対して発揮することを示している（ｎ＝３）。

図３は、ＧＭＰ凍結培地およびサイトカイン中で凍結保存されたＮＫ細胞が、新鮮なＮＫ細胞と類似の細胞傷害性を解凍後にＫ５６２標的に対して発揮することを示している（ｎ＝３）。

図４は、ＧＭＰ凍結培地中で凍結保存されたキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）発現ＮＫ細胞が、新鮮なＣＡＲ ＮＫ細胞と比べて劣る細胞傷害性を解凍後にＲａｊｉ標的に対して発揮することを示している（ｎ＝３）。

図５は、ＧＭＰ凍結培地およびサイトカイン中で凍結保存されたＣＡＲ発現ＮＫ細胞が、新鮮なＣＡＲ ＮＫ細胞と類似の細胞傷害性を解凍後にＲａｊｉ標的に対して発揮することを示している（ｎ＝３）。

図６は、ＧＭＰ凍結培地およびサイトカイン中で凍結保存されたＣＡＲ発現ＮＫ細胞が、新鮮なＣＡＲ ＮＫ細胞と類似の細胞傷害性を解凍後にＲａｊｉ標的に対して発揮し、標準的な凍結培地中で凍結されたＣＡＲ ＮＫ細胞より優れていることを提供している（ｎ＝３）。

図７は、新規の凍結培地＋サイトカイン中で凍結され、解凍の直後にＲａｊｉ移植マウスに注入されたＣＡＲ発現ＮＫ細胞が疾患制御を示すことを示している。

図８は、新規の凍結培地＋サイトカイン中で凍結され、解凍の直後にＲａｊｉ移植マウスに注入されたＣＡＲ発現ＮＫ細胞が、新鮮なＣＡＲ発現ＮＫ細胞と類似の疾患制御を示すこと、およびそれらが、ＧＭＰ標準凍結培地中で凍結されたＣＡＲ発現ＮＫ細胞よりも優れていることを示している。

図９は、種々の凍結培地条件を用いてＣＡＲ ＮＫ細胞を凍結保存するための研究デザインの例を提供している。

図１０は、（１）ＲＰＭＩ 対 ＰｌａｓｍａＬｙｔｅの比較；（２）異なる細胞外凍結保護物質（デキストランおよびヒトアルブミン）の比較；（３）サイトカイン（ＩＬ－２／ＩＬ－１５）の比較；および（４）異なる細胞内凍結保護物質の濃度（ＤＭＳＯ ５％ 対 ７．５％）の比較など、変数を有する種々の凍結条件を示している。

図１１は、種々の異なる培地中で凍結されたＣＡＲ－ＮＫ細胞の解凍後の生存率および回収率を提供しており、異なる濃度のＰｌａｓｍａＬｙｔｅ、細胞外凍結保護物質（ＣＰＡ）（デキストランおよびヒトアルブミン）；細胞内ＣＰＡ（ＤＭＳＯ ５％ 対 ７．５％）＋／－サイトカイン（ＩＬ－２／ＩＬ－１５）が比較されている。生存率および回収率の測定は、解凍の直後または解凍の４時間後に行った。

図１２は、解凍の直後または解凍の４時間後における、異なる濃度のＰｌａｓｍａＬｙｔｅ、細胞外ＣＰＡ（デキストランおよびヒトアルブミン）；細胞内ＣＰＡ（ＤＭＳＯ ５％ 対 ７．５％）＋／－サイトカイン（ＩＬ－２／ＩＬ－１５）を含む培地中で凍結保存されたＮＫ細胞上のＣＡＲの発現を示している。

図１３は、解凍の直後または解凍の４時間後における、異なる濃度のＰｌａｓｍａＬｙｔｅ、細胞外ＣＰＡ（デキストランおよびヒトアルブミン）；細胞内ＣＰＡ（ＤＭＳＯ ５％ 対 ７．５％）＋／－サイトカイン（ＩＬ－２／ＩＬ－１５）を含む培地中で凍結保存されたＮＫ細胞上のＣＤ１６の発現を示している。

図１４は、解凍の直後または解凍の４時間後における、異なる濃度のＰｌａｓｍａＬｙｔｅ、細胞外ＣＰＡ（デキストランおよびヒトアルブミン）；細胞内ＣＰＡ（ＤＭＳＯ ５％ 対 ７．５％）＋／－サイトカイン（ＩＬ－２／ＩＬ－１５）を含む培地中で凍結保存されたＮＫ細胞上のＣＤ５６の発現を示している。

図１５は、解凍の直後における、異なる濃度のＰｌａｓｍａＬｙｔｅ、細胞外ＣＰＡ（デキストランおよびヒトアルブミン）；細胞内ＣＰＡ（ＤＭＳＯ ５％ 対 ７．５％）＋／－サイトカイン（ＩＬ－２／ＩＬ－１５）を含む凍結培地中で凍結されたＣＡＲ ＮＫ細胞のＲａｊｉおよびＫ５６２標的に対する細胞傷害性を示している。

図１６は、解凍の４時間後における、異なる濃度のＰｌａｓｍａＬｙｔｅ、細胞外ＣＰＡ（デキストランおよびヒトアルブミン）；細胞内ＣＰＡ（ＤＭＳＯ ５％ 対 ７．５％）＋／－サイトカイン（ＩＬ－２／ＩＬ－１５）を含む凍結培地中で凍結されたＣＡＲ ＮＫ細胞のＲａｊｉおよびＫ５６２標的に対する細胞傷害性を示している。

図１７は、異なる濃度のＰｌａｓｍａＬｙｔｅ、細胞外ＣＰＡ（デキストランおよびヒトアルブミン）；細胞内ＣＰＡ（ＤＭＳＯ ５％ 対 ７．５％）＋／－サイトカイン（ＩＬ－２／ＩＬ－１５）を含む培地中で凍結されたＣＡＲ ＮＫ細胞によるＫ５６２およびＲａｊｉ標的の殺滅動態を示しているＩｎｃｕＣｙｔｅライブイメージング細胞傷害性アッセイを提供している。

図１８は、様々な配合物を用いて凍結され、解凍され、Ｒａｊｉ細胞と共培養されたＣＡＲ ＮＫ細胞の解凍後のアポトーシス動態を示しているＩｎｃｕＣｙｔｅライブイメージングを提供している。

図１９は、解凍の４時間後における、異なる濃度のＰｌａｓｍａＬｙｔｅ、細胞外ＣＰＡ（デキストランおよびヒトアルブミン）；細胞内ＣＰＡ（ＤＭＳＯ ５％ 対 ７．５％）＋／－サイトカイン（ＩＬ－２／ＩＬ－１５）を含む凍結培地中で凍結されたＣＡＲ ＮＫ細胞のアポトーシス（アネキシンＶ染色）を示している。

図２０は、ＧＭＰグレードのＣＡＲ ＮＫ細胞の凍結培地への血小板溶解産物（ＰＬＴ Ｌｙｓ）、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅおよびＡＢ血清＋異なるサイトカインの組み合わせ（ＩＬ－２／ＩＬ－１５ 対 ＩＬ－２／ＩＬ－２１）の添加に関する試験を、インビトロで１５ 対 ２２日間拡大した後に同じ条件を用いて凍結されたＣＡＲ ＮＫ細胞の比較を含めて説明している。

図２１は、ＧＭＰグレードのＣＡＲ ＮＫ細胞の凍結培地へのＰＬＴ Ｌｙｓ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅおよびＡＢ血清＋異なるサイトカインの組み合わせ（ＩＬ－２／ＩＬ－１５ 対 ＩＬ－２／ＩＬ－２１）の添加に関する試験を、インビトロで１５ 対 ２２日間拡大し、同じ条件を用いて凍結したＣＡＲ ＮＫ細胞の比較を含めて説明している。

図２２は、異なる濃度のＰＬＴＬｙｓ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅおよびＡＢ血清＋異なるサイトカインの組み合わせ（ＩＬ－２／ＩＬ－１５ 対 ＩＬ－２／ＩＬ－２１）を含む凍結培地中で凍結されたＣＡＲ ＮＫ細胞上の、解凍後のＣＡＲ発現を示している。

図２３は、異なる濃度のＰＬＴ Ｌｙｓ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅおよびＡＢ血清＋異なるサイトカインの組み合わせ（ＩＬ－２／ＩＬ－１５ 対 ＩＬ－２／ＩＬ－２１）を含む凍結培地中で凍結されたＣＡＲ ＮＫ細胞上の、解凍後のＣＤ１６発現を示している。

図２４は、異なる濃度のＰＬＴ Ｌｙｓ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅおよびＡＢ血清＋異なるサイトカインの組み合わせ（ＩＬ－２／ＩＬ－１５ 対 ＩＬ－２／ＩＬ－２１）を含む凍結培地中で凍結されたＣＡＲ ＮＫ細胞上の、解凍後のＣＤ５６発現を示している。

図２５は、２２日目にＰＬＴ Ｌｙｓ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅおよびＡＢ血清＋異なるサイトカインの組み合わせ（ＩＬ－２／ＩＬ－１５ 対 ＩＬ－２／ＩＬ－２１）を含む凍結培地中で凍結されたＣＡＲ ＮＫ細胞によるＫ５６２およびＲａｊｉのＩｎｃｕＣｙｔｅライブイメージング細胞傷害性アッセイならびにその殺滅動態を示している。

図２６は、２２日間拡大され、様々な配合物を用いて凍結され、解凍され、Ｒａｊｉ細胞と共培養されたＣＡＲ ＮＫ細胞の解凍後のアポトーシス動態を示しているＩｎｃｕＣｙｔｅライブイメージングを提供している。

図２７は、氷の再結晶化を最小限に抑えるように細胞外凍結保護物質の構成要素の用量を設定するための研究を示している：ＰＬＴ Ｌｙｓ（２５％ 対 ５０％）；デキストラン（２５％ 対 ５０％；ＮＡＣＬ溶液またはデキストロース溶液）；ヒトアルブミン（２０％ 対 ４５％ 対 ７０％）。すべての条件を、２つのサイトカインの組み合わせ（ＩＬ－２／ＩＬ－１５）で試験した。

図２８は、氷の再結晶化を最小限に抑えるために、異なる濃度の細胞外凍結保護物質を含む培地中で凍結されたＣＡＲ ＮＫ細胞の生存率の結果を示している：ＰＬＴ Ｌｙｓ（２５％ 対 ５０％）；デキストラン（２５％ 対 ５０％；ＮＡＣＬ溶液またはデキストロース溶液）；ヒトアルブミン（２０％ 対 ４５ 対 ７０％）。すべての条件を、２つのサイトカインの組み合わせ（ＩＬ－２／ＩＬ－１５）で試験した。解凍の直後に生存率を試験した。

図２９は、氷の再結晶化を最小限に抑えるために異なる構成要素の細胞外凍結保護物質を含む培地を用いて凍結されたＣＡＲ ＮＫ細胞の解凍後の、アネキシン発現ＮＫ細胞のパーセンテージをアポトーシスの尺度として提供している：ＰＬＴ Ｌｙｓ（２５％ 対 ５０％）；デキストラン（２５％ 対 ５０％；ＮＡＣＬ溶液またはデキストロース溶液）；ヒトアルブミン（２０％ 対 ４５ 対 ７０％）。すべての条件を、２つのサイトカインの組み合わせ（ＩＬ－２／ＩＬ－１５）で試験した。

図３０は、異なる濃度のＰＬＴ Ｌｙｓ（２５％ 対 ５０％）、デキストラン（２５％ 対 ５０％；ＮＡＣＬ溶液またはデキストロース溶液）およびヒトアルブミン（２０％ 対 ４５ 対 ７０％）を含む培地中で凍結されたＣＡＲ ＮＫ細胞によるＫ５６２およびＲａｊｉのＩｎｃｕＣｙｔｅライブイメージング細胞傷害性アッセイならびにその殺滅動態を示している。

図３１は、２２日間拡大され、様々な配合物を用いて凍結され、解凍され、Ｒａｊｉ細胞と共培養されたＣＡＲ ＮＫ細胞の解凍後のアポトーシス動態を示しているＩｎｃｕＣｙｔｅライブイメージングを示している。

図３２は、氷の再結晶化を最小限に抑えるように細胞外凍結保護物質の構成要素の用量を設定するための研究を提供している：ＰＬＴ Ｌｙｓ（２５％ 対 ５０％）；デキストラン（２５％ 対 ５０％；ＮＡＣＬ溶液またはデキストロース溶液）；ヒトアルブミン（２０％ 対 ４５％ 対 ７０％）。すべての条件を、２つのサイトカインの組み合わせ（ＩＬ－２／ＩＬ－１５）で試験した。

図３３は、ＰＬＴ Ｌｙｓ（２５％ 対 ５０％）；デキストラン（２５％ 対 ５０％；ＮＡＣＬ溶液またはデキストロース溶液）；ヒトアルブミン（２０％ 対 ４５％ 対 ７０％）を含む凍結保存培地中で凍結されたＣＡＲ ＮＫ細胞の生存率および回収率の測定を示している。すべての条件を、２つのサイトカインの組み合わせ（ＩＬ－２／ＩＬ－１５）で試験した。

図３４は、ＰＬＴ Ｌｙｓ（２５％ 対 ５０％）；デキストラン（２５％ 対 ５０％；ＮＡＣＬ溶液またはデキストロース溶液）；ヒトアルブミン（２０％ 対 ４５％ 対 ７０％）中で凍結されたＣＡＲ ＮＫ細胞上のＣＡＲ発現の試験を提供している。すべての条件を、２つのサイトカインの組み合わせ（ＩＬ－２／ＩＬ－１５）で試験した。

図３５は、１５日間拡大され、ＰＬＴ Ｌｙｓ（２５％ 対 ５０％）；デキストラン（２５％ 対 ５０％；ＮＡＣＬ溶液またはデキストロース溶液）；ヒトアルブミン（２０％対４５％対７０％）を含む培地中で凍結されたＣＡＲ ＮＫ細胞の細胞傷害性の試験を提供している。すべての条件を、２つのサイトカインの組み合わせ（ＩＬ－１２／ＩＬ－１５）で試験した。解凍の直後に５１クロム放出アッセイによってＣＡＲ ＮＫ細胞の細胞傷害性を計測した。

図３６は、１５日間拡大され、凍結保存され、次いで解凍の直後に試験されたＣＡＲ ＮＫ細胞によるＫ５６２およびＲａｊｉのＩｎｃｕＣｙｔｅライブイメージング細胞傷害性アッセイならびにその殺滅動態を示している。

図３７は、ＰＬＴ Ｌｙｓ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅおよびＡＢ血清＋異なるサイトカインの組み合わせ（ＩＬ－２／ＩＬ－１５ 対 ＩＬ－２／ＩＬ－２１）を含む培地中で凍結されたＧＭＰグレードのＣＡＲ ＮＫ細胞のインビボ抗腫瘍活性を試験する計画、その後、１５日間または２２日間拡大し、同じ凍結保存条件を用いて凍結した細胞との比較を説明している。

図３８は、氷の再結晶化を最小限に抑えるための、細胞外凍結保護物質の構成要素の用量設定を説明している。凍結培地は、ＰＬＴ Ｌｙｓ（２５％対５０％）；デキストラン（２５％対５０％；ＮＡＣＬ溶液またはデキストロース溶液）；ヒトアルブミン（２０％対４５％対７０％）を含む。すべての条件を、２つのサイトカインの組み合わせ（ＩＬ－１２／ＩＬ－１５）で試験した。

図３９は、氷の再結晶化を最小限に抑えるための、細胞外凍結保護物質の構成要素の用量設定を示している。凍結培地は、ＰＬＴ Ｌｙｓ（２５％対５０％）；デキストラン（２５％対５０％；ＮＡＣＬ溶液またはデキストロース溶液）；ヒトアルブミン（２０％対４５対７０％）を含む。サイトカインを含まない条件、１つのサイトカインだけを含む条件（ＩＬ－２またはＩＬ－１５）、または２つのサイトカインの組み合わせを含む条件（ＩＬ－１２／ＩＬ－１５）のすべてを試験した。

図４０は、ＰＬＴ Ｌｙｓ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅおよびＡＢ血清＋異なるサイトカインの組み合わせ（ＩＬ－２／ＩＬ－１５対ＩＬ－２／ＩＬ－２１）を凍結培地に添加する試験の計画を示している。ＧＭＰグレードのＣＡＲ ＮＫ細胞を、１５日間対２２日間拡大し、種々の凍結培地を用いて凍結保存した。

図４１は、インビボマウス研究に使用される２２日間拡大されたＧＭＰグレードのＣＡＲ ＮＫ細胞を凍結保存するために使用される凍結培地を説明している表を提供している。

図４２は、Ｒａｊｉ腫瘍細胞を注入され、様々な凍結培地配合物中で凍結保存されたＣＡＲ ＮＫで処置されたマウスの生存率を示している。１つのコホートには、新鮮なＣＤ１９ ＣＡＲ ＮＫ細胞（ポジティブコントロール）を投与し、１１のコホートには、異なる凍結培地中で凍結保存され、解凍の直後に注入された凍結ＣＡＲ ＮＫ細胞を投与した。１つのコホートには、ＣＡＲ ＮＫ細胞を投与しなかった（ネガティブコントロール）。ＣＡＲ ＮＫ細胞を投与されたマウスは、ＣＡＲ ＮＫ細胞を凍結保存するために使用された凍結培地を問わず、未処置のままのマウスと比べて統計学的に有意に優れた生存率を示したが、コホート＃６、＃８および＃１１については、新鮮なＣＡＲ ＮＫ細胞を投与されたマウスの生存率よりも明らかに生存率が劣っていた。コホート＃１（ＨＲ＝０．８１１、ｐ＝０．７８）、＃２（ＨＲ＝０．６、ｐ＝０．４９）、＃３（ＨＲ＝０．９１６、ｐ＝０．９０）、＃４（ＨＲ＝０．８５９、ｐ＝０．８３）および＃７（ＨＲ＝０．８８３、ｐ＝０．８７）において処置されたマウスは、新鮮なＣＡＲ ＮＫ細胞生成物で処置されたマウスと比べて優れた生存率を示したが、それは統計学的に有意ではなかった。

図４３は、ＢＬＩによって評価されたときの、Ｒａｊｉマウスモデルにおける凍結ＣＡＲ ＮＫ細胞の抗腫瘍活性を、新鮮なＣＡＲ ＮＫ細胞と比べて示している。

図４４は、図４１に列挙された種々の条件を用いて凍結されたＣＡＲ ＮＫ細胞で処置されたマウスの平均放射輝度を、ポジティブおよびネガティブコントロールとして、それぞれ新鮮なＣＡＲ ＮＫ細胞で処置されたマウスまたは処置なしのマウスと比較して示している。 図４５は、図４１に列挙された種々の条件を用いて凍結されたＣＡＲ ＮＫ細胞で処置されたマウスの平均放射輝度を、ポジティブおよびネガティブコントロールとして、それぞれ新鮮なＣＡＲ ＮＫ細胞で処置されたマウスまたは処置なしのマウスと比較して示している。

例証的な実施形態の説明
ある特定の凍結保存細胞を臨床治療のために使用する際の限界の１つは、その数が少ないことおよび解凍後の生存率が悪いことが理由である。本開示は、凍結保存後の細胞のエキソビボ拡大に対するＧＭＰ準拠のストラテジーを用いることによって、これらの限界の両方に対処した。本方法の実施形態により、解凍後の生存率が大幅に上昇した。具体的な実施形態において、本明細書中に開示されるいずれの方法も、このストラテジーが、事前に拡大されていない細胞にも適用できるだろうということを示した。

したがって、本開示のある特定の実施形態は、細胞療法および免疫療法を対象とした細胞を含む臨床グレードの細胞の保存（例えば貯蔵のための保存）に関する方法および組成物を提供する。時間的制約を満たしながら、患者への注入に向けて臨床的に妥当な数の細胞を増やし、成形することは、最善の状況であっても極めて難易度が高い。開示される方法および組成物において、あらゆる種類の使用の前の、細胞保存の技術的プロセスについて詳述する。

特定の実施形態において、免疫細胞および／または幹細胞を含む任意のタイプの哺乳動物細胞を保存するための凍結培地配合物がさらに本明細書中に提供される。その免疫細胞は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞、幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、またはｉＰＳＣ、ＭＳＣに由来する任意の細胞、任意の器官、任意の線維芽細胞からの分化細胞もしくはコミット細胞（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ ｃｅｌｌｓ）をはじめとした任意の種類であってよい。いずれの場合においても、それらの哺乳動物細胞は、養子細胞療法に使用され得る。具体的な場合において、それらの細胞は、ＣＡＲ ＮＫ細胞である。具体的な実施形態において、凍結培地は、凍結保護物質、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセリン、グリセロール、ヒドロキシエトールデンプンまたはそれらの組み合わせ（であるがこれらに限定されない）、ヒト由来、ウシ由来もしくは他の動物起源の血清、または血清代替物、例えば、血小板溶解産物、１つ以上のサイトカインもしくは成長因子（ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、インターフェロン、腫瘍壊死因子、幹細胞因子、ＦＬＴ３－リガンド、ＡＰＲＩＬまたはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない）（であるがこれらに限定されない）を含み得る。血清は、成長因子、接着因子、ホルモン、脂質および／またはミネラルの供給源として使用され得、かつ／またはある特定の場合においては、細胞膜透過性を制御するために使用され、細胞内への脂質、酵素、微量養素および微量元素に対するキャリアとして働く。その凍結培地のおかげで、生存率および機能が改善された個々の用量の細胞の凍結が成功する。それらの細胞は、要求ごとに解凍され、患者に注入され得る。したがって、本明細書中に提供される凍結細胞は、作製のために必要とされる遅れなしに、解凍して患者に注入できる「既製」の細胞療法である。

上記培地により、細胞収集のためにドナーを募る必要なく、免疫療法を含むあらゆる目的のために、養子細胞療法用の細胞を細胞バンクとして保存することが可能になるが、このアプローチは、患者特異的な自己の製品の凍結保存にも同様に使用され得る。
Ｉ．定義

本明細書中で使用されるとき、特定の構成要素に関する「本質的に含まない」は、その特定の構成要素が、意図的に組成物に配合されていないことおよび／または夾雑物としてでさえもしくは微量でさえ存在しないことを意味するために本明細書中で使用される。ゆえに、ある組成物の任意の意図されない混入に起因する、その特定の構成要素の総量は、０．０５％未満、好ましくは、０．０１％未満である。標準的な分析方法ではその特定の構成要素の量を検出できない組成物が最も好ましい。

本明細書中で使用されるとき、「ａ」または「ａｎ」は、１つ以上を意味し得る。請求項で使用されるとき、語「ａ」または「ａｎ」は、語「～を含む」とともに使用されるとき、１つまたは１つより多いことを意味し得る。

請求項での用語「または」の使用は、選択肢だけを指すと明示的に示されない限り、またはそれらの選択肢が相互排他的でない限り、「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は、選択肢だけおよび「および／または」を指すという定義を支持する。例えば、「ｘ、ｙおよび／またはｚ」とは、「ｘ」のみ、「ｙ」のみ、「ｚ」のみ、「ｘ、ｙおよびｚ」、「（ｘおよびｙ）またはｚ」、「ｘまたは（ｙおよびｚ）」または「ｘまたはｙまたはｚ」のことを指し得る。ｘ、ｙまたはｚが、ある実施形態から明確に排除され得ることが明確に企図される。用語「約」、「実質的に」および「およそ」は、一般に、述べられている値プラスまたはマイナス５％を意味する。本明細書中で使用されるとき、「別の」は、少なくとも第２のものまたはそれ以上のものを意味し得る。

本明細書全体にわたって、文脈が他のことを要求しない限り、語「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、記載の工程もしくはエレメントまたは工程群もしくはエレメント群を包含するが、他の任意の工程もしくはエレメントまたは工程群もしくはエレメント群を排除しないことを暗に示すと理解される。「～からなる」は、句「～からなる」の前に何が置かれたとしても、「～を含み、それらに限定される」ことを意味する。したがって、句「～からなる」は、列挙されたエレメントが、不可欠または必須であること、および他のエレメントが存在しない可能性があることを示す。「～から本質的になる」は、この句の前に列挙される任意のエレメント、および列挙されたエレメントについて本開示に明示される活性または作用を干渉しないまたはそれらに寄与しない他のエレメントに限定されるエレメントを含むことを意味する。したがって、句「～から本質的になる」は、列挙されたエレメントが、不可欠または必須であるが、他のエレメントは自由選択ではなく、それらが列挙されたエレメントの活性または作用に影響するか否かに応じて、存在してもよいか、または存在してはならないことを示す。

本明細書全体にわたる「１つの実施形態」、「ある実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある特定の実施形態」、「追加の実施形態」もしくは「さらなる実施形態」またはそれらの組み合わせに対する言及は、その実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造または特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含められることを意味する。したがって、本明細書全体にわたる様々な箇所における前述の句の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態について言及しているわけではない。さらに、特定の特徴、構造または特性が、１つ以上の実施形態において任意の好適な様式で組み合わされ得る。

本願全体を通じて、用語「約」は、ある値が、その値を測定するために用いられるデバイス、方法に対する固有の誤差のばらつきを含んでいること、または研究の被験体間に存在するばらつきを示すために用いられる。

「免疫障害」、「免疫関連障害」または「免疫媒介性障害」とは、免疫応答が、その疾患の発症または進行において重要な役割を果たす障害のことを指す。免疫媒介性障害としては、自己免疫障害、同種移植片拒絶、移植片対宿主病ならびに炎症状態およびアレルギー状態が挙げられる。

「免疫応答」は、刺激に対する、Ｂ細胞またはＴ細胞または自然免疫細胞などの免疫系の細胞の応答である。１つの実施形態において、応答は、特定の抗原に特異的である（「抗原特異的応答」）。

「自己免疫疾患」とは、免疫系が、正常な宿主の一部である抗原（すなわち、自己抗原）に対して免疫応答（例えば、Ｂ細胞応答またはＴ細胞応答）を起こし、その結果、組織が傷害される疾患のことを指す。自己抗原は、宿主細胞に由来し得るか、または共生生物（例えば、通常、粘膜表面にコロニー形成する微生物（共生生物として知られる））に由来し得る。

疾患もしくは状態を「処置する」または疾患もしくは状態の処置とは、その疾患の徴候または症状を軽減する目的で、１つ以上の薬物または細胞療法製品を患者に投与することを含み得るプロトコルを実行することを指す。処置の望ましい効果としては、疾患の進行速度の低下、疾患状態の回復または緩和、および予後の緩解または改善が挙げられる。軽減は、現れる疾患または状態の徴候または症状が現れる前、ならびに現れた後において生じ得る。したがって、「処置する」または「処置」は、疾患または望ましくない状態を「予防する」またはそれらの「予防」を含み得る。さらに、「処置する」または「処置」は、徴候または症状の完全な軽減を必要とせず、治癒を必要とせず、詳細には、患者に対して周辺効果しか及ぼさないプロトコルを含む。

本願全体にわたって使用される用語「治療効果」または「治療的に有効な」とは、この状態に対する医学的処置に関して被験体の福祉を増進または向上させる何らかのことを指す。これには、ある疾患の徴候または症状の頻度または重症度の低下が含まれるが、これらに限定されない。例えば、癌の処置は、例えば、腫瘍の完全な根絶、腫瘍サイズの減少、腫瘍の侵襲性の低下、癌の成長速度の低下、または転移の予防を含み得る。癌の処置とは、癌を有する被験体の生存時間の延長のことも指し得る。

「被験体」および「患者」および「個体」は、相互交換可能であり得、ヒトまたは非ヒト、例えば、霊長類、哺乳動物および脊椎動物のことを指し得る。特定の実施形態において、被験体は、ヒトである。その被験体は、方法または材料の対象である任意の生物または動物被験体であり得、それらとしては、哺乳動物、例えば、ヒト、実験動物（例えば、霊長類、ラット、マウス、ウサギ）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、シチメンチョウおよびニワトリ）、家庭のペット（例えば、イヌ、ネコおよびげっ歯類）、ウマおよびトランスジェニック非ヒト動物が挙げられる。被験体は、患者であり得、例えば、１つ以上の感染症、１つ以上の遺伝性障害、１つ以上の癌またはそれらの任意の組み合わせなどの疾患（病状と称され得る）を有し得るか、または有すると疑われ得る。本明細書中で使用される「被験体」または「個体」は、医療施設に収容されていてもよいし収容されていなくてもよく、医療施設の外来患者として処置されてもよい。個体は、インターネットを介して１つ以上の医学的組成物を受け取っていてもよい。個体には、任意の齢のヒトまたは非ヒト動物が含まれ得るので、個体は、成体と若年者（例えば、小児）および乳児の両方を含み、子宮内の個体も含む。被験体は、医学的処置の必要性を有する場合もあるし、有しない場合もある。個体は、臨床的であるか基礎科学研究の支援であるかを問わず、自発的または非自発的に実験の一部となる場合がある。

句「薬学的にまたは薬理学的に許容され得る」とは、ヒトなどの動物に適宜投与されたとき、有害反応、アレルギー反応または他の不都合な反応をもたらさない分子実体および組成物のことを指す。抗体またはさらなる活性成分を含む薬学的組成物の調製は、本開示に照らせば当業者に公知である。さらに、動物（例えば、ヒト）への投与の場合、調製物は、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓが要求する無菌性、発熱性、一般的な安全性および純度の規格を満たすべきであることが理解される。

本明細書中で使用されるとき、「薬学的に許容され得るキャリア」は、当業者に公知であるように、任意のおよびすべての水性溶媒（例えば、水、アルコール溶液／水溶液、食塩水、非経口ビヒクル、例えば、塩化ナトリウム、リンゲルデキストロースなど）、非水溶媒（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油および注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチル）、分散媒、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、保存剤（例えば、抗菌剤または抗真菌剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガス）、等張剤、吸収遅延剤、塩、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、色素、流動性および栄養補給剤、そのような同様の材料ならびにそれらの組み合わせを含む。薬学的組成物のｐＨおよび薬学的組成物中の様々な構成要素の正確な濃度は、周知のパラメータに従って調整される。

用語「抗原提示細胞（ＡＰＣ）」とは、免疫系の特定のエフェクター細胞が認識できるペプチド－ＭＨＣ複合体の形態で１つ以上の抗原を提示でき、それにより、提示される抗原に対して効果的な細胞免疫応答を誘導できる、細胞のクラスのことを指す。用語「ＡＰＣ」は、インタクトな細胞全体（例えば、マクロファージ、Ｂ細胞、内皮細胞、活性化Ｔ細胞および樹状細胞、細胞株（例えば、Ｋ５６２））、または抗原（例えば、β２－ミクログロブリンに複合体化された精製済みのＭＨＣクラスＩ分子）を提示できる天然に存在する分子もしくは合成分子を包含する。
ＩＩ．凍結保存培地およびその使用

本開示の凍結保存培地中では、任意の種類の細胞が保存され得る。それらの細胞は、ある特定の実施形態では哺乳動物であり得、具体的な場合においては、研究および／または治療に使用される哺乳動物細胞である。それらの細胞は、免疫細胞であり得、具体的な場合では養子細胞療法に使用される免疫細胞を含む。そのような細胞は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）、またはｉＰＳＣ、ＭＳＣに由来する任意の細胞、任意の器官由来、任意の線維芽細胞由来の分化細胞もしくはコミット細胞などであってもよいし、そうでなくてもよい。それらの細胞は、ある個体から得られ、本明細書中に包含される培地を用いて凍結保存され、次いで、解凍され、その個体および／または別の１つ以上の他の個体に対して使用され得る。それらの細胞は、ある個体から得られ、操作がない場合の特性に加えて１つ以上の特性を備えるように操作され、本明細書中に包含される培地を用いて凍結保存され、その個体および／または別の１つ以上の他の個体に対して使用され得る。

１つの細胞コレクション由来の第１の複数の細胞が、本明細書中に包含される１つの特定の凍結保存培地中で凍結保存され得、同じ細胞コレクション由来の第２の複数の細胞が、本明細書中に包含される異なる凍結保存培地中で凍結保存され得る。このような実行は、細胞の用途、細胞の数および／または生存率などに応じて行われてもよいし、そうでなくてもよい。

特定の実施形態において、１つ以上の個体から細胞を回収した後、実質的に直ちにそれらの細胞が本明細書中に包含される凍結保存培地中で保存される。他の実施形態において、細胞は、培養後または拡大後に凍結保存される。拡大の後、細胞（例えば、免疫細胞）は、その後の目的（例えば、注入）に向けて直ちに操作されてもよいし、凍結保存によって保存されてもよい。ある特定の態様において、細胞は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日以内に、またはそれ以上の日数以内に、数日間、数週間または数ヶ月間、バルク集団としてエキソビボで増殖され得る。

特定の実施形態において、凍結保存培地は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）；血清（ヒト血清を含む）；および任意の種類の１つ以上のサイトカインを含み得る。具体的な実施形態において、その凍結保存培地のいずれか１つ以上の構成要素が、内在性タンパク質または組換えタンパク質とも称され得る天然タンパク質である。具体的な場合において、その内在性タンパク質は、上記の１つ以上のサイトカインである。凍結保存培地は、１つ以上のＦＤＡ承認作用物質も含み得、ある特定の場合において、その１つ以上のＦＤＡ承認作用物質が上記の１つ以上のサイトカインであり得る。

本開示の特定の実施形態は、少なくとも１つの凍結保護物質、少なくとも１つの血清（または非血清の血清代替物）ならびに少なくとも１つのサイトカインおよび／または少なくとも１つの成長因子を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる、凍結保存培地組成物を含む。凍結保護物質の例としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセリン、グリセロール、ヒドロキシエトールデンプンまたはそれらの組み合わせが挙げられる。本組成物の場合、非血清の代替物は、血小板溶解産物および／または血液製剤溶解産物および／またはヒト血清アルブミンおよび／または動物血清アルブミンを含み得る。ヒト血清は、ヒトＡＢ血清であり得る。任意のサイトカインが、天然タンパク質、組換えタンパク質、合成タンパク質またはそれらの混合物（米国食品医薬品局（ＦＤＡ）承認サイトカインである少なくとも１つのサイトカインを含む）であり得る。具体的な場合において、その組成物は、２つ以上のサイトカインを含む。単なる例として、少なくとも１つのサイトカインは、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、インターフェロン、腫瘍壊死因子、幹細胞因子、ＦＬＴ３－リガンド、ＡＰＲＩＬまたはそれらの組み合わせである。

特定の場合において、１つ以上のサイトカインには、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８および／またはＩＬ－２１が含まれる。上記細胞は、ＤＭＳＯ（例えば、１～１０％、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０％、特に５％）、９５％ヒトＡＢ血清（例えば、９０～９９％、例えば、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％、特に９５％）、血小板溶解産物（例えば、９０～９９％、例えば、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％、特に９５％）、ＩＬ－２（例えば、５０～５００Ｕ／ｍＬ、例えば、１００、２００、３００、４００、５００、１０００または５０００Ｕ／ｍＬ、特に４００Ｕ／ｍＬ）、ＩＬ－１５（５～５００ｎｇ／ｍｌ）および／またはＩＬ－２１（例えば、１～５００ｎｇ／ｍＬ、例えば、１０、２０、３０、４０、５０、１００または５００ｎｇ／ｍＬ、特に２０ｎｇ／ｍＬ）を含むＧＭＰ凍結保存培地に懸濁され得る。特定の場合において、上記細胞は、速度制御された方法を用いて液体窒素中で凍結される。

特定の実施形態において、上記凍結保護物質は、上記組成物の特定の量を構成し、具体的な態様において、その凍結保護物質は、組成物の４～６％または組成物の５～１０％を構成し、具体的な場合において、その凍結保護物質は、組成物の４～１０、４～９、４～８、４～７、４～６、４～５、５～１０、５～９、５～８、５～７、５～６、６～１０、６～９、６～８、６～７、７～１０、７～９、７～８、８～１０、８～９または９～１０％を構成する。上記血清は、上記組成物の特定の量を構成し得、例えば、組成物の５～９９、５～９０、５～８５、５～８０、５～７５、５～７０、５～６５、５～６０、５～５５、５～５０、５～４５、５～４０、５～３５、５～３０、５～２５、５～２０、５～１５、５～１０、１０～９９、１０～９０、１０～８５、１０～８０、１０～７５、１０～７０、１０～６５、１０～６０、１０～５５、１０～５０、１０～４５、１０～４０、１０～３５、１０～３０、１０～２５、１０～２０、１０～１５、２５～９９、２５～９０、２５～８５、２５～０８、２５～７５、２５～７０、２５～６５、２５～６０、２５～５５、２５～５０、２５～４５、２５～４０、２５～３５、２５～３０、５０～９９、５０～９０、５０～８５、５０～８０、５０～７５、５０～７０、４０～６５、５０～６０または５０～５５％を構成する。上記血小板溶解産物は、上記組成物のある特定の量、例えば、組成物の５～９９、５～９０、５～８５、５～８０、５～７５、５～７０、５～６５、５～６０、５～５５、５～５０、５～４５、５～４０、５～３５、５～３０、５～２５、５～２０、５～１５、５～１０、１０～９９、１０～９０、１０～８５、１０～８０、１０～７５、１０～７０、１０～６５、１０～６０、１０～５５、１０～５０、１０～４５、１０～４０、１０～３５、１０～３０、１０～２５、１０～２０、１０～１５、２５～９９、２５～９０、２５～８５、２５～０８、２５～７５、２５～７０、２５～６５、２５～６０、２５～５５、２５～５０、２５～４５、２５～４０、２５～３５、２５～３０、５０～９９、５０～９０、５０～８５、５０～８０、５０～７５、５０～７０、４０～６５、５０～６０または５０～５５％を構成し得る。具体的な態様において、血小板溶解産物は、組成物の９５％を構成する。

上記組成物がＩＬ－２を含む実施形態において、それは、１～５０００、１～４０００、１～３０００、１～２０００、１０～１０００、１００～５０００、１００～４０００、１００～３０００、１００～１０００、１００～１０００、１００～５００、５００～５０００、５００～４０００、５００～３０００、５００～２０００、５００～１０００、１０００～５０００、１０００～４０００、１０００～３０００、１０００～２０００または２０００～５０００Ｕ／ｍＬの濃度（詳細には１００、２００、３００、４００または５００Ｕ／ｍＬを含む）で存在し得る。上記組成物がＩＬ－２１を含む実施形態において、それは、１０～３０００、１０～２５００、１０～２０００、１０～１０００、１０～５００、１００～３０００、１００～２０００、１００～１０００、５００～３０００、５００～２０００、５００～１０００または１０００～３０００ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し得る（詳細には、１０、１５、２０または２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在することを含む）。具体的な場合において、ＩＬ－１５は、１０～２０００、１０～１０００、１０～５００、１００～２０００、１００～１０００、１００～５００、５００～２０００、５００～１０００または１０００～２０００ｎｇ／ｍＬの濃度でその組成物中に存在する。

凍結保存の場合、一例として、上記細胞（例えば、臍帯血ＮＫ細胞を含む養子療法用のＮＫ細胞）は、例えば５％ＤＭＳＯ、９５％ヒトＡＢ血清、４００単位のＩＬ－２／ｍｌおよび２０ｎｇのＩＬ－２１／ｍｌを含む、ＧＭＰ凍結保存培地に懸濁され得る。それらは、例えば、液体窒素、非液体窒素冷凍庫、ダンプフリージング、速度制御された凍結方法および／または速度制御されない凍結方法を用いて、凍結され得る。

具体的な実施形態において、上記培地は、グルコース、ｐＨ指示薬、１つ以上の塩、１つ以上のアミノ酸および１つ以上のビタミンを含む。ｐＨ指示薬の例としては、少なくともフェノールレッド、ブロモフェノールブルー、メチルオレンジ、ブロモクレゾールパープル、コンゴーレッドなどが挙げられる。塩の例としては、少なくとも塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸二ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硝酸カルシウムまたはそれらの組み合わせが挙げられる。アミノ酸の例としては、グルタミン、アルギニン、アスパラギン、システイン、ロイシン、イソロイシン、リジン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒドロキシプロリン、プロリン、トレオニン、チロシン、バリン、ヒスチジン、メチオニン、フェニルアラニン、グリシン、トリプトファン、還元型グルタチオンまたはそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態において、１つ以上のアミノ酸の量が、その培地における他の１つ以上のアミノ酸よりも多いのに対して、他の１つ以上のアミノ酸の量は、その培地において同じであり得る。例えば、グルタミンの量が、その培地中で最も多く、次いでアルギニンであってもよいし、そうでなくてもよい。アスパラギン、システイン、ロイシン、イソロイシンまたはそれらの組み合わせが、培地中に実質的に同じ量で存在してもよいし、そうでなくてもよい。アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒドロキシプロリン、プロリン、トレオニン、チロシン、バリンまたはそれらの組み合わせが、培地中に実質的に同じ量で存在してもよいし、そうでなくてもよい。ヒスチジン、メチオニン、フェニルアラニンまたはそれらの組み合わせが、培地中に実質的に同じ量で存在してもよいし、そうでなくてもよい。１つ以上の特定のビタミンが、培地中に存在してもよく、例えば、ｉ－イノシトール；塩化コリン；パラ－アミノ安息香酸、葉酸、ニコチンアミド、ピリドキシン塩酸塩、チアミン塩酸塩；パントテン酸カルシウム；ビオチン；リボフラビン；シアノコバラミン；またはそれらの組み合わせが、培地中に存在してもよい。それらのビタミンは、特定の量でその培地中に存在してもよいし、そうでなくてもよい。例えば、ｉ－イノシトールが、最も多い量で存在し、次いで塩化コリンであり得る。ある特定のビタミンが、培地中に実質的に等しく存在し得、それらのビタミンとしては、いくつかの場合において、パラ－アミノ安息香酸、葉酸、ニコチンアミド、ピリドキシン塩酸塩、チアミン塩酸塩またはそれらの組み合わせが挙げられる。ビオチンおよびリボフラビンの量が、培地中で本質的に等しくてもよいし、そうでなくてもよい。シアノコバラミンが、培地中のビタミンの最少量で存在してもよいし、そうでなくてもよい。

いくつかの実施形態において、上記細胞は、Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｏｒｅ ＧＥ，Ｇｅｒｎｅｒ ＲＥ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ ＨＡ（１９６７）“Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ”．ＪＡＭＡ．１９９（８）：５１９－５２４）がロズウェルパーク記念研究所において開発した成長培地であるＲＰＭＩ培地としても知られるＲＰＭＩ１６４０培地と実質的に類似または同一の培地中で培養され得る。

ある具体例では、１リットルのＲＰＭＩ１６４０は、以下を含有するかまたは含む：

グルコース（２ｇ）；ｐＨ指示薬（フェノールレッド，５ｍｇ）；塩（６ｇの塩化ナトリウム、２ｇの炭酸水素ナトリウム、１．５１２ｇのリン酸二ナトリウム、４００ｍｇの塩化カリウム、１００ｍｇの硫酸マグネシウムおよび１００ｍｇの硝酸カルシウム）；アミノ酸（３００ｍｇのグルタミン；２００ｍｇのアルギニン；各５０ｍｇのアスパラギン、シスチン、ロイシンおよびイソロイシン；４０ｍｇの塩酸リジン；３０ｍｇのセリン；各２０ｍｇのアスパラギン酸、グルタミン酸、ヒドロキシプロリン、プロリン、トレオニン、チロシンおよびバリン；各１５ｍｇのヒスチジン、メチオニンおよびフェニルアラニン；１０ｍｇのグリシン；５ｍｇのトリプトファン；および１ｍｇの還元型グルタチオン）；およびビタミン（３５ｍｇのｉ－イノシトール；３ｍｇの塩化コリン；各１ｍｇのパラ－アミノ安息香酸、葉酸、ニコチンアミド、ピリドキシン塩酸塩およびチアミン塩酸塩；０．２５ｍｇのパントテン酸カルシウム；各０．２ｍｇのビオチンおよびリボフラビン；および０．００５ｍｇのシアノコバラミン）。

具体的な実施形態において、上記組成物は、ａ）血小板溶解産物、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅおよびロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）培地のうちの１つ以上；（ｂ）デキストロースまたは食塩水（例えば）中に配合され得るデキストラン、アルブミンおよびＤＭＳＯのうちの１つ以上；ならびに（ｃ）ＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－２１のうちの１つ以上を含む。具体的な実施形態において、任意の組成物が、その組成物の５０％～９０％（その組成物の約５０％またはその組成物の約９０％を含む）の血小板溶解産物を含む。ＰｌａｓｍａＬｙｔｅが使用される場合、それは、組成物の約３２．５％、３５％、５０％または７０％を含む、組成物の約３２．５％～７０％であり得る。ＲＰＭＩは、組成物の約３２．５％、３５％または５０％を含む、組成物の３２．５％～５０％であり得る。デキストランが使用される場合、デキストランは、組成物の約２５％または約４０％を含む、組成物の約２５～４０％であり得る。アルブミンが使用される場合、それは、組成物の約２０％を含む、組成物の約１～９９％であり得る。ＤＭＳＯが使用される場合、それは、詳細には組成物の約５％または７．５％を含む、組成物の約５～７．５％であり得る。
ＩＩＩ．凍結保存用の細胞

凍結保存される細胞は、原核生物または真核生物を含む任意の種類であってよいが、具体的な実施形態において、その細胞は、哺乳動物細胞である。具体的な実施形態において、哺乳動物細胞は、１つ以上の個体から得られる。その哺乳動物細胞は、あらゆる種類の研究目的または治療目的で使用され得る。具体的な実施形態において、それらの細胞は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＰＢＭＣ、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、Ｂ細胞、単核細胞、樹状細胞、単球、好中球、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、またはｉＰＳＣ、ＭＳＣに由来する任意の細胞、任意の器官、任意の線維芽細胞由来の分化細胞もしくはコミット細胞などをはじめとした任意の種類の免疫細胞である。それらの細胞は、いくつかの例において、幹細胞であってもよいし、そうでなくてもよい。

特定の実施形態における細胞は、凍結保存の前および／または後に改変される。例えば、それらには、ベクターがトランスフェクトもしくは形質導入され得るか、または特定の遺伝子産物、例えば、その細胞に治療活性を付与する遺伝子産物をコードするプラスミドがエレクトロポレートされ得る。具体的な実施形態において、それらの細胞には、Ｔ細胞レセプターまたはキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を含む１つ以上の抗原レセプター、サイトカイン、ホーミングレセプターまたは他の任意の遺伝子がトランスフェクトされるか、または形質導入されるか、またはエレクトロポレートされる。具体的な場合において、それらの細胞は、ＣＡＲ発現免疫細胞、例えば、ＣＡＲ発現ＮＫ細胞である。

ある特定の実施形態において、ＮＫ細胞は、当該分野で周知の方法によって、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、刺激されていない白血球搬出法産物（ＰＢＳＣ）、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、骨髄または臍帯血から得られる。詳細には、ＮＫ細胞は、臍帯血（ＣＢ）、末梢血（ＰＢ）、骨髄または幹細胞から単離され得る。特定の実施形態において、免疫細胞は、プールされたＣＢから単離される。そのＣＢは、２、３、４、５、６、７、８、１０単位またはそれ以上からプールされ得る。免疫細胞は、自己または同種異系の免疫細胞であり得る。単離されたＮＫ細胞は、細胞治療を受ける被験体と、完全に一致していてもよいし、完全に不一致であってもよいし、ハプロタイプ一致であってもよいし（半分一致）、ハプロタイプより多いが完全一致未満であってもよい。ＮＫ細胞は、特異的な表面マーカー、例えば、ヒトではＣＤ１６およびＣＤ５６によって、検出され得る。

ある特定の態様において、ＮＫ細胞の出発集団は、フィコール密度勾配遠心分離を用いて単核細胞を単離することによって得られる。その細胞培養物から、ＣＤ３、ＣＤ１４および／またはＣＤ１９細胞を発現している任意の細胞が枯渇され得、その細胞培養物が、ＣＤ５６^＋／ＣＤ３^－細胞またはＮＫ細胞のパーセンテージを測定するために特徴付けられ得る。ある特定の手順では、それらは、ＣＤ５６または他の特定のＮＫ細胞抗体を用いたポジティブ選択にもかけられ得る。

上記細胞は、ＡＰＣ、例えばユニバーサルＡＰＣの存在下において、拡大され得る。その拡大は、約２～３０日間またはそれ以上、例えば、３～２０日間、特に１２～１６日間、例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９日間、詳細には約１４日間であり得る。ＮＫ細胞とＡＰＣは、約３：１～１：３、例えば、２：１、１：１、１：２、詳細には約１：２の比で存在し得る。拡大培養物は、拡大を促進するためにサイトカイン、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１および／またはＩＬ－１８をさらに含み得る。それらのサイトカインは、約１０～５００Ｕ／ｍＬ、例えば、１００～３００Ｕ／ｍＬ、特に約２００Ｕ／ｍＬの濃度で存在し得る。それらのサイトカインは、例えば２～３日ごとに、拡大培養物に補充され得る。ＡＰＣは、ＣＡＲ形質導入後など、少なくとも２回目に培養物に加えられ得る。特定の実施形態において、上記サイトカインは、例えば、細胞を被験者に投与する際に培地が細胞とともに含まれる場合または含まれるとき、細胞を受け取った際に個体に治療効果を提供するのを回避するレベルで凍結保存培地中に存在する。それらの細胞は、投与用細胞の調製時に培地が残っているために凍結保存培地の少なくとも一部に含まれている場合もあるし、意図的に凍結保存培地の少なくとも一部に含まれている場合もある。細胞の解凍後、細胞は、被験体に投与する前に洗浄されてもよいし、されなくてもよい。

１つの実施形態において、出発細胞集団は、単一のＣＢ単位からフィコール密度勾配によって単離されたＭＮＣである。次いで、それらの細胞を洗浄し、例えばＣｌｉｎｉＭＡＣＳ免疫磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用することによって、ＣＤ３、ＣＤ１４およびＣＤ１９陽性細胞を枯渇させ得る。未標識の濃縮ＣＢ－ＮＫ細胞を回収し、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ緩衝液で洗浄し、計数し、照射済みの（例えば、１００Ｇｙ）ＡＰＣと、例えば、１：２の比で合わせる。その細胞混合物（例えば、１×１０^６細胞／ｍＬ）を、ＮＫ完全培地（例えば、９０％幹細胞成長培地、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン）およびＩＬ－２（例えば、５０～５００、例えば１００～３００、例えば２００Ｕ／ｍＬ）を含む細胞培養フラスコに移し得る。それらの細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２においてインキュベートし得る。３日目に、遠心分離によって細胞を回収し、それらを、ＩＬ－２（例えば、５０～５００、例えば１００～３００、例えば、２００Ｕ／ｍＬ）を含むＮＫ完全培地（例えば、１×１０^６細胞／ｍＬ）に再懸濁することによって、培地交換を行ってよい。それらの細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２においてインキュベートし得る。５日目に、レトロネクチン形質導入に必要なウェルの数を、培養液中のＣＢ－ＮＫ細胞の数によって決定し得る。レトロネクチン溶液を２４ウェル培養プレートのウェルにプレーティングし得る。それらのプレートを密封し、４℃冷蔵庫内で保存し得る。

６日目に、０日目に記載したようなＮＫ選択の２回目を、ＣＢ－ＮＫ細胞の形質導入の前に行い得る。それらの細胞を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ緩衝液で洗浄し、遠心し、ＩＬ－２（例えば、１００～１０００、特に６００Ｕ／ｍＬ）を含むＮＫ完全培地に０．５×１０^６／ｍＬで再懸濁し得る。次いで、そのレトロネクチンプレートをＮＫ完全培地で洗浄し、使用するまで３７℃でインキュベートし得る。各ウェル内のＮＫ完全培地をレトロウイルス上清で置き換えた後、プレートを３２℃において遠心分離し得る。次いで、そのレトロウイルス上清を吸引し、新鮮なレトロウイルス上清と交換し得る。０．５×１０^６細胞および６００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２を含むＣＢ－ＮＫ細胞懸濁液を各ウェルに加え得、プレートを遠心し得る。次いでそれらのプレートを３７℃、５％ＣＯ_２においてインキュベートし得る。９日目に、ＣＡＲを形質導入されたＣＢ－ＮＫ細胞を、形質導入プレートから取り出し、遠心分離によって回収し、２００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２を含むＮＫ完全培地中において、照射済みの（例えば、１００Ｇｙ）ａＡＰＣで、例えば１：２の比で刺激し得る。それらの細胞培養フラスコを３７℃、５％ＣＯ_２においてインキュベートした。１２日目に、培地の交換を行い得る。１４日目に、細胞を遠心分離によって回収し得、上清を吸引し得、細胞を、２００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２を含む新鮮なＮＫ完全培地に再懸濁し得る。それらの細胞培養フラスコを３７℃、５％ＣＯ_２においてインキュベートする。１×１０^５ＣＤ３^＋細胞／ｋｇ超が存在する場合は、ＣｌｉｎｉＣｌｉｎｉＭＡＣＳ ＣＤ３試薬を用いてＣＤ３^＋細胞の磁気免疫枯渇を行ってもよい。１５日目に、それらの細胞を収集すると、注入または凍結保存のための最終生成物が調製される。

拡大されたＮＫ細胞は、自然免疫細胞と適応免疫細胞の両方を活性化するＩ型サイトカイン（例えば、インターフェロン－γ、腫瘍壊死因子－αおよび顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ））ならびに他のサイトカインおよびケモカインを分泌し得る。これらのサイトカインの計測を用いると、ＮＫ細胞の活性化状態を測定できる。さらに、ＮＫ細胞の活性化を測定するための当該分野で公知の他の方法を、本開示のＮＫ細胞の特徴付けに使用してもよい。

具体的な実施形態において、上記細胞は、１つ以上の操作された抗原レセプター（１つ以上のキメラ抗原レセプターおよび／または１つ以上の操作されたＴＣＲを含む）；１つ以上のサイトカイン；１つ以上の自殺遺伝子；ＣＤ４７；ＨＬＡ－Ｇ；ＨＬＡ－Ｅ；またはそれらの組み合わせを発現するように操作される。
Ａ．キメラ抗原レセプター

いくつかの実施形態において、凍結保存される細胞は、凍結保存の前および／または凍結保存後に、１つ以上のＣＡＲを発現するように操作される。具体的な実施形態において、そのＣＡＲは、ａ）少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメイン、ｂ）膜貫通ドメイン、およびｃ）少なくとも１つの抗原結合領域を含む細胞外ドメインを含む。必要に応じて、そのＣＡＲは、１つ以上の共刺激ドメインを含んでもよい。

いくつかの実施形態において、操作された抗原レセプターには、活性化型もしくは刺激型のＣＡＲ、共刺激型のＣＡＲ（ＷＯ２０１４／０５５６６８を参照のこと）および／または阻害型のＣＡＲ（ｉＣＡＲ、Ｆｅｄｏｒｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１３を参照のこと）をはじめとしたＣＡＲが含まれる。それらのＣＡＲは、一般に、１つ以上の細胞内のシグナル伝達構成要素に、いくつかの態様ではリンカーおよび／または膜貫通ドメインを介して連結された、細胞外の抗原（またはリガンド）結合ドメインを含む。そのような分子は、通常、天然の抗原レセプターを介するシグナル、共刺激レセプターとともにそのようなレセプターを介するシグナル、および／または共刺激レセプターのみを介するシグナルを模倣するかまたはまねる。

本開示のある特定の実施形態は、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、および１つ以上のシグナル伝達モチーフを含む細胞外のドメインを含む、抗原特異的ＣＡＲポリペプチド（免疫原性を低減するためにヒト化されたＣＡＲ（ｈＣＡＲ）を含む）をコードする核酸を含む核酸の使用に関する。ある特定の実施形態において、そのＣＡＲは、１つ以上の抗原の間で共有される空間を含むエピトープを認識し得る。ある特定の実施形態において、結合領域は、モノクローナル抗体の相補性決定領域、モノクローナル抗体の可変領域、および／またはそれらの抗原結合フラグメントを含み得る。別の実施形態において、その特異性は、レセプターに結合するペプチド（例えば、サイトカイン）に由来する。

ヒトＣＡＲ核酸は、ヒト患者に対する細胞免疫療法を増強するために使用されるヒト遺伝子であり得ると企図される。具体的な実施形態において、本発明は、ＣＡＲの完全長ｃＤＮＡまたはコード領域を含む。その抗原結合領域またはドメインは、特定のヒトモノクローナル抗体に由来する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）のＶ_Ｈ鎖およびＶ_Ｌ鎖のフラグメント（例えば、参照により本明細書中に援用される米国特許第７，１０９，３０４号に記載されているもの）を含み得る。そのフラグメントは、ヒト抗原特異的抗体の任意の数の異なる抗原結合ドメインでもあり得る。より具体的な実施形態において、そのフラグメントは、ヒト細胞における発現のためにヒトのコドン使用頻度に最適化された配列によってコードされる抗原特異的ｓｃＦｖである。そのＣＡＲは、同一でない２つの抗原性標的に対して二重特異的であり得るか、または同一でない３つの抗原性標的に対して三重特異的であり得るか、などである。

配置は、多量体であり得る（例えば、ダイアボディまたは多量体）。その多量体は、軽鎖および重鎖の可変部分がダイアボディに交差対形成することによって形成される可能性が最も高い。その構築物のヒンジ部分には、完全欠失から、１つ目のシステインが維持されること、セリン置換ではなくプロリン置換であること、１つ目のシステインまで切断されることにまで及ぶ複数の選択肢があり得る。Ｆｃ部分を欠失させることができる。安定したかつ／または二量体化する任意のタンパク質が、この目的にかない得る。Ｆｃドメインのうちの１つだけ、例えば、ヒト免疫グロブリンのＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインを使用することができる。二量体化を改善するように改変されたヒト免疫グロブリンのヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域を使用することもできる。免疫グロブリンのヒンジ部分だけを使用することもできる。ＣＤ８アルファの部分を使用することもできる。

いくつかの実施形態において、上記ＣＡＲ核酸は、膜貫通ドメインおよび改変されたＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメインなどの、他の共刺激レセプターをコードする配列を含む。他の共刺激レセプターとしては、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ－４０（ＣＤ１３４）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ４０リガンドおよび４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＤ３ζによって惹起される１次シグナルに加えて、ヒトＣＡＲに挿入されたヒト共刺激レセプターによって提供されるさらなるシグナルが、ＮＫ細胞の完全な活性化にとって重要であり、インビボでの持続性および養子免疫療法の治療の成功の改善を助け得る。

いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、養子療法によって標的化される特定の細胞型において発現される抗原などの特定の抗原（またはマーカーまたはリガンド）、例えば、癌マーカーおよび／または減衰応答を誘導することを目的とした抗原（例えば、正常細胞型上または非罹患細胞型上に発現される抗原）に対する特異性を有するように構築される。したがって、上記ＣＡＲは通常、その細胞外の部分に、１つ以上の抗原結合分子（例えば、１つ以上の抗原結合フラグメント、抗原結合ドメインもしくは抗原結合部分）または１つ以上の抗体可変ドメイン、および／または抗体分子を含む。いくつかの実施形態において、上記ＣＡＲは、抗体分子の抗原結合部分（例えば、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）に由来する一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ））を含む。

キメラ抗原レセプターのある特定の実施形態において、そのレセプターの抗原特異的部分（抗原結合領域を含む細胞外ドメインと称され得る）は、腫瘍関連抗原または病原体特異的抗原結合ドメインを含む。抗原には、デクチン－１などのパターン認識レセプターによって認識される糖鎖抗原が含まれる。腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞の細胞表面上に発現される限り、任意の種類であってよい。腫瘍関連抗原の例示的な実施形態としては、ＣＤ１９、ＣＤ２０、癌胎児抗原、アルファフェトプロテイン、ＣＡ－１２５、ＭＵＣ－１、ＣＤ５６、ＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、ＡＫＴ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、上皮性腫瘍抗原、黒色腫関連抗原、変異型ｐ５３、変異型ｒａｓなどが挙げられる。ある特定の実施形態において、ＣＡＲは、腫瘍関連抗原の量が少ないとき、持続性を改善するためにサイトカインと同時発現され得る。例えば、ＣＡＲは、ＩＬ－１５と同時発現され得る。

キメラレセプターをコードするオープンリーディングフレームの配列は、ゲノムＤＮＡ起源、ｃＤＮＡ起源から得ることができるか、または合成することができるか（例えば、ＰＣＲを介して）、またはそれらの組み合わせであり得る。イントロンはｍＲＮＡを安定化すると見出されているので、ゲノムＤＮＡのサイズおよびイントロンの数に応じて、ｃＤＮＡまたはそれらの組み合わせを使用することが望ましい場合がある。また、ｍＲＮＡを安定化するために内在性または外来性の非コード領域を使用することもさらに有益であり得る。

上記キメラ構築物は、裸のＤＮＡとして、プラスミドとして、または好適なベクターに入った状態で、免疫細胞に導入され得ることが企図される。裸のＤＮＡまたはプラスミドを用いたエレクトロポレーションによって細胞を安定的にトランスフェクトする方法は、当該分野で公知である。例えば、米国特許第６，４１０，３１９号を参照のこと。裸のＤＮＡとは、一般に、発現にとって適切な向きでプラスミド発現ベクターに含められたキメラレセプターをコードするＤＮＡのことを指す。

あるいは、キメラ構築物を免疫細胞に導入するために、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター）を用いることができる。本開示の方法に従って使用するのに適したベクターは、免疫細胞において非複製性のベクターである。ウイルスに基づくベクターが多数知られており（例えば、ＨＩＶ、ＳＶ４０、ＥＢＶ、ＨＳＶまたはＢＰＶに基づくベクター）、細胞内に維持されるそのウイルスのコピー数は、その細胞の生存能を維持するほど十分低い。

いくつかの態様において、抗原に特異的に結合する構成要素、すなわち抗原特異的認識構成要素は、１つ以上の膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインに連結される。いくつかの実施形態において、上記ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合された膜貫通ドメインを含む。１つの実施形態において、そのＣＡＲにおけるドメインの１つと天然に会合する膜貫通ドメインが使用される。いくつかの場合において、その膜貫通ドメインは、レセプター複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるためにそのようなドメインが同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに結合するのを回避するように、選択されるかまたはアミノ酸置換によって改変される。

膜貫通ドメインは、いくつかの実施形態において、天然起源または合成起源に由来する。起源が天然である場合、そのドメインは、いくつかの態様において、任意の膜結合型タンパク質または膜貫通タンパク質に由来する。膜貫通領域は、Ｔ細胞レセプターのアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＧＩＴＲ／ＣＤ３５７、ＮＫＧ２ＤおよびＤＡＰ分子に由来する（すなわち、それらの分子の膜貫通領域を少なくとも含む）膜貫通領域を含む。あるいは、膜貫通ドメインは、いくつかの実施形態において、合成の膜貫通ドメインである。いくつかの態様において、合成の膜貫通ドメインは、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主に含む。いくつかの態様では、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットが、合成の膜貫通ドメインの各末端に見られることがある。

ある特定の実施形態において、ＮＫ細胞などの免疫細胞を遺伝的に改変するための本明細書中に開示されるプラットフォーム技術としては、（ｉ）エレクトロポレーションデバイス（例えば、ヌクレオフェクター）を用いた非ウイルス遺伝子導入、（ｉｉ）エンドドメイン（例えば、ＣＤ２８／ＣＤ３－ζ、ＣＤ１３７／ＣＤ３－ζまたは他の組み合わせ）を介してシグナル伝達するＣＡＲ、（ｉｉｉ）長さが不定の細胞外ドメインであって抗原認識ドメインを細胞表面に接続する細胞外ドメインを有するＣＡＲ、およびいくつかの場合では、（ｉｖ）ＣＡＲ＋免疫細胞を頑強かつ数値的に拡大することができる、Ｋ５６２に由来する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，２０１１）が挙げられる。
Ｂ．Ｔ細胞レセプター

いくつかの実施形態において、上記細胞は、組換えＴＣＲおよび／または天然に存在するＴ細胞からクローニングされたＴＣＲを含む遺伝的に操作された抗原レセプターを含む。「Ｔ細胞レセプター」または「ＴＣＲ」とは、可変α鎖および可変β鎖（それぞれＴＣＲαおよびＴＣＲβとしても知られる）または可変γ鎖および可変δ鎖（それぞれＴＣＲγおよびＴＣＲδとしても知られる）を含む分子であって、ＭＨＣレセプターに結合した抗原ペプチドに特異的に結合することができる分子のことを指す。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、αβ型である。代替の実施形態において、上記細胞は、操作されたＴＣＲを欠き、例えば、その細胞内の内在性のＴＣＲが、癌または感染症を標的化し得る（例えば、内在性のＴＣＲを有するＣＭＶまたはＥＢＶ特異的Ｔ細胞）。

通常、αβ型およびγδ型として存在するＴＣＲは、一般に構造が似ているが、それらを発現しているＴ細胞は、解剖学的位置または機能が異なり得る。ＴＣＲは、細胞表面上にまたは可溶型として見られ得る。一般に、ＴＣＲは、Ｔ細胞（またはＴリンパ球）の表面上に見られ、通常、その表面上で、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原の認識に関与する。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、定常ドメイン、膜貫通ドメイン、および／または短い細胞質テイルも含み得る（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ，１９９７を参照のこと）。例えば、いくつかの態様において、ＴＣＲの各鎖は、１つのＮ末端免疫グロブリン可変ドメイン、１つの免疫グロブリン定常ドメイン、膜貫通領域、およびＣ末端に短い細胞質テイルを有し得る。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、シグナル伝達の媒介に関わるＣＤ３複合体のインバリアントタンパク質と会合される。別段述べられない限り、用語「ＴＣＲ」は、その機能的ＴＣＲフラグメントを包含すると理解されるべきである。この用語は、αβ型またはγδ型のＴＣＲをはじめとしたインタクトなまたは完全長のＴＣＲも包含する。

したがって、本明細書中の目的では、ＴＣＲへの言及には、任意のＴＣＲまたは機能的フラグメント（例えば、ＭＨＣ分子において結合した特異的な抗原ペプチド、すなわち、ＭＨＣ－ペプチド複合体に結合するＴＣＲの抗原結合部分）が含まれる。交換可能に使用され得る、ＴＣＲの「抗原結合部分」または抗原結合フラグメントとは、ＴＣＲの構造ドメインの一部しか含まないが、完全なＴＣＲが結合する抗原（例えば、ＭＨＣ－ペプチド複合体）に結合する分子のことを指す。いくつかの場合において、抗原結合部分は、特異的なＭＨＣ－ペプチド複合体に結合するための結合部位を形成するのに十分なＴＣＲの可変ドメイン（例えば、ＴＣＲの可変ａ鎖および可変β鎖）を含み、例えば一般に、各鎖が３つの相補性決定領域を含む。

いくつかの実施形態において、ＴＣＲ鎖の可変ドメインは、会合してループ、または免疫グロブリンに類似の相補性決定領域（ＣＤＲ）を形成し、それにより、抗原認識がもたらされ、ＴＣＲ分子の結合部位を形成することによってペプチド特異性が決定され、ペプチド特異性が決定される。通常、ＣＤＲは、免疫グロブリンと同様に、フレームワーク領域（ＦＲ）によって隔てられる（例えば、Ｊｏｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，２００３を参照のこと）。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ３は、プロセシングされた抗原の認識に関与する主要なＣＤＲであるが、アルファ鎖のＣＤＲ１は、抗原ペプチドのＮ末端部と相互作用するとも示されているのに対して、ベータ鎖のＣＤＲ１は、そのペプチドのＣ末端部と相互作用する。ＣＤＲ２は、ＭＨＣ分子を認識すると考えられている。いくつかの実施形態において、β鎖の可変領域は、さらなる超可変性（ＨＶ４）領域を含み得る。

いくつかの実施形態において、ＴＣＲ鎖は、定常ドメインを含む。例えば、免疫グロブリンと同様に、ＴＣＲ鎖の細胞外の部分（例えば、ａ鎖、β鎖）は、２つの免疫グロブリンドメインである、Ｎ末端における可変ドメイン（例えば、Ｖ_ａまたはＶｐ；通常、ＫａｂａｔナンバリングであるＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，１９９１，５^ｔｈ ｅｄ．に基づくアミノ酸１～１１６）、および細胞膜に隣接した１つの定常ドメイン（例えば、ａ鎖定常ドメインまたはＣ_ａ、通常、Ｋａｂａｔに基づくアミノ酸１１７～２５９、β鎖定常ドメインまたはＣｐ、通常、Ｋａｂａｔに基づくアミノ酸１１７～２９５）を含み得る。例えば、いくつかの場合、それらの２本の鎖によって形成されるＴＣＲの細胞外の部分は、２つの膜近位定常ドメイン、およびＣＤＲを含む２つの膜遠位可変ドメインを含む。ＴＣＲドメインの定常ドメインは、システイン残基がジスルフィド結合を形成する短い接続配列を含み、それにより、それらの２本の鎖の間に連結が形成される。いくつかの実施形態では、ＴＣＲが、定常ドメインに２つのジスルフィド結合を含むように、そのＴＣＲは、α鎖およびβ鎖の各々に追加のシステイン残基を有してもよい。

いくつかの実施形態において、ＴＣＲ鎖は、膜貫通ドメインを含み得る。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、正に帯電している。いくつかの場合において、ＴＣＲ鎖は、細胞質テイルを含む。いくつかの場合において、その構造のおかげで、ＴＣＲはＣＤ３のような他の分子と会合することができる。例えば、膜貫通領域とともに定常ドメインを含むＴＣＲは、そのタンパク質を細胞膜に固定し得、ＣＤ３シグナル伝達装置または複合体のインバリアントサブユニットと会合し得る。

一般に、ＣＤ３は、哺乳動物においては３つの異なる鎖（γ、δおよびε）およびζ鎖を有し得る多タンパク質複合体である。例えば、哺乳動物では、この複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、２つのＣＤ３ε鎖、およびホモ二量体のＣＤ３ζ鎖を含み得る。ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖およびＣＤ３ε鎖は、単一の免疫グロブリンドメインを含む免疫グロブリンスーパーファミリーの高度に関連した細胞表面タンパク質である。ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖およびＣＤ３ε鎖の膜貫通領域は、負に帯電しており、これは、これらの鎖が、正に帯電したＴ細胞レセプター鎖と会合できるようにする特性である。ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖およびＣＤ３ε鎖の各細胞内テイルは、免疫受容活性化チロシンモチーフまたはＩＴＡＭとして知られる保存された単一のモチーフを含むのに対して、各ＣＤ３ζ鎖は、３つ含む。一般に、ＩＴＡＭは、ＴＣＲ複合体のシグナル伝達能に関わる。これらのアクセサリー分子は、負に帯電した膜貫通領域を有し、ＴＣＲから細胞へのシグナルの伝播において役割を果たす。ＣＤ３鎖およびζ鎖は、ＴＣＲと一体となって、Ｔ細胞レセプター複合体として知られる複合体を形成する。

いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、αおよびβ（または必要に応じてγおよびδ）という２本の鎖のヘテロ二量体であり得るか、または一本鎖ＴＣＲ構築物であり得る。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、ジスルフィド結合などによって連結された２本の別個の鎖（α鎖とβ鎖またはγ鎖とδ鎖）を含むヘテロ二量体である。いくつかの実施形態において、標的抗原（例えば、癌抗原）に対するＴＣＲが特定され、細胞に導入される。いくつかの実施形態において、ＴＣＲをコードする核酸ポリマーは、公的に入手可能なＴＣＲ ＤＮＡ配列のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅などによって、種々の起源から得ることができる。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、生物学的起源、例えば、細胞、例えば、Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、Ｔ細胞ハイブリドーマまたは他の公的に入手可能な起源から得られる。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、インビボで単離された細胞から得ることができる。いくつかの実施形態において、高親和性Ｔ細胞クローンが、患者から単離され得、ＴＣＲが単離され得る。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、培養されたＴ細胞ハイブリドーマまたはクローンであり得る。いくつかの実施形態において、標的抗原に対するＴＣＲクローンは、ヒト免疫系遺伝子（例えば、ヒト白血球抗原系、すなわちＨＬＡ）で操作されたトランスジェニックマウスにおいて産生されたクローンである。例えば、腫瘍抗原（例えば、Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，２００９およびＣｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）を参照のこと。いくつかの実施形態では、ファージディスプレイを用いて、標的抗原に対するＴＣＲが単離される（例えば、Ｖａｒｅｌａ－Ｒｏｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．，２００８およびＬｉ，２００５を参照のこと）。いくつかの実施形態において、ＴＣＲまたはその抗原結合部分は、ＴＣＲの配列の知識によって合成的に作製され得る。
Ｃ．抗原提示細胞

抗原提示細胞は、本明細書中に包含される培地を用いて凍結保存され得る。マクロファージ、Ｂリンパ球および樹状細胞を含む抗原提示細胞は、特定のＭＨＣ分子の発現によって識別される。ＡＰＣは、抗原を内部移行し、その抗原の一部をＭＨＣ分子とともにその細胞膜の外膜上に再発現する。ＭＨＣは、複数の遺伝子座を含む大きな遺伝子複合体である。ＭＨＣ遺伝子座は、クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣと称される、ＭＨＣ膜分子の主要２クラスをコードする。一般に、Ｔヘルパーリンパ球が、ＭＨＣクラスＩＩ分子と会合した抗原を認識し、Ｔ細胞傷害性リンパ球が、ＭＨＣクラスＩ分子と会合した抗原を認識する。ＭＨＣは、ヒトではＨＬＡ複合体と称され、マウスではＨ－２複合体と称される。

いくつかの場合において、上記実施形態の治療的組成物および細胞療法用の生成物を調製する際には、ａＡＰＣが有用である。抗原提示システムの調製および使用に関する一般的ガイダンスについては、例えば、米国特許第６，２２５，０４２号、同第６，３５５，４７９号、同第６，３６２，００１号および同第６，７９０，６６２号；米国特許出願公開第２００９／００１７０００号および同第２００９／０００４１４２号；ならびに国際公開番号ＷＯ２００７／１０３００９を参照のこと。

ａＡＰＣシステムは、少なくとも１つの外来性の補助分子を含み得る。任意の好適な数および組み合わせの補助分子が使用され得る。補助分子は、共刺激分子および接着分子などの補助分子から選択され得る。例示的な共刺激分子としては、ＣＤ８６、ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）、４１ＢＢリガンドおよびＩＬ－２１が挙げられる。接着分子としては、例えば、セレクチンなどの糖結合糖タンパク質、インテグリンなどの膜貫通結合糖タンパク質、カドヘリンなどのカルシウム依存性タンパク質、および細胞間の接触または細胞とマトリックスとの接触を促進する細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）などの１回膜貫通型免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリータンパク質が挙げられ得る。例示的な接着分子としては、ＬＦＡ－３、およびＩＣＡＭ－１などのＩＣＡＭが挙げられる。共刺激分子および接着分子をはじめとした例示的な補助分子の選択、クローニング、調製および発現に有用な手法、方法および試薬は、例えば、米国特許第６，２２５，０４２号、同第６，３５５，４７９号および同第６，３６２，００１号に例証されている。
Ｄ．抗原

遺伝的に操作された抗原レセプターによって標的化される抗原には、養子細胞療法を介して標的化される疾患、状態または細胞型の状況において発現される抗原が含まれる。それらの疾患および状態には、血液癌、免疫系の癌（例えば、リンパ腫、白血病および／またはミエローマ、例えば、Ｂ、Ｔおよび骨髄性白血病、リンパ腫ならびに多発性骨髄腫）をはじめとした癌および腫瘍を含む、増殖性、腫瘍性および悪性の疾患および障害が含まれる。いくつかの実施形態において、抗原は、正常細胞もしくは正常組織または非標的化細胞もしくは非標的化組織と比べて、その疾患または状態の細胞上、例えば、腫瘍細胞上または病原性細胞上に、選択的に発現されるかまたは過剰発現される。他の実施形態において、抗原は、正常細胞上に発現され、かつ／または操作された細胞上に発現される。

任意の好適な抗原が、本方法において使用され得る。例示的な抗原としては、感染性物質、自己（ａｕｔｏ）抗原／自己（ｓｅｌｆ）抗原、腫瘍関連抗原／癌関連抗原、および腫瘍新抗原に由来する抗原性分子（Ｌｉｎｎｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の態様において、それらの抗原には、ＢＣＭＡ、ＮＹ－ＥＳＯ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｍｕｃ－１、Ｈｅｒ２、ＣＡ－１２５、ＷＴ－１、Ｍａｇｅ－Ａ３、Ｍａｇｅ－Ａ４、Ｍａｇｅ－Ａ１０、ＴＲＡＩＬ／ＤＲ４およびＣＥＡが含まれる。特定の態様において、２つ以上の抗原レセプターに対する抗原としては、ＣＤ１９、ＥＢＮＡ、ＷＴ１、ＣＤ１２３、ＮＹ－ＥＳＯ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＭＵＣ１、ＨＥＲ２、ＣＡ－１２５、ＷＴ１、Ｍａｇｅ－Ａ３、Ｍａｇｅ－Ａ４、Ｍａｇｅ－Ａ１０、ＴＲＡＩＬ／ＤＲ４および／またはＣＥＡが挙げられるが、これらに限定されない。これらの抗原に対する配列は、当該分野で公知であり、例えば、ＣＤ１９（アクセッション番号ＮＧ＿００７２７５．１）、ＥＢＮＡ（アクセッション番号ＮＧ＿００２３９２．２）、ＷＴ１（アクセッション番号ＮＧ＿００９２７２．１）、ＣＤ１２３（アクセッション番号ＮＣ＿００００２３．１１）、ＮＹ－ＥＳＯ（アクセッション番号ＮＣ＿００００２３．１１）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（アクセッション番号ＮＧ＿００７７２６．３）、ＭＵＣ１（アクセッション番号ＮＧ＿０２９３８３．１）、ＨＥＲ２（アクセッション番号ＮＧ＿００７５０３．１）、ＣＡ－１２５（アクセッション番号ＮＧ＿０５５２５７．１）、ＷＴ１（アクセッション番号ＮＧ＿００９２７２．１）、Ｍａｇｅ－Ａ３（アクセッション番号ＮＧ＿０１３２４４．１）、Ｍａｇｅ－Ａ４（アクセッション番号ＮＧ＿０１３２４５．１）、Ｍａｇｅ－Ａ１０（アクセッション番号ＮＣ＿００００２３．１１）、ＴＲＡＩＬ／ＤＲ４（アクセッション番号ＮＣ＿０００００３．１２）、および／またはＣＥＡ（アクセッション番号ＮＣ＿００００１９．１０）である。

腫瘍関連抗原は、前立腺癌、乳癌、直腸結腸癌、肺癌、膵臓癌、腎癌、中皮腫、卵巣癌または黒色腫に由来し得る。例示的な腫瘍関連抗原または腫瘍細胞由来抗原としては、ＭＡＧＥ１、３およびＭＡＧＥ４（または他のＭＡＧＥ抗原、例えば、国際特許公開番号ＷＯ９９／４０１８８に開示されているもの）；ＰＲＡＭＥ；ＢＡＧＥ；ＲＡＧＥ、Ｌａｇｅ（ＮＹ ＥＳＯ１としても知られる）；ＳＡＧＥ；およびＨＡＧＥまたはＧＡＧＥが挙げられる。腫瘍抗原のこれらの非限定的な例は、黒色腫、肺癌、肉腫および膀胱癌などの広範囲の腫瘍タイプにおいて発現される。例えば、米国特許第６，５４４，５１８号を参照のこと。前立腺癌の腫瘍関連抗原としては、例えば、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺酸性リン酸塩、ＮＫＸ３．１および前立腺の６回膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）が挙げられる。

他の腫瘍関連抗原としては、Ｐｌｕ－１、ＨＡＳＨ－１、ＨａｓＨ－２、ＣｒｉｐｔｏおよびＣｒｉｐｔｉｎが挙げられる。さらに、腫瘍抗原は、多くの癌の処置において有用な自己ペプチドホルモン、例えば、短い１０アミノ酸長のペプチドである完全長の性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）であり得る。

腫瘍抗原には、ＨＥＲ－２／ｎｅｕの発現などの腫瘍関連抗原の発現を特徴とする癌に由来する腫瘍抗原が含まれる。目的の腫瘍関連抗原には、系列特異的腫瘍抗原、例えば、メラノサイト－黒色腫系列抗原ＭＡＲＴ－１／Ｍｅｌａｎ－Ａ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、ｍｄａ－７、チロシナーゼおよびチロシナーゼ関連タンパク質が含まれる。例証的な腫瘍関連抗原としては、ｐ５３、Ｒａｓ、ｃ－Ｍｙｃ、細胞質セリン／トレオニンキナーゼ（例えば、Ａ－Ｒａｆ、Ｂ－ＲａｆおよびＣ－Ｒａｆ、サイクリン依存性キナーゼ）、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＲＴ－１、ＢＡＧＥ、ＤＡＭ－６、－１０、ＧＡＧＥ－１、－２、－８、ＧＡＧＥ－３、－４、－５、－６、－７Ｂ、ＮＡ８８－Ａ、ＭＡＲＴ－１、ＭＣ１Ｒ、Ｇｐ１００、ＰＳＡ、ＰＳＭ、チロシナーゼ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＡＲＴ－４、ＣＡＭＥＬ、ＣＥＡ、Ｃｙｐ－Ｂ、ｈＴＥＲＴ、ｈＴＲＴ、ｉＣＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ホスホイノシチド３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、ＴＲＫレセプター、ＰＲＡＭＥ、Ｐ１５、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＲＴ－１、ＳＡＲＴ－３、ウィルムス腫瘍抗原（ＷＴ１）、ＡＦＰ、－カテニン／ｍ、カスパーゼ－８／ｍ、ＣＥＡ、ＣＤＫ－４／ｍ、ＥＬＦ２Ｍ、ＧｎＴ－Ｖ、Ｇ２５０、ＨＳＰ７０－２Ｍ、ＨＳＴ－２、ＫＩＡＡ０２０５、ＭＵＭ－１、ＭＵＭ－２、ＭＵＭ－３、ミオシン／ｍ、ＲＡＧＥ、ＳＡＲＴ－２、ＴＲＰ－２／ＩＮＴ２、７０７－ＡＰ、アネキシンＩＩ、ＣＤＣ２７／ｍ、ＴＰＩ／ｍｂｃｒ－ａｂｌ、ＢＣＲ－ＡＢＬ、インターフェロン制御因子４（ＩＲＦ４）、ＥＴＶ６／ＡＭＬ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、Ｐｍｌ／ＲＡＲ、腫瘍関連カルシウムシグナル伝達物質１（ＴＡＣＳＴＤ１）ＴＡＣＳＴＤ２、レセプターチロシンキナーゼ（例えば、上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）（特に、ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、血小板由来成長因子レセプター（ＰＤＧＦＲ）、血管内皮成長因子レセプター（ＶＥＧＦＲ））、細胞質チロシンキナーゼ（例えば、ｓｒｃファミリー、ｓｙｋ－ＺＡＰ７０ファミリー）、インテグリン結合キナーゼ（ＩＬＫ）、シグナル伝達性転写因子ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴＳおよびＳＴＡＴＥ、低酸素誘導因子（例えば、ＨＩＦ－１およびＨＩＦ－２）、核因子－カッパーＢ（ＮＦ－Ｂ）、Ｎｏｔｃｈレセプター（例えば、Ｎｏｔｃｈ１～４）、ｃ－Ｍｅｔ、ラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）、ＷＮＴ、細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）およびそれらの調節サブユニット、ＰＭＳＡ、ＰＲ－３、ＭＤＭ２、メソテリン、腎細胞癌－５Ｔ４、ＳＭ２２－アルファ、炭酸脱水酵素Ｉ（ＣＡＩ）およびＩＸ（ＣＡＩＸ）（Ｇ２５０としても知られる）、ＳＴＥＡＤ、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＧＤ２、プロテイナーゼ３、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点（ｓａｒｃｏｍａ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔｓ）、ＥｐｈＡ２、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲンレセプター、サイクリンＢ１、ポリシアル酸、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＧＤ３、フコシルＧＭ１、メソテリアン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｎ）、ＰＳＣＡ、ｓＬｅ、ＰＬＡＣ１、ＧＭ３、ＢＯＲＩＳ、Ｔｎ、ＧＬｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＲＧｓＳ、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、精子タンパク質１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ１、Ｂ７Ｈ３、レグマイン（ｌｅｇｕｍａｉｎ）、ＴＩＥ２、Ｐａｇｅ４、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＦＡＰ、ＭＡＤ－ＣＴ－２、ｆｏｓ関連抗原１、ＣＢＸ２、ＣＬＤＮ６、ＳＰＡＮＸ、ＴＰＴＥ、ＡＣＴＬ８、ＡＮＫＲＤ３０Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＳＵＮＣ１、ＬＲＲＮ１ならびにイディオタイプのうちのいずれか１つ以上に由来するかまたはいずれか１つ以上を含む腫瘍抗原が挙げられるが、これらに限定されない。

抗原には、腫瘍細胞において変異した遺伝子由来の、または正常細胞と比べて腫瘍細胞において異なるレベルで転写される遺伝子由来の、エピトープ領域またはエピトープペプチド（例えば、テロメラーゼ酵素、サバイビン、メソテリン、変異型ｒａｓ、ｂｃｒ／ａｂｌ再配列、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、変異型または野生型ｐ５３、シトクロムＰ４５０ １Ｂ１、およびＮ－アセチルグルコサミン転移酵素－Ｖなどの異常に発現されるイントロン配列）；ミエローマおよびＢ細胞リンパ腫においてユニークなイディオタイプを生成する免疫グロブリン遺伝子のクローン性再配列；オンコウイルスのプロセスに由来するエピトープ領域またはエピトープペプチドを含む腫瘍抗原（例えば、ヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ６およびＥ７）；エプスタイン・バーウイルスタンパク質ＬＭＰ２；腫瘍選択的に発現する変異していない腫瘍胎児性タンパク質（例えば、癌胎児抗原およびアルファ－フェトプロテイン）が含まれ得る。

他の実施形態において、抗原は、病原性微生物または日和見病原性微生物（本明細書中で感染症微生物とも呼ばれる）（例えば、ウイルス、真菌、寄生生物および細菌）から得られるかまたはそれらに由来する。ある特定の実施形態において、そのような微生物に由来する抗原には、完全長タンパク質が含まれる。

本明細書中に記載される方法において使用が企図される抗原を有する例証的な病原性生物としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、インフルエンザＡ、ＢおよびＣ、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ポリオーマウイルス（例えば、ＢＫウイルスおよびＪＣウイルス）、アデノウイルス、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）を含むブドウ球菌属の種、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを含む連鎖球菌属の種が挙げられる。当業者が理解するように、本明細書中に記載されるような抗原として使用するためのこれらおよび他の病原性微生物に由来するタンパク質、ならびにそれらのタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、刊行物ならびにＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）、ＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴ（登録商標）およびＴＲＥＭＢＬ（登録商標）などの公的データベースにおいて特定され得る。

ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に由来する抗原には、ＨＩＶビリオン構造タンパク質（例えば、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、ｐ１７、ｐ２４）、プロテアーゼ、逆転写酵素、またはｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒおよびｖｐｕによってコードされるＨＩＶタンパク質のうちのいずれかが含まれる。

単純ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ１およびＨＳＶ２）に由来する抗原としては、ＨＳＶ後期遺伝子から発現されるタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。後期群の遺伝子は、ビリオン粒子を形成するタンパク質を主にコードする。そのようなタンパク質としては、ウイルスカプシドを形成する（ＵＬ）の５つのタンパク質：ＵＬ６、ＵＬ１８、ＵＬ３５、ＵＬ３８ならびに主要カプシドタンパク質ＵＬ１９、ＵＬ４５およびＵＬ２７が挙げられ、これらの各々が、本明細書中に記載されるような抗原として使用され得る。本明細書中で抗原としての使用が企図される他の例証的なＨＳＶタンパク質としては、ＩＣＰ２７（Ｈ１、Ｈ２）、糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）および糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タンパク質が挙げられる。ＨＳＶゲノムは、少なくとも７４個の遺伝子を含み、その各々が、抗原として使用され得る可能性があるタンパク質をコードする。

サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来する抗原としては、ＣＭＶ構造タンパク質、ウイルス複製の前初期および初期に発現されるウイルス抗原、糖タンパク質ＩおよびＩＩＩ、カプシドタンパク質、コートタンパク質、低分子マトリックスタンパク質（ｌｏｗｅｒ ｍａｔｒｉｘ ｐｒｏｔｅｉｎ）ｐｐ６５（ｐｐＵＬ８３）、ｐ５２（ｐｐＵＬ４４）、ＩＥ１および１Ｅ２（ＵＬ１２３およびＵＬ１２２）、ＵＬ１２８～ＵＬ１５０の遺伝子クラスターのタンパク質産物（Ｒｙｋｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，２００６）、エンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）、ｇＨ、ｇＮ、ならびにｐｐ１５０が挙げられる。当業者が理解するように、本明細書中に記載される抗原として使用するためのＣＭＶタンパク質は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）、ＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴ（登録商標）およびＴＲＥＭＢＬ（登録商標）などの公的データベースにおいて特定され得る（例えば、Ｂｅｎｎｅｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｌｏｅｗｅｎｄｏｒｆ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｍａｒｓｃｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００９を参照のこと）。

ある特定の実施形態において使用が企図されるエプスタイン・バンウイルス（ＥＢＶ）に由来する抗原としては、ＥＢＶ溶解性タンパク質ｇｐ３５０およびｇｐ１１０、エプスタイン・バン核抗原（ＥＢＮＡ）－１、ＥＢＮＡ－２、ＥＢＮＡ－３Ａ、ＥＢＮＡ－３Ｂ、ＥＢＮＡ－３Ｃ、ＥＢＮＡ－リーダータンパク質（ＥＢＮＡ－ＬＰ）、ならびに潜伏感染膜タンパク質（ＬＭＰ）－１、ＬＭＰ－２ＡおよびＬＭＰ－２Ｂを含む、潜伏感染サイクル中に生成されるＥＢＶタンパク質が挙げられる（例えば、Ｌｏｃｋｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００８を参照のこと）。

本明細書中で使用が企図される呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に由来する抗原には、ＲＳＶゲノムによってコードされる１１個のタンパク質またはそれらの抗原性フラグメント：ＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ（ヌクレオカプシドタンパク質）、Ｍ（マトリックスタンパク質）ＳＨ、ＧおよびＦ（ウイルスコートタンパク質）、Ｍ２（第２のマトリックスタンパク質）、Ｍ２－１（伸長因子）、Ｍ２－２（転写制御）、ＲＮＡポリメラーゼ、ならびにリンタンパク質Ｐのうちのいずれかが含まれる。

使用が企図される水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）に由来する抗原には、ＶＳＶゲノムによってコードされる主要な５つのタンパク質およびそれらの抗原性フラグメント：巨大タンパク質（Ｌ）、糖タンパク質（Ｇ）、核タンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）およびマトリックスタンパク質（Ｍ）のうちのいずれか１つが含まれる（例えば、Ｒｉｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９を参照のこと）。

ある特定の実施形態において使用が企図されるインフルエンザウイルスに由来する抗原としては、赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックスタンパク質Ｍ１およびＭ２、ＮＳ１、ＮＳ２（ＮＥＰ）、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ１－Ｆ２、ならびにＰＢ２が挙げられる。

例示的なウイルス抗原としては、アデノウイルスのポリペプチド、アルファウイルスのポリペプチド、カリシウイルスのポリペプチド（例えば、カリシウイルスのカプシド抗原）、コロナウイルスのポリペプチド、ジステンパーウイルスのポリペプチド、エボラウイルスのポリペプチド、エンテロウイルスのポリペプチド、フラビウイルスのポリペプチド、肝炎ウイルス（ＡＥ）のポリペプチド（Ｂ型肝炎のコアまたは表面抗原、Ｃ型肝炎ウイルスのＥ１もしくはＥ２糖タンパク質、コアまたは非構造タンパク質）、ヘルペスウイルスのポリペプチド（単純ヘルペスウイルスまたは水痘帯状疱疹ウイルスの糖タンパク質を含む）、感染性腹膜炎ウイルスのポリペプチド、白血病ウイルスのポリペプチド、マールブルグウイルスのポリペプチド、オルトミクソウイルスのポリペプチド、パピローマウイルスのポリペプチド、パラインフルエンザウイルスのポリペプチド（例えば、赤血球凝集素ポリペプチドおよびノイラミニダーゼポリペプチド）、パラミクソウイルスのポリペプチド、パルボウイルスのポリペプチド、ペスチウイルスのポリペプチド、ピコルナウイルスのポリペプチド（例えば、ポリオウイルスのカプシドポリペプチド）、ポックスウイルスのポリペプチド（例えば、ワクシニアウイルスのポリペプチド）、狂犬病ウイルスのポリペプチド（例えば、狂犬病ウイルスの糖タンパク質Ｇ）、レオウイルスのポリペプチド、レトロウイルスのポリペプチド、およびロタウイルスのポリペプチドも挙げられるが、これらに限定されない。

ある特定の実施形態において、抗原は、細菌抗原であり得る。ある特定の実施形態において、目的の細菌抗原は、分泌型ポリペプチドであり得る。他のある特定の実施形態において、細菌抗原には、細菌の細胞外面上に露出したポリペプチドの一部を有する抗原が含まれる。

使用が企図される、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）を含むブドウ球菌属の種に由来する抗原としては、ビルレンス制御因子、例えば、Ａｇｒシステム、ＳａｒおよびＳａｅ、Ａｒｌシステム、Ｓａｒホモログ（Ｒｏｔ、ＭｇｒＡ、ＳａｒＳ、ＳａｒＲ、ＳａｒＴ、ＳａｒＵ、ＳａｒＶ、ＳａｒＸ、ＳａｒＺおよびＴｃａＲ）、ＳｒｒシステムならびにＴＲＡＰが挙げられる。抗原として役立ち得る他のブドウ球菌属のタンパク質としては、Ｃｌｐタンパク質、ＨｔｒＡ、ＭｓｒＲ、アコニターゼ、ＣｃｐＡ、ＳｖｒＡ、Ｍｓａ、ＣｆｖＡおよびＣｆｖＢが挙げられる（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００８ Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｅｄ．Ｊｏｄｉ Ｌｉｎｄｓａｙを参照のこと）。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの２種（Ｎ３１５およびＭｕ５０）のゲノムが、配列決定済みであり、例えば、ＰＡＴＲＩＣ（ＰＡＴＲＩＣ：Ｔｈｅ ＶＢＩ ＰａｔｈｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓｎｙｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７）において公的に入手可能である。当業者が理解するように、抗原として使用するためのブドウ球菌属のタンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）、Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ（登録商標）およびＴｒＥＭＢＬ（登録商標）などの他の公的データベースにおいても特定され得る。

本明細書中に記載されるある特定の実施形態において使用が企図されるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来する抗原としては、ニューモリシン、ＰｓｐＡ、コリン結合タンパク質Ａ（ＣｂｐＡ）、ＮａｎＡ、ＮａｎＢ、ＳｐｎＨＬ、ＰａｖＡ、ＬｙｔＡ、Ｐｈｔおよびピリンタンパク質（ＲｒｇＡ；ＲｒｇＢ；ＲｒｇＣ）が挙げられる。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの抗原性タンパク質も、当該分野で公知であり、いくつかの実施形態において抗原として使用され得る（例えば、Ｚｙｓｋ ｅｔ ａｌ．，２０００を参照のこと）。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの毒性株の全ゲノム配列は、配列決定済みであり、当業者が理解するように、本明細書中で使用するためのＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）、ＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴ（登録商標）およびＴＲＥＭＢＬ（登録商標）などの他の公的データベースにおいても特定され得る。本開示に係る抗原として特に興味深いタンパク質としては、肺炎球菌の表面に露出すると予測される病原性因子およびタンパク質が挙げられる（例えば、Ｆｒｏｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０１０を参照のこと）。

抗原として使用され得る細菌抗原の例としては、アクチノマイセス属のポリペプチド、バチルス属のポリペプチド、バクテロイデス属のポリペプチド、ボルデテラ属のポリペプチド、バルトネラ属のポリペプチド、ボレリア属のポリペプチド（例えば、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ ＯｓｐＡ）、ブルセラ属のポリペプチド、カンピロバクター属のポリペプチド、キャプノサイトファーガ属のポリペプチド、クラミジア属のポリペプチド、コリネバクテリウム属のポリペプチド、コクシエラ属のポリペプチド、デルマトフィルス属のポリペプチド、エンテロコッカス属のポリペプチド、エーリキア属のポリペプチド、エシェリキア属のポリペプチド、フランシセラ属のポリペプチド、フソバクテリウム属のポリペプチド、ヘモバルトネラ属のポリペプチド、ヘモフィルス属のポリペプチド（例えば、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｂ型外膜タンパク質）、ヘリコバクター属のポリペプチド、クレブシエラ属のポリペプチド、Ｌ型細菌のポリペプチド、レプトスピラ属のポリペプチド、リステリア属のポリペプチド、マイコバクテリウム属のポリペプチド、マイコプラズマ属のポリペプチド、ナイセリア属のポリペプチド、ネオリケッチア属のポリペプチド、ノカルジア属のポリペプチド、パスツレラ属のポリペプチド、ペプトコッカス属のポリペプチド、ペプトストレプトコッカス属のポリペプチド、肺炎球菌のポリペプチド（すなわち、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのポリペプチド）（本明細書中の説明を参照のこと）、プロテウス属のポリペプチド、シュードモナス属のポリペプチド、リケッチア属のポリペプチド、ロシャリメア属のポリペプチド、サルモネラ属のポリペプチド、シゲラ属のポリペプチド、ブドウ球菌属のポリペプチド、Ａ群連鎖球菌のポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＭタンパク質）、Ｂ群連鎖球菌（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）のポリペプチド、トレポネーマ属のポリペプチド、およびエルシニア属のポリペプチド（例えば、Ｙ ｐｅｓｔｉｓのＦ１およびＶ抗原）が挙げられるが、これらに限定されない。

真菌抗原の例としては、アブシディア属のポリペプチド、アクレモニウム属のポリペプチド、アルテルナリア属のポリペプチド、アスペルギルス属のポリペプチド、バシジオボラス属のポリペプチド、ビポラーリス属のポリペプチド、ブラストミセス属のポリペプチド、カンジダ属のポリペプチド、コクシジオイデス属のポリペプチド、コニディオボラス属のポリペプチド、クリプトコッカス属のポリペプチド、カーバラリア属のポリペプチド、エピデルモフィトン属のポリペプチド、エクソフィアラ属のポリペプチド、ゲオトリクム属のポリペプチド、ヒストプラズマ属のポリペプチド、マヅレラ属のポリペプチド、マラセチア属のポリペプチド、ミクロスポルム属のポリペプチド、モニリエラ属のポリペプチド、モルチエレラ属のポリペプチド、ケカビ属のポリペプチド、ペシロマイセス属のポリペプチド、ペニシリウム属のポリペプチド、フィアレモニウム属（Ｐｈｉａｌｅｍｏｎｉｕｍ）のポリペプチド、フィアロフォラ属のポリペプチド、プロトテカ属のポリペプチド、シュードアレシェリア属のポリペプチド、シュードミクロドキウム属（Ｐｓｅｕｄｏｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ）のポリペプチド、フィチウム属のポリペプチド、リノスポリジウム属のポリペプチド、クモノスカビ属のポリペプチド、スコレコバシジウム属（Ｓｃｏｌｅｃｏｂａｓｉｄｉｕｍ）のポリペプチド、スポロトリクス属のポリペプチド、ステンフィリウム属（Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ）のポリペプチド、白癬菌属のポリペプチド、トリコスポロン属のポリペプチドおよびキシロヒファ属（Ｘｙｌｏｈｙｐｈａ）のポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。

原生動物の寄生生物抗原の例としては、バベシア属のポリペプチド、バランチジウム属のポリペプチド、ベスノイチア属（Ｂｅｓｎｏｉｔｉａ）のポリペプチド、クリプトスポリジウム属のポリペプチド、エイメリア属のポリペプチド、エンセファリトゾーン属のポリペプチド、エントアメーバ属のポリペプチド、ジアルジア属のポリペプチド、ハモンディア属（Ｈａｍｍｏｎｄｉａ）のポリペプチド、ヘパトゾーン属のポリペプチド、イソスポラ属のポリペプチド、リーシュマニア属のポリペプチド、微胞子虫門のポリペプチド、ネオスポラ属のポリペプチド、ノゼマ属のポリペプチド、ペンタトリコモナス属のポリペプチド、プラスモディウム属のポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。蠕虫寄生生物抗原の例としては、アカントケイロネマ属のポリペプチド、アエルロストロンギルウス属（Ａｅｌｕｒｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）のポリペプチド、鉤虫属のポリペプチド、住血線虫属のポリペプチド、回虫属のポリペプチド、ブルギア属のポリペプチド、ブノストムム属のポリペプチド、キャピラリア属のポリペプチド、カベルチア属（Ｃｈａｂｅｒｔｉａ）のポリペプチド、クーペリア属のポリペプチド、クレノソマ属（Ｃｒｅｎｏｓｏｍａ）のポリペプチド、ディクチオカウルス属のポリペプチド、ジオクトフィーメ属のポリペプチド、ディペタロネマ属のポリペプチド、裂頭条虫属のポリペプチド、ジプリジウム属のポリペプチド、イヌ糸状虫属のポリペプチド、ドラクンクルス属のポリペプチド、エンテロビウス属のポリペプチド、フィラロイデス属（Ｆｉｌａｒｏｉｄｅｓ）のポリペプチド、ヘモンクス属のポリペプチド、ラゴキラスカリス属（Ｌａｇｏｃｈｉｌａｓｃａｒｉｓ）のポリペプチド、ロア糸状虫属（Ｌｏａ）のポリペプチド、マンソネラ属のポリペプチド、ムエレリウス属（Ｍｕｅｌｌｅｒｉｕｓ）のポリペプチド、ナノフィエツス属（Ｎａｎｏｐｈｙｅｔｕｓ）のポリペプチド、アメリカ鉤虫属のポリペプチド、ネマトジルス属のポリペプチド、腸結節虫属のポリペプチド、オンコセルカ属のポリペプチド、オピストルキス属のポリペプチド、オステルタギア属のポリペプチド、パラフィラリア属（Ｐａｒａｆｉｌａｒｉａ）のポリペプチド、肺吸虫属のポリペプチド、パラスカリス属（Ｐａｒａｓｃａｒｉｓ）のポリペプチド、フィサロプテラ属のポリペプチド、プロトストロンギルス属（Ｐｒｏｔｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）のポリペプチド、セタリア属のポリペプチド、スピロセルカ属（Ｓｐｉｒｏｃｅｒｃａ）のポリペプチド スピロメトラ属のポリペプチド、ステファノフィラリア属のポリペプチド、ストロンギロイデス属のポリペプチド、ストロンギルス属のポリペプチド、テラジア属のポリペプチド、トキサスカリス属のポリペプチド、トキソカラ属のポリペプチド、旋毛虫属のポリペプチド、毛様線虫属のポリペプチド、鞭虫属のポリペプチド、ウンシナリア属のポリペプチドおよびウケレリア属のポリペプチド（例えば、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのスポロゾイト周囲ポリペプチド（ＰｆＣＳＰ））、スポロゾイト表面タンパク質２（ＰｆＳＳＰ２）、肝臓状態抗原（ｌｉｖｅｒ ｓｔａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）１のカルボキシル末端（ＰｆＬＳＡ１ ｃ末端）、ならびに搬出タンパク質１（ＰｆＥｘｐ－１）、ニューモシスチス属のポリペプチド、サルコシスティス属のポリペプチド、住血吸虫属のポリペプチド、タイレリア属のポリペプチド、トキソプラズマ属のポリペプチド、ならびにトリパノソーマ属のポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。

外寄生生物抗原の例としては、ノミ；カタダニおよびヒメダニを含むマダニ；ハエ、例えば、小虫、蚊、スナバエ、ブユ、ウマバエ、ノサシバエ、メクラアブ、ツェツェバエ、サシバエ、ハエ幼虫症の原因となるハエおよび刺して血を吸う小さな羽虫（ｂｉｔｉｎｇ ｇｎａｔｓ）；アリ；クモ、シラミ；ダニ；ならびに半翅類の昆虫、例えば、トコジラミおよびサシガメのポリペプチド（抗原ならびにアレルゲンを含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
Ｅ．自殺遺伝子

いくつかの実施形態において、上記細胞は、１つ以上の自殺遺伝子を発現する核酸を含む。上記細胞は、凍結保存および解凍の前または後に、自殺遺伝子を発現するように操作され得る。本開示の例示的な免疫細胞のＣＡＲは、１つ以上の自殺遺伝子を含み得る。本明細書中で使用される用語「自殺遺伝子」は、プロドラッグが投与された際に、遺伝子産物が、宿主細胞を殺滅する化合物に変化する遺伝子と定義される。使用され得る自殺遺伝子／プロドラッグの組み合わせの例は、単純ヘルペスウイルス－チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）と、ガンシクロビル、アシクロビルまたはＦＩＡＵ；オキシドレダクターゼとシクロヘキシミド；シトシンデアミナーゼと５－フルオロシトシン；チミジンキナーゼチミジル酸キナーゼ（Ｔｄｋ：：Ｔｍｋ）とＡＺＴ；およびデオキシシチジンキナーゼとシトシンアラビノシドである。

プロドラッグである６－メチルプリンデオキシリボシドを毒性のプリンである６－メチルプリンに変換するいわゆる自殺遺伝子であるＥ．ｃｏｌｉのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ。プロドラッグ治療とともに用いられる自殺遺伝子の他の例は、Ｅ．ｃｏｌｉのシトシンデアミナーゼ遺伝子およびＨＳＶチミジンキナーゼ遺伝子である。

例示的な自殺遺伝子としては、ＣＤ２０、変異ＴＮＦ－アルファ（例えば、分泌できない変異体）、ＣＤ５２、ＥＧＦＲｖ３または誘導性カスパーゼ９が挙げられる。１つの実施形態では、切断バージョンのＥＧＦＲバリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖ３）が、セツキシマブによって切断され得る自殺抗原として使用され得る。本開示において使用され得る当該分野で公知のさらなる自殺遺伝子としては、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、シトクロムｐ４５０酵素（ＣＹＰ）、カルボキシペプチダーゼ（ＣＰ）、カルボキシルエステラーゼ（ＣＥ）、ニトロ還元酵素（ＮＴＲ）、グアニンリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＲＴＰ）、グリコシダーゼ酵素、メチオニン－α，γ－リアーゼ（ＭＥＴ）およびチミジンホスホリラーゼ（ＴＰ）が挙げられる。
Ｆ．送達方法

本明細書中に包含される細胞は、凍結保存後の解凍の前または後に、組換えベクターを有することがある。当業者であれば、本開示の抗原レセプターを発現させるために標準的な組換え手法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６（両方が参照により本明細書中に援用される）を参照のこと）によってベクターを構築する能力を充分に備えているだろう。ベクターとしては、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルスおよび植物ウイルス）および人工染色体（例えば、ＹＡＣ）、例えば、レトロウイルスベクター（例えば、モロニーマウス白血病ウイルスベクター（ＭｏＭＬＶ）、ＭＳＣＶ、ＳＦＦＶ、ＭＰＳＶ、ＳＮＶなどに由来するもの）、レンチウイルスベクター（例えば、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＢＩＶ、ＦＩＶなどに由来するもの）、アデノウイルス（Ａｄ）ベクター（その複製可能型、複製欠損型およびガットレス型（ｇｕｔｌｅｓｓ ｆｏｒｍｓ）を含む）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、サルウイルス４０（ＳＶ－４０）ベクター、ウシパピローマウイルスベクター、エプスタイン・バーウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ハーベイマウス肉腫ウイルスベクター、マウス乳癌ウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルスベクター、パルボウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、水疱性口内炎ウイルスベクター、マラバウイルス（ｍａｒａｂａ ｖｉｒｕｓ）ベクターおよびＢ群アデノウイルスｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖベクターが挙げられるがこれらに限定されない。
ａ．ウイルスベクター

抗原レセプターをコードするウイルスベクターが、本開示のある特定の態様において提供され得る。組換えウイルスベクターを作製する際、必須ではない遺伝子は、通常、異種（または非天然）タンパク質の遺伝子またはコード配列で置き換えられる。ウイルスベクターは、ウイルス配列を利用して核酸および場合によってはタンパク質を細胞に導入する一種の発現構築物である。ある特定のウイルスが細胞に感染する能力またはレセプター媒介性のエンドサイトーシスを介して細胞に侵入する能力、および宿主細胞のゲノムにインテグレートし、ウイルス遺伝子を安定かつ効率的に発現する能力によって、それらのウイルスが、外来核酸を細胞（例えば、哺乳動物細胞）に移行させるための魅力的な候補になった。本発明のある特定の態様の核酸を送達するために使用され得るウイルスベクターの非限定的な例を下記に記載する。

レンチウイルスは、複雑なレトロウイルスであり、一般的なレトロウイルス遺伝子であるｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖに加えて、調節機能または構造機能を有する他の遺伝子も含む。レンチウイルスベクターは、当該分野で周知である（例えば、米国特許第６，０１３，５１６号および同第５，９９４，１３６号を参照のこと）。

組換えレンチウイルスベクターは、非分裂細胞に感染することができ、インビボとエキソビボの両方において遺伝子導入および核酸配列発現のために使用され得る。例えば、非分裂細胞に感染することができる組換えレンチウイルス（ここで、好適な宿主細胞が、パッケージング機能を有する２つ以上のベクター、すなわちｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ、ならびにｒｅｖおよびｔａｔでトランスフェクトされる）は、参照により本明細書中に援用される米国特許第５，９９４，１３６号に記載されている。
ｂ．調節エレメント

本開示において有用なベクターに含められる発現カセットは、特に、タンパク質コード配列に作動可能に連結された真核生物転写プロモーター、介在配列を含むスプライスシグナル、および転写終結／ポリアデニル化配列を（５’から３’の方向で）含む。タンパク質をコードする遺伝子の転写を真核細胞において制御するプロモーターおよびエンハンサーは、複数の遺伝的エレメントから構成される。細胞機構は、各エレメントによって運ばれる調節情報を集め、統合することができ、それにより、異なる遺伝子が、多くの場合は複雑なパターンである異なるパターンの転写制御を展開することが可能になる。本開示の状況において使用されるプロモーターとしては、構成的プロモーター、誘導性プロモーターおよび組織特異的プロモーターが挙げられる。
ｃ．プロモーター／エンハンサー

本明細書中に提供される発現構築物は、抗原レセプターの発現を駆動するプロモーターを含む。プロモーターは、一般に、ＲＮＡ合成のための開始部位の位置を特定するように機能する配列を含む。これの最もよく知られている例は、ＴＡＴＡボックスであるが、哺乳動物のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターおよびＳＶ４０後期遺伝子のプロモーターなど、一部のプロモーターでは、ＴＡＴＡボックスを欠き、開始部位自体と重なっている不連続なエレメントが、開始の場所を固定するのを助ける。さらなるプロモーターエレメントが、転写開始の頻度を制御する。通常、これらは、開始部位の３０１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、いくつかのプロモーターは、開始部位の下流にも機能的エレメントを含むと示されている。コード配列をプロモーター「の支配下に」するためには、転写読み枠の転写開始部位の５’末端を、選択されたプロモーターの「下流」（すなわち、３’）に置く。「上流」のプロモーターは、ＤＮＡの転写を刺激し、コードされるＲＮＡの発現を促進する。

プロモーターエレメント間の間隔は、変更がきくことが多く、エレメントが、反転されるかまたは互いに対して移動された場合でも、プロモーターの機能は保存される。ｔｋプロモーターでは、プロモーターエレメント間の間隔は、活性が低下し始めるまで最大５０ｂｐ広げられ得る。プロモーターに応じて、個々のエレメントは、協同的にまたは独自に機能して転写を活性化し得るとみられる。プロモーターは、核酸配列の転写性の活性化に関わるシス作用性制御配列のことを指す「エンハンサー」と併せて使用されてもよいし、使用されなくてもよい。

プロモーターは、コードセグメントおよび／またはエキソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって得られることがあるように、ある核酸配列と天然に会合したプロモーターであり得る。そのようなプロモーターは、「内在性」プロモーターと呼ぶことができる。同様に、エンハンサーは、ある核酸配列の下流または上流に位置する、その配列と天然に会合したエンハンサーであり得る。あるいは、ある核酸配列とその天然の環境では天然には会合していないプロモーターのことを指す、組換えプロモーターまたは異種プロモーターの支配下にコード核酸セグメントを置くことによって、一定の利点が得られる。また、組換えエンハンサーまたは異種エンハンサーは、その天然の環境では核酸配列と天然には会合していないエンハンサーのことを指す。そのようなプロモーターまたはエンハンサーには、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、ならびに他の任意のウイルスまたは原核細胞もしくは真核細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー、ならびに「天然に存在」しない、すなわち、種々の転写制御領域の種々のエレメントおよび／または発現を変化させる変異を含む、プロモーターまたはエンハンサーが含まれ得る。例えば、組換えＤＮＡの構築において最もよく使用されるプロモーターとしては、βラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースおよびトリプトファン（ｔｒｐ－）プロモーターシステムが挙げられる。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成的に作製することに加えて、組換えクローニング、および／またはＰＣＲ^ＴＭをはじめとした核酸増幅技術を用いて、ある配列が、本明細書中に開示される組成物に関連して作製され得る。さらに、核以外のオルガネラ（例えば、ミトコンドリア、葉緑体など）内での配列の転写および／または発現を指示する調節配列も同様に使用できることが企図される。

当然、発現のために選択されたオルガネラ、細胞型、組織、器官または生物におけるＤＮＡセグメントの発現を効果的に指示するプロモーターおよび／またはエンハンサーを使用することが重要になる。分子生物学の当業者は、一般に、タンパク質発現のために、プロモーター、エンハンサーおよび細胞型の組み合わせを使用することを承知している（例えば、参照により本明細書中に援用されるＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．１９８９を参照のこと）。使用されるプロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、および／または導入されたＤＮＡセグメントの高レベル発現を指示する、適切な条件下において有用なプロモーター（例えば、組換えタンパク質および／または組換えペプチドの大規模生成において有益なプロモーター）であり得る。そのプロモーターは、異種であっても、内在性であってもよい。

さらに、任意のプロモーター／エンハンサーの組み合わせ（例えば、ｅｐｄ．ｉｓｂ－ｓｉｂ．ｃｈ／のワールドワイドウェブを介したＥｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｄａｔａ Ｂａｓｅ ＥＰＤＢに従って）も、発現を駆動するために使用され得る。Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６細胞質発現系の使用が、別の実行可能な実施形態である。適切な細菌ポリメラーゼが、送達複合体の一部としてまたはさらなる遺伝的発現構築物として提供される場合、真核細胞は、ある特定の細菌プロモーターからの細胞質での転写を支持し得る。

プロモーターの非限定的な例としては、初期ウイルスプロモーターまたは後期ウイルスプロモーター（例えば、ＳＶ４０初期または後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）初期プロモーター）；真核細胞プロモーター（例えば、ベータアクチンプロモーター、ＧＡＤＰＨプロモーター、メタロチオネインプロモーター）；および連鎖状応答エレメントプロモーター（例えば、サイクリックＡＭＰ応答エレメントプロモーター（ｃｒｅ）、血清応答エレメントプロモーター（ｓｒｅ）、ホルボールエステルプロモーター（ＴＰＡ）およびミニマルＴＡＴＡボックス近傍の応答エレメントプロモーター（ｔｒｅ））が挙げられる。ヒト成長ホルモンプロモーター配列（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋに記載されているヒト成長ホルモンミニマルプロモーター、アクセッション番号Ｘ０５２４４、ヌクレオチド２８３～３４１）またはマウス乳腺腫瘍プロモーター（ＡＴＣＣから入手可能，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＴＣＣ４５００７）を使用することも可能である。ある特定の実施形態において、プロモーターは、ＣＭＶ ＩＥ、デクチン－１、デクチン－２、ヒトＣＤ１１ｃ、Ｆ４／８０、ＳＭ２２、ＲＳＶ、ＳＶ４０、Ａｄ ＭＬＰ、ベータ－アクチン、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩプロモーターであるが、しかしながら、治療用の遺伝子の発現を駆動するために有用な他の任意のプロモーターも本開示の実施に適用できる。

ある特定の態様において、本開示の方法は、エンハンサー配列、すなわち、プロモーターの活性を増加させる核酸配列であって、シスで、かつその向きを問わず、比較的長い距離（標的プロモーターから最大数キロベース離れた距離）にわたって作用する能力を有する核酸配列にも関する。しかしながら、エンハンサーは、所与のプロモーターに対して近位でも機能し得るので、エンハンサーの機能は必ずしもそのような長い距離に限定されない。
ｄ．開始シグナルおよび連結発現

コード配列の効率的な翻訳のために、本開示に提供される発現構築物において、特定の開始シグナルも使用され得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンまたは隣接配列を含む。外来性の翻訳制御シグナル（ＡＴＧ開始コドンを含む）が提供される必要がある場合がある。当業者であれば、これを判断することおよび必要なシグナルを提供することが容易にできるだろう。インサート全体の翻訳を確保するためには、開始コドンが、所望のコード配列の読み枠と「インフレーム」でなければならないことは周知である。その外来性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然のものまたは合成のものであり得る。適切な転写エンハンサーエレメントを含めることによって、発現効率が高められ得る。

ある特定の実施形態において、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントの使用は、多重遺伝子のメッセージ、すなわちポリシストロニックなメッセージを生成するために使用される。ＩＲＥＳエレメントは、５’メチル化キャップ依存的翻訳のリボソームスキャニングモデルを迂回し、内部の部位において翻訳を開始することができる。ピコルナウイルス科の２つのメンバー（ポリオおよび脳心筋炎）由来のＩＲＥＳエレメント、ならびに哺乳動物のメッセージ由来のＩＲＥＳが、報告されている。ＩＲＥＳエレメントは、異種のオープンリーディングフレームに連結できる。各々がＩＲＥＳによって隔てられた複数のオープンリーディングフレームを一緒に転写することができ、ポリシストロニックなメッセージを生成できる。ＩＲＥＳエレメントのおかげで、各オープンリーディングフレームが、効率的な翻訳のためにリボソームに接近できるようになる。単一のプロモーター／エンハンサーを用いて複数の遺伝子を効率的に発現して、単一のメッセージを転写することもできる。

さらに、本開示に提供される構築物内の遺伝子の連結発現または同時発現をもたらすために、ある特定の２Ａ配列エレメントが使用され得る。例えば、オープンリーディングフレームを連結して単一のシストロンを形成することによって遺伝子を同時発現するために、切断配列が使用され得る。例示的な切断配列は、Ｆ２Ａ（口蹄疫ウイルス２Ａ）または「２Ａ様」配列（例えば、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス２Ａ；Ｔ２Ａ）である。
ｅ．複製開始点
宿主細胞においてベクターを増殖させるために、そのベクターは、１つ以上の複製開始部位（「ｏｒｉ」と呼ばれることが多い）、例えば、複製が開始される特異的な核酸配列である、上に記載されたようなＥＢＶのｏｒｉＰまたはプログラミングにおける機能が似ているかもしくは高められた遺伝的に操作されたｏｒｉＰに対応する核酸配列を含み得る。あるいは、上に記載されたような染色体外で複製する他のウイルスの複製起点、または自律複製配列（ＡＲＳ）を使用することができる。
ｆ．選択マーカーおよびスクリーニング可能なマーカー

いくつかの実施形態において、本開示の構築物を含む細胞は、マーカーを発現ベクターに含めることによって、インビトロまたはインビボにおいて特定され得る。そのようなマーカーは、発現ベクターを含む細胞を容易に特定できるようにする特定可能な変化を細胞にもたらす。一般に、選択マーカーは、選択を可能にする特性を付与するマーカーである。ポジティブ選択マーカーは、そのマーカーが存在することによってその選択が可能になるマーカーであり、ネガティブ選択マーカーは、その存在が選択を妨げるマーカーである。ポジティブ選択マーカーの例は、薬物耐性マーカーである。

通常、薬物選択マーカーを含めることにより、形質転換体のクローニングおよび特定が助けられ、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチジノールに対して耐性にする遺伝子が、有用な選択マーカーである。条件の実行に基づいて形質転換体の判別を可能にする表現型を付与するマーカーに加えて、比色解析を基礎とする、ＧＦＰなどのスクリーニング可能なマーカーをはじめとした他のタイプのマーカーも企図される。あるいは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などの、ネガティブ選択マーカーとしてスクリーニング可能な酵素が利用され得る。当業者であれば、免疫学的マーカーをおそらくはＦＡＣＳ解析と併せて使用する方法も承知しているだろう。使用されるマーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現されることが可能である限り、重要ではないと考えられている。選択マーカーおよびスクリーニング可能なマーカーのさらなる例は、当業者に周知である。
ｇ．他の核酸送達方法

抗原レセプターをコードする核酸のウイルス送達に加えて、以下の方法が、所与の宿主細胞への組換え遺伝子送達のさらなる方法であるので、本開示において検討される。

本開示の免疫細胞へのＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸の導入は、本明細書中に記載されるようにまたは当業者に公知であるように、細胞を形質転換するための核酸送達に適した任意の方法を使用し得る。そのような方法としては、ＤＮＡの直接送達（例えば、エキソビボトランスフェクション、注射（マイクロインジェクションを含む））；エレクトロポレーション；リン酸カルシウム沈殿；ＤＥＡＥ－デキストランに続くポリエチレングリコールの使用；直接的な音波負荷；リポソーム媒介性のトランスフェクションおよびレセプター媒介性のトランスフェクション；微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）；炭化ケイ素繊維を伴った撹拌；アグロバクテリウム媒介性の形質転換；乾燥／阻害媒介性のＤＮＡ取り込み、およびそのような方法の任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。これらの手法などの手法の適用により、オルガネラ、細胞、組織または生物が安定にまたは一過性に形質転換され得る。
Ｇ．遺伝子発現の改変

いくつかの実施形態において、凍結保存される本開示の免疫細胞は、ある特定の遺伝子（例えば、糖質コルチコイドレセプター、ＴＧＦβレセプター（例えば、ＴＧＦβ－ＲＩＩ）および／またはＣＩＳＨ）の発現が変化するように改変される。１つの実施形態において、免疫細胞は、内在性ＴＧＦβを枯渇させるサイトカインシンクとして機能し得るドミナントネガティブＴＧＦβレセプターＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩＤＮ）を発現するように改変され得る。

サイトカインシグナル伝達は、造血細胞の正常な機能にとって不可欠である。ＳＯＣＳファミリーのタンパク質は、サイトカインシグナル伝達の負の制御において重要な役割を果たし、内因性のブレーキとして作用する。ＣＩＳＨ遺伝子によってコードされるタンパク質のＳＯＣＳファミリーのメンバーであるＣＩＳは、マウスのＮＫ細胞における重要なチェックポイント分子として特定された。したがって、いくつかの実施形態において、本開示は、例えばＮＫ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の細胞傷害性を改善するための、免疫細胞におけるＣＩＳＨのノックアウトに関する。このアプローチは、単独で用いられてもよいし、抗腫瘍活性を改善する他のチェックポイント阻害剤と組み合わせて用いられてもよい。

いくつかの実施形態において、遺伝子発現の変更は、その遺伝子を破壊すること（例えば、ノックアウト、挿入、ミスセンス変異またはフレームシフト変異、例えば、両アレルフレームシフト変異、その遺伝子の全部または一部の欠失、例えば、１つ以上のエキソンもしくはゆえに一部分の欠失、および／またはノックイン）によって行われる。例えば、遺伝子発現の変更は、遺伝子またはその一部の配列に標的化されるように特異的にデザインされた、配列特異的ヌクレアーゼまたは標的化ヌクレアーゼによってもたらされ得、これらのヌクレアーゼとしては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などのＤＮＡ結合標的化ヌクレアーゼならびにＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（Ｃａｓ）などのＲＮＡガイドヌクレアーゼが挙げられる。

いくつかの実施形態において、遺伝子の発現、活性および／または機能の変更は、その遺伝子を破壊することによって行われる。いくつかの態様において、遺伝子は、その発現が、遺伝子改変が無い場合の発現または改変をもたらす構成要素の導入が無い場合の発現と比べて、少なくとも２０、３０もしくは４０％または約２０、３０もしくは４０％、通常、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０もしくは９５％または約５０、６０、７０、８０、９０もしくは９５％低下するように改変される。

いくつかの実施形態において、上記変更は、一過性または可逆的であり、その遺伝子の発現は、後になって回復される。他の実施形態において、上記変更は、可逆的または一過性ではなく、例えば、永続的である。

いくつかの実施形態において、遺伝子の変更は、通常は標的化された様式で、その遺伝子において１つ以上の二本鎖切断および／または１つ以上の一本鎖切断を誘導することによって行われる。いくつかの実施形態において、二本鎖または一本鎖の切断は、ヌクレアーゼ、例えば、遺伝子標的化ヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼによって行われる。いくつかの態様において、切断は、遺伝子のコード領域、例えば、エキソンにおいて誘導される。例えば、いくつかの実施形態において、その誘導は、コード領域、例えば、第１のエキソン、第２のエキソンまたはそれ以降のエキソンのＮ末端部分付近において生じる。

いくつかの態様において、二本鎖または一本鎖の切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（ＨＤＲ）などによる細胞の修復プロセスを介した修復を受ける。いくつかの態様において、この修復プロセスは、エラーが発生しやすく、遺伝子の完全なノックアウトをもたらし得る遺伝子の破壊、例えば、フレームシフト変異、例えば、両アレルのフレームシフト変異をもたらす。例えば、いくつかの態様において、破壊は、欠失、変異および／または挿入を誘導することを含む。いくつかの実施形態では、破壊によって、停止コドンが早期に存在するようになる。いくつかの態様において、挿入、欠失、転座、フレームシフト変異および／または中途での停止コドンが存在することにより、遺伝子の発現、活性および／または機能が妨害される。

いくつかの実施形態において、遺伝子の変更は、アンチセンス法（例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピン（ｓｈＲＮＡ）および／またはリボザイム）を用いて達成され、それらを用いることにより、遺伝子の発現が選択的に抑制または阻止される。ｓｉＲＮＡ技術は、遺伝子から転写されるｍＲＮＡのヌクレオチド配列と相同な配列およびそのヌクレオチド配列と相補的な配列を有する二本鎖ＲＮＡ分子を使用するＲＮＡｉである。ｓｉＲＮＡは、一般に、遺伝子から転写されるｍＲＮＡの１つの領域と相同／相補的であるか、または種々の領域と相同／相補的である複数のＲＮＡ分子を含むｓｉＲＮＡであり得る。いくつかの態様において、ｓｉＲＮＡは、ポリシストロニック構築物に含められる。
１．ＺＦＰおよびＺＦＮ

いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化分子には、エンドヌクレアーゼなどのエフェクタータンパク質に融合された、１つ以上のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）または転写活性化因子様タンパク質（ＴＡＬ）などのＤＮＡ結合タンパク質が含まれる。例としては、ＺＦＮ、ＴＡＬＥおよびＴＡＬＥＮが挙げられる。

いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化分子には、配列特異的様式でＤＮＡに結合する１つ以上のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）またはそのドメインが含まれる。ＺＦＰまたはそのドメインは、１つ以上のジンクフィンガー（亜鉛イオンの配位によって構造が安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である）を介して配列特異的様式でＤＮＡに結合する、タンパク質または大きなタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと省略されることが多い。ＺＦＰには、通常９～１８ヌクレオチド長の特定のＤＮＡ配列を標的化する人工ＺＦＰドメインが含まれ、このドメインは、個々のフィンガーのアセンブリによって生成される。

ＺＦＰには、１つのフィンガードメインが、およそ３０アミノ酸長であって、亜鉛を介して１つのベータターンの２つのシステインと配位する２つのインバリアントなヒスチジン残基を含む、アルファヘリックスを含むＺＦＰが含まれ、ＺＦＰは、２、３、４、５または６つのフィンガーを有する。一般に、ＺＦＰの配列特異性は、ジンクフィンガー認識ヘリックス上の４つのヘリックス位置（－１、２、３および６）においてアミノ酸置換を行うことによって変更することができる。したがって、いくつかの実施形態において、ＺＦＰまたはＺＦＰ含有分子は、天然に存在せず、例えば、最適な標的部位に結合するように操作される。

いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化分子は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインがＤＮＡ切断ドメインに融合されてジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を形成するものであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、少なくとも１つのＴｙｐｅ ｌｉＳ制限酵素由来の切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）および１つ以上のジンクフィンガー結合ドメイン（操作されていてもよいし、操作されていなくてもよい）を含む。いくつかの実施形態において、切断ドメインは、Ｔｙｐｅ ｌｉＳ制限エンドヌクレアーゼＦｏｋ Ｉに由来する。Ｆｏｋ Ｉは、一般に、一方の鎖におけるその認識部位から９ヌクレオチドおよび他方の鎖におけるその認識部位から１３ヌクレオチドにおいてＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。

操作された多くの遺伝子特異的ジンクフィンガーが、商業的に入手可能である。例えば、Ｓａｎｇａｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）は、研究者がジンクフィンガーの構築および検証を完全に回避できるようにする、ジンクフィンガー構築のためのプラットフォーム（ＣｏｍｐｏＺｒ）をＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）と協力して開発し、数千のタンパク質に対して特異的に標的化されたジンクフィンガーを提供している（Ｇａｊ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３１（７），３９７－４０５）。いくつかの実施形態では、商業的に入手可能なジンクフィンガーを使用するかまたはカスタムデザインする。（例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号ＣＳＴＺＦＮＤ、ＣＳＴＺＦＮ、ＣＴｉｌ－ｌＫＴおよびＰＺＤ００２０を参照のこと）。
２．ＴＡＬ、ＴＡＬＥおよびＴＡＬＥＮ

いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化分子は、転写活性化因子様タンパク質エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質などにおける、天然に存在するまたは操作された（天然に存在しない）転写活性化因子様タンパク質（ＴＡＬ）ＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、米国特許出願公開第２０１１／０３０１０７３号（その全体が本明細書中で参照により援用される）を参照のこと。

ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインまたはＴＡＬＥは、１つ以上のＴＡＬＥリピートドメイン／単位を含むポリペプチドである。それらのリピートドメインは、ＴＡＬＥがその同族の標的ＤＮＡ配列に結合することに関与する。単一の「リピート単位」（「リピート」とも称される）は、通常、３３～３５アミノ酸長であり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥリピート配列に対して少なくともいくらかの配列相同性を示す。各ＴＡＬＥリピート単位は、通常そのリピートの１２および／または１３位に、Ｒｅｐｅａｔ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ（ＲＶＤ）を構成する１または２つのＤＮＡ結合残基を含む。これらのＴＡＬＥのＤＮＡ認識のための天然の（カノニカルな）コードは、決定されており、１２および１３位のＨＤ配列がシトシン（Ｃ）への結合をもたらし、ＮＧがＴに結合し、ＮＩがＡに結合し、ＮＮがＧまたはＡに結合し、ＮＯがＴに結合し、非カノニカル（非定型）ＲＶＤも公知である。いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥは、標的ＤＮＡ配列に対する特異性を有するＴＡＬアレイのデザインによって、任意の遺伝子に標的化され得る。標的配列は、一般にチミジンから始まる。

いくつかの実施形態において、上記分子は、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などのＤＮＡ結合エンドヌクレアーゼである。いくつかの態様において、ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬＥに由来するＤＮＡ結合ドメイン、および核酸標的配列を切断するヌクレアーゼ触媒ドメインを含む融合タンパク質である。

いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥＮは、遺伝子内の標的配列を認識し、切断する。いくつかの態様において、ＤＮＡの切断は、二本鎖切断をもたらす。いくつかの態様において、その切断は、相同組換えまたは非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の比率を押し上げる。一般に、ＮＨＥＪは、切断部位のＤＮＡ配列に変更をもたらすことが多い不完全な修復プロセスである。いくつかの態様において、修復機構は、直接の再ライゲーションまたはいわゆるマイクロホモロジー媒介末端結合を介して２つのＤＮＡ末端の残りの部分を再結合することを含む。いくつかの実施形態において、ＮＨＥＪを介した修復は、小さな挿入または欠失をもたらすため、それを用いることで遺伝子を破壊し、それによって遺伝子を抑制することができる。いくつかの実施形態において、改変は、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、欠失または付加であり得る。いくつかの態様において、切断によって誘導される突然変異誘発事象、すなわち、ＮＨＥＪ事象に続く突然変異誘発事象が起きた細胞は、当該分野において周知の方法によって特定および／または選択され得る。

いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥリピートは、遺伝子を特異的に標的化するようにアセンブルされる（Ｇａｊ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。１８，７４０種のヒトタンパク質をコードする遺伝子を標的化するＴＡＬＥＮのライブラリーが構築された（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。カスタムデザインされたＴＡＬＥアレイは、Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）、Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＫＹ，ＵＳＡ）およびＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）を通じて商業的に入手可能である。詳細には、ＣＤ３８を標的化するＴＡＬＥＮが、商業的に入手可能である（Ｇｅｎｃｏｐｏｅｉａ，カタログ番号ＨＴＮ２２２８７０－ｌ、ＨＴＮ２２２８７０－２およびＨＴＮ２２２８７０－３を参照のこと）。例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１２０６２２号および同第２０１３／０３１５８８４号に、例示的な分子が記載されている。

いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥＮは、１つ以上のプラスミドベクターによってコードされるトランス遺伝子として導入される。いくつかの態様において、そのプラスミドベクターは、前記ベクターを受け取った細胞の特定および／または選択をもたらす選択マーカーを含み得る。
３．ＲＧＥＮ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）

いくつかの実施形態において、上記変更は、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）を介した変更など、１つ以上のＤＮＡ結合核酸を用いて行われる。例えば、上記変更は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）およびＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質を用いて行われ得る。一般に、「ＣＲＩＳＰＲシステム」とは、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子（Ｃａｓ遺伝子をコードする配列を含む）、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性な部分的ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイト配列（内在性のＣＲＩＳＰＲシステムの文脈では「直列反復配列」、およびｔｒａｃｒＲＮＡによってプロセシングされた部分的な直列反復配列を包含する）、ガイド配列（内在性のＣＲＩＳＰＲシステムの文脈では「スペーサー」とも称される）、ならびに／またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座由来の他の配列および転写物の発現に関与するかまたはその活性を指示する転写物および他のエレメントのことを総称する。

ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムは、ＤＮＡに配列特異的に結合する非コードＲＮＡ分子（ガイド）ＲＮＡ、およびヌクレアーゼ機能（例えば、２つのヌクレアーゼドメイン）を有するＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）を含み得る。ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上のエレメントが、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムに由来し得、例えば、内在性のＣＲＩＳＰＲシステムを含む特定の生物（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来し得る。

いくつかの態様において、ＣａｓヌクレアーゼおよびｇＲＮＡ（標的配列に特異的なｃｒＲＮＡと既定のｔｒａｃｒＲＮＡとの融合物を含む）が、細胞に導入される。一般に、ｇＲＮＡの５’末端における標的部位が、相補的な塩基対形成によって、Ｃａｓヌクレアーゼをその標的部位、例えば、遺伝子に標的化する。標的部位は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列（例えば、通常、ＮＧＧまたはＮＡＧ）のすぐ５’の位置に基づいて選択され得る。この点において、ｇＲＮＡは、標的ＤＮＡ配列に対応するようにガイドＲＮＡの最初の２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１４、１２、１１または１０ヌクレオチドを改変することによって、所望の配列に標的化される。一般に、ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的配列の部位においてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントを特徴とする。通常、「標的配列」とは、一般に、ガイド配列が相補性を有するようにデザインされる配列のことを指し、標的配列とガイド配列とのハイブリダイゼーションが、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性があれば、完全な相補性は必ずしも必要ない。

ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的部位における二本鎖切断（ＤＳＢ）に続いて、本明細書中で論じられるような破壊または変更を誘導し得る。他の実施形態では、「ニッカーゼ」とみなされるＣａｓ９バリアントが、標的部位において一本鎖にニックを入れるために使用される。例えば特異性を改善するために、対のニッカーゼを使用することができ、そのニッカーゼの各々は、配列を標的化する異なるｇＲＮＡの対によって導かれ、ニックが同時に導入されると、５’オーバーハングが導入される。他の実施形態では、遺伝子発現に影響するように、触媒的に不活性なＣａｓ９が、転写抑制因子または転写活性化因子などの異種エフェクタードメインに融合される。

標的配列は、ＤＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡポリヌクレオチドなどの任意のポリヌクレオチドを含み得る。標的配列は、細胞のオルガネラ内など、細胞の核または細胞質に位置し得る。一般に、標的配列を含む標的化される遺伝子座への組換えのために使用され得る配列または鋳型は、「編集鋳型」または「編集ポリヌクレオチド」または「編集配列」と称される。いくつかの態様では、外来性の鋳型ポリヌクレオチドが、編集鋳型と称されることがある。いくつかの態様において、組換えは、相同組換えである。

通常、内在性のＣＲＩＳＰＲシステムの文脈では、ＣＲＩＳＰＲ複合体（標的配列にハイブリダイズして１つ以上のＣａｓタンパク質と複合体化するガイド配列を含む）の形成によって、標的配列においてまたは標的配列の近くで（例えば、標的配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０塩基対以内またはそれ以上以内において）一方または両方の鎖の切断が生じる。野生型ｔｒａｃｒ配列の全部もしくは一部（例えば、野生型ｔｒａｃｒ配列の約２０ヌクレオチド、約２６ヌクレオチド、約３２ヌクレオチド、約４５ヌクレオチド、約４８ヌクレオチド、約５４ヌクレオチド、約６３ヌクレオチド、約６７ヌクレオチド、約８５ヌクレオチドもしくはそれ以上または約２０ヌクレオチド超、約２６ヌクレオチド超、約３２ヌクレオチド超、約４５ヌクレオチド超、約４８ヌクレオチド超、約５４ヌクレオチド超、約６３ヌクレオチド超、約６７ヌクレオチド超、約８５ヌクレオチド超もしくはそれ以上）を含み得るかまたはそれらからなり得るｔｒａｃｒ配列も、ガイド配列に作動可能に連結されたｔｒａｃｒメイト配列の全部または一部へのｔｒａｃｒ配列の少なくとも一部に沿ったハイブリダイゼーションなどによって、ＣＲＩＳＰＲ複合体の一部を形成し得る。ｔｒａｃｒ配列は、ハイブリダイズしてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に参加する、ｔｒａｃｒメイト配列に対して十分な相補性（例えば、最適にアラインメントされたとき、ｔｒａｃｒメイト配列の長さに沿って少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の配列相補性）を有する。

ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上のエレメントの発現によって、１つ以上の標的部位においてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成が指示されるように、そのＣＲＩＳＰＲシステムのそれらのエレメントの発現を駆動する１つ以上のベクターが細胞に導入され得る。また、構成要素がタンパク質および／またはＲＮＡとして細胞に送達され得る。例えば、Ｃａｓ酵素、ｔｒａｃｒメイト配列に連結されたガイド配列、およびｔｒａｃｒ配列がそれぞれ、別個のベクター上の別個の調節エレメントに作動可能に連結され得る。あるいは、同じまたは異なる調節エレメントから発現されるエレメントの２つ以上が、単一ベクターにおいて組み合わされ得、１つ以上のさらなるベクターが、第１のベクターに含まれていないＣＲＩＳＰＲシステムの任意の構成要素を提供する。そのベクターは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列などの１つ以上の挿入部位（「クローニング部位」とも称される）を含み得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の挿入部位が、１つ以上のベクターの１つ以上の配列エレメントの上流および／または下流に配置される。複数の異なるガイド配列が使用されるとき、細胞内の異なる複数の対応する標的配列に対してＣＲＩＳＰＲ活性を標的化するために単一の発現構築物が使用され得る。

ベクターは、Ｃａｓタンパク質などのＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に連結された調節エレメントを含み得る。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらのホモログまたはそれらの改変バージョンが挙げられる。これらの酵素は公知であり；例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、アクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２としてＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースに見られ得る。

ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ由来のもの）であり得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列内および／または標的配列の相補鎖内などの標的配列の位置での一方または両方の鎖の切断を指示し得る。ベクターは、対応する野生型酵素と比べて変異したＣＲＩＳＰＲ酵素をコードし得、変異したＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を切断する能力を欠く。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメインにおけるアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）は、Ｃａｓ９を、両方の鎖を切断するヌクレアーゼからニッカーゼ（一本鎖を切断する）に変換する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ガイド配列、例えば、そのＤＮＡ標的のセンス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれ標的化する２つのガイド配列と組み合わせて使用され得る。この組み合わせは、両方の鎖にニックを入れること、およびＮＨＥＪまたはＨＤＲを誘導するために使用されることができる。

いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列は、真核細胞などの特定の細胞における発現に向けてコドンが最適化される。真核細胞は、特定の生物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ヒツジまたは非ヒト霊長類を含むがこれらに限定されない哺乳動物）の細胞またはそれらの生物に由来する細胞であり得る。一般に、コドンの最適化とは、天然のアミノ酸配列を維持しつつ、天然の配列の少なくとも１つのコドンをその宿主細胞の遺伝子においてより高頻度にまたは最も高頻度に使用されるコドンで置き換えることによって、目的の宿主細胞において発現が高まるように核酸配列を改変するプロセスのことを指す。様々な種が、特定のアミノ酸のある特定のコドンについて特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間でのコドン使用頻度の差異）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関することが多く、その翻訳効率は、とりわけ、翻訳されるコドンの特性および特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている。選択されるｔＲＮＡが細胞内で優勢であることは、通常、ペプチド合成において最も高頻度に使用されるコドンであることを反映する。したがって、コドン最適化に基づいて、遺伝子を所与の生物における最適な遺伝子発現に適応させることができる。

一般に、ガイド配列は、標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするのに十分およびその標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指示するのに十分な相補性をその標的配列に対して有する任意のポリヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態において、ガイド配列と対応する標的配列との相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを用いて最適にアラインメントしたとき、約５０％、約６０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７．５％、約９９％もしくはそれ以上、または約５０％超、約６０％超、約７５％超、約８０％超、約８５％超、約９０％超、約９５％超、約９７．５％超、約９９％超もしくはそれ以上である。

ＮＲ３ＣＳ（糖質コルチコイドレセプター）に対する例示的なｇＲＮＡ配列としては、Ｅｘ３ ＮＲ３Ｃ１ ｓＧ１ ５－ＴＧＣ ＴＧＴ ＴＧＡ ＧＧＡ ＧＣＴ ＧＧＡ－３（配列番号１）およびＥｘ３ ＮＲ３Ｃ１ ｓＧ２ ５－ＡＧＣ ＡＣＡ ＣＣＡ ＧＧＣ ＡＧＡ ＧＴＴ－３（配列番号２）が挙げられる。ＴＧＦ－ベータレセプター２に対する例示的なｇＲＮＡ配列としては、ＥＸ３ ＴＧＦＢＲ２ ｓＧ１ ５－ＣＧＧ ＣＴＧ ＡＧＧ ＡＧＣ ＧＧＡ ＡＧＡ－３（配列番号３）およびＥＸ３ ＴＧＦＢＲ２ ｓＧ２ ５－ＴＧＧ－ＡＧＧ－ＴＧＡ－ＧＣＡ－ＡＴＣ－ＣＣＣ－３（配列番号４）が挙げられる。Ｔ７プロモーター、標的配列および重複配列は、配列ＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ（配列番号５）＋標的配列＋ｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇａａａｔａｇｃ（配列番号６）を有し得る。

最適なアラインメントは、配列をアラインメントするための任意の好適なアルゴリズムを使用して決定され得る。そのアルゴリズムの非限定的な例としては、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍに基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎにおいて利用可能）およびＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔにおいて利用可能）が挙げられる。

ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上の異種タンパク質ドメインを含む融合タンパク質の一部であり得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素融合タンパク質は、任意のさらなるタンパク質配列、および必要に応じて任意の２つのドメインの間にリンカー配列を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素に融合され得るタンパク質ドメインの例としては、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、ならびに以下の活性：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性および核酸結合活性のうちの１つ以上を有するタンパク質ドメインが挙げられるがこれらに限定されない。エピトープタグの非限定的な例としては、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ－Ｇタグおよびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが挙げられる。レポーター遺伝子の例としては、グルタチオン－５－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ベータガラクトシダーゼ、ベータ－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自己蛍光タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ分子に結合するかまたは他の細胞分子（マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ－タグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合物、ＧＡＬ４Ａ ＤＮＡ結合ドメイン融合物および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合物を含むがこれらに限定されない）に結合するタンパク質またはタンパク質のフラグメントをコードする遺伝子配列に融合され得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素を含む融合タンパク質の一部を形成し得るさらなるドメインは、参照により本明細書中に援用される米国特許出願公開第２０１１００５９５０２号に記載されている。
ＩＶ．処置方法

いくつかの実施形態において、本開示は、有効量の本開示の凍結保存された細胞を解凍後に投与する工程を含む、免疫療法のための方法を提供する。１つの実施形態において、以前に凍結保存されていた細胞集団（例えば、免疫応答を誘発するＮＫ細胞集団）の移入によって、内科疾患または内科障害が処置される。解凍後の細胞は、個体にその細胞を投与する前に、凍結保存培地の実質的にすべてを除去するために洗浄されてもよいし、されなくてもよい。解凍後の細胞は、洗浄なしに希釈され、注入され得る。その細胞は、解凍したら実質的に直ちに個体に送達され得るか、あるいは送達前におよそ１～２４時間または１日もしくはそれ以上の遅れがあり得る（例えば、注入前に細胞を洗浄した場合など）。その送達は、任意の経路であってよく、処置されている病状に依存し得る。その送達は、局所的または全身性であり得る。送達される細胞の用量の注入体積に関して、注入体積は、ある用量の細胞を被験体がすでに投与されているか否かに依存する場合もあるし、そうでない場合もある。例えば、細胞の第１の用量は、その後の用量よりも体積が大きい場合もあるし、そうでない場合もある。複数の注入体積が、同じ体積であり得る。いくつかの実施形態において、細胞の注入体積は、１、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５もしくは３００ｍＬまたはそれ以上である。注入に向けて細胞が懸濁される液体は、任意の種類であってよい。具体的な実施形態において、その液体は、ＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ Ａまたは類似の溶液である。注入に向けて細胞が懸濁される液体は、例えば、ヒト血清アルブミンを含んでもよいし、そうでなくてもよい。アルブミンは、非血清代替物としても使用され得る凍結保護物質であるので、二重の効果を有する。それを必要とする個体に送達する前に、解凍した細胞を、１つ以上の特性（例えば、汚染による微生物の存在；生存能；細胞数など）について試験してもよい。具体的な実施形態において、注入用の細胞は、細胞自体のほかに１つ以上の他の治療薬を含む溶液に含められる。

本開示のある特定の実施形態において、凍結保存され、解凍された集団（例えば、免疫応答を誘発するＮＫ細胞集団）の移入によって、癌または感染症が処置される。個体の癌を処置するためまたは癌の進行を遅延させるための方法が本明細書中に提供され、その方法は、有効量の抗原特異的細胞療法を個体に投与する工程を含む。本方法は、免疫障害、固形癌、血液癌、ウイルス感染症の処置および再生医療に適用され得る。

本処置方法が有用な腫瘍には、任意の悪性細胞タイプ、例えば、固形腫瘍または血液腫瘍に見られる細胞タイプが含まれる。例示的な固形腫瘍としては、膵臓、結腸、盲腸、胃、脳、頭部、頸部、卵巣、腎臓、喉頭、肉腫、肺、膀胱、黒色腫、前立腺および乳房からなる群より選択される器官の腫瘍が挙げられ得るが、これらに限定されない。例示的な血液腫瘍としては、骨髄の腫瘍、ＴまたはＢ細胞悪性腫瘍、白血病、リンパ腫、芽腫、ミエローマなどが挙げられる。本明細書中に提供される方法を用いて処置され得る癌のさらなる例としては、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌および肺扁平上皮癌を含む）、腹膜癌、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）癌または胃（ｓｔｏｍａｃｈ）癌（消化器癌および消化管間質癌を含む）、膵癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、直腸結腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、様々なタイプの頭頸部癌、および黒色腫が挙げられるが、これらに限定されない。

癌は、具体的には以下の組織タイプの癌であり得るが、これらに限定されない：新生物、悪性；癌腫；癌腫、未分化；巨細胞および紡錘形細胞癌；小細胞癌；乳頭状癌；扁平上皮癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；毛母癌；移行上皮癌；乳頭状移行上皮癌；腺癌；ガストリノーマ、悪性；胆管癌；肝細胞癌；肝細胞癌・胆管癌の混合型；索状腺癌；腺様嚢胞癌；腺腫性ポリープ内腺癌；腺癌、家族性大腸ポリポーシス；固形癌；カルチノイド腫瘍、悪性；細気管支肺胞腺癌；乳頭状腺癌；嫌色素性癌；好酸性癌；好酸性腺癌；好塩基性癌；明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞腺癌；乳頭状・濾胞腺癌；非被包性硬化癌；副腎皮質癌；類内膜癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳垢腺癌；粘表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭状嚢腺癌；乳頭状漿液性嚢胞腺癌；粘液性嚢胞腺癌；粘液性腺癌；印環細胞癌；浸潤性導管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性癌；パジェット病、乳房；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；扁平上皮化生を伴う腺癌；胸腺腫、悪性；卵巣間質腫瘍、悪性；莢膜細胞腫、悪性；顆粒膜細胞腫、悪性；アンドロブラストーマ、悪性；セルトリ細胞癌；ライディッヒ細胞腫瘍、悪性；脂質細胞腫瘍、悪性；傍神経節腫、悪性；乳房外傍神経節腫、悪性；褐色細胞腫；グロムス血管肉腫；悪性黒色腫；無色素性黒色腫；表在拡大型黒色腫；悪性黒子黒色腫；末端黒子型黒色腫；結節性黒色腫；巨大色素性母斑内悪性黒色腫；類上皮細胞黒色腫；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質肉腫；混合腫瘍、悪性；ミュラー管混合腫瘍；腎芽腫；肝芽腫；癌肉腫；間葉腫、悪性；ブレンナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚腫；胎児性癌；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛癌；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管外皮腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍皮質骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨巨細胞腫瘍；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍、悪性；エナメル上皮歯牙肉腫；エナメル上皮腫、悪性；エナメル上皮線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；グリオーマ、悪性；上衣腫；アストロサイトーマ；原形質性アストロサイトーマ；細線維性アストロサイトーマ；星芽腫；膠芽腫；乏突起膠腫；希突起芽腫；原始神経外胚葉性；小脳肉腫；神経節神経芽腫；神経芽腫；網膜芽腫；嗅神経原腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキン；側肉芽腫；悪性リンパ腫、小リンパ球性；悪性リンパ腫、大細胞型、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞性；菌状息肉腫；他の特定の非ホジキンリンパ腫；Ｂ細胞リンパ腫；低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小非切れ込み型細胞ＮＨＬ；巨大病変（ｂｕｌｋｙ ｄｉｓｅａｓｅ）ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；悪性組織球増殖症；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞性白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄性肉腫；ヘアリー細胞白血病；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；および慢性骨髄芽球性白血病。

特定の実施形態は、白血病の処置方法に関する。白血病は、血液または骨髄の癌であり、血液細胞（通常は白血球細胞（白血球）であるが、赤血球細胞も関与し得る（赤白血病））の異常な増殖（分裂増殖による生成）を特徴とする。白血病は、血液腫瘍と呼ばれる広範な疾患群の一部である。白血病は、多種多様な疾患を網羅する広義語である。白血病は、急性および慢性の形態に臨床的におよび病理学的に分けられる。

本開示のある特定の実施形態において、免疫細胞は、それを必要とする個体（例えば、癌または感染症を有する個体）に送達される。次いで、それらの細胞は、その個体の免疫系を増強して、それぞれの癌細胞または病的細胞を攻撃する。いくつかの場合では、その個体に免疫細胞が１回以上提供される。個体に免疫細胞が２回以上提供される場合、投与間の時間は、その個体において伝播するのに十分な時間であるべきであり、具体的な実施形態では、投与間の時間は、ｌ、２、３、４、５、６、７日間またはそれ以上である。

本開示のある特定の実施形態は、免疫媒介性障害を処置または予防するための方法を提供する。１つの実施形態において、被験体は、自己免疫疾患を有する。自己免疫疾患の非限定的な例としては、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性アジソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎および自己免疫性睾丸炎、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアック多発性皮膚炎（ｃｅｌｉａｃ ｓｐａｔｅ－ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、慢性疲労免疫不全症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集素病、クローン病、円板状狼瘡、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛症－線維筋炎、糸球体腎炎、グレーヴズ病、ギランバレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡニューロパシー、若年性関節炎、扁平苔癬、エリテマトーデス、メニエール病、混合結合組織病、多発性硬化症、１型糖尿病または免疫媒介性糖尿病、重症筋無力症、ネフローゼ症候群（例えば、微小変化群、巣状糸球体硬化症または膜性腎症）、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティフ・マン症候群、全身性エリテマトーデス、エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、脈管炎（例えば、結節性多発性動脈炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎または疱疹状皮膚炎脈管炎）、白斑ならびにウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。したがって、本明細書中に開示される方法を用いて処置され得る自己免疫疾患のいくつかの例としては、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、クローン病；潰瘍性大腸炎、重症筋無力症、糸球体腎炎、強直性脊椎炎、脈管炎または乾癬が挙げられるが、これらに限定されない。被験体は、喘息などのアレルギー性障害も有し得る。

さらに別の実施形態では、被験体は、移植される器官または幹細胞のレシピエントであり、拒絶反応を予防および／または処置するために免疫細胞が使用される。特定の実施形態において、被験体は、移植片対宿主病を有するか、または移植片対宿主病を発症するリスクがある。ＧＶＨＤは、血縁ドナーまたは非血縁ドナーからの幹細胞を使用するまたは含む任意の移植に関して起こり得る合併症である。ＧＶＨＤには、急性と慢性の２種類がある。急性ＧＶＨＤは、移植後の最初の３ヶ月以内に現れる。急性ＧＶＨＤの徴候としては、はじめのうちの身体の小領域を含む赤みがかった発疹（胸部、背部、腕、脚）が挙げられ、それは、剥皮または皮膚の水疱形成を伴って身体の＞８０％に広がることがあり、より重篤になることがある。急性ＧＶＨＤは、消化（ＧＩ）管にも影響することがあり、その場合、悪心および嘔吐（上部ＧＩ ＧＶＨＤ）ならびに／または腹部痙攣および下痢（下部ＧＩ ＧＶＨＤ）が認められる。皮膚および目の黄変（黄疸）は、急性ＧＶＨＤが肝臓に影響していることを示す。慢性ＧＶＨＤは、その重症度に基づいて等級付けされる：ステージ／グレード１が軽度であり；ステージ／グレード４が重度である。慢性ＧＶＨＤは、移植の３ヶ月後またはそれ以降に発症する。慢性ＧＶＨＤの症状は、急性ＧＶＨＤの症状と似ているが、さらに、慢性ＧＶＨＤは、眼の粘液腺、口の唾液腺ならびに胃壁および腸を滑らかにする腺にも影響し得る。本明細書中に開示される任意の免疫細胞集団を使用することができる。移植される器官の例としては、臓器移植片、例えば、腎臓、肝臓、皮膚、膵臓、肺および／または心臓、あるいは細胞移植片、例えば、小島、肝細胞、筋芽細胞、骨髄または造血性幹細胞もしくは他の幹細胞が挙げられる。移植片は、複合性の移植片、例えば、顔面の組織であり得る。免疫細胞は、移植の前、移植と同時、または移植の後に、投与され得る。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、移植の前に、例えば、移植の少なくとも１時間前、少なくとも１２時間前、少なくとも１日前、少なくとも２日前、少なくとも３日前、少なくとも４日前、少なくとも５日前、少なくとも６日前、少なくとも１週間前、少なくとも２週間前、少なくとも３週間前、少なくとも４週間前または少なくとも１ヶ月前に投与される。１つの非限定的な具体例では、治療有効量の免疫細胞の投与は、移植の３～５日前に行われる。

いくつかの実施形態において、被験体には、免疫細胞療法の前に骨髄非破壊的なリンパ球除去化学療法が施され得る。その骨髄非破壊的なリンパ球除去化学療法は、任意の好適な経路によって投与され得る任意の好適なそのような治療であり得る。その骨髄非破壊的なリンパ球除去化学療法は、特に、癌が転移性であり得る黒色腫である場合、例えば、シクロホスファミドおよびフルダラビンの投与を含み得る。シクロホスファミドおよびフルダラビンの例示的な投与経路は、静脈内である。同様に、任意の好適な用量のシクロホスファミドおよびフルダラビンが投与され得、それらは、ＣＡＲ－Ｔ細胞またはＣＡＲ－ＮＫ細胞を投与する前のリンパ球除去化学療法として最も一般的なレジメンである。特定の態様では、およそ６０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドが２日間投与され、その後、およそ２５ｍｇ／ｍ^２のフルダラビンが５日間投与される。

ある特定の実施形態では、免疫細胞の増殖および活性化を促進する成長因子が、免疫細胞と同時にまたは免疫細胞に続いて被験体に投与される。免疫細胞成長因子は、免疫細胞の増殖および活性化を促進する任意の好適な成長因子であり得る。好適な免疫細胞成長因子の例としては、インターロイキン（ＩＬ）－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５およびＩＬ－１２が挙げられ、これらは、単独でまたは様々な組み合わせで（例えば、ＩＬ－２とＩＬ－７、ＩＬ－２とＩＬ－１５、ＩＬ－７とＩＬ－１５、ＩＬ－２とＩＬ－７とＩＬ－１５、ＩＬ－１２とＩＬ－７、ＩＬ－１２とＩＬ－１５またはＩＬ－１２とＩＬ２）使用され得る。

治療有効用量の免疫細胞が、非経口投与をはじめとしたいくつかの経路、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、胸骨内もしくは関節内の注射または注入によって投与され得る。

養子細胞療法において使用するための免疫細胞の治療有効用量は、処置される被験体において所望の効果を達成する量である。例えば、これは、進行を阻害するために必要な免疫細胞の用量、または自己免疫疾患もしくは同種免疫疾患を後退させるために必要な免疫細胞の用量、または自己免疫疾患によって引き起こされる症状、例えば、疼痛および炎症を和らげることができる用量であり得る。これは、炎症に伴う症状、例えば、疼痛、浮腫および体温上昇を和らげるために必要な量であり得る。これは、移植された器官の拒絶反応を減少させるまたは予防するために必要な量でもあり得る。

上記免疫細胞集団は、疾患状態を回復させるために、上記疾患と一致した処置レジメンで、例えば、１日から数日間にわたって１回または数回で、投与され得るか、または疾患の進行を阻害するためおよび疾患の再発を予防するために、長期間にわたる定期的な投与で投与され得る。製剤において用いられる正確な用量は、投与経路および疾患または障害の重篤度にも依存し、医師の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。免疫細胞の治療有効用量は、処置される被験体、苦痛の重症度およびタイプならびに投与様式に依存する。いくつかの実施形態において、ヒト被験体の処置において使用され得る用量は、少なくとも３．８×１０^４、少なくとも３．８×１０^５、少なくとも３．８×１０^６、少なくとも３．８×１０^７、少なくとも３．８×１０^８、少なくとも３．８×１０^９または少なくとも３．８×１０^１０免疫細胞／ｍ^２で変動する。ある特定の実施形態において、ヒト被験体の処置において使用される用量は、約３．８×１０^９～約３．８×１０^１０免疫細胞／ｍ^２で変動する。さらなる実施形態において、免疫細胞の治療有効量は、約５×１０^６細胞／ｋｇ体重～約７．５×１０^８細胞／ｋｇ体重、例えば、約２×１０^７細胞～約５×１０^８細胞／ｋｇ体重または約５×１０^７細胞～約２×１０^８細胞／ｋｇ体重で変動し得る。免疫細胞の正確な量は、被験体の年齢、体重、性別および生理学的状態に基づいて当業者によってすぐに決定される。有効量は、インビトロモデルまたは動物モデルの試験系から導かれた用量反応曲線から外挿され得る。

上記免疫細胞は、免疫媒介性障害を処置するための１つ以上の他の治療薬と併用して投与され得る。併用療法としては、１つ以上の抗菌剤（例えば、抗生物質、抗ウイルス剤および抗真菌剤）、抗腫瘍剤（例えば、フルオロウラシル、メトトレキサート、パクリタキセル、フルダラビン、エトポシド、ドキソルビシンまたはビンクリスチン）、免疫枯渇剤（例えば、フルダラビン、エトポシド、ドキソルビシンまたはビンクリスチン）、免疫抑制剤（例えば、アザチオプリンまたは糖質コルチコイド、例えば、デキサメタゾンまたはプレドニゾン）、抗炎症剤（例えば、糖質コルチコイド（例えば、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾンまたはプレドニゾン）または非ステロイド性抗炎症剤（例えば、アセチルサリチル酸、イブプロフェンまたはナプロキセンナトリウム））、サイトカイン（例えば、インターロイキン－１０またはトランスフォーミング成長因子－ベータ）、ホルモン（例えば、エストロゲン）またはワクチンが挙げられ得るが、これらに限定されない。さらに、カルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリンおよびタクロリムス）；ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）；ミコフェノール酸モフェチル、抗体（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ１５４、ＣＤ４５、ＩＶＩＧまたはＢ細胞を認識する抗体）；化学療法剤（例えば、メトトレキサート、トレオスルファン、ブスルファン）；照射；またはケモカイン、インターロイキンもしくはそれらの阻害剤（例えば、ＢＡＦＦ、ＩＬ－２、抗ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－４、ＪＡＫキナーゼ阻害剤）を含むがこれらに限定されない免疫抑制剤または免疫寛容誘発剤が投与され得る。そのようなさらなる医薬品は、所望の効果に応じて免疫細胞の投与前、投与中または投与後に投与され得る。上記細胞および作用物質のこの投与は、同じ経路または異なる経路による投与、および同じ部位または異なる部位における投与であり得る。
Ｖ．薬学的組成物

凍結保存に供された細胞（例えば、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞））および薬学的に許容され得るキャリアを含む薬学的組成物および製剤も本明細書中に提供される。

本明細書中に記載されるような薬学的組成物および製剤は、所望の程度の純度を有する活性成分（例えば、細胞）を１つ以上の自由選択の薬学的に許容され得るキャリア（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２２^ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１２）と混合することによって、凍結乾燥された製剤または水溶液の形態で調製され得る。薬学的に許容され得るキャリアは、一般に、使用される投与量および濃度においてレシピエントにとって無毒性であり、それらのキャリアとしては、緩衝剤（例えば、リン酸、クエン酸および他の有機酸）；酸化防止剤（アスコルビン酸およびメチオニンを含む）；保存剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノールアルコール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン（例えば、メチルパラベンまたはプロピルパラベン）；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン）；単糖類、二糖類および他の炭水化物（グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖類（例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）；および／または非イオン性界面活性剤（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な本明細書中の薬学的に許容され得るキャリアとしては、間質薬物分散剤、例えば、中性で活性な可溶性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標），Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）がさらに挙げられる。ｒＨｕＰＨ２０を含むある特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰおよび使用方法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号および同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。１つの態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、１つ以上のさらなるグリコサミノグリカナーゼ、例えば、コンドロイチナーゼと併用される。
ＶＩ．併用療法

ある特定の実施形態において、本実施形態の組成物および方法は、少なくとも１つのさらなる治療と併用される、以前に凍結保存された細胞集団を含む。そのさらなる治療は、放射線療法、手術（例えば、ランペクトミーおよび乳房切除術）、化学療法、遺伝子治療、ＤＮＡ治療、ウイルス治療、ＲＮＡ治療、免疫療法、骨髄移植、ナノ治療、モノクローナル抗体治療または前述の組み合わせであり得る。そのさらなる治療は、アジュバント療法またはネオアジュバント療法の形態であり得る。

いくつかの実施形態において、さらなる治療は、小分子酵素阻害剤または抗転移剤の投与である。いくつかの実施形態において、さらなる治療は、副作用制限剤（例えば、処置の副作用の発生率および／または重症度を下げることを目的とする作用物質、例えば、抗悪心剤など）の投与である。いくつかの実施形態において、さらなる治療は、放射線療法である。いくつかの実施形態において、さらなる治療は、手術である。いくつかの実施形態において、さらなる治療は、放射線療法と手術の併用である。いくつかの実施形態において、さらなる治療は、ガンマ線照射である。いくつかの実施形態において、さらなる治療は、ＰＢＫ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路を標的化する治療、ＨＳＰ９０阻害剤、チューブリン阻害剤、アポトーシス阻害剤および／または化学予防剤である。さらなる治療は、当該分野で公知の化学療法剤の１つ以上であり得る。

免疫細胞療法は、免疫チェックポイント療法などのさらなる癌治療の前、最中、後または様々な組み合わせで投与され得る。それらの投与は、同時から数分、数日、数週間までの範囲の間隔で行われ得る。免疫細胞療法がさらなる治療薬とは別に患者に提供される実施形態では、それら２つの化合物が、なおも患者に対して有益な併用効果を発揮できるように、各送達時点の間にかなりの期間が経過しないことを保証するのが一般的である。そのような場合、抗体療法と抗癌療法とが、互いの約１２～２４または７２時間以内に、より詳細には、互いの約６～１２時間以内に患者に提供され得ることが企図される。いくつかの状況において、それぞれの投与間に数日（２、３、４、５、６または７）から数週間（１、２、３、４、５、６、７または８）が経過した場合、処置期間をかなり延長することが望ましいことがある。

様々な組み合わせが使用され得る。下記の例の場合、免疫細胞療法が、「Ａ」であり、抗癌療法が、「Ｂ」である：
Ａ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ａ／Ｂ Ｂ／Ｂ／Ａ Ａ／Ａ／Ｂ Ａ／Ｂ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ａ Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ
Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ
Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ

本実施形態の任意の化合物または治療の患者への投与は、それらの作用物質に毒性がある場合はそれを考慮して、そのような化合物を投与するための一般的なプロトコルに従う。ゆえに、いくつかの実施形態では、併用療法に起因し得る毒性をモニタリングする工程が存在する。
Ａ．化学療法

多種多様の化学療法剤が、本実施形態に従って使用され得る。用語「化学療法」とは、薬物を使用して癌を処置することを指す。「化学療法剤」は、癌の処置において投与される化合物または組成物を意味するために使用される。これらの作用物質または薬物は、細胞内でのそれらの活性様式によって、例えば、それらが細胞周期に影響するか否かおよびどのステージにおいて細胞周期に影響するかによって、分類される。あるいは、作用物質は、ＤＮＡを直接架橋する能力、ＤＮＡにインターカレートする能力、または核酸合成に影響することによって染色体異常および有糸分裂異常を誘導する能力に基づいて特徴付けられ得る。

化学療法剤の例としては、アルキル化剤（例えば、チオテパおよびシクロスホスファミド）；スルホン酸アルキル（例えば、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン）；アジリジン（例えば、ベンゾドパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）およびウレドパ（ｕｒｅｄｏｐａ））；エチレンイミンおよびメチルアメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチローロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含む）；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成アナログであるトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ－１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン（ｃａｒｚｅｌｅｓｉｎ）およびビゼレシン（ｂｉｚｅｌｅｓｉｎ）合成アナログを含む）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成アナログであるＫＷ－２１８９およびＣＢ１－ＴＭ１を含む）；エレウセロビン（ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｂｉｎ）；パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコジクチイン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンギスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）；ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルナファジン（ｃｈｌｏｒｎａｐｈａｚｉｎｅ）、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンビキン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロフォスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）およびウラシルマスタード）；ニトロソ尿素（例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチンおよびラニムヌスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ））；抗生物質（例えば、エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特に、カリケアマイシンガンマｌＩおよびカリケアマイシンオメガＩ１））；ジネマイシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）（ジネマイシンＡを含む）；ビスホスホネート（例えば、クロドロネート）；エスペラミシン；ならびにネオカルチノスタチンクロモフォアおよび関連色素タンパク質であるエンジイン抗生物質クロモフォア、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウトラルニシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモミシニス、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ－ドキソルビシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、２－ピロリノ－ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン（例えば、マイトマイシンＣ）、ミコフェノール酸、ノガラルニシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチンおよびゾルビシン；抗代謝産物（例えば、メトトレキサートおよび５－フルオロウラシル（５－ＦＵ））；葉酸アナログ（例えば、デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、プテロプテリンおよびトリメトレキサート）；プリンアナログ（例えば、フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）およびチオグアニン）；ピリミジンアナログ（例えば、アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビンおよびフロクスウリジン）；アンドロゲン（例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタンおよびテストラクトン）；抗副腎（ａｎｔｉ－ａｄｒｅｎａｌｓ）（例えば、ミトタンおよびトリロスタン）；葉酸補給剤（例えば、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ））；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デホファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジコン；エルフォルミチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ）（例えば、メイタンシンおよびアンサミトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎｓ））；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖複合体；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクォン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；２，２’，２”－トリクロロトリエチルアミン；トリコテシン（特に、Ｔ－２トキシン、ベラクリンＡ、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎ）Ａおよびアングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ））；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；タキソイド、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセルゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；白金配位錯体（例えば、シスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチン）；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセロダ（ｘｅｌｏｄａ）；イバンドロネート；イリノテカン（例えば、ＣＰＴ－１１）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド（例えば、レチノイン酸）；カペシタビン；カルボプラチン、プロカルバジン、プリコマイシン、ゲムシタビエン、ナベルビン、ファルネシル－タンパク質タンスフェラーゼ阻害剤、トランスプラチナ（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、ならびに上記のいずれかの薬学的に許容され得る塩、酸または誘導体が挙げられる。
Ｂ．放射線療法

ＤＮＡ損傷を引き起こす、広く使用されてきた他の因子としては、γ線、Ｘ線および／または腫瘍細胞への放射性同位体の定方向送達として一般的に知られているものが挙げられる。マイクロ波、陽子ビーム照射（米国特許第５，７６０，３９５号および同第４，８７０，２８７号）およびＵＶ照射などの他の形態のＤＮＡ損傷因子も企図される。これらの因子のすべてが、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製および修復ならびに染色体のアセンブリおよび維持に対して広範囲のダメージをもたらす可能性が最も高い。Ｘ線の線量の範囲は、長期間（３～４週間）にわたる５０～２００レントゲンという１日線量から、２０００～６０００レントゲンという単回線量までの範囲である。放射性同位体の線量の範囲は、大きく異なり、同位体の半減期、放射される放射線の強度およびタイプ、ならびに腫瘍性細胞による取り込みに依存する。
Ｃ．免疫療法

当業者は、さらなる免疫療法が上記実施形態の方法と併用してまたは併せて使用され得ることを理解する。癌の処置の状況において、免疫治療薬は、通常、癌細胞を標的化し、破壊するために免疫エフェクター細胞および免疫エフェクター分子を使用することに頼る。リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））が、そのような例である。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上の何らかのマーカーに特異的な抗体であり得る。その抗体は、単独で治療のエフェクターとして機能し得るか、または他の細胞をリクルートして、実際に細胞殺滅に影響し得る。その抗体はまた、薬物またはトキシン（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）に結合体化され得、標的化剤として役立ち得る。あるいは、そのエフェクターは、腫瘍細胞標的と直接または間接的に相互作用する表面分子を有するリンパ球であり得る。様々なエフェクター細胞には、細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞が含まれる。

抗体－薬物結合体は、癌治療の発展に対する画期的なアプローチとして台頭した。癌は、世界の主要な死因の１つである。抗体－薬物結合体（ＡＤＣ）は、殺細胞薬に共有結合的に連結されたモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を含む。このアプローチは、抗原標的に対するＭＡｂの高い特異性を非常に強力な細胞傷害性薬物と組み合わせることにより、豊富なレベルの抗原を有する腫瘍細胞にペイロード（薬物）を送達する「武装した」ＭＡｂをもたらす。また、薬物の標的化送達は、正常組織への曝露を最小限に抑えることから、毒性を低減し、治療指数を改善する。ＦＤＡによって２０１１年にＡＤＣＥＴＲＩＳ（登録商標）（ブレンツキシマブベドチン）、および２０１３年にＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標）（トラスツズマブエムタンシンまたはＴ－ＤＭ１）という２つのＡＤＣ薬物が承認されたことで、このアプローチの妥当性が確認された。現在、３０を超えるＡＤＣ薬物候補が、癌を処置するために様々な段階の臨床試験中である（Ｌｅａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。抗体の操作およびリンカー－ペイロードの最適化の完成度が上がるにつれて、新しいＡＤＣの発見および開発は、このアプローチに適した新しい標的の同定および検証ならびに標的化ＭＡｂの作製にますます依存するようになる。ＡＤＣ標的に対する２つの基準は、腫瘍細胞におけるアップレギュレート／高レベル発現および頑健な内部移行である。

免疫療法の１つの態様において、腫瘍細胞は、標的化の影響を受けやすい何らかのマーカー、すなわち、他の大部分の細胞上に存在しない何らかのマーカーを有さなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらのいずれかが、本実施形態の状況において標的化に好適であり得る。一般的な腫瘍マーカーとしては、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＡ－１２５、癌胎児抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ－７２、ＨＭＦＧ、Ｓｉａｌｙｌ Ｌｅｗｉｓ抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、ラミニンレセプター、ｅｒｂ Ｂおよびｐ１５５が挙げられる。免疫療法の代替の態様は、抗癌効果と免疫刺激効果とを組み合わせることである。ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１２、ＧＭ－ＣＳＦ、ガンマ－ＩＦＮなどのサイトカイン、ＭＩＰ－１、ＭＣＰ－１、ＩＬ－８などのケモカイン、およびＦＬＴ３リガンドなどの成長因子をはじめとした免疫刺激分子も存在する。

現在研究中のまたは使用されている免疫療法の例は、免疫アジュバント、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、ジニトロクロロベンゼンおよび芳香族化合物（米国特許第５，８０１，００５号および同第５，７３９，１６９号；Ｈｕｉ ａｎｄ Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，１９９８；Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８）；サイトカイン療法、例えば、インターフェロンα、βおよびγ、ＩＬ－１、ＧＭ－ＣＳＦならびにＴＮＦ（Ｂｕｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｈｅｌｌｓｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９８）；遺伝子治療、例えば、ＴＮＦ、ＩＬ－１、ＩＬ－２およびｐ５３（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ａｕｓｔｉｎ－Ｗａｒｄ ａｎｄ Ｖｉｌｌａｓｅｃａ，１９９８；米国特許第５，８３０，８８０号および同第５，８４６，９４５号）；ならびにモノクローナル抗体、例えば、抗ＣＤ２０、抗ガングリオシドＧＭ２および抗ｐ１８５（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ，２０１２；Ｈａｎｉｂｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８；米国特許第５，８２４，３１１号）である。１つ以上の抗癌療法が、本明細書中に記載される抗体療法とともに使用され得ることが企図される。

いくつかの実施形態において、免疫療法は、免疫チェックポイント阻害剤であり得る。免疫チェックポイントは、シグナルを強める（例えば、共刺激分子）かまたはシグナルを弱めるかのいずれかである。免疫チェックポイントの遮断によって標的化され得る阻害性免疫チェックポイントとしては、アデノシンＡ２Ａレセプター（Ａ２ＡＲ）、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６としても知られる）、ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＤ１５２としても知られるＣＴＬＡ－４）、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、キラー細胞免疫グロブリン（ＫＩＲ）、リンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ３）、プログラム死１（ＰＤ－１）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ－３）、ならびにＴ細胞活性化のＶ－ドメインＩｇサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）が挙げられる。特に、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１軸および／またはＣＴＬＡ－４を標的化する。

免疫チェックポイント阻害剤は、小分子、組換え型のリガンドまたはレセプターなどの薬物であり得るか、または特に、ヒト抗体などの抗体である（例えば、国際特許公開ＷＯ２０１５０１６７１８；Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ，１２（４）：２５２－６４，２０１２；この両方が参照により本明細書中に援用される）。免疫チェックポイントタンパク質またはそのアナログの公知の阻害剤が、使用され得、特に、キメラ化型、ヒト化型またはヒト型の抗体が使用され得る。当業者が承知しているように、代替のおよび／または等価な名称が、本開示において述べられるある特定の抗体に対して使用され得る。そのような代替のおよび／または等価な名称は、本開示の文脈において相互交換可能である。例えば、ランブロリズマブが、代替のおよび等価な名称であるＭＫ－３４７５およびペンブロリズマブとしても知られていることは公知である。

いくつかの実施形態において、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＰＤ－１がそのリガンド結合パートナーに結合するのを阻害する分子である。具体的な態様において、ＰＤ－１リガンド結合パートナーは、ＰＤＬ１および／またはＰＤＬ２である。別の実施形態において、ＰＤＬ１結合アンタゴニストは、ＰＤＬ１がその結合パートナーに結合するのを阻害する分子である。具体的な態様において、ＰＤＬ１結合パートナーは、ＰＤ－１および／またはＢ７－１である。別の実施形態において、ＰＤＬ２結合アンタゴニストは、ＰＤＬ２がその結合パートナーに結合するのを阻害する分子である。具体的な態様において、ＰＤＬ２結合パートナーは、ＰＤ－１である。アンタゴニストは、抗体、その抗原結合フラグメント、イムノアドヘシン、融合タンパク質またはオリゴペプチドであり得る。例示的な抗体は、米国特許第８７３５５５３号、同第８３５４５０９号および同第８００８４４９号（これらすべてが参照により本明細書中に援用される）に記載されている。本明細書中に提供される方法において使用するための他のＰＤ－１軸アンタゴニストは、当該分野で公知であり、例えば、米国特許出願公開第２０１４０２９４８９８号、同第２０１４０２２０２１号および同第２０１１０００８３６９号（これらすべてが参照により本明細書中に援用される）に記載されているものなどである。

いくつかの実施形態において、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ－１抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体）である。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブ、ペンブロリズマブおよびＣＴ－０１１からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、イムノアドヘシン（例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のＦｃ領域）に融合されたＰＤＬ１またはＰＤＬ２の細胞外部分またはＰＤ－１結合部分を含むイムノアドヘシン）である。いくつかの実施形態において、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＡＭＰ－２２４である。ＭＤＸ－１１０６－０４、ＭＤＸ－１１０６、ＯＮＯ－４５３８、ＢＭＳ－９３６５５８およびＯＰＤＩＶＯ（登録商標）としても知られるニボルマブは、ＷＯ２００６／１２１１６８に記載されている抗ＰＤ－１抗体である。ＭＫ－３４７５、Ｍｅｒｃｋ３４７５、ランブロリズマブ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）およびＳＣＨ－９００４７５としても知られるペンブロリズマブは、ＷＯ２００９／１１４３３５に記載されている抗ＰＤ－１抗体である。ｈＢＡＴまたはｈＢＡＴ－１としても知られるＣＴ－０１１は、ＷＯ２００９／１０１６１１に記載されている抗ＰＤ－１抗体である。Ｂ７－ＤＣＩｇとしても知られるＡＭＰ－２２４は、ＷＯ２０１０／０２７８２７およびＷＯ２０１１／０６６３４２に記載されているＰＤＬ２－Ｆｃ融合可溶性レセプターである。

本明細書中に提供される方法において標的化され得る別の免疫チェックポイントは、ＣＤ１５２としても知られる細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）である。ヒトＣＴＬＡ－４の完全ｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｌ１５００６を有する。ＣＴＬＡ－４は、Ｔ細胞の表面上に見られ、抗原提示細胞の表面上のＣＤ８０またはＣＤ８６に結合したとき「切」スイッチとして作用する。ＣＴＬＡ４は、ヘルパーＴ細胞の表面上に発現される免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、Ｔ細胞に阻害シグナルを伝達する。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞共刺激タンパク質であるＣＤ２８に似ており、両分子は、抗原提示細胞上のＣＤ８０およびＣＤ８６（それぞれＢ７－１およびＢ７－２とも呼ばれる）に結合する。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞に阻害シグナルを伝達するのに対して、ＣＤ２８は、刺激シグナルを伝達する。細胞内ＣＴＬＡ４は、制御性Ｔ細胞にも見られ、それらの細胞の機能にとって重要であり得る。Ｔ細胞レセプターおよびＣＤ２８を介したＴ細胞の活性化により、Ｂ７分子に対する阻害性レセプターであるＣＴＬＡ－４が高発現される。

いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ－４抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体）、それらの抗原結合フラグメント、イムノアドヘシン、融合タンパク質またはオリゴペプチドである。

本方法における使用に適した抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体（またはそれ由来のＶＨおよび／もしくはＶＬドメイン）は、当該分野で周知の方法を用いて作製され得る。あるいは、当該分野で認められている抗ＣＴＬＡ－４抗体を使用することができる。例えば、米国特許第８，１１９，１２９号、ＷＯ０１／１４４２４、ＷＯ９８／４２７５２；ＷＯ００／３７５０４（トレメリムマブとしても知られ；以前はチシリムマブとしても知られた、ＣＰ６７５，２０６）、米国特許第６，２０７，１５６号；Ｈｕｒｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５（１７）：１００６７－１００７１；Ｃａｍａｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２２（１４５）：Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．２５０５（抗体ＣＰ－６７５２０６）；およびＭｏｋｙｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５８：５３０１－５３０４に開示されている抗ＣＴＬＡ－４抗体が、本明細書中に開示される方法において使用され得る。上述の各刊行物の教示が、参照により本明細書に援用される。これらの当該分野で認められている任意の抗体とＣＴＬＡ－４への結合について競合する抗体も使用され得る。例えば、ヒト化ＣＴＬＡ－４抗体が、国際特許出願番号ＷＯ２００１０１４４２４、ＷＯ２００００３７５０４および米国特許第８，０１７，１１４号に記載されており、すべてが参照により本明細書中に援用される。

例示的な抗ＣＴＬＡ－４抗体は、イピリムマブ（１０Ｄ１、ＭＤＸ－０１０、ＭＤＸ－１０１およびＹｅｒｖｏｙ（登録商標）としても知られる）またはその抗原結合フラグメントおよびバリアントである（例えば、ＷＯ０１／１４４２４を参照のこと）。他の実施形態において、その抗体は、イピリムマブの重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲまたは重鎖ＶＲおよび軽鎖ＶＲを含む。したがって、１つの実施形態において、その抗体は、イピリムマブのＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインならびにイピリムマブのＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む。別の実施形態において、その抗体は、ＣＴＬＡ－４上の、上述の抗体と同じエピトープへの結合について競合し、かつ／またはＣＴＬＡ－４上の、上述の抗体と同じエピトープに結合する。別の実施形態において、その抗体は、上述の抗体に対して少なくとも約９０％の可変領域アミノ酸配列同一性（例えば、イピリムマブと少なくとも約９０％、９５％または９９％の可変領域同一性）を有する。

ＣＴＬＡ－４を調節するための他の分子としては、ＣＴＬＡ－４リガンドおよびＣＴＬＡ－４レセプター（例えば、米国特許第５８４４９０５号、同第５８８５７９６号ならびに国際特許出願番号ＷＯ１９９５００１９９４およびＷＯ１９９８０４２７５２（すべてが参照により本明細書中に援用される）に記載されているもの）、ならびにイムノアドヘシン（例えば、米国特許第８３２９８６７号（参照により本明細書中に援用される）に記載されているもの）が挙げられる。
Ｄ．手術

癌を有する人のおよそ６０％が、予防的手術、診断的手術または進行度診断手術、根治的手術および緩和手術をはじめとした何らかのタイプの手術を受ける。根治的手術には、癌性組織の全部または一部を物理的に除去、切除および／または破壊する摘出術が含まれ、他の治療（例えば、本実施形態の処置、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子治療、免疫療法および／または代替療法）と併せて使用され得る。腫瘍摘出術とは、腫瘍の少なくとも一部を物理的に除去することを指す。手術による処置には、腫瘍摘出術に加えて、レーザー手術、凍結手術、電気手術および顕微鏡下手術（モース術）が含まれる。

癌性細胞、組織または腫瘍の一部または全部を切除する際、身体に空洞が形成され得る。処置は、さらなる抗癌療法によるその領域の灌流、直接注射または局所適用によって達成され得る。そのような処置は、例えば、１、２、３、４、５、６もしくは７日ごとに、または１、２、３、４および５週間ごとに、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２ヶ月ごとに、反復され得る。これらの処置は、様々な投与量の処置でもあり得る。
Ｅ．他の作用物質

処置の治療効果を改善するために、本実施形態のある特定の態様と組み合わせて他の作用物質が使用され得ることが企図される。これらのさらなる作用物質としては、細胞表面レセプターおよびギャップ結合のアップレギュレーションに影響する作用物質、細胞分裂抑制剤および分化剤、細胞接着の阻害剤、アポトーシス誘導物質に対する過剰増殖細胞の感度を高める作用物質、または他の生物学的作用物質が挙げられる。ギャップ結合数を増加させることによる細胞間のシグナル伝達の増加は、隣接する過剰増殖細胞集団に対する抗過剰増殖効果を高め得る。他の実施形態では、処置の抗過剰増殖の有効性を改善するために、本実施形態のある特定の態様と組み合わせて細胞分裂抑制剤または分化剤が使用され得る。本実施形態の有効性を改善するために、細胞接着の阻害剤が企図される。細胞接着阻害剤の例は、接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤およびロバスタチンである。アポトーシスに対する過剰増殖細胞の感度を高める他の作用物質（例えば、抗体ｃ２２５）が、処置の有効性を改善するために本実施形態のある特定の態様と組み合わせて使用され得ることがさらに企図される。
ＶＩＩ．製品またはキット

凍結保存培地またはその構成要素および必要に応じて免疫細胞を含む製品またはキットが提供される。その製品またはキットは、個体の癌を処置するためもしくは癌の進行を遅延させるためにまたは癌を有する個体の免疫機能を高めるために凍結保存および／または免疫細胞を使用するための指示を含む添付文書をさらに含み得る。凍結保存培地の任意の構成要素および必要に応じて本明細書中に記載される抗原特異的免疫細胞が、その製品またはキットに含められ得る。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、バッグおよびシリンジが挙げられる。その容器は、ガラス、プラスチック（例えば、ポリ塩化ビニルまたはポリオレフィン）または金属合金（例えば、ステンレス鋼またはハステロイ）などの種々の材料から形成され得る。いくつかの実施形態において、その容器は、製剤およびラベルを保持し、そのラベルは、容器に付着しているかまたは関連付けられており、その容器には、使用法が示されている場合がある。その製品またはキットは、商業的な観点およびユーザーの観点から望ましい他の材料をさらに含むことがあり、それらの材料としては、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および使用するための指示を含む添付文書が挙げられる。いくつかの実施形態において、その製品は、１つ以上の別の作用物質（例えば、化学療法剤および抗悪性腫瘍剤）をさらに含む。その１つ以上の作用物質に適した容器としては、例えば、ボトル、バイアル、バッグおよびシリンジが挙げられる。

ＶＩＩＩ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含められる。以下の実施例に開示される手法は、本発明の実施において十分に機能すると本発明者が発見した手法であり、ゆえにその実施にとって好ましい形式であると考えることができることが当業者によって認識されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に鑑みて、開示される具体的な実施形態において多くの変更を行うことができ、それらの変更は、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、なおも同様または類似の結果をもたらすと認識するはずである。
実施例１－ＮＫ－ＣＡＲ細胞の凍結保存

具体的な実施形態では、好適な時点において、ＮＫ－ＣＡＲ細胞（細胞の一例）を含む注入生成物が収集され、洗浄され、凍結保存され得る。それらの細胞は、必要なときに、例えば、細胞の拡大に好適な時点の後に収集される。いくつかの場合では、拡大された細胞の表現型を特徴付けるために、細胞数および生存率について調べるため、ならびにフローサイトメトリーに向けて、サンプルが取り出され得る。また、一例として、マイコプラズマ試験（例えば、ＰＣＲおよびＭｙｃｏＡｌｅｒｔを用いる）に向けて、培養物からサンプルが取り出され得る。細菌が存在しないことを確かめるために、グラム染色を行うことが多い。細胞生存率が＞７０％である場合、遠心分離によって細胞が回収され得、細胞培養ベースのアッセイによるＰＣＲ試験（必要であるとみなされる場合）に向けて、上清からサンプルが取り出され得る。

細胞生成物は、培養液試薬を除去するために、例えば、０．５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むＰｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ Ａで洗浄され得る。リリース試験および非リリース試験のためにサンプルが回収される。１０％ヒトＡＢ血清を含むＰｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ Ａの混合物で洗浄することによって、最終的な細胞懸濁液が凍結保存に向けて調製され得る。それらの細胞を、５％ＤＭＳＯ、４００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２および２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１を含む９５％ヒトＡＢ血清の混合物中で凍結保存する。それらの細胞を、注入の準備が整うまで、気相液体窒素中で保存する。リリース試験には、純度、グラム染色、マイコプラズマ（ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ）、目視検査、生存率（７ＡＡＤ）、イムノフェノタイピングおよびエンドトキシン（ＬＡＬ）についての試験が含まれる。非リリース試験には、ＰＣＲによるマイコプラズマ（１５日目）およびＱＰＣＲによるベクターコピー数（ＶＣＮ）解析（１５日目）が含まれる。
実施例２－注入用の凍結保存ＮＫ－ＣＡＲ細胞の調製

注入の当日に、凍結保存細胞を３７℃で解凍する。その細胞を、０．５％ＨＳＡを含むＰｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ Ａの混合物で２回洗浄する。サンプルを、細胞数、イムノフェノタイピングおよび生存率（７ＡＡＤ）を調べるために回収する。次いで、その細胞生成物を、必要とされる用量レベルで、０．５％ＨＳＡを含むＰｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ Ａに再懸濁する。最終的な注入体積は、投与１の場合はおよそ２０ｍＬであり得、投与２および投与３の場合はおよそ１００ｍＬであり得る。目視検査、生存率（７ＡＡＤ）、グラム染色、イムノフェノタイピングおよび細胞数（細胞量）についての試験を含むリリース試験に向けて、最終的な注入生成物からサンプルを取り出す。非リリース試験には、無菌性試験（ＢＤ Ｂａｃｔｅｃ）が含まれる。
実施例３－凍結保存の実施形態

単なる一例として、臍帯血（ＣＢ）由来のＮＫ細胞に対して凍結保存方法を用い、この場合では、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）のリスクを高めることなく抗腫瘍活性を増強し得る腫瘍特異的キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を発現するようにそれらの細胞を遺伝的に操作することによって、それらの細胞の特異性を再指示した。これにより、治療のための、例えば、標的を発現している任意の癌の免疫療法のための、「既製」の細胞起源を提供することが可能になる。

凍結保存に向けて、ＣＢ ＮＫ細胞を、５％ＤＭＳＯ、９５％ヒトＡＢ血清、４００単位のＩＬ－２／ｍｌおよび２０ｎｇのＩＬ－２１／ｍｌを含むＧＭＰ凍結保存培地に懸濁し、それらの細胞を、速度制御された方法を用いて液体窒素中で凍結した。

最終生成物として凍結されていた培養済みのＣＢ－ＮＫ細胞を解凍した後、それらの細胞を特徴付けた。解凍後、細胞生存率は、８０％超であり、細胞回収率は、８５％超だった。さらに、ＦＭＣ中で凍結保存されたＮＫ細胞は、ＦＭのみの中で凍結保存されたＮＫ細胞と比べて有意に良好な細胞傷害性をＫ５６２およびＲａｊｉ標的に対して発揮した（それぞれｐ＝０．０２およびｐ＝０．０００４）。

したがって、例示的なＣＡＲ形質導入済み臍帯血由来ＮＫ細胞は、液性腫瘍と固形腫瘍の両方を含む多くの癌を認識、攻撃できる既製の個別化されたＮＫ細胞起源を提供できる。臍帯血由来のナチュラルキラー細胞のレトロウイルス形質導入によって、多くの癌の免疫療法において使用するための、および潜在的には、多くのウイルス感染症を処置するための、操作された細胞の持続性を延長することおよび有効性を改善することが可能になる。

さらなる研究において、異なるサイトカインの組み合わせを含む異なる９つの凍結培地中で凍結保存されたＣＢ－ＮＫの生存率を試験したところ、その多くが、標準的な凍結培地よりも統計学的に有意な生存率を有した（図１）。標準的な凍結培地は、９５％ヒトＡＢ血清＋５％ＤＭＳＯである。図１において、サイトカインの組み合わせには、以下が含まれる：（１）標準的な凍結培地；（２）ＩＬ２のみ；（３）ＩＬ１５のみ；（４）ＩＬ２１のみ；（５）ＩＬ２＋ＩＬ２１；（６）ＩＬ２＋ＩＬ１５；（７）ＩＬ２１＋ＩＬ１５；（８）ＩＬ２＋ＩＬ１５＋ＩＬ２１；および（９）研究グレードの凍結培地（Ｓｉｇｍａ）。

図２は、ＧＭＰ標準凍結培地中で凍結保存されたＮＫ細胞と新鮮なＮＫ細胞との比較を示している。ＧＭＰ凍結培地中で凍結保存されたＮＫ細胞は、解凍後に、新鮮なＮＫ細胞と比べて劣る細胞傷害性をＫ５６２標的に対して発揮する。対照的に、ＧＭＰ凍結培地およびサイトカイン中で凍結保存されたＮＫ細胞は、解凍後に、新鮮なＮＫ細胞と類似の細胞傷害性をＫ５６２標的に対して発揮する（図３）。キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を発現するＮＫ細胞を試験したとき、図４は、ＧＭＰ標準凍結培地中で凍結保存されたＣＡＲ発現ＮＫ細胞が、解凍後に、新鮮なＣＡＲ発現ＮＫ細胞と比べて劣る細胞傷害性をＲａｊｉ標的に対して発揮することを示している。しかしながら、ＧＭＰ凍結培地およびサイトカイン中で凍結保存されたＣＡＲ発現ＮＫ細胞は、解凍後に、新鮮なＣＡＲ発現ＮＫ細胞と類似の細胞傷害性をＲａｊｉ標的に対して発揮する（ｎ＝３）。同じように、ＧＭＰ標準凍結培地およびサイトカイン中で凍結保存されたＣＡＲ発現ＮＫ細胞は、解凍後に、新鮮なＣＡＲ発現ＮＫ細胞と類似の細胞傷害性をＲａｊｉ標的に対して発揮し、それらは、ＧＭＰ標準凍結培地中で凍結されたＣＡＲ発現ＮＫ細胞よりも優れている（図６）。サイトカインを含む本開示の凍結保存培地中で凍結され、解凍後直ちにＲａｊｉ移植マウスに注入されたＣＡＲ発現ＮＫ細胞は、疾患制御を示す。図８は、サイトカインを含む本開示の凍結保存培地（ＦＭ＋サイトカイン）中で凍結され、解凍後直ちにＲａｊｉ移植マウスに注入されたＣＡＲ発現ＮＫ細胞が、新鮮なＣＡＲ発現ＮＫ細胞と類似の疾患制御を示すこと、およびそれらが、ＧＭＰ標準凍結培地（ＦＭ）中で凍結されたＣＡＲ発現ＮＫ細胞よりも優れていることを示している。
実施例４－既製の免疫療法のためのＧＭＰ準拠ＣＡＲ－ＮＫ細胞生成物の頑健な凍結保存

本実施例は、作製のために必要とされる遅れなしに、解凍してそれを必要とする個体に注入できる「既製」の細胞療法として使用され得る凍結された細胞生成物の作製に関する。上記方法および組成物は、ＮＫ細胞、例えば臍帯血由来のナチュラルキラー（ＣＢ－ＮＫ）細胞をはじめとした任意のタイプの細胞に適用され得る。それらの細胞には、レトロウイルスベクターなどのウイルスベクターを含む１つ以上のタイプのベクターが形質導入され得る。具体的な実施形態において、それらのベクターは、その細胞が例えば癌抗原を通じて癌を標的化できるようにする遺伝子産物を細胞内で生成する。標的の具体例としては、ＣＤ１９＋リンパ系癌、骨髄腫瘍および固形腫瘍の癌抗原が挙げられる。

ある特定の実施形態において、本開示は、通常の状況下では「既製」のアプローチが可能でない末梢血由来のＮＫ細胞に特に適している。これは、各場合において、ＮＫ細胞の供与のためのドナーを特定しなければならないからである。具体的な実施形態では、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）によって操作されたＮＫ細胞が、本開示の方法および組成物に特に適している。ＣＡＲで操作されたＮＫ９２細胞が、当該分野で公知であるが、ＮＫ９２は、リンパ腫患者に由来するＮＫ細胞株であり、ＮＫ細胞の細胞傷害性にとって重要なＮＫ細胞レセプターの多くを欠く。この細胞株は、リンパ腫患者に由来するので、注入前に放射線照射しなければならないか、またはレシピエントにおいてリンパ腫を引き起こすリスクがある。放射線照射は、増殖および持続する能力を有意に低下させる。ゆえに、これらの細胞は、すべてのＮＫ細胞レセプターを発現する、ＣＡＲによって改変されたＣＢ－ＮＫ細胞よりも効果的でない可能性がある。

本開示は、癌細胞の免疫療法のための、既製の細胞起源を提供する。ＣＡＲ－Ｔ細胞にまさる主要な利点としては、既製のＣＡＲ Ｔ細胞は、ＨＬＡが完全に適合していないと患者に注入した場合、致死的なＧＶＨＤを引き起こす可能性があるが、ＮＫ細胞は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を引き起こす可能性がかなり低い点である。末梢血由来のＣＡＲ－ＮＫ細胞にまさる利点は、ＣＢバンクが世界的に利用可能であることであり、それにより、ＮＫ細胞回収のためにドナーを募る必要なく、免疫療法用の、ＣＡＲによって操作された臍帯血由来ＮＫ細胞の既製の起源が可能になり得る。ＣＡＲで操作されたＮＫ細胞は、ＮＫ９２－ＣＡＲ形質導入細胞よりも有効である可能性が高い。なぜなら、後者は、前者と比べてＮＫ細胞殺滅の全機構を保持せず、注入前に放射線照射される必要があるので、その持続性および増殖に負の影響を受けるからである。さらに、ＮＫ細胞が解凍後も新鮮な対応物と同じ効力を保持するようにＮＫ細胞を凍結保存できると、このタイプの免疫療法が癌患者に対する既製の治療として使用できるようになるので、このように凍結保存できることは、極めて価値のあることである。

上記方法および組成物の特定の実施形態は、少なくとも以下を含む：ユニバーサル抗原提示細胞（ｕＡＰＣ）または他のフィーダー細胞およびインターロイキン（ＩＬ）－２を含むサイトカインを含む共培養における、凍結／解凍したＣＢ単位からのＮＫ細胞の頑健な拡大；ＣＡＲ構築物を有するＮＫ細胞の高いおよび一貫した形質導入レベル；新鮮な状態で注入され得るかまたはその後の注入のために凍結され得る非常に強力なＣＢ－ＮＫ－ＣＡＲ細胞の迅速な作製。作製された凍結済みＮＫ－ＣＡＲ生成物は、細胞の作製を待っている間に処置を延期する必要なく、意のままに解凍し、患者に注入できる真の「既製」の細胞療法を提供する。

１つの例では、健康ドナーの臍帯血（ＣＢ）から単離されたＮＫ細胞を、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、Ｋ５６２ベースのフィーダーまたは他のフィーダー細胞（例えば、リンパ芽球様細胞株またはビーズ））と共培養し、これを、ＩＬ－２を含む１つ以上のサイトカインの存在下において行う。次いで、そのＮＫ細胞に、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター（例として）を形質導入するか、またはスリーピングビューティー（ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙ）構築物もしくはピギーバック構築物をエレクトロポレートし、これらの構築物またはベクターにより、それらの細胞が血液癌および固形癌を標的化することが可能になる。次いで、形質導入された細胞を、ＡＰＣまたは他のフィーダーおよびＩＬ－２（または他のサイトカイン）を含む共培養においてさらに拡大して、強力なＣＢ－ＮＫ細胞を得る。１つの具体的な場合において、そのＮＫ細胞は、ＣＡＲを形質導入されたＮＫ細胞である。それらの細胞は、新鮮な状態で注入することもできるし、サイトカインを含む培地中で凍結して後日、解凍および注入することもできる。同じまたは類似のアプローチを用いることにより、ＣＡＲを形質導入されたＮＫ細胞を健康ドナーの末梢血（ＰＢ）もしくは患者のＰＢ、ＮＫ９２細胞などのＮＫ細胞株、人工多能性幹細胞または造血幹細胞または骨髄から作製し、凍結保存することができる。所望のＮＫ細胞（例えば、レトロウイルスベクターで遺伝的に改変されたＣＢ－ＮＫ細胞）を作製するための手順は、以下のとおりである：

ＣＡＲ－ＮＫ細胞の凍結保存。網羅的な一連の研究において、本発明者らは、ＣＡＲ－ＮＫ細胞の凍結保存を最適化した。デキストランおよびアルブミン（細胞外凍結保護物質）ならびにＤＭＳＯ（細胞内凍結保護物質）の添加が、標準的な凍結保存手法と比べて、解凍後に腫瘍細胞に対するＣＡＲ ＮＫ細胞の細胞傷害性を保存し、改善すらすると示された。

本発明者らは、生存率アッセイおよびインビトロ殺滅アッセイを用いて、種々の濃度のＰｌａｓｍａＬｙｔｅ、細胞外凍結保護物質（デキストランおよびヒトアルブミン）および細胞内凍結保護物質の濃度（ＤＭＳＯ ５％ 対 ７．５％）＋／－サイトカイン（ＩＬ－２もしくはＩＬ１５のみ、またはＩＬ－２／ＩＬ－１５もしくはＩＬ－２／ＩＬ－２１の組み合わせ）を比較した。

研究デザインの例を図９に示しており、ＣＡＲ－ＮＫ細胞を、様々な濃度のＰｌａｓｍａＬｙｔｅ、ＲＰＭＩ、デキストラン、ヒトアルブミンおよびＤＭＳＯを含む凍結培地中で凍結した。さらなる実験の詳細を図１０に要約しており、それには、ＲＰＭＩ 対 ＰｌａｓｍａＬｙｔｅの比較、種々の細胞外凍結保護物質（デキストランおよびヒトアルブミン）、凍結培地へのサイトカインの添加（ＩＬ－２／ＩＬ－１５）、および種々の細胞内凍結保護物質の濃度の比較（ＤＭＳＯ ５％ 対 ７．５％）が含まれている。解凍の直後または４時間後の、ＣＡＲ－ＮＫ細胞の解凍後の生存率および回収率を図１１に示し、これらの条件の間に大きな差は無いことが実証された。図１２は、解凍後のＣＡＲ発現を示しており、様々な条件の間に有意な差がなかった。図１３は、解凍後のＣＤ１６発現を示しており、様々な条件の間に有意な差がなかった。図１４は、解凍後のＣＤ５６発現を示しており、様々な条件の間に有意な差がなかった。図１５は、試験されたすべての条件で、優れた細胞傷害性が、解凍の直後にＲａｊｉおよびＫ５６２標的に対して実証されたことを示している。図１６では、細胞外の細胞保護剤（ＣＰＡ）であるデキストランの最適濃度が４０％以下であること、および４０％以下のデキストランを含む条件において凍結されたＣＡＲ ＮＫ細胞が、解凍の４時間後に、９０％血小板（ＰＬＴ）溶解産物＋１０％ＤＭＳＯ＋ＩＬ２／ＩＬ－１５または７０％デキストラン中で凍結された場合と比べて優れた細胞傷害性をＫ５６２およびＲａｊｉ標的に対して示すことが実証された。図１７は、ＩｎｃｕＣｙｔｅアッセイにおいて、試験されたすべての条件でＲａｊｉおよびＫ５６２標的の優れた殺滅を示した。また、図１８においてＩｎｃｕＣｙｔｅアッセイを用いたとき、本発明者らは、解凍後にＲａｊｉと共培養した後、長時間にわたって最小のＣＡＲ ＮＫ細胞死（＜２０％）が観察されたこと、および最初の２４時間において最大のアポトーシスが観察されたことを実証した。図１９は、すべての条件で解凍の４時間後のＣＡＲ ＮＫ細胞死（アネキシン染色）が最小だったこと（＜２０％）を示している。

次に、異なるサイトカインの組み合わせ（ＩＬ－２／ＩＬ－１５ 対 ＩＬ－２／ＩＬ－２１）を含む、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ 対 ＲＭＰＩ中の細胞外ＣＰＡおよび細胞内ＣＰＡに血小板溶解産物（ＰＬＴ Ｌｙｓ）またはＡＢ血清を添加する影響を試験した。凍結保存の前にＣＡＲ ＮＫ細胞を１５日間または２２日間、拡大した。より詳細な実験計画を図２０に示す。そこには、１５日間 対 ２２日間拡大されたＣＡＲ ＮＫ細胞に対する凍結条件の評価が説明されている。図２１では、１５日間拡大され、種々の条件を用いて凍結保存されたＣＡＲ ＮＫ細胞について、解凍後の優れた生存率（＞８５％）および回収率が実証された。図２２では、ＰＬＴＬｙｓａｔｅおよびＡＢ血清を凍結培地に添加すると、解凍後にＣＡＲ発現が保存され、異なるサイトカインの組み合わせ（ＩＬ－２／ＩＬ－１５ 対 ＩＬ－２／ＩＬ－２１）で観察されたＣＡＲ発現に差が無かったことが実証された。図２３では、ＰＬＴ溶解産物またはＡＢ血清＋サイトカインを凍結培地に添加した条件において最も高いＣＤ１６が観察されたことが実証された。図２４では、試験されたすべての条件で、高くて安定したＣＤ５６発現が実証された。図２５は、２２日間拡大され、種々の条件を用いて凍結保存されたＣＡＲ ＮＫ細胞が、ＩｎｃｕＣｙｔｅアッセイにおいて解凍の直後にＲａｊｉ細胞に対して優れた細胞傷害性を保持することを示している。図２６は、解凍後にＲａｊｉと共培養した後、長時間にわたって最小のＣＡＲ ＮＫ細胞死（＜２０％）がＩｎｃｕＣｙｔｅアッセイにおいて観察されたことを示している。

次いで、本発明者らは、１５日間 対 ２２日間拡大された凍結ＣＡＲ ＮＫ細胞において細胞外凍結保護物質の構成要素の用量を設定するために以下を選んだ：詳細には、凍結培地に添加されるＰＬＴＬｙｓａｔｅの濃度（２５％ 対 ５０％）；デキストラン濃度（２５％ 対 ５０％）および希釈剤（ＮＡＣＬ 対 デキストロース）；ならびにヒトアルブミン濃度（２０％ 対 ４５％ 対 ７０％）。ＩＬ－２／ＩＬ－１５サイトカインの組み合わせの添加で、すべての条件を試験した。図２７は、これらの研究の詳細なスキーマを示している。図２８では、試験されたすべての条件で、解凍後に優れた生存率（＞８７％）が示された。図２９は、（ｉ）２５％デキストランのデキストロース溶液＋７０％ヒトアルブミン＋５％ＤＭＳＯ、および（ｉｉ）５０％デキストランのデキストロース溶液＋４５％ヒトアルブミン＋５％ＤＭＳＯを含む凍結培地を除く試験されたほとんどの条件で、解凍の４時間後にアネキシン染色を用いたときのＣＡＲ ＮＫ細胞死が最小だった（＜２０％）を示している（ＮＫ細胞の解凍後のアポトーシスは約３０％だった）。図３０は、試験されたすべての条件に対するＩｎｃｕＣｙｔｅアッセイにおけるＲａｊｉおよびＫ５６２細胞の優れた殺滅を示している。図３１は、２５％デキストランのデキストロース溶液＋７０％ヒトアルブミン＋５％ＤＭＳＯ中で凍結された細胞（＞４０％が、解凍後、Ｒａｊｉとの共培養後にアポトーシスを起こした）を除くほとんどの条件について、最小のＣＡＲ ＮＫ細胞死が長時間にわたって観察されたことを示しており、最大のアポトーシスが最初の１６時間に観察された。図３２は、様々な凍結配合物が２つのサイトカインの組み合わせ（ＩＬ－２／ＩＬ－１５）を含む次の一連の研究のスキーマを示している。図３３は、試験されたすべての条件において、解凍直後のＣＡＲ ＮＫ細胞の優れた生存率（＞８９％）を示している。図３４は、解凍の４時間後のＣＡＲ ＮＫ細胞のＣＡＲ発現が似ていることを示している。図３５は、以下の３つの条件で凍結保存されたＣＡＲ ＮＫ細胞の解凍直後の細胞傷害性が劣ることを示している。

２５％デキストランのデキストロース溶液；７０％ヒトアルブミン；５％ＤＭＳＯ（黒丸）

２５％デキストランのＮＡＣＬ溶液；７０％ヒトアルブミン；５％ＤＭＳＯ＋ＩＬ－２／ＩＬ－１５（橙色菱形）

５０％デキストランのデキストロース溶液、４５％ヒトアルブミン；５％ＤＭＳＯ（青色三角）

図３５における５１クロム放出アッセイでのデータと一致して、図３６では、以下の２つの条件で凍結保存されたＣＡＲ ＮＫ細胞によるＫ５６２標的に対する細胞傷害性が劣ることが、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ殺滅アッセイを用いたライブイメージングによって確認された：

２５％デキストランのデキストロース溶液；７０％ヒトアルブミン；５％ＤＭＳＯ（黒丸）

５０％デキストランのデキストロース溶液、４５％ヒトアルブミン；５％ＤＭＳＯ（青色三角）

図３７～図４０は、様々な凍結配合物において臨床用ＣＡＲ－ＮＫ細胞生成物を評価するその後の研究の詳細なスキーマを示している。これらの研究は、上に記載された最適化された配合物を用いたとき、頑健かつ再現性のある生存率および殺滅を示した。まとめると、これらの研究から、新規の濃度の細胞内凍結保護物質および細胞外凍結保護物質、ならびにサイトカインを含む凍結保存配合物が、解凍後に優れた生存率、回収率およびインビトロ細胞傷害性を有する頑健なＣＡＲ－ＮＫ生成物をもたらすことが確認された。

これらの結果は、生物発光および生存解析によって示されたように、新鮮なＣＡＲ－ＮＫ細胞で観察されたものに匹敵する、Ｒａｊｉリンパ腫細胞に対する目覚ましい抗腫瘍活性によって異種マウスモデルにおいて再現された（図４１）。簡潔には、ＣＡＲ ＮＫ細胞を凍結保存するための最適な凍結培地を特定するために、本発明者らは、１３コホートのＮＳＧマウスに２×１０ｅ４個のＲａｊｉ細胞を接種した。その当日（０日目）に、１つのコホートには、１×１０ｅ７個の新鮮なＣＤ１９ ＣＡＲ ＮＫ細胞（ポジティブコントロール）を投与し、１１のコホートには、１×１０ｅ７個の凍結ＣＡＲ ＮＫ細胞を２回（０および７日目に）注入した（この凍結細胞は、表１（図４１）に詳述されたような凍結培地中で凍結保存され、解凍の直後に注入された）。１つのコホートには、ＣＡＲ ＮＫ細胞を投与しなかった（ネガティブコホート）。ＣＡＲ ＮＫ細胞を投与されたマウスは、ＣＡＲ細胞を凍結保存するために使用された凍結培地を問わず、未処置のままのマウスと比べて統計学的に有意に優れた生存率を示した（図４２）が、コホート＃６、＃８および＃１１については、新鮮なＣＡＲ ＮＫ細胞を投与されたマウスの生存率よりも明らかに生存率が劣っていた（図４２）。

新鮮な生成物と凍結された生成物との間に存在する可能性のある差をさらに評価するために、生存率についてはＣｏｘ回帰モデルを用いた。コホート＃１（ＨＲ＝０．８１１、ｐ＝０．７８）、＃２（ＨＲ＝０．６、ｐ＝０．４９）、＃３（ＨＲ＝０．９１６、ｐ＝０．９０）、＃４（ＨＲ＝０．８５９、ｐ＝０．８３）および＃７（ＨＲ＝０．８８３、ｐ＝０．８７）において処置されたマウスは、新鮮なＣＡＲ ＮＫ細胞生成物で処置されたマウスと比べて優れた生存率を示したが、それは統計学的に有意ではなかった。

腫瘍成長を測定するための生物発光イメージングを図４３に示す。図４１に列挙された種々の条件を用いて凍結されたＣＡＲ ＮＫ細胞で処置されたマウスに対する平均放射輝度が、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとしてそれぞれ新鮮なＣＡＲ ＮＫ細胞で処置されたマウスまたは処置なしのマウスと比べて示されている。Ｒａｊｉのみで処置された動物がすべて、２２日目に予定されていたＢＬＩの前に疾患で死亡したので、１７日目以降のＲＯＩは、Ｒａｊｉのみで処置された動物に対しては入手できなかった。試験されたすべての条件に対して、凍結ＣＡＲ ＮＫ細胞で処置されたマウスのＲＯＩ値である腫瘍制御は、新鮮なＣＡＲ ＮＫ群で観察されたものと等しいかまたはそれより良かった。

本開示の方法および組成物を用いれば、ＣＡＲを形質導入された臍帯血由来ＮＫ細胞は、液状腫瘍と固形腫瘍の両方を含む多くの癌を認識および攻撃できる既製の個別化されたＮＫ細胞起源を提供できる。任意の起源由来（臍帯血、末梢血、骨髄、ＮＫ９２細胞などの細胞株、ＨＳＣ由来、ｉＰＳＣ由来）のナチュラルキラー細胞のＣＡＲ形質導入または遺伝子編集によって、多くの癌の免疫療法において使用するための、および潜在的には、多くのウイルス感染症を処置するための、操作された細胞の持続性を延長することおよび有効性を改善することが可能になる。ＮＫ細胞が解凍後も新鮮な対応物と同じ効力を保持するようにＮＫ細胞を凍結保存できると、このタイプの免疫療法が癌患者に対する既製の治療として使用できるようになるので、このように凍結保存できることは、極めて価値のあることである。ＮＫ細胞は従来、凍結することが非常に難しく、ＮＫ細胞の凍結保存に利用可能な商業的または学術的な凍結プロトコルは現在のところ存在しないことに注意することが重要である。
実施例５－凍結保存培地の具体的な配合

本実施例は、凍結保存培地のための特定の配合を提供する。

以下のようなある特定の濃度を有する特定の配合の例が使用され得る：

本明細書中に開示および特許請求される方法のすべてが、本開示に鑑みて、過度の実験を行うことなく実施および実行され得る。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態の点から説明してきたが、本発明の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載された方法および方法の工程または工程の順序に変更が適用されてもよいことが当業者には明らかだろう。より詳細には、同じまたは類似の結果が達成される限り、化学的かつ生理的に関係するある特定の作用物質を本明細書中に記載される作用物質の代わりに用いてもよいことが明らかだろう。当業者に明らかなそのような類似の代替物および改変のすべてが、添付の請求項によって定義される本発明の趣旨、範囲および概念の範囲内であるとみなされる。

Claims (93)

1. 少なくとも１つの凍結保護物質、少なくとも１つの血清または非血清の血清代替物、ならびに少なくとも１つのサイトカインおよび／または少なくとも１つの成長因子を含む、凍結保存培地組成物。
2. 前記凍結保護物質が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセリン、グリセロール、ヒドロキシエトールデンプンまたはそれらの組み合わせである、請求項１に記載の組成物。
3. 前記非血清の代替物が、血小板溶解産物および／もしくは血液製剤溶解産物またはヒトもしくは動物の血清アルブミンを含む、請求項１または２に記載の組成物。
4. 前記少なくとも１つのサイトカインが、天然タンパク質、組換えタンパク質、合成タンパク質またはそれらの混合物である、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
5. 前記少なくとも１つのサイトカインが、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）承認のサイトカインである、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。
6. 前記組成物が、２つ以上のサイトカインを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
7. 前記少なくとも１つのサイトカインが、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、インターフェロン、腫瘍壊死因子、幹細胞因子、ＦＬＴ３－リガンド、ＡＰＲＩＬ、トロンボポエチン、エリトロポイエチンまたはそれらの組み合わせである、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物。
8. 前記血清が、動物由来血清である、請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物。
9. 前記動物由来血清が、ヒト血清またはウシ血清である、請求項８に記載の組成物。
10. 前記ヒト血清が、ヒトＡＢ血清である、請求項９に記載の組成物。
11. 前記凍結保護物質が、前記組成物の４～６％を構成する、請求項２～１０のいずれか１項に記載の組成物。
12. 前記凍結保護物質が、前記組成物の５～１０％を構成する、請求項２～１０のいずれか１項に記載の組成物。
13. 前記血清が、前記組成物の５～９９％を構成する、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組成物。
14. 前記血清が、前記組成物の９５％を構成する、請求項１～１３のいずれか１項に記載の組成物。
15. 前記血小板溶解産物が、前記組成物の５％～９９％を構成する、請求項３～１４のいずれか１項に記載の組成物。
16. 前記血小板溶解産物が、前記組成物の９５％を構成する、請求項３～１５のいずれか１項に記載の組成物。
17. 前記ＩＬ－２が、１～５０００Ｕ／ｍＬという濃度で存在する、請求項７～１６のいずれか１項に記載の組成物。
18. 前記ＩＬ－２が、４００Ｕ／ｍＬという濃度で存在する、請求項７～１６のいずれか１項に記載の組成物。
19. 前記ＩＬ－２１が、１０～３０００ｎｇ／ｍＬという濃度で存在する、請求項７～１８のいずれか１項に記載の組成物。
20. 前記ＩＬ－２１が、２０ｎｇ／ｍＬという濃度で存在する、請求項７～１９のいずれか１項に記載の組成物。
21. 前記ＩＬ－１５が、１０～２０００ｎｇ／ｍＬという濃度で存在する、請求項７～１９のいずれか１項に記載の組成物。
22. 前記組成物が、
    （ａ）血小板溶解産物、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅおよびロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）培地のうちの１つ以上；
    （ｂ）デキストラン、アルブミンおよびＤＭＳＯのうちの１つ以上；ならびに
    （ｃ）ＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－２１のうちの１つ以上
    を含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載の組成物。
23. 前記血小板溶解産物が、前記組成物の５０％～９０％である、請求項２２に記載の組成物。
24. 前記血小板溶解産物が、前記組成物の約５０％である、請求項２２または２３に記載の組成物。
25. 前記血小板溶解産物が、前記組成物の約９０％である、請求項２２または２３に記載の組成物。
26. 前記ＰｌａｓｍａＬｙｔｅが、前記組成物の約３２．５％～７０％である、請求項２２～２５のいずれか１項に記載の組成物。
27. 前記ＰｌａｓｍａＬｙｔｅが、前記組成物の約３２．５％である、請求項２２～２６のいずれか１項に記載の組成物。
28. 前記ＰｌａｓｍａＬｙｔｅが、前記組成物の約３５％である、請求項２２～２６のいずれか１項に記載の組成物。
29. 前記ＰｌａｓｍａＬｙｔｅが、前記組成物の約５０％である、請求項２２～２６のいずれか１項に記載の組成物。
30. 前記ＰｌａｓｍａＬｙｔｅが、前記組成物の約７０％である、請求項２２～２６のいずれか１項に記載の組成物。
31. 前記ＲＰＭＩが、前記組成物の３２．５％～５０％である、請求項２２～３０のいずれか１項に記載の組成物。
32. 前記ＲＰＭＩが、前記組成物の約３２．５％である、請求項２２～３１のいずれか１項に記載の組成物。
33. 前記ＲＰＭＩが、前記組成物の約３５％である、請求項２２～３１のいずれか１項に記載の組成物。
34. 前記ＲＰＭＩが、前記組成物の約５０％である、請求項２２～３１のいずれか１項に記載の組成物。
35. 前記デキストランが、前記組成物の約２５～４０％である、請求項２２～３４のいずれか１項に記載の組成物。
36. 前記デキストランが、前記組成物の約２５％である、請求項２２～３４のいずれか１項に記載の組成物。
37. 前記デキストランが、前記組成物の約４０％である、請求項２２～３４のいずれか１項に記載の組成物。
38. 前記アルブミンが、前記組成物の約１～９９％である、請求項２２～３７のいずれか１項に記載の組成物。
39. 前記アルブミンが、前記組成物の約２０％である、請求項２２～３８のいずれか１項に記載の組成物。
40. 前記ＤＭＳＯが、前記組成物の約５～７．５％である、請求項２２～３９のいずれか１項に記載の組成物。
41. 前記ＤＭＳＯが、前記組成物の５％である、請求項２２～４０のいずれか１項に記載の組成物。
42. 前記ＤＭＳＯが、前記組成物の７．５％である、請求項２２～４０のいずれか１項に記載の組成物。
43. 前記組成物が、以下：
    

    

    のうちの１つを含む、請求項１～４２のいずれか１項に記載の組成物。
44. 前記組成物が、以下
    

    

    のうちの１つを含む、請求項１～４３のいずれか１項に記載の組成物。
45. 複数の細胞をさらに含む、請求項１～４４のいずれか１項に記載の組成物。
46. 前記細胞が、成熟細胞、腫瘍細胞、幹細胞、人工多能性幹細胞、ＭＳＣまたはそれらの混合物に由来する、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ｉＮＫＴ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞、ＭＳＣ、マクロファージ、単球、樹状細胞、ＮＫＴ細胞である、請求項４４に記載の組成物。
47. 前記ＮＫ細胞が、拡大されたＮＫ細胞である、請求項４６に記載の組成物。
48. 請求項２２～４７のいずれか１項に記載の組成物および薬学的に許容され得るキャリアを含む、薬学的組成物。
49. 請求項２２～４７のいずれか１項に記載の組成物を作製する方法であって、前記細胞を有効量の前記凍結保存培地組成物に曝す工程を含む、方法。
50. 前記細胞が、免疫細胞または幹細胞である、請求項４９に記載の方法。
51. 前記細胞が、成熟細胞、腫瘍細胞、幹細胞、人工多能性幹細胞または造血幹細胞に由来する、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、インバリアントＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、ＭＳＣ、単球、マクロファージ、樹状細胞である、請求項４９または５０に記載の方法。
52. 前記細胞が、拡大されたＮＫ細胞である、請求項４９～５１のいずれか１項に記載の方法。
53. 請求項４９～５３のいずれか１項に記載の方法に従って作製された細胞の集団。
54. 請求項５３に記載の集団および薬学的に許容され得るキャリア。
55. 前記細胞が、免疫細胞または幹細胞である、請求項５３または５３に記載の集団。
56. 前記細胞が、成熟細胞、腫瘍細胞、幹細胞、人工多能性幹細胞またはＭＳＣに由来する、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、インバリアントＮＫＴ細胞である、請求項５３、５４または５５に記載の集団。
57. 前記ＮＫ細胞が、拡大されたＮＫ細胞である、請求項５６に記載の集団。
58. 被験体の免疫関連障害を処置する方法であって、有効量の請求項５３～５７のいずれか１項に記載の解凍された集団を前記被験体に投与する工程を含む、方法。
59. 前記免疫関連障害が、癌、自己免疫障害、移植片対宿主病、同種移植片拒絶または炎症状態である、請求項５８に記載の方法。
60. 前記集団が、成熟細胞、腫瘍細胞、幹細胞、人工多能性幹細胞またはＭＳＣに由来する、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、インバリアントＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞である細胞を含む、請求項５８または５９に記載の方法。
61. 前記免疫関連障害が、癌である、請求項５８～６０のいずれか１項に記載の方法。
62. 前記少なくとも１つのサイトカインが、前記被験体に対して治療効果を提供しないレベルで前記組成物中に存在する、請求項５８～６１のいずれか１項に記載の方法。
63. 前記組成物中の前記細胞が、前記投与工程の前に洗浄される、請求項５８～６２のいずれか１項に記載の方法。
64. 前記組成物中の前記細胞が、前記投与工程の前に洗浄されない、請求項５８～６２のいずれか１項に記載の方法。
65. 凍結保存に敏感な細胞を保存する方法であって、凍結保存に敏感な細胞を有効量の請求項１～４７のいずれか１項に記載の凍結保存培地組成物に曝す工程を含む、方法。
66. 前記細胞が、成熟細胞、幹細胞、人工多能性幹細胞またはＭＳＣに由来する、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、インバリアントＮＫＴ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞である、請求項６５に記載の方法。
67. 前記凍結保存培地組成物に曝される細胞を入手または提供する工程をさらに含む、請求項６５または６６に記載の方法。
68. 有効量の前記細胞が、前記細胞の凍結保存および解凍の後に、それを必要とする被験体に送達される、請求項６５～６７のいずれか１項に記載の方法。
69. 前記細胞が、前記被験体に対して同種異系または自己の細胞である、請求項６８に記載の方法。
70. 前記被験体が、癌、自己免疫障害、移植片対宿主病、同種移植片拒絶または炎症状態を有する、請求項６８または６９に記載の方法。
71. 前記少なくとも１つのサイトカインが、前記被験体に対して治療効果を提供しないレベルで前記組成物中に存在する、請求項６８～７０のいずれか１項に記載の方法。
72. 前記組成物中の前記細胞が、前記投与工程の前に洗浄される、請求項６８～７１のいずれか１項に記載の方法。
73. 前記組成物中の前記細胞が、前記投与工程の前に洗浄されない、請求項６８～７１のいずれか１項に記載の方法。
74. 細胞集団の生存率を前記集団の凍結保存の後に少なくとも５０％パーセント超で維持する方法であって、前記方法は、有効量の請求項１～４４のいずれか１項に記載の凍結保存培地組成物に前記集団を曝す工程、および前記集団を解凍する工程を含み、解凍したとき、前記集団の生存率は、少なくとも５０％超である、方法。
75. 解凍したとき、前記細胞集団の生存率が、前記集団の凍結保存後に、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％超である、請求項７４に記載の方法。
76. 前記細胞が、成熟細胞、腫瘍細胞、幹細胞、人工多能性幹細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞またはＭＳＣに由来する、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、インバリアントＮＫＴ細胞である、請求項７４～７５のいずれか１項に記載の方法。
77. 細胞集団の凍結保存の際に前記集団の有効期間を延長する方法であって、有効量の請求項１～４４のいずれか１項に記載の凍結保存培地組成物に前記集団を曝す工程を含む、方法。
78. 前記細胞が、成熟細胞、腫瘍細胞、幹細胞、人工多能性幹細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞またはＭＳＣに由来する、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、インバリアントＮＫＴ細胞である、請求項７７に記載の方法。
79. 前記細胞を入手する工程をさらに含む、請求項７７または７８に記載の方法。
80. 前記細胞の凍結保存および解凍の後、有効量の前記細胞が、それを必要とする被験体に送達される、請求項７７～７９のいずれか１項に記載の方法。
81. 前記細胞が、前記被験体に対して同種異系または自己の細胞である、請求項８０に記載の方法。
82. 前記被験体が、癌、自己免疫障害、移植片対宿主病、同種移植片拒絶、細菌感染症、ウイルス感染症もしくは真菌感染症、または炎症状態を有する、請求項８０または８１に記載の方法。
83. 前記少なくとも１つのサイトカインが、前記被験体に対して治療効果を提供しないレベルで前記組成物中に存在する、請求項８０～８２のいずれか１項に記載の方法。
84. 前記組成物中の前記細胞が、前記投与工程の前に洗浄される、請求項８０～８３のいずれか１項に記載の方法。
85. 前記組成物中の前記細胞が、前記投与工程の前に洗浄されない、請求項８０～８３のいずれか１項に記載の方法。
86. 請求項１～４４のいずれか１項に記載の凍結保存培地組成物を用いて凍結保存されていた集団細胞を解凍する方法であって、
    前記細胞集団を有効量の前記凍結保存培地組成物に曝露して、凍結保存集団を作製する工程；および
    前記凍結保存集団を好適な解凍条件に曝露する工程
    を含む、方法。
87. 個体の標的部位または標的組織に細胞を送達する方法であって、前記方法は、前記細胞の解凍後、実質的に直ちにまたはすぐに、有効量の細胞を前記標的部位または標的組織に注入する工程を含み、前記細胞は、請求項１～４４のいずれか１項に記載の凍結保存培地組成物中で凍結保存されていた、方法。
88. 前記標的部位または標的組織が、癌性である、請求項８７に記載の方法。
89. 前記標的部位または標的組織が、固形腫瘍である、請求項８７に記載の方法。
90. 少なくとも１つのサイトカインが、前記被験体に対して治療効果を提供しないレベルで前記組成物中に存在する、請求項８７～８９のいずれか１項に記載の方法。
91. 前記組成物中の前記細胞が、前記投与工程の前に洗浄される、請求項８７～９０のいずれか１項に記載の方法。
92. 請求項１～４４のいずれか１項に記載の凍結保存培地中に含められている、１つ以上の免疫細胞。
93. 前記細胞が、成熟細胞、幹細胞、人工多能性幹細胞、ＭＳＣまたはそれらの混合物に由来する、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、インバリアントＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞である、請求項９２に記載の細胞。
    

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