CN117098543A - 用于选择冷冻保存的脐带血单位以制备具有增强的抗癌效力的工程化自然杀伤细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本公开的实施方案涉及与优化脐带血单位选择相关的方法和组合物，以产生用于过继性细胞治疗用途的免疫细胞，例如NK细胞。在特定的实施方案中，分析了脐带血单位的具体特征和/或源自其的细胞的特征特征。当一个或多个脐带血单位和/或源自其的细胞的特征满足一种或多种特征的阈值测量时，利用所述一个或多个脐带血单位作为产生免疫细胞的来源。测量的具体特征包括脐带血细胞活力、总的核细胞回收率和有核红细胞含量，每一种都在冷冻保存之前测量，以及任选地冷冻保存之后测量免疫细胞的细胞毒性和/或扩增。

Description

用于选择冷冻保存的脐带血单位以制备具有增强的抗癌效力 的工程化自然杀伤细胞的方法

本申请要求2021年3月22日提交的申请号为63/164,379的美国临时专利申请和2021年9月13日提交的申请号为63/243,669的美国临时专利申请的优先权，这两个申请的全部内容均通过引用方式并入本文。

技术领域

本公开的实施方案至少涉及细胞生物学、分子生物学、免疫学和医学的技术领域。

背景技术

经修饰以表达CAR的脐带血来源的自然杀伤(NK)细胞是对抗癌症的有效疗法。事实上，脐带来源的NK细胞可以被修饰(通过遗传或非遗传方法)来治疗多种恶性肿瘤和感染。冷冻保存的脐带血单位可容易地在生物样本库中获得(因为它们被用作干细胞移植的细胞源)，并且可以提供足够数量的NK细胞来制备用于临床用途的多种细胞治疗产品。使用脐带血单位作为NK细胞来源的替代方案是通过白细胞单采术(leukoapheresis)从健康供体获得细胞。这一程序较复杂，而且对供体来说也存在风险。NK细胞产品的临床疗效在很大程度上受到冷冻保存的脐带单位的特征的影响。本公开满足了现有技术中获取合适细胞以用于细胞治疗的长期存在的需求。

发明内容

本公开涉及与个体的细胞疗法相关的方法和组合物。细胞疗法可以是任何类型的，但在特定的实施方案中，细胞疗法包含使用免疫细胞的过继性细胞疗法，这些免疫细胞至少包括在向需要细胞的个体施用之前终归可以受到修饰的免疫细胞。在特定的实施方案中，本公开涉及鉴定特别适合于产生用于个体的过继性细胞疗法的有效免疫细胞的脐带血单位，包括比在未鉴定的情况下选择脐带血更有效的情况。

本公开涉及鉴定最有可能产生用于治疗患者的高效免疫细胞治疗产品的脐带血单位的多部分策略，这些治疗包括治疗任何类型的医学病况，至少诸如任何类型的癌症或感染。本公开提供了一组选择标准，包括以下标准：(i)在冷冻保存脐带血单位之前，(ii)冻融后和免疫细胞制备开始时，诸如在GMP设施中，以及(iii)在制备过程中和制备结束时的免疫细胞特征。

具体实施方案包括选择脐带血组合物的方法，包括在冷冻保存或使用脐带血组合物之前进行测量的以下步骤：(a)脐带血细胞活力；(b)任选地总单核细胞(TNC)回收率；(c)有核红细胞(NRBC)含量；(d)脐带血所来源的婴儿的体重；(e)脐带血所来源的婴儿的生物学母亲和/或生物学父亲的种族；(f)任选的脐带血所来源的婴儿的胎龄；(g)任选地子宫内采集脐带血(尽管在本公开的任何方法中可以使用子宫外或子宫内与子宫外的组合)；(h)任选地脐带血所来源的是生物学男性婴儿；(i)任选地处理前体积(采集的脐带血加上抗凝剂(一个示例是35ml柠檬酸磷酸盐右旋糖(CPD))的体积)≤120mL；(j)任选地抽取的脐带血的细胞为>0.4％ CD34+；并且任选地在冷冻保存之后测量(k)源自冻融后脐带血组合物的免疫细胞的细胞毒性；以及(l)在冻融后的培养期间，源自脐带血的免疫细胞(包括NK细胞)的倍数扩增。在特定的实施方案中，该标准满足其中至少一种特征的定量阈值。

在特定情况下，满足以下一项或多项标准：(a)脐带血细胞活力大于或等于98％或99％；(b)任选地总单核细胞(TNC)回收率大于或等于76.3％；以及(c)有核红细胞(NRBC)含量小于或等于7.5x10⁷或8.0x10⁷或者其间的任何量。

本公开的实施方案涵盖选择脐带血组合物的方法，包括以下步骤：在冷冻保存脐带血组合物之前测量：(a)脐带血细胞活力；(b)任选地总单核细胞(TNC)回收率；(c)有核红细胞(NRBC)含量；(d)脐带血所来源的婴儿的体重；(e)脐带血所来源的婴儿的生物学母亲和/或生物学父亲的种族；(f)任选地脐带血所来源的婴儿的胎龄；(g)任选地子宫内采集脐带血(尽管在本公开的任何方法中可以使用子宫外或子宫内与子宫外的组合)；(h)任选地脐带血所来源的是生物学男性婴儿；(i)任选地处理前体积(采集的脐带血加上抗凝剂(35ml CPD)的体积)≤120mL；(j)任选地，抽取的脐带血的细胞为>0.4％ CD34+；并且在冷冻保存之后，任选地测量(k)源自冻融后脐带血组合物的免疫细胞的细胞毒性。在特定的实施方案中，免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞。所述方法可以进一步包括扩增NK细胞和/或修饰NK细胞的步骤。在一些情况下，对NK细胞进行修饰以表达一种或多种非内源性基因产物，诸如一种或多种非内源性受体(诸如一种或多种嵌合受体，包括一种或多种嵌合抗原受体和/或一种或多种非天然T细胞受体)。在一些情况下，非内源性基因产物包含一种或多种非内源性受体、一种或多种细胞因子、一种或多种趋化因子、一种或多种酶或者其组合。可以对NK细胞进行修饰以破坏NK细胞中一种或多种内源性基因的表达。

在一个实施方案中，有一种选择脐带血组合物的方法，包括以下步骤：在冷冻保存之前鉴定脐带血组合物，确定其具有以下一种或多种特征：(a)脐带血细胞活力大于或等于98％或99％；(b)任选地总单核细胞(TNC)回收率大于或等于76.3％；(c)有核红细胞(NRBC)含量小于或等于7.5x10⁷或8.0x10⁷或者其间的任何量；(d)脐带血所来源的婴儿的体重大于3650克；(e)脐带血所来源的婴儿的生物学母亲和/或生物学父亲的种族是白种人；(f)任选地脐带血所来源的婴儿的胎龄小于或等于约38周；(g)任选地子宫内采集脐带血(尽管在本公开的任何方法中可以使用子宫外或子宫内与子宫外的组合)；(h)任选地脐带血所来源的是生物学男性婴儿；(i)任选地处理前体积(采集的脐带血加上抗凝剂(35ml CPD)的体积)≤120mL；(j)任选地，抽取的脐带血的细胞为>0.4％ CD34+；并且任选地(k)测量源自冻融后脐带血组合物的免疫细胞的细胞毒性。在一些情况下，在冷冻保存之前确定脐带血组合物至少具有(a)和(b)；确定其具有(b)和(c)；确定其具有(a)和(c)；或者确定其具有(a)、(b)和(c)。

在特定情况下，对于(a)而言，脐带血细胞活力大于或等于98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％。在特定情况下，对于(b)而言，TNC回收率大于或等于77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在特定情况下，NRBC含量小于或等于8.0x10⁷、7.9x10⁷、7.8x10⁷、7.7x10⁷、7.6x10⁷、7.5x10⁷、7.0x10⁷、6.0x10⁷、5.0x10⁷、4.0x10⁷、3.0x10⁷、2.0x10⁷、1.0x10⁷、9.0x10⁶、8.0x10⁶、7.0x10⁶、6.0x10⁶、5.0x10⁶、4.0x10⁶、3.0x10⁶、2.0x10⁶、1.0x10⁶、9.0x10⁵、8.0x10⁵、7.0x10⁵、6.0x10⁵、5.0x10⁵、4.0x10⁵、3.0x10⁵、2.0x10⁵、1.0x10⁵、9.0x10⁴、8.0x10⁴、7.0x10⁴、6.0x10⁴、5.0x10⁴、4.0x10⁴、3.0x10⁴、2.0x10⁴、1.0x10⁴、9.0x10³、8.0x10³、7.0x10³、6.0x10³、5.0x10³、4.0x10³、3.0x10³、2.0x10³、1.0x10³、9.0x10²、8.0x10²、7.0x10²、6.0x10²、5.0x10²、4.0x10²、3.0x10²、2.0x10²、1.0x10²，如此等等。在特定情况下，脐带血所来源的婴儿的体重大于3650克。在特定情况下，脐带血所来源的生物学母亲的种族是白种人和/或脐带血所来源的婴儿的生物学父亲是白种人。在特定的实施方案中，脐带血所来源的婴儿的胎龄小于或等于约38周。在某些实施方案中，脐带血可以通过任何合适的方法获得，但在特定的实施方案中，脐带血在子宫内、子宫外或二者兼有而获得，尽管在特定的情况下，脐带血仅由子宫内获得。在某些实施方案中，所抽取脐带血的体积加上约35mL的抗凝剂体积≤120mL，如此使得所抽取脐带血的体积不大于约85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31或30mL，或者更小的体积。

本文所包含的任何方法可以进一步包括从冻融的脐带血组合物衍生免疫细胞的步骤。免疫细胞可以是NK细胞、恒定NK细胞、NK T细胞、T细胞、B细胞、单核细胞、粒细胞、髓系细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、干细胞或其混合物。在特定情况下，源自冻融后脐带血组合物的免疫细胞是NK细胞，并且细胞毒性大于或等于66.7％。细胞毒性可以大于或等于67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

在一些实施方案中，脐带血来源于胎龄小于或等于39或38周的胎儿或婴儿。脐带血可以来源于胎龄小于或等于下列的胎儿或婴儿：39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25或24周，或者更短时间。在某些情况下，该方法进一步包括确定冻融后脐带血细胞的活力。在特定方面中，冻融后脐带血细胞的活力大于或等于86.5％，诸如大于或等于87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

当源自冻融的脐带血组合物的免疫细胞是NK细胞时，可以对它们进行扩增。扩增参数可以根据或不根据具体情况而确定。可以在培养特定天数之后对扩增进行定量，诸如第0天至第15天以及其间的任何范围。细胞的扩增倍数可以是任何合适的量，例如至少或大于约3倍、5倍、7倍、10倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、125倍、150倍、175倍、200倍、225倍、250倍、275倍、300倍、325倍、350倍、375倍、400倍、425倍、450倍、475倍、500倍等等。在某些情况下，NK细胞在培养第0天至第6天的扩增大于或等于7倍。在某些情况下，NK细胞在培养第6天至第15天的扩增大于或等于10倍。在特定情况下，扩增在0至15天或6至15天或0至6天(以及其间的任何范围)进行，并且具有大于70倍的扩增。在特定情况下，扩增在0至15天(以及其间的任何范围)进行，并且具有大于450倍的扩增。任何倍数水平的扩增天数范围可以包括0-15、0-14、0-13、0-12、0-11、0-10、0-9、0-8、0-7、0-6、0-5、0-4、0-3、0-2、0-1、1-15、1-14、1-13、1-12、1-11、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-15、2-14、2-13、2-12、2-11、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-15、3-14、3-13、3-12、3-11、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-15、4-14、4-13、4-12、4-11、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-15、5-14、5-13、5-12、5-11、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、6-15、6-14、6-13、6-12、6-11、6-10、6-9、6-8、6-7、7-15、7-14、7-13、7-12、7-11、7-10、7-9、7-8、8-15、8-14、8-13、8-12、8-11、8-10、8-9、9-15、9-14、9-13、9-12、9-11、9-10、10-15、10-14、10-13、10-12、10-11、11-15、11-14、11-13、11-12、12-15、12-14、12-13、13-15、13-14、14-15等等。

可以对NK细胞进行修饰，例如经过修饰以表达一种或多种非内源性基因产物，诸如非内源性受体，包括嵌合受体例如嵌合抗原受体，或非内源性受体是非天然T细胞受体。在一些情况下，非内源性基因产物包含一种或多种非内源性受体、一种或多种细胞因子、一种或多种趋化因子、一种或多种酶或者其组合。在特定情况下，对源自所冻融脐带血组合物的免疫细胞进行修饰以破坏细胞中一种或多种内源性基因的表达。

在特定情况下，脐带血细胞活力大于98％或99％，TNC回收率大于76.3％，并且NRBC含量低于7.5x10⁷或8.0x10⁷或者其间的任何范围，包括7.5x10⁷-8.0x10⁷、7.5x10⁷-7.9x10⁷；7.5x10⁷-7.8x10⁷；7.5x10⁷-7.7x10⁷；7.5x10⁷-7.6x10⁷；7.6x10⁷-8.0x10⁷；7.6x10⁷-7.9x10⁷；7.6x10⁷-7.8x10⁷；7.6x10⁷-7.7x10⁷；7.7x10⁷-8.0x10⁷；7.7x10⁷-7.9x10⁷；7.7x10⁷-7.8x10⁷；7.8x10⁷-8.0x10⁷；7.8x10⁷-7.9x10⁷；7.9x10⁷-8.0x10⁷。在特定的实施方案中，脐带血来源于胎龄小于或等于39或38周的胎儿或婴儿，冻融后脐带血细胞的活力大于或等于86.5％(这是任选的)，NK细胞在培养第0天至第6天的扩增大于或等于3倍，并且NK细胞在培养第6天至第15天的扩增大于或等于100倍，并且NK细胞在第0天至第15天的扩增大于或等于900倍。在特定情况下，扩增持续6至15天，并且具有大于70倍的扩增。在特定情况下，扩增持续0至15天，并且具有大于450倍的扩增。

本公开的实施方案包括通过本文所涵盖的任何一种方法鉴定的脐带血组合物。该组合物可以包含在药学上可接受的载剂中。该组合物可以与一种或多种冷冻保护剂一起配制。

本公开的实施方案包括含有源自本文所涵盖的任何方法的免疫细胞群的组合物。

在一些实施方案中，有一种预测免疫细胞治疗功效的方法，包括测量一种或多种未冷冻的脐带血组合物的以下特征：(a)脐带血细胞活力；(b)任选地总单核细胞(TNC)回收率；(c)有核红细胞(NRBC)含量；(d)脐带血所来源的婴儿体重；(e)脐带血所来源的婴儿生物学母亲和/或生物学父亲的种族是白种人；(f)任选地脐带血所来源的婴儿胎龄；其中当脐带血组合物具有一种或多种以下特征时，免疫细胞对治疗有效：(a)脐带血细胞活力大于或等于98％或99％；(b)任选地总单核细胞(TNC)回收率大于或等于76.3％；(c)有核红细胞(NRBC)含量小于或等于8.0x10⁷；(d)脐带血所来源的婴儿体重大于3650克；(e)脐带血所来源的婴儿生物学母亲和/或生物学父亲的种族是白种人；(f)任选地脐带血所来源的婴儿胎龄小于或等于约38周。该方法可以进一步包括冷冻一种或多种血液组合物的步骤。该方法可以进一步包括在冻融后测量(d)源自脐带血组合物的免疫细胞的细胞毒性。在一些情况下，细胞毒性大于或等于66.7％。

上文已经较为广泛地概述了本公开的特征和技术优势，以便可以更好地理解下文的详细描述。附加特征和优势将在下文描述，它们构成本文权利要求的主题。本领域技术人员应当理解，所公开的构思和具体实施方案可以很容易地用作修改或设计其他结构的基础，以实现与本设计相同的目的。本领域技术人员还应当认识到，这种等同构造并不脱离如所附权利要求中阐述的精神和范围。当结合附图考虑时，根据以下描述将更好地理解被认为是本文所公开设计的特征的新的特征，无论是在组织结构和操作方法方面，还是在其他目的和优势方面。然而，应当明确地理解，每个附图仅是出于说明和描述的目的而提供，而并非意在作为对本公开进行限制的解释。

附图说明

为了更全面地理解本公开，现在结合附图提及以下描述。

图1.冷冻前CBU特征预测针对细胞活力的临床应答。

图2.冷冻前CBU特征预测针对总单核细胞(TNC)回收率的临床应答。

图3.冷冻前CBU特征预测针对有核红细胞(NRBC)含量减少的临床应答。

图4.当通过患者临床特征调整时，在多元模型中三种CBU特征是应答的独立预测因子。

图5.30天应答时的CBU有利特征的数量(交叉表)。

图6.未转导NK细胞(来自冷冻CB)对Raji肿瘤细胞的杀伤是临床应答的独立预测因子(通过⁵¹Cr释放测定法测量)。

图7A-7B.使用其他参数来提高对临床应答的预测，针对使用细胞活力>98％；TNC回收率>76.3％；和NRBC含量(7A)，相比于使用这三项参数以及胎龄<39周；脐带血冻融后活力>86.5％；NK细胞在培养第0天至第6天的扩增大于或等于3倍；NK细胞在培养第6天至第15天的扩增大于或等于100倍和/或NK细胞在培养第0天至第15天的扩增大于或等于900倍。

图8A示出了通过流式细胞术测量的脐带血单位的细胞活力可用于预测完全应答的实现，并将99％确定为预测应答的最佳截断值。图8B示出了根据脐带单位的细胞活力的+30总体应答(PR/CR)和完全应答(CR)。接受源自活力≥99％的CBU的细胞产物的患者比接受源自较低活力的CBU的细胞产物治疗的患者具有统计学显著的更好的临床应答。

图9显示了脐带血单位的有核红细胞计数，其预测临床应答的实现。

图10A提供了种族信息，因为它与所选择的脐带血单位和治疗应答相关。图10B示出了根据冷冻前CBU活力和CBU种族的第30天应答。与接受源自冷冻前活力≥99％但不属于白色人种的CBU的细胞产物的患者相比，接受源自冷冻前活力≥99％且属于白色人种的CBU的细胞产物的患者具有统计学显著的CR率。

图11显示了对于脐带血的婴儿体重，因为它与疗法的成功相关。

图12A-12C示出了基于四项特定标准的CBU选择是决定患者应答的主要因素。

图13提供了在接受不同NK细胞产物治疗的19名患者的独立样本中进行验证。

图14证明了添加其他特征可提高模型的预测能力。

详细描述

Ⅰ.定义示例

如本文在说明书中所用的，“一个/种(a)”或“一个/种(an)”可以表示一个/种或多个/种。如本文在权利要求中所用的，当与词语“包含/包括(comprising)”结合使用时，单词“一个/种(a)”或“一个/种(an)”可以表示一个/种或多于一个/种。本公开的一些实施方案可以由或者基本上由本公开的一个/种或多个/种要素、方法步骤和/或方法组成。可以设想的是，本文所述的任何方法或组合物都可以与本文所述的任何其他方法或组合物一起实施，并且可以将不同的实施方案组合在一起。

权利要求中使用术语“或”用于表示“和/或”，除非明确说明仅指备选方案或备选方案相互排斥，尽管本公开支持仅指备选方案和“和/或”的定义。例如，“x、y和/或z”可以指单独的“x”、单独的“y”、单独的“z”、“x、y和z”、“(x和y)或z”、“x或(y和z)”或者“x或y或z”。可以特别设想的是，x、y或z可以明确地排除在实施方案之外。如本文所用的，“另一个/种”可以表示至少第二个/种或更多个/种。术语“约”、“基本上”和“大概”通常表示所列值加上或减去5％。

在整个本说明书中，除非上下文另有要求，否则会将词语“包含”、“包括”和“含有”理解为意味着包含某个指定步骤或要素或者步骤或要素组，但不排除任何其他步骤或要素或者步骤或要素组。所谓“由……组成”意思是包括且限于短语“由……组成”之后的任何内容。因此，短语“由……组成”表示列出的要素是必需的或强制性的，并且不能出现其他要素。所谓“基本上由……组成”意思是包括该短语之后列出的任何要素，并且仅限于不干扰或无助于所列要素在本公开中指定的活动或作用的其他要素。因此，短语“基本上由……组成”表示列出的要素是必需的或强制性的，而其他要素是可选的，并且可能存在或不存在，这取决于它们是否会影响所列要素的活动或作用。

如本文所用的术语“脐带血组合物”或“脐带血单位”指的是最初从分娩后胎盘和/或附着的脐带中获得的一定体积的脐带血。脐带血单位或脐带血组合物在其采集后可以储存或不储存在储存设施中。在一些情况下，脐带血单位或脐带血组合物含有源自单个个体的血液，而在其他情况下，脐带血单位或脐带血组合物是来自多个个体的混合物。

如本文所用的术语“冷冻保存”指的是在低于冰点的温度冷却和储存细胞的过程。在具体示例中，冷冻保存的温度至少低至-80℃。冷冻保存可以包括也可以不包括在冷冻之前向细胞中添加一种或多种冷冻保护剂。冷冻保护剂的实例包括二甲基亚砜(DMSO)、羟乙基淀粉、葡聚糖40或其组合。在一个具体实例中，可以采用在5ml 55％二甲基亚砜/5％葡聚糖40(在0.9％氯化钠溶液中)中的6％羟乙基淀粉(在0.9％氯化钠溶液中)。

如本文所用的，基因的“破坏”指的是与不存在破坏的情况下基因产物的表达水平相比，消除或降低由主题基因编码的一种或多种基因产物在细胞中的表达。示例性基因产物包括由基因编码的mRNA和蛋白产物。在一些情况下，破坏是暂时的或可逆的，而在其他情况下，破坏是永久性的。在一些情况下，破坏的是功能性或全长蛋白质或mRNA，尽管有可能产生截短型或非功能性产物。在本文的一些实施方案中，基因活性或功能而非其表达受到破坏。基因破坏通常由人工方法诱导，即通过添加或引入化合物、分子、复合物或组合物，和/或通过破坏基因的核酸或与基因相关联的核酸，例如在DNA水平上。用于基因破坏的示例性方法包括基因沉默、敲低、敲除和/或基因破坏技术，例如基因编辑。实例包括反义技术，诸如RNAi、siRNA、shRNA和/或核酶，其通常导致表达的瞬时减少，以及基因编辑技术，其导致靶向基因失活或破坏，例如通过诱导断裂和/或同源重组。实例包括插入、突变和缺失。破坏通常导致由基因编码的正常或“野生型”产物的表达受到抑制和/或完全缺失。这种基因破坏的示例是基因或部分基因的插入、移码和错义突变、缺失、敲入和敲除，包括整个基因的缺失。此类破坏可发生在编码区中，例如在一个或多个外显子中，导致无法产生全长产物、功能性产物或任何产物，诸如通过插入终止密码子。这种破坏也可以通过破坏启动子或增强子或影响转录激活的其他区域而发生，从而阻止基因的转录。基因破坏包括基因打靶，包括通过同源重组导致的靶向基因失活。

如本文所用的术语“工程化”或“工程化改造”指的是由人工生成的实体(或生成该实体的过程)，包括细胞、核酸、多肽、载体等。在至少一些情况下，工程化实体是合成的并且包含并非天然存在或以其在本公开中使用的方式进行配置的元件。就细胞而言，可以对细胞进行工程化改造，因为它们降低了一种或多种内源性基因的表达和/或因为它们表达一种或多种异源基因(诸如合成抗原受体和/或细胞因子)，在这种/这些情况下，工程化改造全部通过人工进行。就抗原受体而言，可以将抗原受体视为工程化的，因为它包含多种组分，这些组分经过遗传重组以自然界中并不存在的方式进行配置，诸如以自然界中并不存在如此配置的组分形成的融合蛋白的形式。

如本文所用的术语“异源”指的是来源于与接受体不同的细胞类型或不同的物种。在特定情况下，它指的是合成的和/或并非来自NK细胞的基因或蛋白质。该术语也指合成来源的基因或基因构建体。该术语也指合成来源的基因或基因构建体。例如，可以将细胞因子视为相对于NK细胞为异源的，即使该细胞因子是由NK细胞天然产生的，因为它是合成来源的，诸如通过遗传重组，包括以含有编码该细胞因子的核酸序列的载体形式提供给NK细胞。

如本文所用的术语“免疫细胞”指的是作为免疫系统的一部分并协助身体对抗感染和其他疾病的细胞。免疫细胞包括自然杀伤细胞、恒定NK细胞、NK T细胞、任何种类的T细胞(例如，调节性T细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞或γδT细胞)、B细胞、单核细胞、粒细胞、髓系细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和/或干细胞(例如，间充质干细胞(MSC)或诱导性多能干(iPSC)细胞)。本文还提供了在选择合适的脐带血单位后产生和工程化改造免疫细胞的方法，以及使用和施用细胞用于过继性细胞疗法的方法，在这种情况下，相对于脐带血的来源和细胞的接受体而言，细胞可以是自体的或同种异体的。

在整个本说明书中提及“一个实施方案”、“实施方案”、“特定实施方案”、“相关实施方案”、“某个实施方案”、“其他实施方案”或“另一实施方案”或者其组合意指结合实施方案描述的特定特征、结构或属性包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，在整个本说明书的各处出现的前述短语不一定都指同一实施方案。此外，特定特征、结构或属性可以在一个或多个实施方案中以任何合适的方式进行组合。

疾病或病况的“治疗”或“处理”指的是执行方案，其可以包括向患者施用一种或多种药物，以努力缓解疾病的体征或症状。治疗的期望效果包括降低病情进展速度、改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。缓解可以发生在疾病或病况的体征或症状出现之前，也可以发生在它们出现之后。因此，“治疗”或“处理”可以包括“预防”或“防止”疾病或不良病况。另外，“治疗”或“处理”不需要完全缓解体征或症状，不需要治愈，并特别包括对患者仅产生边际效应的方案。

在整个本申请中使用的术语“治疗有益”或“治疗有效的”指的是就该病况的医学治疗而言促进或增强受试者安康的任何事物。这包括但不限于降低疾病体征或症状的频次或严重程度。举例来说，癌症的治疗可能涉及例如缩小肿瘤的大小、降低肿瘤的侵袭性、降低癌症的生长速率或预防转移。癌症的治疗也可以指延长患有癌症的受试者的存活。

“受试者”、“患者”和“个体”可以互换，并且可以指人类或非人类，诸如灵长类动物、哺乳动物和脊椎动物。在特定的实施方案中，受试者是人类。受试者可以是作为方法或材料对象的任何生物体或动物受试者，包括哺乳动物，例如人类、实验动物(如灵长类动物、大鼠、小鼠、兔)、家畜(如牛、绵羊、山羊、猪、火鸡和鸡)、家庭宠物(如狗、猫和啮齿类动物)、马以及转基因非人动物。受试者可以是患者，例如其患有或疑似患有某种疾病(可以称之为医学病况)，诸如一种或多种感染性疾病、一种或多种遗传性病症、一种或多种癌症或者其任意组合。如本文所用的“受试者”或“个体”可能会或可能不会被安置在医疗机构中，并且可能作为医疗机构的门诊患者进行治疗。个体可以通过互联网接收一种或多种医疗组合物。个体可以包括任何年龄的人类或非人动物，因此包括成年和青少年(例如儿童)和婴儿，并且包括子宫内的个体。受试者可能需要也可能不需要医学治疗；个体可能自愿或非自愿地参与实验，无论是临床实验还是支持基础科学研究的实验。

短语“药学上或药理学上可接受的”指的是在适当地施用于动物诸如人类时，不会产生有害反应、过敏反应或其他不良反应的分子实体和组合物。制备包含抗体或另外活性成分的药物组合物对于本领域技术人员来说根据本公开内容将是已知的。而且，对于动物(例如人类)施用，应当理解的是，制剂应符合FDA生物制品标准部门所要求的无菌、热原性、一般安全性和纯度标准。

如本文所用的术语“任选地”指的是在本公开的任何方法中可以使用或不使用的要素、步骤或参数。

如本文所用的，“药学上可接受的载剂”包括任何和所有水性溶剂(例如，水、醇/水溶液、盐水溶液、胃肠外媒介物，诸如氯化钠、林格氏葡萄糖等)、非水溶剂(例如，丙二醇、聚乙二醇、植物油以及可注射有机酯类，诸如油酸乙酯)、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化物、防腐剂(例如，抗细菌剂或抗真菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体)、等渗剂、吸收延迟剂、盐类、药物、药物稳定剂、凝胶剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、色素、流体和营养补充剂，像这样如本领域普通技术人员已知的物质及其组合。根据众所周知的参数调节药物组合物中各种组分的pH值和确切浓度。

如本文所用的术语“活力”指的是特定细胞或多个细胞维持存活状态的能力。

Ⅱ.方法的实施方案

本公开的实施方案包括用于鉴定对源自脐带血细胞的免疫细胞(诸如NK细胞)的应答的预测因子的方法。在特定的实施方案中，测试脐带血单位的一种或多种预测因子，与缺乏一种或多种预测因子的脐带血单位相比，这些脐带血单位可以产生更适合过继性细胞疗法的免疫细胞。与未经如此测试的细胞相比，可以预测对源自脐带血细胞的免疫细胞的应答提高的测试参数可以包括细胞产量、细胞工程化改造和/或细胞活动过程。参数可以涉及脐带血单位本身，或者参数可以涉及源自脐带血单位的任何细胞，或者对其的操控或修饰。这些参数包括脐带血单位的活力；脐带血单位的红细胞含量；从脐带血单位的总的单核细胞回收率；源自冻融的脐带血单位的免疫细胞的扩增(包括在一个或多个时间点范围内)；材料的体积；婴儿的性别、年龄和/或体重，婴儿的一个或多个生物学父母的种族；细胞的一种或多种标志物；源自所冻融脐带血单位的免疫细胞的工程化改造；源自所冻融脐带血单位的免疫细胞的细胞毒性；脐带血所来源的母亲的胎龄；源自所冻融脐带血单位的免疫细胞的细胞毒性(包括对癌细胞或受病原体感染的细胞的细胞毒性)；冻融后脐带血单位的活力；如此等等。

本公开的实施方案包括用于选择冷冻保存的脐带血单位以制备用于过继性细胞疗法的细胞的方法，这些细胞对于特定目的(包括临床应用)具有比未经如此选择的细胞更高的效力(诸如通过使用细胞毒性测定和产生应答的患者比例进行测量)。在特定的实施方案中，所述方法用于选择冷冻保存的脐带血单位来制备工程化免疫细胞，这些工程化免疫细胞对于过继性细胞疗法具有比未经如此选择的细胞更高的效力，包括例如对于癌症的治疗。在特定方面，所述方法用于选择冷冻保存的脐带血单位来制备工程化的自然杀伤细胞，这些工程化自然杀伤细胞对于过继性细胞疗法具有比未经如此选择的细胞更高的效力，包括例如对于治疗任何类型的癌症。

在特定的实施方案中，本文所涵盖的方法包括其中降低选择会产生以下免疫细胞(如NK细胞)的脐带血单位(可称之为脐带血组合物)的风险的方法，这些免疫细胞在进行工程化、扩增和/或临床使用方面无效或效果较差，诸如对于癌症的治疗。在特定的实施方案中，所述方法降低了选择会产生缺乏高效力的免疫细胞的脐带血单位的风险，诸如作为过继性细胞疗法用于癌症治疗。在特定情况下，本文所涵盖的方法增加了产生对一种或多种类型癌症有效的过继性NK细胞疗法的可能性。

本公开的方法选择用于过继性细胞治疗的细胞，在细胞治疗方面，这些细胞定量和/或定性地优于未经如此选择的细胞。定性地，细胞可能更具细胞毒性，可能扩增至更大的产量，可能具有更长的持久性，可能更有利于工程化，可能有更高的产生应答的患者比例，或者其组合。定量地，与在不了解本文所涵盖的一项或多项选择参数的情况下选择的脐带血单位相比，根据所述方法所选择的脐带血单位的细胞活力水平可能高出至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。与在不了解本文所涵盖的一项或多项选择参数的情况下选择的脐带血单位相比，根据所述方法所选择的脐带血单位的细胞活力水平可能高出至少10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、250倍、500倍、750倍、1000倍或更多。根据所述方法选择的脐带血单位可产生比在不了解本文所涵盖的一项或多项选择参数的情况下选择的脐带血单位高出至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的总单核细胞回收率。根据所述方法选择的脐带血单位可产生比在不了解本文所涵盖的一项或多项选择参数的情况下选择的脐带血单位高出至少10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、250倍、500倍、750倍、1000倍或更多的总单核细胞回收率。与在不了解本文所涵盖的一项或多项选择参数的情况下选择的脐带血单位相比，根据所述方法选择的脐带血单位的有核红细胞含量可能低至少1x10³、1x10⁴、1x10⁵、1x10⁶、1x10⁷、5x10⁷或更多。与在不了解本文所涵盖的一项或多项选择参数的情况下选择的脐带血单位相比，根据所述方法选择的脐带血单位的有核红细胞含量可能低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或低更多。

在某些实施方案中，在本公开的方法中可以考虑采集脐带血组织时婴儿的体重，无论是在子宫内还是在子宫外。在特定的实施方案中，婴儿体重大于3650克，诸如大于3650、3700、3750、3800、3850、3900、3950、4000、4050、4100、4150、4200、4250、4500克等等。在特定的实施方案中，这是在冷冻保存和/或使用之前测量的。

在特定的实施方案中，婴儿的一个或多个生物学父母的种族是白种人。在一些情况下，婴儿的生物学父母都是白种人，在一些情况下，生物学母亲是白种人，而在某些情况下，生物学父亲是白种人。

在特定的实施方案中，从婴儿采集脐带血的时机是该方法的一个因素。在特定的实施方案中，在子宫内从婴儿的脐带中获得脐带血。采集步骤可以通过任何合适的方法进行，并且获得脐带血的一方可能是也可能不是操控、储存脐带血和/或分析脐带血的一项或多项参数的一方。在特定的实施方案中，在采集时或采集后不久，将脐带血与一种或多种抗凝剂混合，并且抗凝剂的体积可以是也可以不是标准量。在特定情况下，处理前体积是所采集脐带血加上抗凝剂的体积，而在某些情况下，处理前体积是所采集脐带血的体积加上特定体积的抗凝剂，诸如35mL或约35mL。在特定的实施方案中，所抽取的脐带血的体积不大于约85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31或30mL，或者更小的体积。在一些情况下，抗凝剂的体积为或约为25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50mL，或者更大。在特定情况下，抗凝剂的体积为或约为35mL。抗凝剂可以是任何种类，至少包括CPD(并且可以是CDP-A(CDP+腺苷)；柠檬酸盐-磷酸盐-可溶葡萄糖(CP2D)；酸性柠檬酸葡萄糖(ACD)；肝素等)。在特定的实施方案中，所采集脐带血中的细胞可以表达一种或多种特定标志物。在特定情况下，所采集脐带血中的细胞可以表达CD34。在某些实施方案中，特定百分比的细胞表达任何标志物，包括CD34。在某些情况下，所采集血液中>0.4％的细胞表达CD34。在某些情况下，所采集血液中>0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.5％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的细胞表达CD34。在某些情况下，所采集血液中至少0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.5％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的细胞表达CD34。在特定的实施方案中，这是在冷冻保存和/或使用之前测量的。

与从在不了解本文所涵盖的一项或多项选择参数的情况下选择的脐带血细胞产生的免疫细胞相比，根据所述方法选择的脐带血细胞可产生细胞毒性水平高出至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的免疫细胞。在一些情况下，与从在不了解本文所涵盖的一项或多项选择参数的情况下选择的脐带血细胞产生的免疫细胞相比，从所选择脐带血细胞产生的免疫细胞的细胞毒性水平可能高出至少10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、250倍、500倍、750倍、1000倍或更多。

本公开的特定方面选择了在任何种类的冷冻之前脐带血单位的一种或多种产物特征，而在一些方面，存在冷冻脐带血单位冻融后所选择的一种或多种产物特征。这种操作或这些操作允许选择最适于产生细胞产物(从可供选择的脐带血单位的集合中)，包括用于过继性细胞治疗的细胞产物的脐带血单位。冻融后脐带血单位的特征可能与细胞产物的产生直接相关，也可能不直接相关。也就是说，在一些情况下，通过选择合适的脐带血单位来增强通过对源自脐带血单位的细胞进行工程化改造而产生的细胞治疗，而在另外或备选情况下，通过选择合适的脐带血单位来增强对源自脐带血单位的细胞进行工程化改造后的细胞治疗活性(例如，活性诸如细胞毒性、体内持久性等)。

本公开的实施方案包括对来自任何种类的脐带血单位的一个或多个储存库的一个或多个脐带血单位的一项或多项参数进行表征的方法。在特定情况下，在对一个或多个脐带血单位进行表征后，可能会拒绝一个或多个特定的脐带血单位，因为其不适合提供最佳应答(例如，治疗性施用时的活性)。在另外情况下，可以确定一个或多个特定的脐带血单位适合于增强活性，诸如在治疗性施用时。在一些情况下，当通过本公开的方法确定多于一个脐带血单位值得选择时，它们可以在冻融之前或冻融之后组合或不组合。从所选择脐带血单位产生的免疫细胞可以在从脐带血单位衍生后进行组合。

在特定的实施方案中，本公开提供了一组新的标准来鉴定脐带血单位，用于制备具有最高的癌症治疗效力的NK细胞治疗产品。由这些高效力的脐带血单位生成的NK细胞最有可能在癌症患者中产生最佳应答。因此，本公开的方法用于选择具有最高效力的脐带血单位作为用于制备NK细胞治疗产品的材料来源，并用于避免选择不太可能诱导临床应答或可能诱导无效临床应答的脐带血单位和/或避免生成此类NK细胞。在特定的实施方案中，由通过本公开的方法选择的脐带血单位产生的高效力NK细胞在过继性输注后的癌症患者中诱导缓解的可能性最高。在特定情况下，与由缺乏所公开的有益特征的脐带血单位产生的NK细胞相比，从通过本公开的方法所选择的脐带血单位产生的高效力NK细胞在过继性输注后的癌症患者中诱导缓解的可能性更高。

本公开的实施方案包括选择脐带血组合物的方法，包括在冷冻保存之前鉴定脐带血组合物的步骤，确定其具有以下一种或多种特征：(a)脐带血细胞活力大于或等于98％或99％；(b)任选地总单核细胞(TNC)回收率大于或等于76.3％；和(c)有核红细胞(NRBC)含量小于或等于7.5x10⁷-8.0x10⁷以及其间的任何量；(d)脐带血所来源的婴儿体重；(e)脐带血所来源的婴儿生物学母亲和/或生物学父亲的种族是白种人；(f)任选地脐带血所来源的婴儿胎龄；(g)任选地子宫内采集脐带血(尽管在本公开的任何方法中可以使用子宫外或子宫内与子宫外的组合)；(h)任选地脐带血所来源的是生物学男性婴儿；(i)任选地处理前体积(采集的脐带血加上抗凝剂(35ml CPD)的体积)≤120mL；(j)任选地，抽取的脐带血的细胞为>0.4％ CD34+；并且任选地(k)测量源自冻融后脐带血组合物的免疫细胞的细胞毒性；以及任选地(l)测量培养细胞的扩增。在一些情况下，确定冷冻保存之前的脐带血组合物至少具有(a)和(c)的特征。在一些情况下，确定冷冻保存之前的脐带血组合物至少具有(b)和(c)的特征。在一些情况下，确定冷冻保存之前的脐带血组合物至少具有(a)和(b)的特征。在一些情况下，确定冷冻保存之前的脐带血组合物具有(a)、(c)、(d)和(e)的特征中的1种、2种、3种或全部，并且它们可以进行任意组合。在一些情况下，确定冷冻保存之前的脐带血组合物具有(a)、(b)、(c)和(d)。在一些情况下，确定冷冻保存之前的脐带血组合物除了具有(b)、(f)、(g)、(h)、(i)和(j)中的一种或多种之外，还具有(a)、(c)、(d)和(e)的特征中的1种、2种、3种或全部。

A.测量细胞活力

本公开的实施方案包括测量脐带血单位中细胞的活力的方法，并且测量提供脐带血单位是否适合的信息，诸如适合于选择衍生用于过继性细胞治疗的免疫细胞。进行活力测试的脐带血细胞可以是脐带血中细胞的混合物，诸如单核细胞、干细胞(例如，造血细胞或间充质细胞)、白细胞、免疫系统细胞(单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、树突状细胞、T细胞(包括辅助性T细胞和细胞毒性T细胞)、B细胞、NK细胞)，如此等等。可以通过细胞的一种或多种物理性质和/或细胞的一种或多种活性来观察脐带血中细胞的活力。

尽管可以通过任何合适的方法测定活力，但在特定情况下，通过以下方法进行测量，即流式细胞术、四氮唑还原测定法、刃天青还原测定法、蛋白酶活力标志物测定法、ATP测定法、钠钾比、乳酸脱氢酶测定法、中性红摄取、碘化丙啶、TUNEL测定法、基于甲臜的测定法、伊文斯蓝、台盼蓝、溴乙非啶同二聚体测定法或其组合。

可以在冷冻保存之前和/或冷冻保存之后测量脐带血细胞的细胞活力。在一个实施方案中，所需的脐带血单位的脐带血细胞活力大于或等于98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％。

在除了测量一种或多种其他特征(诸如总的核细胞回收率和测量有核红细胞含量)之外还测量活力的情况下，细胞活力可以先于或可以不先于一种或多种其他测量。在特定情况下，在TNC回收率和NRBC测量之前测量活力，或者在TNC回收率和NRBC测量之后测量活力。在一些情况下，在TNC之后但在NRBC之前测量活力，或者在NRBC之后但在TNC回收率之前测量活力。

B.测量总的核细胞回收率

在方法的特定实施方案中，测量总核细胞(TNC)回收率，其中在脐带血处理后测量有核细胞。TNC回收测量活的和死的有核细胞两者。这个步骤可以是也可以不是任选的。

可以采用测量TNC的任何合适的测定法，但在特定的实施方案中，TNC回收率测定法包括流式细胞术；台盼蓝；3％乙酸亚甲基蓝；血液学分析仪分析；或其组合。在特定情况下，TNC回收率测定可能是自动化的，也可能不是自动化的。

在一个实施方案中，TNC回收率大于或等于76.3％、76.4％、76.5％、76.6％、76.7％、76.8％、76.9％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

在特定的实施方案中，在冷冻保存之前测量脐带血单位的TNC回收率。

在除了测量一种或多种其他特征(诸如细胞活力和测量NRBC含量)之外还测量TNC回收率的情况下，TNC回收率可以先于或可以不先于一种或多种其他测量。在特定情况下，在细胞活力和NRBC测量之前测量TNC回收率，或者在细胞活力和NRBC测量之后测量TNC回收率。在一些情况下，在细胞活力之后但在NRBC之前测量TNC回收率，或者在NRBC之后但在细胞活力之前测量TNC回收率。

C.测量有核红细胞计数

在特定的实施方案中，基于有核红细胞(NRBC)含量的测量来选择脐带血单位。测量可以是手动的或自动的。在特定的实施方案中，NRBC含量较低的脐带血单位比NRBC含量较高的脐带血单位更有效地产生有效免疫细胞。脐带血单位中NRBC的水平决定了接受源自特定脐带血单位的免疫细胞如NK细胞治疗的个体的应答率。NRBC含量可以通过密度离心来测量，例如在装置上。

在特定的实施方案中，NRBC含量小于或等于8.0x10⁷、7.9x10⁷、7.8x10⁷、7.7x10⁷、7.6x10⁷、7.5x10⁷、7.0x10⁷、6.0x10⁷、5.0x10⁷、4.0x10⁷、3.0x10⁷、2.0x10⁷、1.0x10⁷、9.0x10⁶、8.0x10⁶、7.0x10⁶、6.0x10⁶、5.0x10⁶、4.0x10⁶、3.0x10⁶、2.0x10⁶、1.0x10⁶、9.0x10⁵、8.0x10⁵、7.0x10⁵、6.0x10⁵、5.0x10⁵、4.0x10⁵、3.0x10⁵、2.0x10⁵、1.0x10⁵、9.0x10⁴、8.0x10⁴、7.0x10⁴、6.0x10⁴、5.0x10⁴、4.0x10⁴、3.0x10⁴、2.0x10⁴、1.0x10⁴、9.0x10³、8.0x10³、7.0x10³、6.0x10³、5.0x10³、4.0x10³、3.0x10³、2.0x10³、1.0x10³、9.0x10²、8.0x10²、7.0x10²、6.0x10²、5.0x10²、4.0x10²、3.0x10²、2.0x10²、1.0x10²等等，包括达到不可检测的水平。

在特定的实施方案中，在冷冻保存之前测量NRBC。

在除了测量一种或多种其他特征(诸如总核细胞回收率和细胞活力)之外还测量NRBC的情况下，NRBC可以先于或可以不先于一种或多种其他测量。在特定情况下，在TNC回收率和细胞活力之前测量NRBC，或者在TNC回收率和细胞活力之后测量NRBC。在一些情况下，在TNC之后但在细胞活力之前测量NRBC，或者在细胞活力之后但在TNC回收率之前测量NRBC。

D.婴儿体重

在一些实施方案中，将脐带血所来源的婴儿的体重用作本公开所涵盖的任何方法中的参数。可以紧接在采集脐带血之前，例如在几天或几小时或几分钟内，测量婴儿的体重。在一些情况下，可以通过使用产前超声在子宫内确定婴儿的体重。在一些情况下，婴儿的体重是在子宫外确定的，例如在标准秤上。测量婴儿体重的一方可能是也可能不是操控、储存脐带血和/或分析脐带血的一项或多项参数的一方。这一步骤可以发生在冷冻保存之前的任何其他步骤之前和/或之后。在特定的实施方案中，婴儿的体重大于一定量，这通常可能与胎龄相关，也可能不相关。在特定情况下，婴儿体重大于约3650克，诸如大于3650、3700、3750、3800、3850、3900、3950、4000、4050、4100、4150、4200、4250、4500克等等。在特定的实施方案中，这是在冷冻保存和/或使用之前测量的。

E.生物学父母的种族

在特定的实施方案中，一个或多个生物学父母的种族是白种人。在一些情况下，生物学母亲是白种人，并且生物学父亲也是白种人。在一些情况下，生物学母亲是白种人，但生物学父亲不是白种人。在一些情况下，生物学父亲是白种人，但生物学母亲不是白种人。

F.脐带血的采集参数

在一些实施方案中，脐带血是通过本领域的标准方法获得的，例如在婴儿出生后通过针头从脐静脉获得。对于子宫外抽取，这是在取出胎盘后进行的，并且将脐带血放入包含抗凝剂或可添加抗凝剂的无菌收集袋中。对于子宫内抽取，这是在胎盘仍在母亲体内时通过脐静脉完成的，随后将其放入包含抗凝剂或可添加抗凝剂的无菌收集袋中。在一些情况下，来自同一婴儿的脐带血由子宫内和子宫外抽取组合而成。在一个特定实施方案中，子宫内抽取是一种优于子宫外抽取的方法。

在特定的实施方案中，在本公开的方法中考虑了所抽取脐带血的体积。举例来说，在本公开的方法中考虑了作为处理前组合物的脐带血和抗凝剂二者的组合的体积。在特定情况下，脐带血和抗凝剂组合的体积≤120mL。举一个示例，当抗凝剂的体积约为35mL时，脐带血的体积小于约85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31或30mL的体积。

G.脐带血细胞标志物

在特定的实施方案中，脐带血中至少一些任何类型的细胞可以共同表达一种或多种特定标志物。在特定的实施方案中，脐带血中特定百分比的细胞表达CD34。脐带血细胞类型的实例包括干细胞、祖细胞、红细胞、白细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、NK细胞、单核细胞和血小板。在一些情况下，所采集脐带血中>0.4％的细胞表达CD34。在某些情况下，所采集血液中>0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.5％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的细胞表达CD34。在某些情况下，所采集血液中至少0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.5％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的细胞表达CD34。在特定的实施方案中，这是在冷冻保存和/或使用之前测量的。

H.测量细胞毒性

本公开的实施方案包括测量源自脐带血单位的任何种类的免疫细胞(包括NK细胞)的细胞毒性。在特定的实施方案中，对源自一个或多个脐带血单位的NK细胞的细胞毒性进行测量。在特定情况下，对一个或多个脐带血细胞单位的活力、NRBC和TNC回收率进行表征，并且在基于该表征结果选择一个或多个脐带血细胞单位之后，以及任选地在冷冻保存和冻融后，可以测量来自一个或多个脐带血单位的细胞的细胞毒性。

细胞毒性测定通常依赖于细胞膜高度受损的濒死细胞，这种细胞允许释放细胞质内容物或者荧光染料渗透到细胞结构内。可以通过多种不同的方式测量细胞毒性，例如使用活体染料(甲臜染料)、蛋白酶生物标志物或通过测量ATP含量来测量细胞活力。甲臜染料是由细胞死亡时释放的脱氢酶诸如乳酸脱氢酶(LDH)和还原酶通过还原四唑盐(INT、MTT、MTS和XTT)而形成的显色产物。其他测定法包括磺酰罗丹明B和水溶性四唑盐测定，它们可用于高通量筛选。可以使用装置测量细胞毒性。

在特定的实施方案中，可以利用选择性穿透死细胞的染料，诸如台盼蓝。在其他情况下，可以利用穿透死细胞的荧光DNA结合染料，诸如Hoechst 33342、YO-PRO-1或CellToxGreen。

在进行测试具有细胞毒性的细胞是T细胞或NK细胞的特定实施方案中，可以利用⁵¹Cr释放测定法。

I.测量NK细胞扩增

在本公开的方法的具体实施方案中，脐带血单位(包括基于本文涵盖的标准选择的脐带血单位)冷冻保存和冻融之后NK细胞扩增的程度是临床应答的预测因子。也就是说，在脐带血冻融之后，在一定条件下对所冻融血液进行处理和培养，使得培养的NK细胞的量增加。符合本文所涵盖的选择标准的脐带血单位可以在NK细胞扩增之前合并，也可以不合并。在一些实施方案中，将NK细胞扩增的定量程度，包括在某些情况下的某些时间点处，用作NK细胞的选择标准，这些NK细胞与与源自随机选择的脐带血单位的NK细胞相比，临床功效会更好。

在特定情况下，扩增NK细胞并测定扩增水平。当NK细胞在某个时间点处至少扩增至一个特定水平时，该NK细胞与无法扩增至这种水平的NK细胞相比，临床功效更好。在至少一些情况下，在第0天至第6天范围内会产生临床疗效的NK细胞的扩增大于或等于2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍(包括8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、20倍、50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、500倍、1000倍、1500倍、2000倍等等)。在至少一些情况下，如果在第0天至第6天范围内，NK细胞的扩增小于7倍(包括小于6倍、5倍、4倍、3倍或2倍)，则NK细胞的临床功效可能不足。在至少一些情况下，如果在第6天至第15天范围内，NK细胞的培养扩增大于或等于10²倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍(包括10⁶倍、10⁷倍、10⁸倍、10⁹倍、10¹⁰倍、10¹¹倍、10¹²倍、10¹³倍等等)，则NK细胞会产生临床功效。在至少一些情况下，如果在第6天至第15天范围内，NK细胞的培养扩增小于10⁵倍(包括小于10⁴倍、10³倍、10²倍等等)，则NK细胞的临床功效可能不足。在至少一些情况下，在第0天至第15天范围内会产生临床疗效的NK细胞的扩增大于或等于900倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2500倍、3000倍、4000倍、5000倍、10000倍或更大。在至少一些情况下，如果在第6天至第15天范围内，NK细胞的培养扩增小于900倍，诸如小于800倍、700倍、600倍、500倍、400倍、300倍、200倍、100倍等等，则NK细胞的临床功效可能不足。

在一些实施方案中，NK细胞扩增利用特定的体外方法来扩增NK细胞。在一些情况下，在包含有效浓度的IL-12、IL-15和/或IL-18的预活化培养物中对NK细胞群进行预活化，以获得预活化的NK细胞；然后在包含表达CD137配体的人工抗原呈递细胞(aAPC)的扩增培养物中扩增预活化的NK细胞。在某些方面，aAPC进一步表达膜结合的细胞因子。在一些方面，膜结合的细胞因子是膜结合的IL-21(mIL-21)和/或膜结合的IL-15(mIL-15)。在一些方面，aAPC基本上不表达内源性HLAI类、II类或CD1d分子。在某些方面，aAPC表达ICAM-1(CD54)和LFA-3(CD58)。在一些方面，将aAPC进一步定义为白血病细胞来源的aAPC。在某些方面，将白血病细胞来源的aAPC进一步定义为经工程化改造以表达CD137配体和/或mIL-21的K562细胞。可以对K562细胞进行工程化改造以表达CD137配体和mIL-21。在某些方面，将工程化进一步定义为逆转录病毒转导。在特定方面，对aAPC进行辐照。在特定情况下，预活化步骤持续10-20小时，诸如14-18小时(例如，约14、15、16、17或18小时)，特别是约16小时。在某些方面，预活化培养物包含浓度为10-100ng/mL的IL-18和/或IL-15，诸如40-60ng/mL，特别是约50ng/mL。在一些方面，预活化培养物包含浓度为0.1-150ng/mL的IL-12，诸如1-20ng/mL，特别是约10ng/mL。在另外的方面，扩增培养物进一步包含IL-2。在一些方面，IL-2以10-500U/mL的浓度存在，诸如100-300U/mL，特别是约200U/mL。在一些方面，IL-12、IL-18、IL-15和/或IL-2是重组人IL-2。在一些方面，每2-3天在扩增培养物中补充IL-2。在一些方面，至少第二次将aAPC添加到扩增培养物中。在一些方面，该方法在无血清培养基中进行。

在一个实施方案中，扩增步骤包括在有效量的通用抗原呈递细胞(UAPC)的存在下培养NK细胞，这些通用抗原呈递细胞经工程化改造以表达(1)CD48和/或CS1(CD319)、(2)膜结合的白细胞介素-21(mbIL-21)和(3)41BB配体(41BBL)。在一些方面，将免疫细胞和UAPC以3:1至1:3的比例培养，例如3:1、3:2、1:1、1:2或1:3。在特定方面，将免疫细胞和UAPC以1:2的比例培养。在一些方面，UAPC基本上不表达内源性HLAI类、II类或CD1d分子。在某些方面，UAPC表达ICAM-1(CD54)和LFA-3(CD58)。在某些方面，将UAPC进一步定义为白血病细胞来源的aAPC。在一些方面，将白血病细胞来源的UAPC进一步定义为K562细胞。在某些方面，至少第二次添加UAPC。

在一些方面，扩增是在IL-2存在的情况下进行的。在特定方面，IL-2以10-500U/mL的浓度存在，例如10-25、25-50、50-75、75-10、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400或400-500U/mL。在某些方面，IL-2以100-300U/mL的浓度存在。在特定方面，IL-2以200U/mL的浓度存在。在一些方面，IL-2是重组人IL-2。在特定方面，每2-3天例如每2天或每3天补充IL-2。

Ⅲ.脐带血来源的免疫细胞

本公开的某些实施方案涉及源自一个或多个脐带血单位的免疫细胞，根据本文所涵盖的一项或多项标准来选择这些脐带血单位进行处理。免疫细胞可以是任何种类，包括NK细胞、恒定NK细胞、NKT细胞、T细胞(例如，调节性T细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞或γδT细胞)、单核细胞、粒细胞、髓系细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、干细胞(例如，间充质干细胞(MSC)或诱导性多能干(iPSC)细胞)，如此等等。本文还提供了产生和工程化改造免疫细胞的方法以及使用和施用细胞用于过继性细胞疗法的方法，在这种情况下，相对于从其中获得脐带血的一个或多个个体而言，细胞可以是自体的或同种异体的。因此，可以将免疫细胞用作免疫疗法，例如以靶向癌细胞。

免疫细胞可以从来自人类受试者的脐带血单位中分离出来。脐带血可以获自所关注的受试者，例如疑似患有特定疾病或病况的受试者、疑似具有特定疾病或病况易感性的受试者、或者正在接受特定疾病或病况治疗的受试者。脐带血可以获自受试者，目的是为了储存脐带血，以备日后对其不时之需(包括源自脐带血的免疫细胞)。源自脐带血的免疫细胞可以直接使用，也可以储存一段时间，例如通过冷冻。脐带血可以合并也可以不合并，诸如脐带血可以来自2个或更多个来源，例如3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个来源(例如，供体受试者)。

免疫细胞所来源的脐带血可以获自需要治疗或患有任何类型疾病(包括与免疫细胞活性降低相关的疾病)的受试者。因此，细胞对于需要治疗的受试者而言是自体的。备选地，免疫细胞群可以获自供体，优选组织相容性匹配的供体。免疫细胞群可以从外周血、脐带血、骨髓、脾脏或者所述受试者或供体中驻留免疫细胞的任何其他器官/组织收获。可以从一组受试者和/或供体中分离出免疫细胞，例如从合并的脐带血中分离出来。

当从不同于受试者的供体的脐带血单位中获得免疫细胞群时，优选供体是同种异体的，前提是所获得细胞是与受试者相容的，因为可以将它们引入受试者中。同种异体供体细胞可能是人类白细胞抗原(HLA)相容的，也可能不相容。为了使同种异体细胞与受试者相容，可以对其进行处理以降低免疫原性。

A.NK细胞

在一些实施方案中，源自所选择的一个或多个脐带血单位的免疫细胞是NK细胞。NK细胞是淋巴细胞的一个亚群，其对多种肿瘤细胞、病毒感染的细胞以及骨髓和胸腺中的一些正常细胞具有自发的细胞毒性。NK细胞是针对转化细胞和病毒感染细胞的早期先天性免疫应答的关键效应器。NK细胞约占人外周血中的淋巴细胞的10％。当淋巴细胞在IL-2存在的情况下培养时，会出现强的细胞毒性反应性。NK细胞是被称为大颗粒淋巴细胞的效应细胞，因为它们的体积较大，并且在其细胞质中存在特征性嗜天青颗粒。NK细胞在骨髓、淋巴结、脾脏、扁桃体和胸腺中分化并成熟。NK细胞可以通过特定的表面标志物来检测，诸如通过人类的CD16、CD56和CD8。NK细胞不表达T细胞抗原受体、泛T细胞标志物CD3或表面免疫球蛋白B细胞受体。

通过源自细胞表面活化受体和抑制受体的信号交互作用来实现NK细胞的刺激。NK细胞的活化状态受到从一系列种系编码的活化和抑制受体接收的细胞内信号平衡的调节(Campbell,2006)。当NK细胞遇到异常细胞(例如，肿瘤细胞或病毒感染的细胞)并且活化信号占主导地位时，NK细胞可以通过定向分泌含有穿孔素和颗粒酶的溶细胞颗粒或者含死亡结构域受体的参与，快速诱导靶细胞的凋亡。活化的NK细胞还可以分泌I型细胞因子，例如干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，它们激活先天性和适应性免疫细胞以及其他细胞因子和趋化因子(Wu等人,2003)。NK细胞在早期先天性免疫应答中产生的这些可溶性因子显著影响其他造血细胞的募集和功能。而且，通过物理接触和细胞因子的产生，NK细胞在与树突状细胞和中性粒细胞的调节性交互作用网络中发挥核心作用，以促进或限制免疫应答。

在某些方面，通过先前描述的离体扩增NK细胞的方法分离和扩增NK细胞(Shah等人,2013)。在这种方法中，通过Ficoll密度梯度离心分离出CB单核细胞，并将其培养在含有IL-2和人工抗原呈递细胞(aAPC)的生物反应器中。7天后，去除细胞培养物中任何表达CD3的细胞，并再培养另外7天。对细胞再次进行CD3去除，并进行表征以确定CD56⁺/CD3^-细胞或NK细胞的百分比。在其他方法中，使用脐带CB通过分离出CD34⁺细胞并在含有SCF、IL-7、IL-15和IL-2的培养基中培养使其分化成CD56⁺/CD3^-细胞来衍生NK细胞。

B.T细胞

在一些实施方案中，源自所选择的一个或多个脐带血单位的免疫细胞是T细胞。在过去的二十年中，已经描述了用于衍生、活化和扩增功能性抗肿瘤效应细胞的几种基本途径。这些包括：自体细胞，如肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)；使用自体DC、淋巴细胞、人工抗原呈递细胞(APC)或涂有T细胞配体和活化抗体的微珠进行离体活化的T细胞，或者通过捕获靶细胞膜分离出的细胞；天然表达抗宿主肿瘤TCR的同种异体细胞；以及非肿瘤特异性自体或同种异体细胞，它们经过基因重塑或“重定向”以表达肿瘤反应性TCR或嵌合性TCR分子，其显示出抗体样肿瘤识别能力，称为“T体(T-bodies)”。这些途径已经产生了许多用于T细胞制备和免疫接种的方案，这些方案可用于本文所述的方法中。

在一些实施方案中，T细胞的一个或多个子群源自所选择脐带血，诸如CD4⁺细胞、CD8⁺细胞及其亚群，例如由下列所定义的亚群：功能、活化状态、成熟度、分化潜能、扩增、再循环、定位和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体类型、在特定器官或腔室中的存在、标志物或细胞因子分泌谱和/或分化程度。对于要治疗的受试者，T细胞可以来自同种异体或自体的脐带血，或者是其混合物。

某些类型的T细胞可以来源于所选择的脐带血。在T细胞的亚型和亚群(例如，CD4⁺和/或CD8⁺T细胞)中，存在初始T(T_N)细胞、效应性T细胞(T_EFF)、记忆性T细胞及其亚型，诸如干细胞记忆T细胞(TSC_M)、中央记忆性T细胞(TC_M)、效应记忆性T细胞(T_EM)或终末分化效应记忆性T细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助性T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关恒定T(MAIT)细胞、天然存在且适应性调节T(Treg)细胞、辅助性T细胞，例如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助性T细胞、α/βT细胞和δ/γT细胞。

在一些实施方案中，对于源自脐带血的一个或多个T细胞群，富集或去除对一种或多种特定标志物如表面标志物呈阳性的细胞，或者对一种或多种特定标志物呈阴性的细胞。在一些情况下，这种标志物是指在某些T细胞群体(例如，非记忆细胞)中不存在或以相对较低水平表达，而在某些其他T细胞群体(例如，记忆细胞)中存在或以较高水平表达的标志物。

在一些实施方案中，通过对非T细胞(例如，B细胞、单核细胞或其他白细胞)上表达的标志物如CD14进行阴性选择，将T细胞从脐带血样品中分离出来。在一些方面，CD4⁺或CD8⁺选择步骤用于分离CD4⁺辅助性T细胞和CD8⁺细胞毒性T细胞。通过对在一种或多种初始、记忆性和/或效应性T细胞亚群上表达或以相对较高程度表达的标志物进行阳性或阴性选择，可以将这种CD4⁺和CD8⁺群体进一步分选为亚群。

在一些实施方案中，对于CD8⁺T细胞，进一步富集或去除初始、中央记忆性、效应记忆性T细胞和/或中央记忆性干细胞，例如通过基于与相应亚群相关的表面抗原进行阳性或阴性选择。

在一些实施方案中，将T细胞在白细胞介素-2(IL-2)中培养，并且在任何情况下它们都可以在扩增前合并。可以通过本领域已知的多种方法中的任何一种来完成扩增。举例来说，在饲养淋巴细胞和白细胞介素-2(IL-2)或白细胞介素-15(IL-15)存在的情况下，使用非特异性T细胞受体刺激可以快速扩增T细胞。非特异性T细胞受体刺激物可以包括约30ng/ml的OKT3，这是一种小鼠单克隆抗CD3抗体(可获自Ortho-McNeil.RTM.,Raritan,N.J.)。备选地，在T细胞生长因子，如300IU/ml IL-2或IL-15的存在下，通过使用癌症的一种或多种抗原(包括其抗原性部分如一个或多个表位，或一种细胞)，在体外刺激外周血单核细胞(PBMC)，可以快速扩增T细胞，可以任选地从载体中表达这些抗原，诸如人白细胞抗原A2(HLA-A2)结合肽。通过使用脉冲到表达HLA-A2的抗原呈递细胞上的一种或多种相同癌症抗原再次刺激，快速扩增体外诱导的T细胞。备选地，例如可以使用经辐照的自体淋巴细胞或使用经辐照的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2再次刺激T细胞。

C.干细胞

在一些实施方案中，源自所选择一个或多个脐带血单位的免疫细胞可以是干细胞，诸如诱导性多能干细胞(PSC)、间充质干细胞(MSC)或造血干细胞(HSC)，或者其混合物。

本文所涵盖的多能干细胞可以是诱导性多能干(iPS)细胞，通常简称为iPS细胞或iPSC。多能性的诱导最初于2006年使用小鼠细胞(Yamanaka等人2006)和2007年使用人类细胞(Yu等人2007；Takahashi等人2007)通过引入与多能性相关的转录因子对体细胞进行重编程而实现。iPSC的使用规避了与ES细胞大规模临床应用相关的大多数伦理和实践问题，并且接受iPSC衍生的自体移植物的患者可能不需要终身免疫抑制治疗来预防移植排斥。

可以使用本领域技术人员已知的方法对体细胞(例如脐带血单位中的体细胞)进行重编程以产生iPS细胞。本领域技术人员可以容易地产生iPS细胞，参见例如，已公布美国专利申请号2009/0246875、已公布美国专利申请号2010/0210014；已公布美国专利申请号2012/0276636；美国专利号8,058,065；8,129,187；PCT公布号WO 2007/069666 A1、美国专利号8,268,620；8,546,140；9,175,268；8,741,648；美国专利申请号2011/0104125和美国专利号8,691,574，这些文献通过引用方式并入本文。总体来说，使用核重编程因子(nuclear reprogramming factor)从体细胞产生多能干细胞。在一些实施方案中，使用Klf4、c-Myc、Oct3/4、Sox2、Nanog和Lin28中的至少三种或至少四种。在其他实施方案中，使用Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4，或者使用Oct3/4、Sox2、Nanog和Lin28。

参考WO 2007/069666和美国专利号8,183,038中提及的NCBI登录号，可以获得这些核重编程物质的小鼠和人cDNA序列，这些文献通过引用方式并入本文。用于引入一种或多种重编程物质或者编码这些重编程物质的核酸的方法是本领域已知的，并且在例如以下文献中公开，即美国专利号8,268,620、8,691,574、8,741,648、8,546,140，已公布美国专利号8,900,871和8,071,369，这些文献都通过引用方式并入本文。

一旦衍生，可以将iPSC在足以维持多能性的培养基中培养。iPSC可以与开发用于培养多能干细胞，更具体地说是胚胎干细胞的各种培养基和技术一起使用，如在以下文献中所述，即美国专利号7,442,548和美国专利公布号2003/0211603。在小鼠细胞的情况下，在普通培养基中添加作为分化抑制因子的白血病抑制因子(LIF)来进行培养。在人类细胞的情况下，期望添加碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)来代替LIF。本领域技术人员已知的用于培养和维持iPSC的其他方法可以与本文公开的方法一起使用。

在某些实施方案中，可以使用未定义的条件；例如，可以将多能细胞在成纤维细胞饲养细胞或已暴露于成纤维细胞饲养细胞的培养基上培养，以维持干细胞处于未分化状态。在一些实施方案中，将细胞在经过辐照或抗生素处理以终止细胞分裂的小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养细胞的共存下培养。备选地，可以使用已定义的不依赖于饲养细胞的培养系统，诸如TESR.TM.培养基或E8.TM./必需型8.TM.培养基，来培养多能细胞并将其保持在基本上未分化状态。

质粒的设计考虑到了许多目标，诸如实现经调节的高拷贝数和避免细菌中质粒不稳定的潜在原因，以及提供相容于在哺乳动物细胞(包括人类细胞)中使用的质粒选择的方式。特别关注了用于人类细胞的质粒的双重要求。首先，它们适合在大肠杆菌(E.coli)中维持和发酵，从而可以产生并纯化出大量DNA。其次，它们是安全的，并适合用于人类患者和动物。第一个要求需要高拷贝数的质粒，可以在细菌发酵过程中相对容易地选择这些质粒并稳定维持。第二个要求需要关注一些元件诸如可筛选标志物和其他编码序列。在一些实施方案中，编码标志物的质粒由以下组成：(1)高拷贝数复制起点，(2)可选择标志物，例如但不限于用于卡那霉素抗生素筛选的neo基因，(3)转录终止序列，包括酪氨酸酶增强子和(4)用于引入各种核酸盒的多克隆位点；以及(5)编码与酪氨酸酶启动子可操作地连接的标志物的核酸序列。在特定方面，质粒不包含酪氨酸酶增强子或启动子。本领域已知有许多质粒载体用于诱导编码蛋白质的核酸。这些包括但不限于在以下文献中公开的载体:美国专利号6,103,470；7,598,364；7,989,425；和6,416,998，以及申请号为12/478,154的美国申请，这些文献通过引用方式并入本文。

游离型基因递送系统可以是质粒、基于EB病毒(EBV)的游离型载体、基于酵母的载体、基于腺病毒的载体、基于猿猴病毒40(SV40)的游离型载体、基于牛乳头瘤病毒(BPV)的载体或慢病毒载体。病毒基因递送系统可以是基于RNA或基于DNA的病毒载体。

Ⅳ.细胞的工程化改造

在一些实施方案中，经过人工对源自选择的一个或多个脐带血单位的免疫细胞进行工程化改造，以用于多种目的。该工程化改造可以用于临床或研究应用的目的。在一些情况下，可以储存工程化免疫细胞，或者可以使用它们，诸如施用于有此需要的个体。该工程化改造可能是也可能不是由从选择的一个或多个脐带血单位生成免疫细胞的同一个体进行的。

在特定的实施方案中，对免疫细胞进行工程化改造，以表达一种或多种非天然受体，诸如抗原受体。抗原可以属于任何种类，并且在至少一些情况下，对免疫细胞进行工程化改造以表达抗原有利于将细胞用于临床应用。抗原可以是癌症抗原(包括肿瘤抗原或造血细胞抗原)，或者抗原可能涉及任何种类的病原体，包括细菌、病毒、真菌、寄生生物等等。

可以对来自所选择的一个或多个脐带血单位的免疫细胞(例如，自体或同种异体T细胞(如调节性T细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞或γδT细胞)、NK细胞、恒定NK细胞、NKT细胞、干细胞(如MSC或iPS细胞))进行基因工程化改造，以表达抗原受体，例如工程化的TCR和/或CAR。举例来说，可以对免疫细胞进行修饰以表达对癌症抗原具有抗原特异性的TCR。在特定的实施方案中，对NK细胞进行工程化改造，以表达TCR。备选地或进一步地对NK细胞进行工程化改造，以表达CAR。可以将多种CAR和/或TCR，诸如针对不同抗原的CAR和/或TCR，添加到单一细胞类型(例如T细胞或NK细胞)中。

修饰细胞的合适方法或重组试剂是本领域已知的。例如，参见上文Sambrook和Ausubel。举例来说，可以使用Heemskerk等人,2008和Johnson等人,2009中所述的转导技术转导细胞以表达对癌症抗原具有抗原特异性的TCR。

在一些实施方案中，细胞包含一种或多种通过基因工程导入的编码一种或多种抗原受体的核酸，以及这种核酸的基因工程化产物。在一些实施方案中，核酸是异源的，即正常情况下不存在于细胞或从该细胞获得的样品中，诸如从另一生物体或细胞获得的核酸，例如，这种核酸通常不存在于接受工程化改造的细胞和/或这种细胞所来源的生物体中。在一些实施方案中，核酸不是天然存在的，诸如是自然界中不存在的核酸(例如，嵌合的)。

在一些实施方案中，CAR包含特异性结合抗原的细胞外抗原识别结构域。在一些实施方案中，抗原是在细胞表面上表达的蛋白质。在一些实施方案中，CAR是TCR样CAR，并且抗原是经过加工的肽抗原，诸如细胞内蛋白的肽抗原，其像TCR一样，在主要组织相容性复合体(MHC)分子的背景下在细胞表面上得到识别。

示例性抗原受体，包括CAR和重组TCR，以及用于工程化改造受体并将其导入细胞的方法，包括例如在以下文献中描述的那些：国际专利申请公布号WO2000/14257、WO2013/126726、WO2012/129514、WO2014/031687、WO2013/166321、WO2013/071154、WO2013/123061，美国专利申请公布号US2002131960、US2013287748、US20130149337，美国专利号6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353和8,479,118，以及欧洲专利申请号EP2537416，和/或由Sadelain等人,2013；Davila等人,2013；Turtle等人,2012；Wu等人,2012描述的那些。在一些方面，基因工程化的抗原受体包括如美国专利号7,446,190中所述的CAR和国际专利申请公布号WO/2014055668A1中描述的那些抗原受体。

对于其中利用TCR的实施方案，编码全长TCRα和β(或γ和δ)链的RNA的电穿孔可以用作备选方案，以克服由逆转录病毒转导的TCR链和内源性TCR链配对造成的长期自身反应性问题。即使在瞬时转染策略中发生这种备选配对，可能产生的自身反应性T细胞在一段时间后也会丧失这种自身反应性，因为所导入的TCRα和β链只是瞬时表达。当所导入的TCRα和β链表达减少时，只剩下正常的自体T细胞。当通过稳定的逆转录病毒转导导入全长TCR链时，情况并非如此，它永远不会失去所导入的TCR链，从而在患者中导致持续存在的自身反应性。

在基因修饰之后，可以立即递送免疫细胞(例如输注)，或者可以将它们储存起来。在某些方面，在基因修饰之后，可以在基因转移到细胞中后约1、2、3、4、5天或更长时间内，将细胞作为主体群落(bulk population)离体增殖数天、数周或数月。在另一方面，克隆转染子，并离体扩增证明存在单一整合的或游离型维持的表达盒或质粒以及表达嵌合受体(举例来说)的克隆。选择用于扩增的克隆表现出特异性识别并溶解表达抗原的靶细胞的能力。重组免疫细胞可以通过刺激来扩增，诸如使用IL-2或者结合共同γ链的其他细胞因子(例如，IL-7、IL-12、IL-15、IL-21等)。重组免疫细胞可以通过使用人工抗原呈递细胞刺激来扩增。在另一方面，基因修饰的细胞可以冷冻保存。

A.嵌合抗原受体

在一些实施方案中，对免疫细胞进行工程化改造以表达CAR，并且该CAR可以包括：a)一个或多个细胞内信号传导结构域，b)跨膜结构域，以及c)包含抗原结合区的胞外结构域。

在一些实施方案中，工程化抗原受体包括CAR，其包括激活性或刺激性CAR、共刺激CAR(参见WO2014/055668)和/或抑制性CAR(iCAR，参见Fedorov等人,2013)。CAR通常包括与一个或多个细胞内信号传导成分连接的胞外抗原(或配体)结合结构域，在一些方面通过接头和/或一个或多个跨膜结构域连接。这种分子通常模拟或近似通过天然抗原受体的信号、通过这种受体与共刺激受体组合的信号和/或仅通过共刺激受体的信号。

本公开的某些实施方案涉及使用核酸，包括编码抗原特异性CAR多肽的核酸，这种CAR包括已进行人源化以降低免疫原性的CAR(hCAR)，其包含细胞内信号传导结构域、跨膜结构域以及含有一个或多个信号传导基序的胞外结构域。在某些实施方案中，CAR可以识别包含一种或多种抗原之间的共有空间的表位。在某些实施方案中，结合区可以包含单克隆抗体的互补决定区、单克隆抗体的可变区和/或其抗原结合片段。在另一实施方案中，这种特异性来源于与受体结合的肽(如细胞因子)。

可以设想的是，人CAR核酸可以是用于增强人类患者的细胞免疫治疗的人类基因。在一个具体实施方案中，本发明包括全长CAR cDNA或编码区。抗原结合区或结构域可以包含源自特定人单克隆抗体的单链可变片段(scFv)的V_H和V_L链的片段，诸如在美国专利号7,109,304中描述的那些，其通过引用方式并入本文。片段也可以是任意数量的人抗原特异性抗体的不同抗原结合结构域。在一个更具体的实施方案中，该片段是抗原特异性scFv，其由针对在人类细胞中表达的人类密码子使用而优化的序列编码。

排列可以是多聚形式，例如双链抗体或多聚体。多聚体最有可能是通过将轻链和重链的可变部分交叉配对成双链抗体而形成的。构建体的铰链部分可以有多种选择，从完全缺失，到保留第一半胱氨酸，到脯氨酸而不是丝氨酸置换，再到一直截短至第一半胱氨酸。Fc部分可以缺失。任何稳定的和/或二聚化的蛋白质都可以达到这个目的。可以仅使用Fc结构域之一，例如来自人免疫球蛋白的CH2或CH3结构域。还可以使用已经过修饰以改善二聚化的人免疫球蛋白的铰链、CH2和CH3区域。还可以仅使用免疫球蛋白的铰链部分。也可以使用CD8α的部分。

在一些实施方案中，CAR核酸包含编码其他共刺激受体的序列，例如跨膜结构域和经修饰的CD28细胞内信号传导结构域。其他共刺激受体包括但不限于CD28、CD27、OX-40(CD134)、DAP10、DAP12和4-1BB(CD137)中的一种或多种。除了由CD3ζ启动的初级信号外，由插入人CAR中的人共刺激受体提供的附加信号对于NK细胞的完全激活也很重要，并且可能有助于提高过继性免疫疗法的体内持久性和治疗成功率。

在一些实施方案中，将CAR构建成对特定抗原(或标志物或配体)具有特异性，这种抗原诸如在过继性疗法所靶向的特定细胞类型中表达的抗原，例如癌症标志物和/或旨在诱导遏抑应答的抗原，诸如在正常或非病变细胞类型上表达的抗原。因此，CAR通常在其胞外部分包括一个或多个抗原结合分子，例如一个或多个抗原结合片段、结构域或部分，或者一个或多个抗体可变结构域，和/或抗体分子。在一些实施方案中，CAR包括抗体分子的一个或多个抗原结合部分，例如源自单克隆抗体(mAb)的可变重(VH)链和可变轻(VL)链的单链抗体片段(scFv)。

在嵌合抗原受体的某些实施方案中，受体的抗原特异性部分(其可以称为包含抗原结合区的胞外结构域)包含肿瘤相关抗原或病原体特异性抗原结合结构域。抗原包括由模式识别受体如Dectin-1识别的碳水化合物抗原。肿瘤相关抗原可以属于任何种类，只要其在肿瘤细胞的细胞表面上表达即可。肿瘤相关抗原的示例性实施方案包括CD19、CD20、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、MUC-1、CD56、EGFR、c-Met、AKT、Her2、Her3、上皮性肿瘤抗原、黑色素瘤相关抗原、突变型p53、突变型ras等等。在某些实施方案中，当存在少量肿瘤相关抗原时，可以将CAR与细胞因子共表达以提高持久性。举例来说，可以将CAR与IL-15共表达。

编码嵌合受体的开放阅读框的序列可以获自基因组DNA来源、cDNA来源，或者可以合成(例如，通过PCR)，或者它们的组合。根据基因组DNA的大小和内含子的数量，可能期望使用cDNA或其组合，因为发现内含子会稳定mRNA。而且，使用内源性或外源性非编码区来稳定mRNA可能更有优势。

可以设想的是，可以将嵌合构建体作为裸DNA或在合适的载体中导入免疫细胞中。通过使用裸DNA进行电穿孔来稳定转染细胞的方法是本领域已知的。参见，例如美国专利号6,410,319。一般而言，裸DNA指的是质粒表达载体中包含的编码嵌合受体的DNA，其处于正确方向以进行表达。

备选地，可以使用病毒载体(例如，逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或慢病毒载体)将嵌合构建体导入免疫细胞中。根据本公开的方法使用的合适载体在免疫细胞中是非复制型。已知大量基于病毒的载体，其中保留在细胞中的病毒拷贝数低到足以维持细胞的活力，例如基于HIV、SV40、EBV、HSV或BPV的载体。

在一些方面，抗原特异性结合或识别成分与一个或多个跨膜和细胞内信号传导结构域相连。在一些实施方案中，CAR包括与CAR的胞外结构域融合的跨膜结构域。在一个实施方案中，使用了与CAR中的结构域之一天然缔合的跨膜结构域。在一些情况下，通过氨基酸置换选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而最大限度地减少与受体复合物的其他成员的相互作用。

在一些实施方案中，跨膜结构域源自天然或合成的来源。如果来源是天然的，该结构域在某些方面来源于任何膜结合型或跨膜蛋白。跨膜区包括源自T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、ICOS/CD278、GITR/CD357、NKG2D和DAP分子的那些区域(即至少包含其一个或多个跨膜区)。备选地，在一些实施方案中，跨膜结构域是合成的。在一些方面，合成的跨膜结构域主要包含疏水性残基，例如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，在合成跨膜结构域的每一端都会发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。

在某些实施方案中，本文公开的对免疫细胞如NK细胞进行基因修饰的平台技术包括(i)使用电穿孔装置(例如，核转染仪)的非病毒基因转移，(ii)通过胞内结构域(例如，CD28/CD3-ζ、CD137/CD3-ζ或其他组合)传导信号的CAR，(iii)具有可变长度的将抗原识别结构域连接到细胞表面的胞外结构域的CAR，并且在一些情况下，(iv)源自K562的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其能够稳健且大量地扩增CAR⁺免疫细胞(Singh等人,2008；Singh等人,2011)。

B.T细胞受体(TCR)

在一些实施方案中，基因工程化的抗原受体包括重组TCR和/或从天然存在的T细胞克隆的TCR。“T细胞受体”或“TCR”指的是含有可变α和β链(也分别称为TCRα和TCRβ)或者可变γ和δ链(也分别称为TCRγ和TCRδ)并且能够特异性结合与MHC受体结合的抗原肽的分子。在一些实施方案中，TCR是αβ形式。

一般而言，以αβ和γδ形式存在的TCR通常在结构上相似，但表达它们的T细胞可能具有不同的解剖位置或功能。TCR可以存在于细胞表面上或以可溶形式存在。总体来说，TCR存在于T细胞(或T淋巴细胞)的表面上，在那里它通常负责识别与主要组织相容性复合体(MHC)分子结合的抗原。在一些实施方案中，TCR还可以包含恒定结构域、跨膜结构域和/或短胞质尾(参见，例如Janeway等人,1997)。举例来说，在一些方面，TCR的每条链可以具有一个N-末端免疫球蛋白可变结构域、一个免疫球蛋白恒定结构域、跨膜区和位于C-末端端的短胞质尾。在一些实施方案中，TCR与参与介导信号转导的CD3复合物的恒定蛋白缔合。除非另有说明，否则术语“TCR”应当理解为涵盖其功能性TCR片段。该术语还涵盖完整或全长TCR，包括αβ形式或γδ形式的TCR。

因此，出于本文的目的，提及的TCR包括任何TCR或功能性片段，诸如与结合在MHC分子中的特定抗原肽(即MHC-肽复合物)结合的TCR的抗原结合部分。可以互换使用的TCR的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”指的是含有TCR结构域的一部分但结合完整TCR所结合的抗原(例如MHC-肽复合物)的分子。在一些情况下，抗原结合部分包含TCR的可变结构域，例如TCR的可变α链和可变β链，其足以形成用于结合特定MHC-肽复合物的结合位点，诸如通常其中每条链包含三个互补决定区。

在一些实施方案中，TCR链的可变结构域缔合以形成环或类似于免疫球蛋白的互补决定区(CDR)，其通过形成TCR分子的结合位点而赋予抗原识别并决定肽特异性，并决定肽特异性。通常，与免疫球蛋白一样，CDR由框架区(FR)隔开(参见，例如Jores等人,1990；Chothia等人,1988；Lefranc等人,2003)。在一些实施方案中，CDR3是负责识别经加工抗原的主要CDR，尽管也已证明α链的CDR1与抗原肽的N-末端部分相互作用，而β链的CDR1与该肽的C-末端部分相互作用。认为CDR2识别MHC分子。在一些实施方案中，β链的可变区可以包含另一个高变(HV4)区。

在一些实施方案中，TCR链包含恒定结构域。举例来说，与免疫球蛋白一样，TCR链(例如，α链、β链)的胞外部分可包含两个免疫球蛋白结构域，一个位于N-末端的可变结构域(例如，Va或Vp；通常是基于Kabat编号的氨基酸1至116，Kabat等人,Sequences ofProteins ofImmunological Interest,USDept.Health and Human Services,PublicHealth Service National Institutes of Health,1991年,第5版)和一个邻近细胞膜的恒定结构域(例如，a-链恒定结构域或C_a，通常是基于Kabat的氨基酸117至259、β-链恒定结构域或Cp，通常是基于Kabat的氨基酸117至295)。举例来说，在一些情况下，由两条链形成的TCR的胞外部分包含两个膜近端恒定结构域和两个包含CDR的膜远端可变结构域。TCR结构域的恒定结构域包含短连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，从而在两条链之间形成连接。在一些实施方案中，TCR可以在α链和β链中的每一条中都具有额外的半胱氨酸残基，使得TCR在恒定结构域中包含两个二硫键。

在一些实施方案中，TCR链可以包含跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域带有正电荷。在一些情况下，TCR链包含胞质尾。在一些情况下，该结构允许TCR与其他分子如CD3缔合。举例来说，包含带有跨膜区的恒定结构域的TCR可以将蛋白质锚定在细胞膜中，并与CD3信号传导器或复合物的恒定亚基缔合。

一般而言，CD3是一种多蛋白复合物，其可以具有哺乳动物的三种不同的链(γ、δ和ε)以及ζ-链。举例来说，在哺乳动物中，该复合物可以包含一条CD3-γ链、一条CD3-δ链、两条CD3-ε链和CD3-ζ链的同二聚体。CD3-γ、CD3-δ和CD3-ε链是包含单个免疫球蛋白结构域的免疫球蛋白超家族中高度相关的细胞表面蛋白。CD3-γ、CD3-δ和CD3-ε链的跨膜区带有负电荷，这一特征使这些链可以与带正电荷的T细胞受体链缔合。CD3-γ、CD3-δ和CD3-ε链的细胞内尾部各自包含单个保守基序，称为免疫受体基于酪氨酸激活基序或ITAM，而每条CD3-ζ链都有三个保守基序。总体来说，ITAM参与TCR复合物的信号传导能力。这些辅助分子具有带负电荷的跨膜区，并在将信号从TCR传播到细胞内的过程中发挥作用。

在一些实施方案中，TCR可以是两条链α和β(或任选地γ和δ)的异二聚体，或者它可以是单链TCR构建体。在一些实施方案中，TCR是一种异二聚体，含有两条分别的链(α和β链或γ和δ链)，这两条链连接在一起，例如通过一个或多个二硫键连接。在一些实施方案中，鉴定针对靶抗原(例如，癌症抗原)的TCR并将其导入细胞中。在一些实施方案中，编码TCR的核酸可以获自多种来源，诸如通过对可公开获取的TCR DNA序列进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。在一些实施方案中，TCR获自生物来源，诸如获自细胞，例如获自T细胞(例如，细胞毒性T细胞)、T细胞杂交瘤或其他可公开获取的来源。在一些实施方案中，T细胞可以从体内分离的细胞中获得。在一些实施方案中，可以从患者中分离出高亲和力T细胞克隆，并分离出TCR。在一些实施方案中，T细胞可以是培养的T细胞杂交瘤或克隆。在一些实施方案中，已经在使用人免疫系统基因(例如，人白细胞抗原系统或HLA)进行工程化改造的转基因小鼠中生成了针对靶抗原的TCR克隆。参见，例如肿瘤抗原(参见，例如Parkhurst等人,2009和Cohen等人,2005)。在一些实施方案中，使用噬菌体展示来分离针对靶抗原的TCR(参见，例如Varela-Rohena等人,2008和Li,2005)。在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分可以根据TCR序列的知识以合成方式生成。

C.抗原

在特定情况下，源自所选择的一个或多个脐带血单位的免疫细胞经过工程化改造以表达靶向抗原的蛋白质，诸如靶向抗原的受体。在特定情况下，该受体经过基因工程化改造以包含不同来源的嵌合成分。基因工程化抗原受体所靶向的抗原包括那些在通过过继性细胞疗法要靶向的疾病、病况或细胞类型的背景中表达的抗原。所述疾病和病况涵盖增殖性、赘生性和恶性疾病和病症，包括癌症和肿瘤，包括血液系统癌症、免疫系统癌症，诸如淋巴瘤、白血病和/或骨髓瘤，例如B型、T型和髓系白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，与正常或非靶向细胞或组织相比，在疾病或病况的细胞(例如肿瘤或病变细胞)上选择性表达或过表达抗原。在其他实施方案中，抗原在正常细胞上表达和/或在工程化细胞上表达。

任何合适的抗原均可用于本发明的方法中。示例性抗原包括但不限于来自感染性物质的抗原分子、自身/自体抗原、肿瘤/癌症相关抗原和肿瘤新生抗原(Linnemann等人,2015)。在特定方面，抗原包括NY-ESO、EGFRvIII、Muc-1、Her2、CA-125、WT-1、Mage-A3、Mage-A4、Mage-A10、TRAIL/DR4和CEA。在特定方面，两种或更多种抗原受体的抗原包括但不限于CD19、EBNA、WT1、CD123、NY-ESO、EGFRvIII、MUC1、HER2、CA-125、WT1、Mage-A3、Mage-A4、Mage-A10、TRAIL/DR4和/或CEA。这些抗原的序列是本领域已知的，例如CD19(登录号NG_007275.1)、EBNA(登录号NG_002392.2)、WT1(登录号NG_009272.1)、CD123(登录号NC_000023.11)、NY-ESO(登录号NC_000023.11)、EGFRvIII(登录号NG_007726.3)、MUC1(登录号NG_029383.1)、HER2(登录号NG_007503.1)、CA-125(登录号NG_055257.1)、WT1(登录号NG_009272.1)、Mage-A3(登录号NG_013244.1)、Mage-A4(登录号NG_013245.1)、Mage-A10(登录号NC_000023.11)、TRAIL/DR4(登录号NC_000003.12)和/或CEA(登录号NC_000019.10)。

肿瘤相关抗原可源自前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胰腺癌、肾癌、间皮瘤、卵巢癌或黑色素瘤癌。示例性肿瘤相关抗原或肿瘤细胞来源的抗原包括MAGE 1、3和MAGE 4(或者其他MAGE抗原，诸如在国际专利公布号WO99/40188中公开的抗原)；PRAME；BAGE；RAGE、Lage(亦称为NY ESO 1)；SAGE；以及HAGE或GAGE。肿瘤抗原的这些非限制性实例在多种肿瘤类型中表达，诸如黑色素瘤、肺癌、肉瘤和膀胱癌。参见，例如美国专利号6,544,518。前列腺癌肿瘤相关抗原包括例如前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺酸性磷酸、NKX3.1以及前列腺六跨膜上皮抗原(STEAP)。

其他肿瘤相关抗原包括Plu-1、HASH-1、HasH-2、Cripto和Criptin。另外，肿瘤抗原可以是自身肽激素，诸如全长促性腺激素释放激素(GnRH)，这是一种10个氨基酸长的短肽，可用于治疗多种癌症。

肿瘤抗原包括来源于以肿瘤相关抗原表达(例如HER-2/neu表达)为特征的癌症的肿瘤抗原。所关注的肿瘤相关抗原包括谱系特异性肿瘤抗原，例如黑色素细胞-黑色素瘤谱系抗原MART-1/Melan-A、gp100、gp75、mda-7、酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白。说明性的肿瘤相关抗原包括但不限于源自或包含以下任何一种或多种的肿瘤抗原：p53、Ras、c-Myc、胞质型丝氨酸/苏氨酸激酶(例如，A-Raf、B-Raf和C-Raf、细胞周期蛋白依赖性激酶)、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、MART-1、BAGE、DAM-6、DAM-10,GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、MART-1、MC1R、Gpl00、PSA、PSM、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC2、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)、TRK受体、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、Wilms肿瘤抗原(WT1)、AFP、-连环蛋白/m、半胱天冬酶-8/m、CEA、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TPI/mbcr-abl、BCR-ABL、干扰素调节因子4(IRF4)、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RAR、肿瘤相关钙信号转导蛋白1(TACSTD1)、TACSTD2、受体酪氨酸激酶(例如，表皮生长因子受体(EGFR)(特别是EGFRvIII)、血小板来源的生长因子受体(PDGFR)、血管内皮生长因子受体(VEGFR))、细胞质酪氨酸激酶(例如，src家族、syk-ZAP70家族)、整联蛋白连接激酶(ILK)、信号转导和转录激活因子STAT3、STATS和STATE、缺氧诱导因子(例如，HIF-1和HIF-2)、核因子κB(NF-B)、Notch受体(例如，Notchl-4)、c-Met、哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR)、WNT、细胞外信号调节激酶(ERK)及其调节亚基、PMSA、PR-3、MDM2、间皮素、肾细胞癌-5T4、SM22-α、碳酸酐酶I(CAI)和IX(CAIX)(亦称为G250)、STEAD、TEL/AML1、GD2、蛋白酶3、hTERT、肉瘤易位断点蛋白、EphA2、ML-IAP、EpCAM、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、ALK、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、聚唾液酸、MYCN、RhoC、GD3、岩藻糖基GM1、间皮素、PSCA、sLe、PLAC1、GM3、BORIS、Tn、GLoboH、NY-BR-1、RGsS、SART3、STn、PAX5、OY-TES1、精子蛋白17、LCK、HMWMAA、AKAP-4、SSX2、XAGE 1、B7H3、豆荚蛋白、TIE2、Page4、MAD-CT-1、FAP、MAD-CT-2、fos相关抗原1、CBX2、CLDN6、SPANX、TPTE、ACTL8、ANKRD30A、CDKN2A、MAD2L1、CTAGiB、SUNC1、LRRN1以及独特型。

抗原可以包括源自肿瘤细胞中发生突变的基因或源自肿瘤细胞中与正常细胞相比以不同水平转录的基因的表位区或表位肽，诸如端粒酶、存活素、间皮素、突变型ras、bcr/abl重排、Her2/neu、突变型或野生型p53、细胞色素P450 1B1和异常表达的内含子序列，如N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-V；免疫球蛋白基因的克隆性重排，从而在骨髓瘤和B细胞淋巴瘤中生成罕见的独特型；包括源自致癌病毒过程的表位区或表位肽的肿瘤抗原，如人乳头瘤病毒蛋白E6和E7；EB病毒蛋白LMP2；具有肿瘤选择性表达的非突变型癌胚蛋白，如癌胚抗原和甲胎蛋白。

在其他实施方案中，抗原获自或源自病原微生物或机会性病原微生物(本文也称为感染性疾病微生物)，诸如病毒、真菌、寄生虫和细菌。在某些实施方案中，源自这种微生物的抗原包括全长蛋白质。

可以设想将其抗原用于本文所述方法的说明性致病生物体包括任何种类的冠状病毒，包括SARS-CoV和SARS-CoV2、人类免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹病毒(HSV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、甲型、乙型和丙型流感病毒、水泡性口炎病毒(VSV)、水泡性口炎病毒(VSV)、多瘤病毒(例如，BK病毒和JC病毒)、腺病毒、葡萄球菌属(Staphylococcus)物种，包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，以及链球菌(Streptococcus)物种，包括肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)。如本领域技术人员所理解的，可以在出版物和公共数据库(例如，和)中鉴定源自这些和其他病原微生物以用作如本文所述抗原的蛋白质以及编码蛋白质的核苷酸序列。

源自人类免疫缺陷病毒(HIV)的抗原包括任何HIV病毒体结构蛋白(例如，gp120、gp41、p17、p24)、蛋白酶、逆转录酶或由tat、rev、nef、vif、vpr和vpu编码的HIV蛋白。

源自单纯疱疹病毒(例如，HSV1和HSV2)的抗原包括但不限于由HSV晚期基因表达的蛋白质。该晚期组基因主要编码形成病毒体颗粒的蛋白质。这种蛋白质包括由其(UL)形成病毒衣壳的五种蛋白质：UL6、UL18、UL35、UL38和主要衣壳蛋白UL19、UL45和UL27，其中每一种都可用作如本文所述的抗原。可以设想用作本文抗原的其他说明性HSV蛋白包括ICP27(H1、H2)、糖蛋白B(gB)和糖蛋白D(gD)蛋白。HSV基因组包含至少74个基因，每个基因都编码一种可能用作抗原的蛋白质。

源自巨细胞病毒(CMV)的抗原包括CMV结构蛋白、在病毒复制的立即早期和早期阶段表达的病毒抗原、糖蛋白I和III、衣壳蛋白、外壳蛋白、低基质蛋白pp65(ppUL83)、p52(ppUL44)、IE1和IE2(UL123和UL122)、来自UL128-UL150的基因簇的蛋白产物(Rykman等人,2006)、包膜糖蛋白B(gB)、gH、gN和pp150。如本领域技术人员所理解的，可以在公共数据库例如GENBANK.RTM.、SWISS-PROT.RTM.和TREMBL.RTM.中鉴定用作本文所述抗原的CMV蛋白(参见，例如Bennekov等人,2004；Loewendorf等人,2010；Marschall等人,2009)。

可以设想在某些实施方案中使用的源自EB病毒(EBV)的抗原包括EBV溶解蛋白gp350和gp110，潜伏周期感染期间产生的EBV蛋白，包括EB病毒核抗原(EBNA)-1、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNA-前导蛋白(EBNA-LP)以及潜伏膜蛋白(LMP)-1、LMP-2A和LMP-2B(参见，例如Lockey等人,2008)。

可以设想用于本文的源自呼吸道合胞病毒(RSV)的抗原包括由RSV基因组编码的11种蛋白质中的任何一种，或其抗原片段：NS1、NS2、N(核衣壳蛋白)、M(基质蛋白)、SH、G和F(病毒外壳蛋白)、M2(第二基质蛋白)、M2-1(延伸因子)、M2-2(转录调控)、RNA聚合酶以及磷蛋白P。

可以设想使用的源自水泡性口炎病毒(VSV)的抗原包括由VSV基因组编码的五种主要蛋白质中的任何一种及其抗原片段：大蛋白(L)、糖蛋白(G)、核蛋白(N)、磷蛋白(P)和基质蛋白(M)(参见，例如Rieder等人,1999)。

可以设想在某些实施方案中使用的源自流感病毒的抗原包括血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质蛋白M1和M2、NS1、NS2(NEP)、PA、PB1、PB1-F2和PB2。

示例性病毒抗原还包括但不限于腺病毒多肽、甲病毒多肽、杯状病毒多肽(例如，杯状病毒衣壳抗原)、冠状病毒多肽、瘟热病毒多肽、埃博拉病毒多肽、肠道病毒多肽、黄病毒多肽、肝炎病毒(AE)多肽(乙型肝炎核心或表面抗原、丙型肝炎病毒E1或E2糖蛋白、核心或非结构蛋白)、疱疹病毒多肽(包括单纯疱疹病毒或水痘带状疱疹病毒糖蛋白)、感染性腹膜炎病毒多肽、白血病病毒多肽、马尔堡(Marburg)病毒多肽、正粘液病毒多肽、乳头瘤病毒多肽、副流感病毒多肽(例如，血凝素和神经氨酸酶多肽)、副粘液病毒多肽、细小病毒多肽、瘟疫病毒多肽、微小核糖核酸病毒多肽(例如，脊髓灰质炎病毒衣壳多肽)、痘病毒多肽(例如，痘苗病毒多肽)、狂犬病病毒多肽(例如，狂犬病病毒糖蛋白G)、呼肠孤病毒多肽、逆转录病毒多肽以及轮状病毒多肽。

在某些实施方案中，抗原可以是细菌抗原。在某些实施方案中，所关注的细菌抗原可以是分泌型多肽。在其他某些实施方案中，细菌抗原包括其多肽的一部分或多部分暴露在细菌外细胞表面上的抗原。

可以设想使用的源自葡萄球菌属物种(包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA))的抗原包括毒力调节因子，诸如Agr系统、Sar和Sae、Arl系统、Sar同源物(Rot、MgrA、SarS、SarR、SarT、SarU、SarV、SarX、SarZ和TcaR)、Srr系统以及TRAP。其他可用作抗原的葡萄球菌蛋白包括Clp蛋白、HtrA、MsrR、顺乌头酸酶、CcpA、SvrA、Msa、CfvA和CfvB(参见，例如Staphylococcus:Molecular Genetics,2008Caister Academic Press,Jodi Lindsay编著)。两种金黄色葡萄球菌(N315和Mu50)的基因组已完成测序并可公开获取，例如在PATRIC(PATRIC:The VBIPathoSystems Resource Integration Center,Snyder等人,2007)。如本领域技术人员所理解的，也可以在其他公共数据库例如和中鉴定用作抗原的葡萄球菌蛋白。

可以设想在本文所述的某些实施方案中使用的源自肺炎链球菌的抗原包括肺炎链球菌溶血素、PspA、胆碱结合蛋白A(CbpA)、NanA、NanB、SpnHL、PavA、LytA、Pht以及菌毛蛋白(RrgA；RrgB；RrgC)。肺炎链球菌的抗原蛋白也是本领域已知的，并且可以在一些实施方案中用作抗原(参见，例如Zysk等人,2000)。肺炎链球菌的毒力株的全基因组序列已完成测序，并且如本领域技术人员所理解的，也可以在其他公共数据库例如和/>中鉴定用于本文的肺炎链球菌蛋白。对根据本公开的抗原所特别关注的蛋白包括毒力因子和预测将暴露于肺炎球菌表面的蛋白质(参见，例如Frolet等人,2010)。

可用作抗原的细菌抗原的实例包括但不限于放线菌多肽、杆菌多肽、拟杆菌(Bacteroides)多肽、博德特氏菌(Bordetella)多肽、巴尔通氏体(Bartonella)多肽、疏螺旋体(Borrelia)多肽(例如，伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi)OspA)、布鲁氏菌(Brucella)多肽、弯曲菌(Campylobacter)多肽、二氧化碳噬纤维菌(Capnocytophaga)多肽、衣原体(Chlamydia)多肽、棒杆菌(Corynebacterium)多肽、考克斯菌(Coxiella)多肽、嗜皮菌(Dermatophilus)多肽、肠球菌(Enterococcus)多肽、埃利希氏体(Ehrlichia)多肽、埃希氏菌(Escherichia)多肽、弗朗西斯氏菌(Francisella)多肽、梭菌(Fusobacterium)多肽、血巴通氏体(Haemobartonella)多肽、嗜血杆菌(Haemophilus)多肽(例如，乙型流感嗜血杆菌外膜蛋白)、螺杆菌(Helicobacter)多肽、克雷伯氏菌(Klebsiella)多肽、L型细菌多肽、钩端螺旋体(Leptospira)多肽、李斯特菌(Listeria)多肽、分枝杆菌(Mycobacteria)多肽、支原体(Mycoplasma)多肽、奈瑟菌(Neisseria)多肽、新立克次氏体(Neorickettsia)多肽、诺卡菌(Nocardia)多肽、巴斯德氏菌(Pasteurella)多肽、消化球菌(Peptococcus)多肽、消化链球菌(Peptostreptococcus)多肽、肺炎球菌多肽(即，肺炎链球菌多肽)(参见本文的描述)、变形杆菌(Proteus)多肽、假单胞菌(Pseudomonas)多肽、立克次体(Rickettsia)多肽、罗卡利马氏体(Rochalimaea)多肽、沙门氏菌(Salmonella)多肽、志贺菌(Shigella)多肽、葡萄球菌多肽、A族链球菌多肽(例如，酿脓链球菌(S.pyogenes)M蛋白)、B族链球菌(无乳链球菌(S.agalactiae))多肽、密螺旋体(Treponema)多肽以及耶尔辛氏菌(Yersinia)多肽(例如，鼠疫耶尔辛氏菌F1和V抗原)。

真菌抗原的实例包括但不限于犁头霉(Absidia)多肽、枝顶孢霉(Acremonium)多肽、链格孢霉(Alternaria)多肽、曲霉(Aspergillus)多肽、蛙粪霉(Basidiobolus)多肽、离蠕孢(Bipolaris)多肽、芽生菌(Blastomyces)多肽、假丝酵母菌(Candida)多肽、球孢子菌(Coccidioides)多肽、耳霉(Conidiobolus)多肽、隐球菌(Cryptococcus)多肽、弯孢菌(Curvalaria)多肽、表皮癣菌(Epidermophyton)多肽、外瓶霉(Exophiala)多肽、地霉(Geotrichum)多肽、组织胞浆菌(Histoplasma)多肽、马杜拉分支菌(Madurella)多肽、马拉色菌(Malassezia)多肽、小孢癣菌(Microsporum)多肽、丛梗孢(Moniliella)多肽、被孢霉(Mortierella)多肽、毛霉(Mucor)多肽、拟青霉(Paecilomyces)多肽、青霉菌(Penicillium)多肽、单胞瓶霉(Phialemonium)多肽、瓶霉(Phialophora)多肽、原孢囊藻(Prototheca)多肽、假霉样真菌(Pseudallescheria)多肽、假小托菌(Pseudomicrodochium)多肽、腐霉(Pythium)多肽、鼻孢子(Rhinosporidium)多肽、根霉(Rhizopus)多肽、齿梗孢(Scolecobasidium)多肽、孢子丝菌(Sporothrix)多肽、匍柄霉(Stemphylium)多肽、毛癣菌(Trichophyton)多肽、丝孢酵母(Trichosporon)多肽和木丝霉(Xylohypha)多肽。

原生动物寄生虫抗原的实例包括但不限于巴倍虫(Babesia)多肽、小袋虫(Balantidium)多肽、贝诺孢子虫(Besnoitia)多肽、隐胞子虫(Cryptosporidium)多肽、艾美球虫(Eimeria)多肽、脑炎微孢子虫(Encephalitozoon)多肽、阿米巴原虫(Entamoeba)多肽、贾第鞭毛虫(Giardia)多肽、哈蒙德虫(Hammondia)多肽、肝簇虫(Hepatozoon)多肽、等孢球虫(Isospora)多肽、利什曼虫(Leishmania)多肽、微孢子虫(Microsporidia)多肽、新孢子虫(Neospora)多肽、微粒子虫(Nosema)多肽、五毛滴虫(Pentatrichomonas)多肽、疟原虫(Plasmodium)多肽。蠕虫寄生虫抗原的实例包括但不限于棘唇线虫(Acanthocheilonema)多肽、猫圆线虫(Aelurostrongylus)多肽、钩口线虫(Ancylostoma)多肽、管圆线虫(Angiostrongylus)多肽、蛔虫(Ascaris)多肽、布鲁线虫(Brugia)多肽、仰钩虫(Bunostomum)多肽、毛细线虫(Capillaria)多肽、夏伯特线虫(Chabertia)多肽、古柏线虫(Cooperia)多肽、环体线虫(Crenosoma)多肽、网尾线虫(Dictyocaulus)多肽、膨结线虫(Dioctophyme)多肽、双瓣线虫(Dipetalonema)多肽、裂头绦虫(Diphyllobothrium)多肽、复孔绦虫(Diplydium)多肽、恶丝虫(Dirofilaria)多肽、龙线虫(Dracunculus)多肽、蛲虫(Enterobius)多肽、类丝虫(Filaroides)多肽、血矛线虫(Haemonchus)多肽、兔唇蛔虫(Lagochilascaris)多肽、罗阿丝虫(Loa)多肽、曼森线虫(Mansonella)多肽、缪勒线虫(Muellerius)多肽、侏形吸虫(Nanophyetus)多肽、板口线虫(Necator)多肽、细颈线虫(Nematodirus)多肽、结节线虫(Oesophagostomum)多肽、盘尾丝虫(Onchocerca)多肽、后睾吸虫(Opisthorchis)多肽、奥斯特线虫(Ostertagia)多肽、副丝虫(Parafilaria)多肽、并殖吸虫(Paragonimus)多肽、副蛔虫(Parascaris)多肽、泡翼线虫(Physaloptera)多肽、原圆线虫(Protostrongylus)多肽、丝状线虫(Setaria)多肽、旋尾线虫(Spirocerca)多肽、螺旋绦虫(Spirometra)多肽、冠丝虫(Stephanofilaria)多肽、类圆线虫(Strongyloides)多肽、圆线虫(Strongylus)多肽、吸吮线虫(Thelazia)多肽、弓蛔虫(Toxascaris)多肽、弓首蛔虫(Toxocara)多肽、旋毛虫(Trichinella)多肽、毛圆线虫(Trichostrongylus)多肽、毛首线虫(Trichuris)多肽、钩虫(Uncinaria)多肽和吴策线虫(Wuchereria)多肽(例如，恶性疟原虫环子孢子蛋白(PfCSP))、子孢子表面蛋白2(PfSSP2)、肝期抗原1羧基末端(PfLSA1c-term)和输出蛋白1(PfExp-1)、肺孢子虫(Pneumocystis)多肽、肉孢子虫(Sarcocystis)多肽、血吸虫(Schistosoma)多肽、泰勒虫(Theileria)多肽、弓形虫(Toxoplasma)多肽以及锥虫(Trypanosoma)多肽。

外寄生虫抗原的实例包括但不限于来自下列的多肽(包括抗原以及过敏原)，即蚤类；蜱类，包括硬蜱和软蜱；蝇类，诸如蠓、蚊、沙蝇、黑蝇、马蝇、角蝇、鹿蝇、舌蝇、螫蝇、蝇蛆病蝇和叮咬蠓虫；蚁类；蜘蛛、虱子；螨类；以及蝽类(true bugs)，诸如床虫和骚扰锥蝽(kissing bugs)。

D.细胞因子

在一些情况下，源自所选择一个或多个脐带血单位的免疫细胞经过工程化改造以表达一种或多种细胞因子，包括一种或多种异源细胞因子。细胞因子可以属于任何种类，但在特定的实施方案中，该一种或多种异源细胞因子选自于由下列组成的组，即IL-4、IL-10、IL-7、IL-2、IL-15、IL-12、IL-18、IL-21及其组合。

在特定的实施方案中，细胞因子是IL-15。IL-15是组织限定性的，并且只有在病理状态下才能在血清或全身中观察到任何水平的IL-15。IL-15具有过继性治疗所需要的几种特征。IL-15是一种稳态细胞因子，其诱导自然杀伤细胞的发育和细胞增殖，通过减轻肿瘤驻留细胞的功能抑制来促进消除既定肿瘤，并抑制AICD。

在一个实施方案中，本公开涉及用一种或多种细胞因子，包括IL-15，共修饰表达CAR的免疫细胞和/或TCR免疫细胞。除了IL-15之外，还设想了其他细胞因子。这些包括但不限于细胞因子、趋化因子和其他有助于用于人类应用的细胞活化和增殖的分子。表达IL-15的NK或T细胞能够持续进行支持性细胞因子信号传导，这对于它们在输注后的存活是关键性的。

E.自杀基因

来源于一个或多个脐带血单位的本公开的免疫细胞可以包含一个或多个自杀基因。如本文所用的术语“自杀基因”定义为一种基因，其在施用前药后实现基因产物转变为杀伤其宿主细胞的化合物。可以使用的自杀基因/前药组合的实例是单纯疱疹病毒-胸苷激酶(HSV-tk)与更昔洛韦、阿昔洛韦或FIAU；氧化还原酶与放线菌酮；胞嘧啶脱氨酶与5-氟胞嘧啶；胸苷激酶胸苷酸激酶(Tdk::Tmk)与AZT；以及脱氧胞苷激酶与阿糖胞苷。

大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶，一种所谓的自杀基因，其可将前药6-甲基嘌呤脱氧核苷转化为有毒的嘌呤6-甲基嘌呤。与前药疗法一起使用的自杀基因的其他实例是大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因和HSV胸苷激酶基因。

示例性自杀基因包括CD20、CD52、EGFRv3或诱导型半胱天冬酶9。在一个实施方案中，截短形式的EGFR变体III(EGFRv3)可用作自杀抗原，其可由西妥昔单抗消除。本领域已知的可用于本公开的其他自杀基因包括嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、细胞色素p450酶(CYP)、羧肽酶(CP)、羧酸酯酶(CE)、硝基还原酶(NTR)、鸟嘌呤核糖基转移酶(XGRTP)、糖苷酶、甲硫氨酸-α,γ-裂合酶(MET)以及胸苷磷酸化酶(TP)。

F.基因破坏

在一些实施方案中，免疫细胞经过工程化改造以破坏一种或多种内源性基因的表达。在特定情况下，破坏可能是敲除或敲低。可以通过任何合适的方法在细胞中产生破坏，包括CRISPR、反义技术，诸如RNAi、siRNA、shRNA和/或核酶，其通常导致表达的瞬时减少，以及基因编辑技术，它导致靶向基因失活或破坏，例如通过诱导断裂和/或同源重组。

在特定情况下，对免疫细胞的一种或多种内源性基因进行修饰，例如表达破坏，其中表达是部分或全部降低。在特定情况下，敲低或敲除一个或多个基因。在特定情况下，在同一步骤或多个步骤中敲低或敲除多个基因。在免疫细胞中编辑的基因可以是任何类型。在特定情况下，在免疫细胞中经过编辑的基因允许免疫细胞在肿瘤微环境中更有效地发挥作用。在特定情况下，基因是以下一种或多种：NKG2A、SIGLEC-7、LAG3、TIM3、CISH、FOXO1、TGFBR2、TIGIT、CD96、ADORA2、NR3C1、PD1、PDL-1、PDL-2、CD47、SIRPA、SHIP1、ADAM17、RPS6、4EBP1、CD25、CD40、IL21R、ICAM1、CD95、CD80、CD86、IL10R、TDAG8、CD5、CD7、SLAMF7、CD38、LAG3、TCR、β2-微球蛋白、HLA、CD73和CD39。在某些实施方案中，经CRISPR破坏的内源性基因是TIGIT，并且在特定情况下，用于此目的的gRNA是GACAGGCACAATAGAAACAA(SEQ ID NO:1)。在一些实施方案中，由CRISPR编辑的内源性基因是CD38，并且在特定情况下，用于此目的的gRNA是TGAGTTCCCAACTTCATTAG(SEQ ID NO:2)和/或GCGGGACATGTTCACCCTGG(SEQ ID NO:3)。

Ⅴ.使用方法

一旦选择了一个或多个脐带血单位，源于其的免疫细胞就可能会或可能不会经过工程化，并且可能会或可能不会储存。在任何情况下，都可以将治疗有效的免疫细胞递送至有此需要的个体，无论是否经过工程化改造。免疫细胞特别有效，因为它们源自所选择的一个或多个脐带血单位，选择它们的明确原因是符合本文所述的一项或多项选择标准。

在一些实施方案中，本公开提供了用于免疫治疗的方法，包括施用有效量的由本公开的方法产生的免疫细胞。在一个实施方案中，通过转移引发免疫应答的免疫细胞群来治疗医学疾病或病症。在本公开的某些实施方案中，通过转移所产生的引发免疫应答的免疫细胞群来治疗癌症或感染。本文提供了用于治疗个体中的癌症或延缓其进展的方法，包括向个体施用有效量的抗原特异性细胞疗法。本发明的方法可用于治疗免疫病症、实体癌、血液系统癌症和病毒感染。

本发明的治疗方法可用的肿瘤包括任何恶性细胞类型，例如存在于实体瘤或血液系统肿瘤中的细胞类型。示例性实体瘤可以包括但不限于选自于由下列器官组成的组中的器官的肿瘤，即胰腺、结肠、盲肠、胃、脑、头、颈、卵巢、肾、喉、肉瘤、肺、膀胱、黑色素瘤、前列腺和乳腺。示例性血液系统肿瘤包括骨髓肿瘤、T或B细胞恶性肿瘤、白血病、淋巴瘤、母细胞瘤、骨髓瘤等。可以使用本文提供的方法治疗的癌症的其他实例包括但不限于肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、腹膜癌、胃部癌症或胃癌(包括胃肠道癌和胃肠道间质癌)、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌症或肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、各种类型的头颈癌和黑色素瘤。

具体而言，癌症可以属于以下组织学分型，但并不限于这些分型：恶性赘生物；癌；未分化癌；巨细胞和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆管细胞癌；肝细胞癌；混合型肝细胞癌和胆管细胞癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉内腺癌；家族性肠息肉型腺癌；实体癌；恶性类癌；细支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸细胞癌；嗜氧性腺癌；嗜碱细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡状腺癌；乳头状及滤泡状腺癌；非包囊硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜癌；皮肤附属器癌；大汗腺腺癌；皮脂腺腺癌；耵聍腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液性腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓质癌；小叶癌；炎性癌；乳腺Paget病；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌伴鳞状化生；恶性胸腺瘤；恶性卵巢间质瘤；恶性泡膜细胞瘤；恶性颗粒细胞瘤；恶性睾丸母细胞瘤；支持细胞癌；恶性睾丸间质细胞瘤；恶性脂质细胞瘤；恶性副神经节瘤；恶性乳腺外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；皮肤丝球肉瘤(glomangiosarcoma)；恶性黑色素瘤；无黑色素性黑色素瘤；浅表扩散性黑色素瘤；小痣恶性黑色素瘤；肢端小痣性黑色素瘤；结节性黑色素瘤；巨大色素痣内恶性黑色素瘤；上皮样细胞黑色素瘤；恶性蓝痣；肉瘤；纤维肉瘤；恶性纤维组织细胞瘤；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；腺泡状横纹肌肉瘤；间质肉瘤；恶性混合瘤；中胚叶混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；恶性间叶瘤；恶性布伦内罗氏瘤(brenner tumor)；恶性乳腺叶状肿瘤；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；胚胎性癌；恶性畸胎瘤；恶性卵巢甲状腺瘤；绒毛膜癌；恶性中肾瘤；血管肉瘤；恶性血管内皮瘤；卡波西氏肉瘤；恶性血管外皮细胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁骨肉瘤；软骨肉瘤；恶性软骨母细胞瘤；间叶性软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤文氏肉瘤；恶性牙源性肿瘤；成釉质细胞牙肉瘤；恶性成釉质细胞瘤；成釉质细胞纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆型星形胶质细胞瘤；纤维型星形胶质细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突神经胶质瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原始神经外胚层肿瘤；小脑肉瘤；神经节神经母细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；恶性脑膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性颗粒细胞瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金病；霍奇金氏；副肉芽肿；恶性小淋巴细胞淋巴瘤；恶性弥漫大细胞淋巴瘤；恶性滤泡性淋巴瘤；蕈样肉芽肿；其他特指的非霍奇金淋巴瘤；B细胞淋巴瘤；低级别/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞性(SL)NHL；中级别/滤泡性NHL；中度弥散性NHL；高级别免疫母细胞性NHL；高级别淋巴母细胞性NHL；高级别小而无裂细胞型NHL；巨块病变型NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；华氏巨球蛋白血症；恶性组织细胞增生；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增殖性小肠病；白血病；淋巴细胞白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞性白血病；髓系白血病；嗜碱性粒细胞白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；成巨核细胞白血病；髓系肉瘤；毛细胞白血病；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴细胞白血病(ALL)；急性髓系白血病(AML)；以及慢性髓系白血病。

特定的实施方案涉及治疗白血病的方法。白血病是一种血液或骨髓癌症，并且其特征在于血细胞(通常是白细胞(白血球))的异常增殖(通过繁殖产生)。它是被称为血液肿瘤的这一大类疾病的一部分。白血病是一个广义术语，涵盖一系列疾病。白血病在临床上和病理学上分为急性和慢性两种形式。

在本公开内容的某些实施方案中，将免疫细胞递送至有此需要的个体，例如患有癌症或感染的个体。然后，细胞增强个体的免疫系统，以攻击相应的癌症或病变细胞。在某些情况下，向个体提供一剂或多剂免疫细胞。在向个体提供两剂或更多剂免疫细胞的情况下，两次施用之间的间隔时间应足够长，以便留出时间使其在个体中增殖，并且在特定的实施方案中，剂次之间的间隔时间为1、2、3、4、5、6、7天或更多天。

本公开的某些实施方案提供了用于治疗或预防免疫介导性病症的方法。在一个实施方案中，受试者患有自身免疫性疾病。自身免疫性疾病的非限制性实例包括：斑秃、强直性脊椎炎、抗磷脂综合征、自身免疫性艾迪森氏病、肾上腺自身免疫性疾病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性卵巢炎和睾丸炎、自身免疫性血小板减少症、白塞病(Behcet's disease)、大疱性类天疱疮、心肌病、乳糜泻性皮炎、慢性疲劳免疫功能紊乱综合征(CFIDS)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、查格-施特劳斯综合征、瘢痕性类天疱疮、CREST综合征、冷凝集素病、克罗恩病、盘状狼疮、原发性混合型冷球蛋白血症、纤维肌痛症-纤维肌炎、肾小球肾炎、格雷氏病、吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barre)、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA神经病变、幼年型关节炎、扁平苔藓、红斑狼疮、梅尼埃病(Meniere's disease)、混合性结缔组织病、多发性硬化、1型或免疫介导性糖尿病、重症肌无力、肾病综合征(例如微小病变肾病、局灶性肾小球硬化症或膜性肾病)、寻常性天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多发性软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、银屑病性关节炎、雷诺现象、赖特综合征(Reiter's syndrome)、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、干燥综合征、僵人综合征、系统性红斑狼疮、红斑狼疮、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎(诸如结节性多动脉炎、大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞性动脉炎或疱疹样皮炎型血管炎)、白癜风以及韦格纳肉芽肿(Wegener's granulomatosis)。因此，可以使用本文公开的方法治疗的自身免疫性疾病的一些实例包括但不限于多发性硬化、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、I型糖尿病、克罗恩病；溃疡性结肠炎、重症肌无力、肾小球肾炎、强直性脊椎炎、血管炎或银屑病。受试者还可能患有过敏性病症，例如哮喘。

在又一实施方案中，受试者是移植器官或干细胞的接受体，并且使用免疫细胞来预防和/或治疗排斥反应。在特定的实施方案中，受试者患有移植物抗宿主病或处于发生移植物抗宿主病的风险中。GVHD是任何使用或含有来自亲缘或非亲缘供体的干细胞的移植的可能并发症。GVHD有两种，急性和慢性。急性GVHD出现在移植后的前三个月内。急性GVHD的体征包括手脚上出现淡红色皮疹，这种皮疹可能扩散并变得更严重，伴有皮肤剥落或起泡。急性GVHD也会影响胃肠，在这种情况下，会出现痉挛、恶心和腹泻。皮肤和眼睛发黄(黄疸)表明急性GVHD已经影响到肝脏。慢性GVHD根据其严重程度进行分级：1期/级为轻度；4期/级为重度。移植后三个月或更晚出现慢性GVHD。慢性GVHD的症状与急性GVHD相似，但除此之外，慢性GVHD还可能影响眼睛的粘液腺、口腔的唾液腺以及润滑胃粘膜和肠道的腺体。可以利用本文公开的任何免疫细胞群。移植器官的实例包括实体器官移植物，例如肾、肝、皮肤、胰腺、肺和/或心脏，或细胞移植物，例如胰岛、肝细胞、成肌细胞、骨髓或者造血干细胞或其他干细胞。移植物可以是复合移植物，例如面部组织。可以在移植前、移植同时或移植后施用免疫细胞。在一些实施方案中，在移植前施用免疫细胞，例如在移植前至少1小时、至少12小时、至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周或至少1个月。在一个特定的非限制性实例中，施用治疗有效量的免疫细胞发生在移植前3-5天。

在一些实施方案中，在免疫细胞治疗之前，可以向受试者施用非清髓性淋巴细胞耗竭化学疗法。非清髓性淋巴细胞耗竭化学疗法可以是任何合适的此类疗法，其可以通过任何合适的途径施用。非清髓性淋巴细胞耗竭化学疗法可以包括例如施用环磷酰胺和氟达拉滨，尤其是在癌症为黑色素瘤的情况下，它可能是转移性的。施用环磷酰胺和氟达拉滨的示例性途径是静脉内途径。同样，可以施用任何合适剂量的环磷酰胺和氟达拉滨。在特定方面，施用约60mg/kg的环磷酰胺两天，然后施用约25mg/m²的氟达拉滨五天。

在某些实施方案中，将促进免疫细胞生长和活化的生长因子与免疫细胞一起或者在免疫细胞之后施用于受试者。免疫细胞生长因子可以是促进免疫细胞生长和活化的任何合适的生长因子。合适的免疫细胞生长因子的实例包括IL-2、IL-7、IL-15和IL-12，其可以单独使用或以各种组合使用，例如IL-2和IL-7，IL-2和IL-15，IL-7和IL-15，IL-2、IL-7和IL-15，IL-12和IL-7，IL-12和IL-15或者IL-12和IL2。

治疗有效量的免疫细胞可以通过多种途径施用，包括胃肠外施用，例如静脉内、腹膜内、肌内、胸骨内或关节内注射，或者输注。

用于过继性细胞疗法的免疫细胞的治疗有效量是指在接受治疗的受试者中实现期望效果的量。例如，这可以是抑制自身免疫性疾病或同种免疫性疾病进展或者引起它们消退所需的免疫细胞的量，或者该量能够缓解由自身免疫性疾病导致的症状，例如疼痛和炎症。它可以是缓解炎症相关症状(如疼痛、水肿和体温升高)所需的量。它也可以是减少或防止移植器官排斥所需的量。

可以按照与疾病一致的治疗方案施用免疫细胞群，例如在一天到数天内单次或多次施用以改善疾病状态，或者在延长的时间内定期施用以抑制病情进展和防止疾病复发。制剂中使用的精确剂量还取决于施用途径以及疾病或病症的严重程度，并且应当根据从业人员的判断和每名患者的情况来决定。免疫细胞的治疗有效量将取决于接受治疗的受试者、痛苦的严重程度和类型以及施用方式。在一些实施方案中，可用于治疗人类受试者的剂量范围为至少3.8x10⁴、至少3.8x10⁵、至少3.8x10⁶、至少3.8x10⁷、至少3.8x10⁸、至少3.8x10⁹到至少3.8x10¹⁰个免疫细胞/m²。在某个实施方案中，用于治疗人类受试者的剂量范围为约3.8×10⁹至约3.8×10¹⁰个免疫细胞/m²。在另外的实施方案中，免疫细胞的治疗有效量可以从约5×10⁶个细胞/kg体重变化至约7.5×10⁸个细胞/kg体重，例如约2×10⁷个细胞/kg体重至约5×10⁸个细胞/kg体重，或约5×10⁷个细胞/kg体重至约2×10⁸个细胞/kg体重。本领域技术人员可以根据受试者的年龄、体重、性别和生理状况很容易地确定免疫细胞的准确量。有效剂量可以从体外或动物模型测试系统得出的剂量应答曲线中外推。

可以将免疫细胞与一种或多种用于治疗免疫介导性病症的其他治疗剂联合施用。联合疗法可以包括但不限于一种或多种抗微生物剂(例如，抗生素、抗病毒剂和抗真菌剂)、抗肿瘤剂(例如，氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、紫杉醇、氟达拉滨、依托泊苷、多柔比星或长春新碱)、免疫消耗剂(例如，氟达拉滨、依托泊苷、多柔比星或长春新碱)、免疫抑制剂(例如，硫唑嘌呤或糖皮质激素，如地塞米松或泼尼松)、抗炎剂(例如，糖皮质激素诸如氢化可的松、地塞米松或泼尼松，或者非甾体抗炎剂诸如乙酰水杨酸、布洛芬或萘普生钠)、细胞因子(例如，白细胞介素-10或转化生长因子-β)、激素(例如，雌激素)或疫苗。另外，可以施用免疫抑制剂或致耐受剂，包括但不限于钙调磷酸酶(calcineurin)抑制剂(例如，环孢素和他克莫司)；mTOR抑制剂(例如，雷帕霉素)；霉酚酸酯、抗体(例如，识别CD3、CD4、CD40、CD154、CD45、IVIG或B细胞)；化学治疗剂(例如，甲氨蝶呤、苏消安(Treosulfan)、白消安(Busulfan))；辐照；或者趋化因子、白细胞介素或其抑制剂(例如，BAFF、IL-2、抗IL-2R、IL-4、JAK激酶抑制剂)。根据所需效果，可以在施用免疫细胞之前、期间或之后施用这种另外的药剂。细胞和药剂的这种施用可以通过相同的途径或通过不同的途径，并且可以在相同的部位或在不同的部位。

在某些实施方案中，本发明实施方案的组合物和方法涉及免疫细胞群与至少一种另外疗法的组合。另外的疗法可以是放射疗法、手术(例如，肿瘤切除术和乳房切除术)、化疗、基因疗法、DNA疗法、病毒疗法、RNA疗法、免疫疗法、骨髓移植、纳米疗法、单克隆抗体疗法或前述疗法的组合。另外的疗法可以是辅助疗法或新辅助疗法的形式。

在一些实施方案中，另外的疗法是施用小分子酶抑制剂或抗转移剂。在一些实施方案中，另外的疗法是施用副作用限制剂(例如，旨在降低治疗副作用的发生率和/或严重程度的药剂，诸如止吐剂等)。在一些实施方案中，另外的疗法是放射疗法。在一些实施方案中，另外的疗法是手术。在一些实施方案中，另外的疗法是放射疗法和外科手术的组合。在一些实施方案中，另外的疗法是γ辐照。在一些实施方案中，另外的疗法是靶向PBK/AKT/mTOR通路的疗法、HSP90抑制剂、微管蛋白抑制剂、细胞凋亡抑制剂和/或化学预防剂。另外的疗法可以是本领域已知的一种或多种化学治疗剂。

相对于另外的癌症疗法，例如免疫检查点疗法，可以在其之前、期间、之后或以各种组合施用免疫细胞疗法。施用的时间间隔范围可以是从同时到几分钟到几天再到几周。在将免疫细胞疗法与另外的治疗剂分开提供给患者的实施方案中，通常会确保在每种递送的时间之间存在的较长一段时间没有失效，从而使得两种化合物仍然能够对患者发挥有利的组合效果。在这种情况下，可以设想的是，可以将抗体疗法和抗癌疗法在彼此相隔约12至24或72小时内，更具体而言是在彼此相隔约6-12小时内，提供给患者。在一些情况下，可能期望大幅延长治疗周期，其中在各自施用之间经过几天(2、3、4、5、6或7天)至几周(1、2、3、4、5、6、7或8周)。

向患者施用任何化合物或本发明实施方案的任何疗法将遵循施用此类化合物的一般规程，同时要考虑到药剂的毒性(如果有的话)。因此，在一些实施方案中，有一个步骤是监测联合疗法可能导致的毒性。

可以将多种多样的化学治疗剂与所产生的免疫细胞一起使用。术语“化学疗法/化疗”指的是使用药物来治疗癌症。“化学治疗剂”用于表示在癌症治疗中施用的化合物或组合物。这些药剂或药物根据它们在细胞内的活性模式进行分类，例如它们是否以及在哪个阶段影响细胞周期。备选地，药剂可以根据其直接交联DNA、嵌入DNA或者通过影响核酸合成来诱导染色体和有丝分裂畸变的能力来表征。

化学治疗剂的实例包括烷化剂，例如噻替哌和环磷酰胺；烷基磺酸酯类，例如白消安、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类，诸如苯并多巴、卡波醌、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙撑亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三乙撑磷酰胺、三乙撑硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；乙酰精宁(acetogenins)(特别是布拉它辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone))；喜树碱类(包括合成类似物拓扑替康)；苔藓虫素(bryostatin)；海绵多聚乙酰(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；念珠藻素(cryptophycin)(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；海兔毒素(dolastatin)；倍癌霉素(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑制素(spongistatin)；氮芥类，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、盐酸氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼氮芥、曲磷胺和尿嘧啶氮芥；亚硝基脲类，例如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，例如烯二炔类抗生素(例如，卡奇霉素(calicheamicin)，特别是卡奇霉素γlI和卡奇霉素ωI1)；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；双膦酸盐，例如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)发色团和相关色素蛋白烯二炔类抗生素发色团、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素、氨茴霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素、放线菌素C、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯琳-多柔比星和脱氧多柔比星)、表阿霉素、依索比星(esorubicin)、伊达比星、马塞罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素，例如丝裂霉素C、霉酚酸、诺拉霉素(nogalarnycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链脲菌素、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)和佐柔比星(zorubicin)；抗代谢药物，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸、蝶罗呤(pteropterin)和三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨和氟尿苷；雄激素类，诸如卡普睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)和睾内酯；抗肾上腺药，例如米托坦和曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；倍曲布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；伊达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌(diaziquone)；伊弗尼辛(elformithine)；依利醋铵；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓(gallium nitrate)；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱类，例如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；尼曲吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多糖复合物；雷佐生(razoxane)；利索新(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verracurin)A、杆孢菌素A和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；紫杉烷类化合物，例如紫杉醇和多西他赛联合吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；铂配位络合物，例如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞宾；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷；伊达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(如CPT-11)；拓朴异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇，例如视黄酸；卡培他滨；卡铂、丙卡巴肼、光神霉素(plicomycin)、吉西他滨、诺维本(navelbine)、法尼基蛋白转移酶抑制剂、反铂(transplatinum)以及上述任何一种的药学上可接受的盐类、酸类或衍生物。

在一些实施方案中，除了本文产生的免疫细胞之外，还向个体提供放射治疗。照射可包括γ-射线、X-射线和/或将放射性同位素定向递送至肿瘤细胞。还考虑了其他形式的DNA损伤因素，诸如微波、质子束照射(美国专利号5,760,395和4,870,287)和UV-照射。最有可能的是，所有这些因素都对DNA、DNA前体、DNA复制和修复以及染色体的组装和维护产生广泛的损害。X射线的剂量范围从长时间(3至4周)50至200伦琴的每日剂量至2000至6000伦琴的单次剂量。放射性同位素的剂量范围变化很大，并且取决于同位素的半衰期、发射的辐射强度和类型以及肿瘤细胞的吸收。

本领域技术人员还将理解，另外的免疫疗法可以与通过本文所涵盖的方法产生的免疫细胞组合使用或一起使用。在癌症治疗的背景下，免疫疗法通常依赖于使用免疫效应细胞和分子来靶向和破坏癌细胞。利妥昔单抗就是这样一个示例。免疫效应物可以是例如对肿瘤细胞表面上的某些标志物具有特异性的抗体。抗体本身可以作为治疗的效应物，或者它可以募集其他细胞来真正影响细胞杀伤。抗体还可以与药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒素A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合并用作靶向剂。备选地，效应物可以是携带表面分子的淋巴细胞，该表面分子直接或间接地与肿瘤细胞靶标发生相互作用。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。

抗体-药物缀合物已成为开发癌症疗法的突破性途径。癌症是世界上导致死亡的主要原因之一。抗体-药物缀合物(ADC)包含与细胞杀伤性药物共价连接的单克隆抗体(MAb)。这种途径将MAb针对其抗原靶标的高特异性与高效力的细胞毒性药物相结合，产生了“武装的”MAb，其将有效载荷(药物)递送至具有富集水平抗原的肿瘤细胞。药物的靶向递送还可最大限度地减少其在正常组织中的暴露，从而降低毒性并提高治疗指数。FDA批准了两种ADC药物，即2011年的ADCETRIS.RTM.(维布妥昔单抗(brentuximab vedotin))和2013年的KADCYLA.RTM.(恩美曲妥珠单抗或T-DM1)，它们验证了这种途径的有效性。目前有超过30种ADC候选药物处于癌症治疗的不同临床试验阶段(Leal等人,2014)。随着抗体工程化和接头-有效载荷优化变得越来越成熟，新ADC的发现和开发越来越依赖于适合这种途径的新靶标的鉴定和验证以及靶向型MAb的产生。ADC靶标的两项标准是在肿瘤细胞中的上调/高水平的表达和稳健的内化作用。

在免疫疗法的一方面，肿瘤细胞必须带有一些易于打靶的标志物，即在大多数其他细胞上不存在的标志物。存在许多肿瘤标志物，并且这些标志物中的任何一种都可能适于在本实施方案的背景下打靶。常见的肿瘤标志物包括CD20、癌胚抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸化路易斯抗原、MucA、MucB、PLAP、层粘连蛋白受体、erb B和p155。免疫疗法的一个备选方面是将抗癌作用与免疫刺激作用相结合。还存在免疫刺激分子，包括：细胞因子，例如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN，趋化因子，例如MIP-1、MCP-1、IL-8，以及生长因子，例如FLT3配体。

目前正在研究或使用的免疫疗法的实例是免疫佐剂，例如牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、二硝基氯苯和芳香族化合物(美国专利号5,801,005和5,739,169；Hui和Hashimoto,1998；Christodoulides等人,1998)；细胞因子疗法，例如干扰素α、β和γ、IL-1、GM-CSF和TNF(Bukowski等人,1998；Davidson等人,1998；Hellstrand等人,1998)；基因疗法，例如TNF、IL-1、IL-2和p53(Qin等人,1998；Austin-Ward和Villaseca,1998；美国专利号5,830,880和5,846,945)；以及单克隆抗体，例如抗CD20、抗神经节苷脂GM2和抗p185(Hollander,2012；Hanibuchi等人,1998；美国专利号5,824,311)。可以设想的是，一种或多种抗癌疗法可以与本文描述的抗体疗法一起使用。

在一些实施方案中，免疫疗法可以是免疫检查点抑制剂。免疫检查点要么上调信号(例如共刺激分子)，要么下调信号。免疫检查点阻断可能针对的抑制性免疫检查点包括腺苷A2A受体(A2AR)、B7-H3(亦称为CD276)、B和T淋巴细胞弱化因子(BTLA)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4，亦称为CD152)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白(KIR)、淋巴细胞活化基因-3(LAG3)、程序性死亡配体1(PD-1)、T细胞免疫球蛋白结构域和黏蛋白结构域3(TIM-3)以及T细胞活化免疫球蛋白抑制V型结构域(VISTA)。尤其是，免疫检查点抑制剂靶向PD-1轴和/或CTLA-4。

免疫检查点抑制剂可以是药物，例如小分子、重组形式的配体或受体，或者特别是抗体，例如人抗体(例如，国际专利公布WO2015016718；Pardoll,Nat Rev Cancer,12(4):252-64,2012；二者都通过引用方式并入本文)。可以使用免疫检查点蛋白或其类似物的已知抑制剂，特别是可以使用嵌合、人源化或人形式的抗体。如本领域技术人员所知的，对于本公开中提及的某些抗体，可以使用备选名称和/或等同名称。在本公开的上下文中，这样的备选和/或等同名称是可互换的。举例来说，已知的是，拉姆布罗力珠单抗(lambrolizumab)也以备选名称和等同名称MK-3475和帕博利珠单抗(pembrolizumab)而为人所知。

在一些情况下，对将接受或已接受本公开免疫细胞的个体进行手术。大约60％的癌症病人将接受某种类型的手术，包括预防性、诊断性或分期性、治疗性和姑息性手术。治疗性手术包括切除术，其中物理性移除、割除和/或破坏全部或部分癌性组织，并且可以与其他疗法结合使用，例如本实施方案的治疗、化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或另类疗法。肿瘤切除术是指对肿瘤的至少一部分进行物理性移除。除了肿瘤切除术之外，手术治疗还包括激光手术、冷冻手术、电手术和显微控制性手术(莫氏手术)。在割除部分或全部癌性细胞、组织或肿瘤后，体内可能形成空腔。可以通过使用另外的抗癌疗法对该区域进行灌注、直接注射或局部施用来完成治疗。这种治疗可以重复进行，例如每1、2、3、4、5、6或7天，或者每1、2、3、4和5周，或者每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。这些治疗也可以是不同的剂量。

可以设想的是，还可以将其他药剂与本实施方案的某些方面联合使用，以提高治疗的疗效。这些另外的药剂包括影响细胞表面受体和GAP连接上调的药剂、细胞抑制剂和分化剂、细胞粘附抑制剂、增加过度增殖细胞对凋亡诱导剂的敏感性的药剂或者其他生物药剂。通过增加GAP连接的数量来增加细胞间信号传导将提高对邻近的过度增殖细胞群的抗过度增殖作用。在其他实施方案中，可以将细胞抑制剂或分化剂与本发明实施方案的某些方面联合使用，以提高治疗的抗过度增殖功效。可以设想细胞粘附抑制剂提高本发明实施方案的功效。细胞粘附抑制剂的实例是局部粘着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀。可以进一步设想的是，可以将提高过度增殖细胞对凋亡敏感性的其他药剂，例如抗体c225，与本实施方案的某些方面联合使用，以提高治疗功效。

Ⅵ.制品或试剂盒

本文还提供了一种制品或试剂盒，其包含从所选择的一个或多个脐带血单位产生的免疫细胞。制品或试剂盒可进一步包括含有说明书的包装插页，该说明书用于使用免疫细胞来治疗个体中的癌症或延缓其进展或者增强患有癌症的个体的免疫功能。本文所述的任何抗原特异性免疫细胞可以包含在制品或试剂盒中。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、袋子和注射器。容器可以由多种材料制成，例如玻璃、塑料(例如聚氯乙烯或聚烯烃)或金属合金(例如不锈钢或哈氏合金)。在一些实施方案中，容器装有配制品，并且容器上或与容器相关的标签可以标明用法。该制品或试剂盒可进一步包括从商业和使用者立场出发所需的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器和带有使用说明的包装插页。在一些实施方案中，该制品进一步包括一种或多种的另一种药剂(例如，化疗剂和抗肿瘤剂)。用于一种或多种药剂的合适容器包括例如瓶子、小瓶、袋子和注射器。

在特定的实施方案中，该制品包含通过本文描述的方法产生的冷冻保存的免疫细胞。冷冻保存的细胞可以用特定的冷冻保护剂来冷冻，该冷冻保护剂适于防止它们在冷冻或冻融时受损。

实施例

包括以下实施例来展示本公开的具体实施方案。本领域技术人员应当理解，在以下实施例中公开的技术代表了本发明人发现的技术，这些技术在公开实施方案的实践中表现良好，因此可以将它们视为构成其实践的特定模式。然而根据本公开，本领域技术人员应该理解，在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方案进行许多更改，并且仍然获得相似或类似的结果。

实施例1

冷冻前CBU特征预测临床应答

本实施例中的研究表征了冷冻前脐带血单位(CBU)特征是否可用于鉴定那些更有可能产生临床有效的细胞产物的CBU。

本发明人利用接收者操作特征(ROC)曲线来表征感兴趣的CBU特征的预测值，并鉴定适当的截断值，该截断值允许将每个单个CBU分类为可能(“好”)或不太可能(“坏”)在患者中诱导临床应答。例如，在图1中，检查了CBU的细胞活力。ROC曲线上的箭头表示CBU细胞活力的值，该值可用于以最佳灵敏度和特异度将CBU分类为“好或坏”(这是由最接近100％灵敏度和100％灵敏度[1-特异度＝0]的点确定的)。在这种情况下，该值是98％。然后，检查患者对CAR-NK细胞的应答。接受由活力>98％的CBU产生的CAR-NK细胞的患者有81.8％的应答率，而接受由活力<98％的CBU制备的CAR-NK细胞的患者只有20％的应答率。这一结果是统计学显著的(Fisher精确检验，p＝0.004)。然后，利用逻辑回归模型验证了这一结果独立于患者的临床特征例如病情缓解状态。

将上述方法用于研究其他变量，如总单核细胞(TNC)回收率。用于预测应答的最佳截断值是76.3％(图2)。在这种情况下，接受由TNC高于和低于73.6的CBU制备的CAR-NK细胞的患者之间的应答差异(58.8％与22.2％)不具有统计学显著性(p＝0.11)。然而，多元逻辑回归模型显示，当考虑到混杂临床变量(如缓解状态)的影响时，TNC对结局的影响具有统计学显著性。

如上所述，该方法也用于其他CBU特征。在一种情况下，对CBU的有核红细胞(NRBC)含量进行了表征。接受由低细胞含量(<7.5x10e7NRBC)的CBU制备的CAR-NK治疗的患者比接受由较高NRBC含量的CBU制备的CAR-NK细胞治疗的患者具有更高的应答率(62.5％与20％,p＝0.05)。同样，采用多元逻辑模型来证明这种影响与临床变量无关。

实施例2

可以将冷冻前CBU特征进行组合以鉴定“超级CBU”

在根据临床特征调整的多元逻辑回归模型中，实施例1中描述的三种CBU特征是应答的独立预测因子。出于这个原因，可以将这三种结合起来以定义“最佳CBU”的标准。图4显示了实施例1中提到的三种CBU特征的多元统计学显著性。然后，利用ROC曲线(右图)来测量CBU标准对输注的CAR-NK细胞产物应答的预测值。曲线下面积(AUC)为0.932表明满足三项标准(活力>98％、TNC回收率>76.3％和NRBC含量<7.5×10e7)是对应答的良好预测因子。图5显示了接受由符合此处和实施例1中提到的三项标准(100％)、两项标准(62.5％)和少于2项标准(8.3％)的CBU单位制备的CAR-NK细胞治疗的患者的应答。这种差异具有统计学意义(p＝0.00009)。在包括临床特征的多元模型中，有利的脐带特征的数量是应答的唯一独立预测因子。

表征了其他CBU相关变量的预测值，它们在选择脐带时是未知的，但可以在细胞产物的制备过程中阐明。在特定的实施方案中，这类变量将在冻融后确定。如果细胞产物不符合适当的标准，则可以利用该方法在制备后丢弃它们。在图6中，检查了获自冷冻CBU的NK细胞的细胞毒性是否可以预测对CAR-NK细胞的临床应答。使用上述方法，结果表明，接受由CBU产生的CAR-NK细胞治疗的患者，其中所述CAR-NK细胞对Raji细胞系的NK细胞细胞毒性在比例为20:1时>18.2，这些患者比接受源自细胞毒性较低的CBU的CAR-NK细胞治疗的患者具有更高的应答率(66.7％与12.5％,p＝0.03)。同样，使用多元逻辑模型来证明这种影响与其他变量无关。

在特定的实施方案中，可以考虑其他变量来改进对临床应答的预测。示例包括以下变量：(1)从中获得脐带血的胎儿或婴儿胎龄<39周；(2)脐带血细胞的冻融后活力>86.5％；(3)培养第0天至第6天期间NK细胞扩增大于或等于7倍；和/或(4)培养第6天至第15天期间NK细胞扩增大于或等于10⁵倍。图7A-7B显示了设定的三项标准(活力>98％、TNC回收率>76.3％和NRBC含量<7.5×10⁷)(图7A)的预测值，其临床应答为93.2％。通过添加紧接上面描述的四个变量，可以将其提高到99.6％(图7B)。

实施例3

一种选择冷冻保存脐带血单位以制备具有最高抗癌效力的工程化自然杀伤细胞的方法

本实施例涉及鉴定对治疗应答的预测因子，其考虑了与选择合适的脐带血单位(CBU)相关的标准。本发明人研究了冷冻前CBU特征是否可用于鉴定那些更有可能产生临床有效细胞产物的CBU。产物特征可以包括冷冻前CBU特征(选择最佳CBU来产生细胞产物)和/或可以包括冻融后和产生中的产物特征，这些特征在特定情况下可以用于拒绝被认为不太可能产生最佳应答的产物。本实施例涉及基于在CD19-CAR-NK试验中接受治疗的37名患者的分析，结局为30天时的完全应答(CR)和部分应答(PR)/CR。

利用接收者操作特征(ROC)曲线来研究感兴趣的CBU特征的预测值，并鉴定适当的截断值，该截断值将允许将每个单个的CBU分类为可能(“好”)或不太可能(“坏”)在患者中诱导临床应答。举例来说，在图8中，检查了CBU的细胞活力。ROC曲线上的箭头表示CBU细胞活力的值，该值可用于以最佳灵敏度和特异度将CBU分类为“好或坏”(这是由最接近100％灵敏度和100％灵敏度[1-特异度＝0]的点确定的)。在这种情况下，该值为99％。然后，考虑了患者对CAR-NK细胞的应答。接受由活力≥99％的CBU产生的CAR-NK细胞的患者具有40.9％的CR率和68.2％的CR/PR率。另一方面，接受由活力<99％的CBU制备的CAR-NK细胞的患者仅具有6.7％的CR率和20％的CR/PR率。这些结果具有统计学意义(Fisher精确检验，分别为p＝0.028和p＝0.007)。然后，使用逻辑回归模型验证了这一结果与患者的临床特征例如缓解状态无关。

将图8中的相同方法应用于图9中的其他CBU特征；在这种情况下，检查了CBU的有核红细胞(NRBC)含量。接受由低细胞含量(<8.0x10e7NRBC)的CBU制备的CAR-NK治疗的患者比接受由较高NRBC含量的CBU制备的CAR-NK细胞治疗的患者具有更高的应答率(CR率35.7％与0％,p＝0.079和PR/CR率60.7％与11.1％,p＝0.019)。同样，使用多元逻辑模型来证明这种影响与其他临床变量无关。

接受由白色人种的CBU制备的CAR-NK细胞治疗的患者比接受其他种族的CBU制备的CAR-NK细胞治疗的患者具有更高的应答率(图10A)。可以将CBU种族与其他CBU特征相结合，以改进更有可能产生临床应答的CBU的选择。图10B示出了将CBU种族与CBU活力相结合的结果。两个因素的结合将CR率从仅有活力时的40.9％提高到两项标准结合时的61.5％(p＝0.031)。

接受由体重>3650克的婴儿的CBU制备的CAR-NK治疗的患者比接受由体重较轻婴儿的CBU制备的CAR-NK细胞治疗的患者具有更高的应答率(图11左侧的图)。类似于图10，可以将婴儿体重与其他CBU特征相结合，以更好地选择更有可能产生临床应答的CBU。图11右侧的图显示了将婴儿体重与CBU活力相结合的结果。两个因素的结合将CR率从仅有活力时的40.9％提高到两项标准结合时的72.7％(p＝0.008)。

在根据临床特征调整的多元逻辑回归模型中，本实施例中上述的四种CBU特征是应答的独立预测因子。出于这个原因，在一些实施方案中，可以将这四种结合起来以定义“最佳CBU”的标准(图12A)。然后，本发明人使用ROC曲线检查了满足最佳CBU标准对CAR-NK细胞产物应答的预测值(图12A)。曲线下面积(AUC)为0.893，表明满足4项标准(活力≥99％、NRBC含量<8.0、婴儿体重>3650克和白色种族)是应答的良好预测因子。

图12C显示了根据患者接受的NK细胞产物所具有的“最佳”CBU特征的数量而得出的应答率(CR在上图并且CR/PR在下图)。举例来说，CR率范围从接受源自仅符合一项标准的CBU的产物的患者的0％到接受源自符合四项标准的CBU的细胞产物的患者的100％应答率(p<0.001)。类似地，对于接受源自具有1、2、3或4项所需特征的CBU的细胞产物的患者，PR/CR率分别为12.5％、30.0％、58.3％和100％(p＝0.003)。图12A示出了根据CBU特征的数量而得出的存活概率。接受源自具有1、2、3或4种特征的CBU的细胞产物的患者的12个月存活概率分别为37.5％、57.1％、79.5％和100％(p＝0.02)。

在19名接受不同NK细胞产物治疗的患者的独立样本中验证了该结果，结果非常相似。在这种情况下，对于接受源自具有≤2、3或4种特征的CBU的细胞产物的患者，第+30天的CR率分别为0％、33.3％和75％(p＝0.029)(图13)。

在一些实施方案中，还有其他参数可以改进对临床应答的预测，例如胎龄≤38周；子宫内采集方法；男性婴儿；处理前体积≤120ml；CD34％>0.4％；培养第0天至第15天期间NK细胞扩增≥450倍；以及培养第6天至第15天期间NK细胞扩增≥70倍。

如前所示，设定的四项标准(活力≥99％、NRBC含量<8、白种人和婴儿体重>3650克)对临床应答的预测值为89.3％。通过添加上述变量，可以将其提高到97.0％(图14)。

尽管已经详细描述了本公开及其优势，但是应当理解的是，在不脱离由所附权利要求限定的设计精神和范围的情况下，可以在本文中做出各种变更、替换和改动。而且，本申请的范围并非意在局限于本说明书中描述的工艺、机器、制造品、物质组成、手段、方法和步骤的特定实施方案。如本领域普通技术人员将从本公开易于理解的那样，根据本公开，可以利用当前存在的或以后将开发的执行与本文描述的相应实施方案基本相同的功能或实现与其基本相同的结果的工艺、机器、制造品、物质组成、手段、方法或步骤。因此，所附权利要求旨在将这些工艺、机器、制造品、物质组成、手段、方法或步骤包括在其范围内。

Claims (51)

1.一种选择脐带血组合物的方法，其包括以下步骤：

在冷冻保存所述脐带血组合物之前测量或者在冷冻保存之前考虑以下项：

(a)脐带血细胞活力；

(b)任选地，总单核细胞(TNC)回收率；

(c)有核红细胞(NRBC)含量；

(d)所述脐带血所来源的婴儿的体重；

(e)所述脐带血所来源的婴儿的生物学母亲和/或生物学父亲的种族；

(f)任选地，所述脐带血所来源的婴儿的胎龄；

(g)任选地，所述脐带血的子宫内采集；

(h)任选地，所述脐带血所来源的是生物学男性婴儿；

(i)任选地，采集的所述脐带血的体积；

(j)任选地，抽取的脐带血中CD34+细胞的数量；以及

冷冻保存之后测量(d)源自冻融后所述脐带血组合物的免疫细胞的细胞毒性。

2.权利要求2所述的方法，其中所述免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞。

3.权利要求2所述的方法，其进一步包括扩增所述NK细胞的步骤。

4.权利要求2或3所述的方法，其进一步包括修饰所述NK细胞的步骤。

5.权利要求4所述的方法，其中对所述NK细胞进行修饰以表达一种或多种非内源性基因产物。

6.权利要求5所述的方法，其中所述非内源性基因产物包含一种或多种非内源性受体。

7.权利要求6所述的方法，其中所述非内源性受体是嵌合受体。

8.权利要求7所述的方法，其中所述嵌合受体是嵌合抗原受体。

9.权利要求6所述的方法，其中所述非内源性受体是非天然T细胞受体。

10.权利要求5所述的方法，其中所述非内源性基因产物包含一种或多种非内源性受体、一种或多种细胞因子、一种或多种趋化因子、一种或多种酶或者其组合。

11.权利要求4-10中任一项所述的方法，其中对所述NK细胞进行修饰以破坏NK细胞中一种或多种内源性基因的表达。

12.一种选择脐带血组合物的方法，其包括以下步骤：

在冷冻保存之前鉴定脐带血组合物，确定所述脐带血组合物具有以下一种或多种特征：

(a)脐带血细胞活力大于或等于约98％或99％；

(b)任选地，总单核细胞(TNC)回收率大于或等于76.3％；

(c)有核红细胞(NRBC)含量小于或等于约7.5x10⁷至约8.0x10⁷；

(d)所述脐带血所来源的婴儿的体重大于约3650克；

(e)所述脐带血所来源的婴儿的生物学母亲和/或生物学父亲的种族是白种人；

(f)任选地，所述脐带血所来源的婴儿的胎龄小于或等于约38周；

(g)任选地，子宫内采集所述脐带血；

(h)任选地，所述脐带血所来源的是生物学男性婴儿；

(i)任选地，采集的所述脐带血加上抗凝剂的体积≤约120mL；

(j)任选地，抽取的脐带血的细胞中>约0.4％为CD34+；以及

任选地，(k)测量源自冻融后所述脐带血组合物的免疫细胞的细胞毒性。

13.权利要求12所述的方法，其中确定冷冻保存之前的所述脐带血组合物具有(a)、(c)、(d)和(e)。

14.权利要求12或13所述的方法，其中(a)中的所述脐带血细胞活力大于或等于99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％。

15.权利要求12-14中任一项所述的方法，其中(b)中的所述TNC回收率大于或等于77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

16.权利要求12-15中任一项所述的方法，其中所述NRBC含量小于或等于8.0x10⁷、7.9x10⁷、7.8x10⁷、7.7x10⁷、7.6x10⁷、7.5x10⁷、7.0x10⁷、6.0x10⁷、5.0x10⁷、4.0x10⁷、3.0x10⁷、2.0x10⁷、1.0x10⁷、9.0x10⁶、8.0x10⁶、7.0x10⁶、6.0x10⁶、5.0x10⁶、4.0x10⁶、3.0x10⁶、2.0x10⁶、1.0x10⁶、9.0x10⁵、8.0x10⁵、7.0x10⁵、6.0x10⁵、5.0x10⁵、4.0x10⁵、3.0x10⁵、2.0x10⁵、1.0x10⁵、9.0x10⁴、8.0x10⁴、7.0x10⁴、6.0x10⁴、5.0x10⁴、4.0x10⁴、3.0x10⁴、2.0x10⁴、1.0x10⁴、9.0x10³、8.0x10³、7.0x10³、6.0x10³、5.0x10³、4.0x10³、3.0x10³、2.0x10³、1.0x10³、9.0x10²、8.0x10²、7.0x10²、6.0x10²、5.0x10²、4.0x10²、3.0x10²、2.0x10²、1.0x10²或更少。

17.权利要求12-16中任一项所述的方法，其中所述脐带血所来源的婴儿的体重大于约3650、3700、3750、3800、3850、3900、3950、4000、4050、4100、4150、4200、4250或4500克。

18.权利要求12-17中任一项所述的方法，其中采集的所述脐带血加上抗凝剂的体积≤约120、115、110、100、90、80、70、60或50mL。

19.权利要求12-18中任一项所述的方法，其中所述抽取的脐带血的细胞中>0.4％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％或更多％是CD34+的。

20.权利要求12-19中任一项所述的方法，其进一步包括从所述冻融的脐带血组合物中衍生免疫细胞的步骤。

21.权利要求20所述的方法，其中所述免疫细胞是NK细胞、恒定NK细胞、NK T细胞、T细胞、B细胞、单核细胞、粒细胞、髓系细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、干细胞或其混合物。

22.权利要求20或21所述的方法，其中源自冻融后所述脐带血组合物的所述免疫细胞是NK细胞，并且细胞毒性大于或等于66.7％。

23.权利要求22所述的方法，其中所述细胞毒性大于或等于67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

24.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脐带血来源于胎龄小于或等于38周的胎儿或婴儿。

25.权利要求24所述的方法，其中所述脐带血来源于胎龄小于或等于38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25或24周的胎儿或婴儿。

26.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括确定冻融后脐带血细胞的活力。

27.权利要求26所述的方法，其中冻融后所述脐带血细胞的活力大于或等于86.5％。

28.权利要求27所述的方法，其中冻融后所述脐带血细胞的活力大于或等于87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

29.权利要求21所述的方法，其中所述免疫细胞是NK细胞。

30.权利要求29所述的方法，其中对所述NK细胞进行扩增。

31.权利要求30所述的方法，其中培养第0天至第6天期间所述NK细胞的扩增大于或等于3倍。

32.权利要求30或31所述的方法，其中培养第6天至第15天期间所述NK细胞的扩增大于或等于70倍。

33.权利要求30所述的方法，其中培养第0天至第15天期间所述NK细胞的扩增大于或等于450倍。

34.权利要求29-33中任一项所述的方法，其中对所述NK细胞进行修饰。

35.权利要求34所述的方法，其中对所述NK细胞进行修饰以表达一种或多种非内源性基因产物。

36.权利要求35所述的方法，其中所述非内源性基因产物是非内源性受体。

37.权利要求36所述的方法，其中所述非内源性受体是嵌合受体。

38.权利要求37所述的方法，其中所述嵌合受体是嵌合抗原受体。

39.权利要求36所述的方法，其中所述非内源性受体是非天然T细胞受体。

40.权利要求35所述的方法，其中所述非内源性基因产物包含一种或多种非内源性受体、一种或多种细胞因子、一种或多种趋化因子、一种或多种酶或者其组合。

41.前述权利要求中任一项所述的方法，其中对所述免疫细胞进行修饰以破坏细胞中一种或多种内源性基因的表达。

42.权利要求12-41中任一项所述的方法，其中所述脐带血细胞的活力大于98％或99％，所述TNC回收率大于76.3％，并且所述NRBC含量大于7.5x10⁷或8.0x10⁷。

43.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脐带血来源于胎龄小于或等于39周的胎儿或婴儿，冻融后脐带血细胞的活力大于或等于86.5％，培养第0天和第6天期间所述NK细胞的扩增大于或等于7倍，并且培养第6天和第15天期间所述NK细胞的扩增大于或等于10⁵倍。

44.一种通过权利要求1-43中任一项所述的方法鉴定的脐带血组合物。

45.权利要求44所述的组合物，包含在药学上可接受的载剂中。

46.权利要求44所述的组合物，其与一种或多种冷冻保护剂一起配制。

47.一种组合物，其包含源自权利要求1-43中任一项所述的方法的免疫细胞群。

48.一种预测免疫细胞治疗功效的方法，其包括：

测量一种或多种尚未冷冻的脐带血组合物的以下特征或者考虑以下一种或多种特征：

(a)脐带血细胞活力；

(b)任选地，总单核细胞(TNC)回收率；和

(c)有核红细胞(NRBC)含量；

(d)所述脐带血所来源的婴儿的体重；

(e)所述脐带血所来源的婴儿的生物学母亲和/或生物学父亲的种族；

(f)任选地，所述脐带血所来源的婴儿的胎龄；

(g)任选地，子宫内采集所述脐带血；

(h)任选地，所述脐带血所来源的是生物学男性婴儿；

(i)任选地，采集的所述脐带血的体积；

(j)任选地，抽取的脐带血中CD34+细胞的数量；

其中当所述脐带血组合物具有一种或多种以下特征时，所述免疫细胞对治疗有效：

(a)脐带血细胞活力大于或等于98％或99％；

(b)总单核细胞(TNC)回收率大于或等于76.3％；和

(c)有核红细胞(NRBC)含量小于或等于7.5x10⁷或8.0x10⁷；

(d)所述脐带血所来源的婴儿的体重大于3650克；

(e)所述脐带血所来源的婴儿的生物学母亲和/或生物学父亲的种族是白种人；

(f)任选地，所述脐带血所来源的婴儿的胎龄小于或等于38周；

(g)任选地，子宫内采集所述脐带血；

(h)任选地，所述脐带血所来源的是生物学男性婴儿；

(i)任选地，采集的所述脐带血和抗凝剂的体积≤约120、115、110、100、90、80、70、60或50mL；

(j)任选地，抽取的脐带血中细胞的数量中>0.4％为CD34+。

49.权利要求48所述的方法，其进一步包括冷冻所述一种或多种血液组合物的步骤。

50.权利要求49所述的方法，其进一步包括在冻融后测量(d)源自所述脐带血组合物的免疫细胞的细胞毒性。

51.权利要求50所述的方法，其中所述细胞毒性大于或等于66.7％。