TW202121984A - 細胞冷凍保存培養基 - Google Patents

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凱蒂 瑞分尼
劉恩莉
依麗莎白 Ｊ 須帕爾
拉斐特 巴薩
柯斯塔 大衛 馬林
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美國德州系統大學評議委員會
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Abstract

本發明提供用於任何種類細胞的冷凍保存組合物及方法，包括用於過繼細胞療法的細胞，其為現成細胞。用於冷凍保存之細胞可為表現嵌合抗原受體之擴增NK細胞。在特定情況下，該冷凍保存培養基包含冷凍保護劑，諸如DMSO、甘油或羥乙基澱粉；血清或非血清替代物，諸如血小板溶解產物；及一或多種天然、經修飾、合成或重組之細胞介素。

Description

細胞冷凍保存培養基
本發明大體上係關於細胞生物學、分子生物學、生物化學、免疫學及醫學領域。
用於活體外研究或用於向人類或動物投與之離體培養物的細胞(例如哺乳動物細胞)之培養為研究及治療人類疾病之重要工具。細胞培養廣泛用於產生各種生物學活性產物，諸如病毒疫苗、單株抗體、多肽生長因子、激素、酶及腫瘤特異性抗原。然而，許多用於培養細胞之培養基或方法包含可對培養物中之細胞生長及/或細胞之維持具有消極影響之組分。
另外，目前存在儲存細胞(例如人類胎盤或臍帶幹細胞)以供將來醫療用途之若干細胞庫。亦存在儲存於例如生物反應器中培養以用於科學目的以及用於醫學療法之細胞的細胞庫。所有細胞庫之共同點為通常藉由冷凍保存在液氮中來儲存細胞。本發明滿足此項技術中對經改良之冷凍保存培養基之需求。
本發明係關於細胞培養基，包括冷凍保存培養基，其允許細胞與在不存在所揭示之培養基及方法之情況下冷凍保存之細胞相比，具有更穩固的細胞增殖及細胞特徵保留。在特定實施例中，細胞冷凍保存培養基允許增強待「現成」使用之細胞的細胞存活率。在所揭示之培養基中冷凍保存之後，解凍後之細胞可立即使用或可經進一步操縱，諸如經歷重組技術，包括例如轉染。在一些情況下，細胞第二次或後續次冷凍保存，無論是否在所揭示之培養基中，且在第二次或後續次冷凍保存之前，細胞可或可不經進一步操縱，諸如經歷重組技術，包括例如轉染。
本發明之實施例提供一種冷凍保存培養基組合物，其包含至少一種冷凍保護劑、血清(人類或動物血清)或血清之非血清替代物(非人類血清或動物血清)及至少一種細胞介素及/或至少一種生長因子。在一些情況下，該冷凍保護劑為二甲亞碸(DMSO)、丙三醇、甘油、羥乙基澱粉(hydroxyethyl starch)或其組合。非血清替代物可為任何種類，至少包括血小板溶解產物及/或血液產物溶解產物(例如人類血清白蛋白)。在其中利用一或多種(包括兩種或更多種)細胞介素之組合物的實施例中，細胞介素可為天然或重組或合成蛋白質。細胞介素中之至少一者可為美國食品藥物管理局(FDA)批准之細胞介素。細胞介素及生長因子之實例至少包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-22、干擾素、腫瘤壞死因子、幹細胞因子、FLT3-配位體、APRIL、血小板生成素、紅血球生成素或其組合。對於血清實施例，血清可為來源於動物之血清，諸如人類血清(包括人類AB血清)或牛血清。DMSO及其他冷凍保護劑在利用時可占組合物之4至10%、4至6%、4至8%、5至10%、5至8%、6至10%、6至8%、8至10%等。對於其中採用血清的實施例，血清可占組合物之5-99%、5-95%、5-90%、5-85%、5-80%、5-75%、5-70%、5-65%、5-60%、5-55%、5-50%、5-45%、5-40%、5-35%、5-30%、5-25%、5-20%、5-15%、5-10%、10-99%、10-95%、10-90%、10-85%、10-80%、10-75%、10-70%、10-65%、10-60%、10-55%、10-50%、10-45%、10-40%、10-35%、10-30%、10-25%、10-20%、10-15%、20-99%、20-95%、20-90%、20-85%、20-80%、20-75%、20-70%、20-65%、20-60%、20-55%、20-50%、20-45%、20-40%、20-35%、20-30%、20-25%、30-99%、30-95%、30-90%、30-85%、30-80%、30-75%、30-70%、30-65%、30-60%、30-55%、30-50%、30-45%、30-40%、30-35%、40-99%、40-95%、40-90%、40-85%、40-80%、40-75%、40-70%、40-65%、40-60%、40-55%、40-50%、40-45%、50-99%、50-95%、50-90%、50-85%、50-80%、50-75%、50-70%、50-65%、50-60%、50-55%、60-99%、60-95%、60-90%、60-85%、60-80%、60-75%、60-70%、60-65%、70-99%、70-95%、70-90%、70-85%、70-80%、70-75%、80-99%、80-95%、80-90%、80-85%、90-99%、90-95%或95-99%。組合物可包含至少或不超過10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%之血清。在特定實施例中，組合物包含血小板溶解產物，其可在組合物中呈任何濃度，但在某些實施例中，血小板溶解產物占組合物之5-99%、5-95%、5-90%、5-85%、5-80%、5-75%、5-70%、5-65%、5-60%、5-55%、5-50%、5-45%、5-40%、5-35%、5-30%、5-25%、5-20%、5-15%、5-10%、10-99%、10-95%、10-90%、10-85%、10-80%、10-75%、10-70%、10-65%、10-60%、10-55%、10-50%、10-45%、10-40%、10-35%、10-30%、10-25%、10-20%、10-15%、20-99%、20-95%、20-90%、20-85%、20-80%、20-75%、20-70%、20-65%、20-60%、20-55%、20-50%、20-45%、20-40%、20-35%、20-30%、20-25%、30-99%、30-95%、30-90%、30-85%、30-80%、30-75%、30-70%、30-65%、30-60%、30-55%、30-50%、30-45%、30-40%、30-35%、40-99%、40-95%、40-90%、40-85%、40-80%、40-75%、40-70%、40-65%、40-60%、40-55%、40-50%、40-45%、50-99%、50-95%、50-90%、50-85%、50-80%、50-75%、50-70%、50-65%、50-60%、50-55%、60-99%、60-95%、60-90%、60-85%、60-80%、60-75%、60-70%、60-65%、70-99%、70-95%、70-90%、70-85%、70-80%、70-75%、80-99%、80-95%、80-90%、80-85%、90-99%、90-95%或95-99%。組合物可包含至少或不超過10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%之血小板溶解產物。
組合物可具有一定濃度之組分，包括細胞介素及/或生長因子。在特定情況下，例如，任何細胞介素，包括IL-2、IL-21及/或IL-15以特定濃度存在於組合物中。舉例而言，IL-2可以1至5000、1至1000、1至500、1至100、100至5000、100至500、500至5000、500至1000或1000至5000 U/mL之濃度存在。在一特定情況下，IL-2以至少或不超過100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000 U/mL之濃度存在於組合物中。在特定實施例中，IL-21以10至3000、10至2000、10至1000、10至500、10至100、100至3000、100至2000、100至1000、500至3000、500至2000、500至1000、1000至3000、1000至2000或2000至3000 ng/mL之濃度存在於組合物中。IL-21在組合物中之濃度可為至少或不大於1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、750、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750或3000 ng/mL。IL-15可以1至2000、1至1000、1至500、1至100、100至2000、100至1000、100至500、500至2000、500至1000或1000至2000 ng/mL之濃度存在於組合物中。IL-15可以至少或不超過10、50、100、500、1000、1500或2000 ng/mL之濃度存在於組合物中。
包含至少一種冷凍保護劑、血清或血清之非血清替代物及至少一種細胞介素及/或至少一種生長因子的如本文所涵蓋之組合物可進一步包含複數個免疫細胞及/或幹細胞，各自屬於任何種類。在特定實施例中，細胞為NK細胞、T細胞、B細胞、衍生自成熟骨髓或末梢血液細胞之NKT細胞、細胞株(諸如腫瘤細胞株(例如NK92或其他NK細胞株))、造血幹細胞、誘導性多能幹細胞、MSC (文獻中替代地稱為「間葉幹細胞」及「間葉基質細胞」之細胞群體)或其混合物，其可來源於骨髓、末梢血液、皮膚、脂肪組織，或其組合。在其中利用NK細胞之實施例中，NK細胞可為或可不為經擴增之NK細胞。本發明之實施例亦涵蓋包含本發明之任何組合物及適合醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。
本發明之實施例包括產生本發明之任何組合物之方法，其包含使細胞經受有效量之冷凍保存培養基組合物之步驟。細胞可為免疫細胞及/或幹細胞。細胞之實例包括NK細胞、T細胞、NKT細胞、B細胞、衍生自成熟末梢血液、骨髓及/或臍帶血細胞之NKT細胞、細胞株(諸如腫瘤細胞株(例如NK92或其他NK細胞株))、幹細胞、誘導性多能幹細胞或來自臍帶血、骨髓、末梢血液、脂肪組織及/或皮膚之MSC。細胞可為經擴增NK細胞或本文所涵蓋之任何細胞類型之經擴增部分。
本發明之實施例包括根據本文所涵蓋之任何方法產生之細胞群體。群體可包含或可不包含於適合的醫藥學上可接受之載劑中。細胞可為任何種類之免疫細胞及/或幹細胞。細胞可為NK細胞(無論其是否經擴增)、T細胞、NKT細胞、B細胞、衍生自成熟細胞之NKT細胞、細胞株(諸如腫瘤細胞株(例如NK92或其他NK細胞株))、幹細胞或誘導性多能幹細胞。本文所涵蓋之任何細胞可或可不經擴增。本發明之實施例包括治療個體之免疫相關病症之方法，其包含投與有效量之本文所涵蓋之任何解凍群體。免疫相關病症之實例包括癌症、自體免疫病症、移植物抗宿主疾病、同種異體移植排斥反應或發炎性病狀，包括細菌、病毒或真菌感染。群體可包含為NK細胞、T細胞、NKT細胞、B細胞、衍生自成熟細胞之NKT細胞、幹細胞、誘導性多能幹細胞或MSC的細胞。另外，非免疫來源之癌細胞可用為NK細胞、T細胞、NKT細胞、B細胞、衍生自成熟細胞之NKT細胞、幹細胞、誘導性多能幹細胞及/或MSC之細胞群體處理。
本發明之實施例包括保存對冷凍保存敏感之細胞的方法，其包含使對冷凍保存敏感之細胞經受有效量之本發明之冷凍保存培養基組合物的步驟。細胞可為例如NK細胞、T細胞、NKT細胞、B細胞、衍生自成熟細胞之NKT細胞、細胞株(諸如腫瘤細胞株(例如NK92或其他NK細胞株))、幹細胞、誘導性多能幹細胞或MSC。該方法可或可不進一步包含獲得或提供待經受冷凍保存培養基組合物之細胞的步驟。冷凍保存及解凍細胞之後，可將有效量之細胞遞送至有需要之個體，諸如患有癌症、自體免疫病症、移植物抗宿主疾病、同種異體移植排斥反應或發炎性病狀(包括細菌、病毒或真菌感染)之個體。細胞相對於個體可為同種異體或自體的。另外，器官受損(包括至少心、肺、腦及/或腎)之個體可接受有效量之冷凍保存且解凍之細胞，包括例如MSC及/或誘導性多能幹細胞以用於再生醫學。
本發明之實施例包括在冷凍保存細胞群體之後將該群體之存活率維持在至少50%以上之方法，其包含使該群體經受有效量之本文所涵蓋之冷凍保存培養基組合物及解凍該群體之步驟，其中在解凍後，該群體之存活率大於至少50%。在一些情況下，在群體之冷凍保存後，在細胞解凍後細胞群體之存活率超過至少55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%。細胞可為免疫細胞及/或幹細胞，包括NK細胞、T細胞、NKT細胞、B細胞、衍生自成熟細胞之NKT細胞、細胞株(諸如腫瘤細胞株(例如NK92或其他NK細胞株))、幹細胞、誘導性多能幹細胞或MSC。
本文中考慮在冷凍保存細胞群體(例如免疫細胞及/或幹細胞)時延長該群體之存放期的方法，諸如包含使群體經受有效量之本發明之冷凍保存培養基組合物的步驟。與在不使用本發明之冷凍保存培養基組合物的情況下冷凍保存的細胞之存放期相比，存放期可延長約1-4、1-2、1-3、2-4、2-3或3-4週、1-12、2-12、3-12、4-12、5-12、6-12、7-12、8-12、9-12、10-12或11-12個月或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20年或更多年。細胞可為或可不為NK細胞、T細胞、NKT細胞、B細胞、衍生自成熟細胞之NKT細胞、細胞株(諸如腫瘤細胞株(例如NK92或其他NK細胞株))、幹細胞、誘導性多能幹細胞或MSC。一些方法進一步包含獲得細胞之步驟。在細胞之冷凍保存及解凍後，可將有效量之細胞遞送至有需要之個體。細胞相對於個體可為同種異體或自體的，且個體可患有癌症、自體免疫病症、移植物抗宿主疾病、同種異體移植排斥反應或發炎性病狀，包括細菌、病毒或真菌感染。個體亦可具有需要再生修復之生命器官損壞。
本發明之實施例包括解凍已用本文涵蓋之冷凍保存培養基組合物冷凍保存的細胞群體的方法，其包含以下步驟：將該細胞群體暴露於有效量之該冷凍保存培養基組合物以產生冷凍保存群體；及將該冷凍保存群體暴露於適合解凍條件。解凍條件可為此項技術中之標準條件。舉例而言，可在37℃水浴中快速(＜1分鐘)解凍冷凍細胞，且這之後可視情況使用預溫熱生長培養基緩慢稀釋解凍細胞。在特定情況下，以高密度塗鋪解凍細胞以使回收率最佳化。
本發明之某些實施例係關於將細胞遞送至個體中之目標位點或組織之方法，其包含以下步驟：在細胞解凍之後實質上立即及/或實質上直接將有效量之細胞靜脈內、局部、鞘內、腹膜內、皮下灌注或投與細胞至目標位點或組織，其中細胞冷凍保存於本發明之冷凍保存培養基組合物中。在特定實施例中，目標位點或組織為癌性，諸如為實體腫瘤。
本發明之其他目標、特點及優勢將自以下實施方式而變得顯而易見。然而，應理解，由於在本發明之精神及範疇內之各種改變及修改將自此實施方式而對熟習此項技術者變得顯而易見，所以實施方式及特定實例在指示本發明之較佳實施例時僅以說明方式給出。
本申請案主張於2019年8月29日申請之美國臨時專利申請案第62/893,597號以及於2020年4月22日申請之美國臨時專利申請案第63/013,823號之優先權，該等申請案皆以全文引用之方式併入本文中。
將某些冷凍保存細胞用於臨床療法之一種限制性係因為其解凍後較少之數目及其較差之存活率。本發明藉由使用用於在冷凍保存後離體擴增細胞的符合GMP之策略來解決此等限制中之兩者。本發明方法之實施例得到在解凍之後大得多的存活率。在特定實施例中，本文所揭示之任何方法指示此策略亦可在無先前擴增之情況下應用於細胞。
因此，本發明之某些實施例提供關於臨床級細胞，包括意欲用於細胞及免疫療法之彼等細胞之保存(諸如用於儲存)的方法及組合物。生長且塑造臨床上相關數目之細胞以用於輸注至患者中，同時滿足時間限制，即使在最佳情況下亦極具挑戰性。所揭示之方法及組合物在任何種類之使用之前詳述細胞保存之技術過程。
在特定實施例中，本文進一步提供用於保存任何類型哺乳動物細胞，包括免疫細胞及/或幹細胞之冷凍培養基調配物。免疫細胞可為任何種類，包括NK細胞、T細胞、B細胞、NKT細胞、幹細胞、誘導性多能幹細胞(iPSC)或衍生自iPSC的任何細胞、MSC、來自任何器官之分化或定向細胞(committed cell)、任何纖維母細胞。在任何情況下，哺乳動物細胞可用於過繼細胞療法。在特定情況下，細胞為CAR NK細胞。在特定實施例中，冷凍培養基可包含冷凍保護劑，諸如但不限於二甲亞碸(DMSO)、丙三醇、甘油、羥乙基澱粉或其組合；來自人類、牛或其他動物來源之血清，或血清替代物，諸如但不限於血小板溶解產物；一或多種細胞介素或生長因子，包括但不限於IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-22、干擾素、腫瘤壞死因子、幹細胞因子、FLT3-配位體、APRIL，或其組合。血清可用作生長因子、黏附因子、激素、脂質及/或礦物質之來源，及/或在某些情況下用於調節細胞膜滲透率且充當脂質、酶、微量養分及微量元素進入細胞中之載體。冷凍培養基允許以提高之存活率及功能性成功冷凍個別劑量之細胞。細胞可按需解凍且輸注至患者中。因此，本文提供之冷凍細胞為「現成」細胞療法，其可解凍且輸注至患者中而無產生所需之延遲。
培養基允許出於包括免疫療法之任何目的將過繼細胞療法細胞儲存為細胞庫，而無需募集供體以收集細胞，但此方法亦可用於冷凍保存針對患者之自體產物(autologous patient-directed product)。  I. 定義
如本文所用，關於指定組分「基本上無」在本文中用於意謂無指定組分有目的地調配入組合物中及/或僅以污染物或以痕量存在。因此，由組合物之任何非預期污染得到之指定組分之總量遠低於0.05%，較佳低於0.01%。最佳為用標準分析方法無法偵測到指定組分之量的組合物。
如本說明書中所使用，「一(a)」或「一(an)」可意謂一或多個(種)。如本文一或多個請求項中所使用，當與字組「包含」結合使用時，字組「一(a)」或「一(an)」可意謂一個(種)或超過一個(種)。
儘管本發明支持僅指替代方案及「及/或」之定義，但除非明確地指示為僅指替代方案或替代方案相互排斥，否則術語「或」之使用在申請專利範圍中用於意謂「及/或」。舉例而言，「x、y及/或z」可指單獨「x」、單獨「y」、單獨「z」、「x、y及z」、「(x及y)或z」、「x或(y及z)」或「x或y或z」。尤其經考慮，x、y或z可特定地自實施例排除。術語「約」、「實質上」及「大約」一般意謂所陳述值加或減5%。如本文所用，「另一」可意謂至少第二個或更多個。
在本說明書通篇中，除非上下文另有要求，否則字組「包含(comprise/comprises/comprising)」應理解為意味著包括所陳述步驟或要素或步驟或要素之群組，但不排除任何其他步驟或要素或其他步驟或要素群組。「由…組成」意欲包括且限於在片語「由……組成」中間的任何事物。因此，片語「由……組成」指示所列要素為所需或必選的，且不可存在其他要素。「基本上由……組成」意欲包括該片語中間所列之任何要素，且限於不干擾或有助於所列要素在本發明中所指定之活性或作用的其他要素。因此，片語「基本上由…組成」指示所列舉之要素為所需或必選的，但沒有其他要素為視情況選用的且視其是否影響所列舉要素之活性或作用而定，可存在或可不存在。
本說明書通篇中，提及「一個實施例」、「實施例」、「特定實施例」、「相關實施例」、「某一實施例」、「額外實施例」或「另一實施例」或其組合意謂結合實施例描述的特定特點、結構或特徵包括於本發明的至少一個實施例中。因此，在本說明書通篇各處出現上述片語未必均指代相同實施例。另外，可在一或多個實施例中以任何適合的方式組合特定特點、結構或特徵。
貫穿本申請案，術語「約」用於指示值包括用以測定值之裝置、方法固有之誤差變異，或研究個體當中存在之誤差變異。
「免疫病症」、「免疫相關病症」或「免疫介導之病症」係指其中免疫反應在疾病之發展或進展中起關鍵作用之病症。免疫介導之病症包括自體免疫病症、同種異體移植排斥反應、移植物抗宿主疾病及發炎性及過敏性病狀。
「免疫反應」為諸如B細胞或T細胞或先天性免疫細胞之免疫系統細胞對刺激之反應。在一個實施例中，反應對特定抗原具有特異性(「抗原特異性反應」)。
「自體免疫疾病」係指其中免疫系統針對為正常宿主之一部分之抗原(亦即自體抗原)產生免疫反應(例如B細胞或T細胞反應)並且隨之對組織有損傷之疾病。自體抗原可來源於宿主細胞，或可來源於諸如通常定殖黏膜表面之微生物體(稱為共生生物體)之共生生物體。
「治療(treating)」或治療(treatment)疾病或病狀係指執行方案，其可包括致力於減輕疾病之病徵或症狀而向患者投與一或多種藥物或細胞療法產物。所要治療作用包括降低疾病進展速率、改善或緩和疾病狀態及緩解或改良預後。緩解可在疾病或病狀之病徵或症狀出現之前以及在其出現之後出現。因此，「治療(treating)」或「治療(treatment)」可包括「預防(preventing)」或「預防(prevention)」疾病或非所要病狀。此外，「治療(treating)」或「治療(treatment)」不需要完全緩解病徵或症狀，不需要治癒，且尤其包括對患者僅具有微小作用之方案。
如本申請案通篇使用，術語「治療益處」或「治療有效」係指關於此病狀之醫療治療，促進或增強個體之健康的任何事物。此包括但不限於疾病之病徵或症狀之頻率或嚴重程度降低。舉例而言，癌症之治療可涉及例如完全根除腫瘤、減小腫瘤尺寸、減小腫瘤侵襲性、減小癌症之生長速率或預防癌轉移。癌症之治療亦可指延長患有癌症之個體之存活期。
「個體(subject)」及「患者」及「個體(individual)」可為可互換的且可指人類或非人類，諸如靈長類動物、哺乳動物及脊椎動物。在特定實施例中，個體為人類。個體可為作為方法或材料之對象的任何生物體或動物個體，包括哺乳動物(例如人類)、實驗室動物(例如，靈長類動物、大鼠、小鼠、兔)、家畜(例如，母牛、綿羊、山羊、豬、火雞及雞)、家養寵物(例如，狗、貓及嚙齒動物)、馬及轉殖基因非人類動物。個體可為例如患有或疑似患有疾病(可稱為醫學病狀)之患者，該疾病諸如一或多種感染性疾病、一或多種遺傳病症、一或多種癌症或其任何組合。如本文所用，「個體(subject)」或「個體(individual)」可或可不安置於醫療機構中且可作為醫療機構之門診患者進行治療。個體可經由網際網路接受一或多種醫療組合物。個體可包含任何年齡之人類或非人類動物且因此包括成人及青少年(例如，兒童)及嬰兒且包括未出生的個體。個體可或可不需要醫療治療；個體可自願地或非自願地參與實驗，無論為臨床或支持基礎科學研究。
片語「醫藥上或藥理學上可接受」係指在按需要向諸如人類之動物投與時不產生不利、過敏性或其他不良反應之分子實體及組合物。根據本發明，包含抗體或額外活性成分之醫藥組合物之製備將為熟習此項技術者已知。此外，對於動物(例如人類)投藥，應理解，製劑應滿足如FDA生物標準辦公室(FDA Office of Biological Standards)所要求之無菌性、發熱性、一般安全性及純度標準。
如本文所用，「醫藥學上可接受之載劑」包括任何及所有水性溶劑(例如水、醇性/水性溶液、生理鹽水溶液、非經腸媒劑，諸如氯化鈉、林格氏右旋糖(Ringer's dextrose)等)、非水性溶劑(例如丙二醇、聚乙二醇、植物油及可注射有機酯，諸如油酸乙酯)、分散介質、包衣、界面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如抗細菌或抗真菌劑、抗氧化劑、螯合劑及惰性氣體)、等張劑、吸收延遲劑、鹽、藥物、藥物穩定劑、凝膠、黏合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、調味劑、染料、流體及養分補充劑，諸如材料及其組合，如一般熟習此項技術者應已知。根據熟知參數調節醫藥組合物中各種組分之pH值及精確濃度。
術語「抗原呈現細胞(APC)」係指能夠呈現一或多種呈可藉由免疫系統之特異性效應細胞識別之肽-MHC複合物形式之抗原，且由此誘導針對所呈現的一或多種抗原的有效細胞免疫反應的一類細胞。術語「APC」涵蓋完整全細胞，諸如巨噬細胞、B細胞、內皮細胞、活化T細胞、樹突狀細胞、細胞株(諸如K562)或能夠呈現抗原之天然存在或合成的分子，諸如與β2-微球蛋白複合之經純化MHC I類分子。 II. 冷凍保存培養基及其用途
任何種類之細胞均可保存在本發明之冷凍保存培養基中。在某些實施例中，細胞可為哺乳動物細胞，且在特定情況下，其為待用於研究及/或療法之哺乳動物細胞。在特定情況下，細胞可為免疫細胞，包括待用於過繼細胞療法之免疫細胞。此類細胞可為或可不為NK細胞、T細胞、NKT細胞、B細胞、幹細胞、誘導性多能幹細胞(iPSC)或衍生自iPSC的任何細胞、MSC、來自任何器官之分化或定向細胞、任何纖維母細胞等。細胞可獲自個體，使用本文涵蓋之培養基冷凍保存，且接著解凍且用於該個體及/或另一個體或多個其他個體。細胞可獲自個體，經操縱以包含除無操縱之情況下的特徵以外的一或多個特徵，使用本文所涵蓋之培養基冷凍保存，且用於該個體及/或另一個體或多個其他個體。
來自一個細胞集合之第一複數個細胞可在本文所涵蓋之一種特定冷凍保存培養基中冷凍保存，而來自相同細胞集合之第二複數個細胞可在本文中亦涵蓋之不同冷凍保存培養基中冷凍保存。視細胞之應用、細胞之數目及/或存活率等而定，可採用或可不採用此類實踐。
在特定實施例中，細胞在自一或多個個體收集後實質上立即保存在本文所涵蓋之冷凍保存培養基中。在其他實施例中，細胞在培養或擴增後冷凍保存。在擴增之後，可立即操縱細胞(諸如免疫細胞)以用於隨後目的(諸如輸注)，或其可經由冷凍保存儲存。在某些態樣中，細胞可在約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或更多天內以混合群體(bulk population)形式離體繁殖數天、數週或數月。
在特定實施例中，冷凍保存培養基可包含二甲亞碸(DMSO)；血清(包括人類血清)；及一或多種任何種類之細胞介素。在特定實施例中，冷凍保存培養基之任何一或多種組分為天然蛋白質，其亦可稱為內源或重組蛋白質。在特定情況下，內源蛋白質為一或多種細胞介素。在某些情況下，冷凍保存培養基亦可包含一或多種FDA批准之試劑，且一或多種FDA批准之試劑可為一或多種細胞介素。
本發明之特定實施例包括冷凍保存培養基組合物，其包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：至少一種冷凍保護劑、至少一種血清(或血清之非血清替代物)及至少一種細胞介素及/或至少一種生長因子。冷凍保護劑之實例包括二甲亞碸(DMSO)、丙三醇、甘油、羥乙基澱粉或其組合。對於該組合物，非血清替代物可包含血小板溶解產物及/或血液產物溶解產物及/或人類血清白蛋白及/或動物血清白蛋白。人類血清可為人類AB血清。任何細胞介素可為天然蛋白質、重組蛋白質、合成蛋白質或其混合物，包括至少一種為美國食品藥物管理局(FDA)批准之細胞介素的細胞介素。在特定情況下，組合物包含兩種或更多種細胞介素。僅作為實例，至少一種細胞介素為IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-22、干擾素、腫瘤壞死因子、幹細胞因子、FLT3-配位體、APRIL或其組合。
在特定情況下，一或多種細胞介素包括IL-2、IL-15、IL-12、IL-18及/或IL-21。細胞可懸浮於GMP冷凍保存培養基中，該培養基包含DMSO (例如1-10%，諸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10%，尤其5%)、95%人類AB血清(例如90-99%，諸如91、92、93、94、95、96、97、98或99%，尤其95%)、血小板溶解產物(例如90-99%，諸如91、92、93、94、95、96、97、98或99%，尤其95%)、IL-2 (例如50-500 U/mL，諸如100、200、300、400、500、1000或5000 U/mL，尤其400 U/mL)、IL-15 (5-500 ng/ml)及/或IL-21 (例如1-500 ng/mL，諸如10、20、30、40、50、100或500 ng/mL，尤其20 ng/mL)。在特定情況下，細胞係使用速率受控方法在液氮中冷凍。
在特定實施例中，冷凍保護劑占組合物中之特定量；在特定態樣中，冷凍保護劑占組合物之4至6%或組合物之5至10%；在特定情況下，冷凍保護劑占組合物之4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、6-10、6-9、6-8、6-7、7-10、7-9、7-8、8-10、8-9或9-10%。血清可占組合物中之特定量，諸如占組合物之5-99、5-90、5-85、5-80、5-75、5-70、5-65、5-60、5-55、5-50、5-45、5-40、5-35、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10、10-99、10-90、10-85、10-80、10-75、10-70、10-65、10-60、10-55、10-50、10-45、10-40、10-35、10-30、10-25、10-20、10-15、25-99、25-90、25-85、25-08、25-75、25-70、25-65、25-60、25-55、25-50、25-45、25-40、25-35、25-30、50-99、50-90、50-85、50-80、50-75、50-70、40-65、50-60或50-55%。血小板溶解產物可占組合物中之一定量，諸如組合物之5-99、5-90、5-85、5-80、5-75、5-70、5-65、5-60、5-55、5-50、5-45、5-40、5-35、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10、10-99、10-90、10-85、10-80、10-75、10-70、10-65、10-60、10-55、10-50、10-45、10-40、10-35、10-30、10-25、10-20、10-15、25-99、25-90、25-85、25-08、25-75、25-70、25-65、25-60、25-55、25-50、25-45、25-40、25-35、25-30、50-99、50-90、50-85、50-80、50-75、50-70、40-65、50-60或50-55%。在特定態樣中，血小板溶解產物占組合物之95%。
在組合物包含IL-2之實施例中，IL-2可以以下濃度存在：1-5000、1-4000、1-3000、1-2000、10-1000、100-5000、100-4000、100-3000、100-1000、100-1000、100-500、500-5000、500-4000、500-3000、500-2000、500-1000、1000-5000、1000-4000、1000-3000、1000-2000或2000-5000 U/mL，特定地包括100、200、300、400或500 U/mL。在組合物包含IL-21之實施例中，IL-21可以以下濃度存在：10-3000、10-2500、10-2000、10-1000、10-500、100-3000、100-2000、100-1000、500-3000、500-2000、500-1000或1000-3000 ng/mL，特定地包括以10、15、20或25 ng/mL之濃度存在。在特定情況下，IL-15以10-2000、10-1000、10-500、100-2000、100-1000、100-500、500-2000、500-1000或1000-2000 ng/mL之濃度存在於組合物中。
對於冷凍保存，作為一個實例，細胞(諸如用於過繼療法之NK細胞，包括臍帶血NK細胞)可懸浮於包含例如5% DMSO、95%人類AB血清、400單位IL-2/ml及20 ng IL-21/ml的GMP冷凍保存培養基中。例如，其可使用液氮、非液氮冷凍劑，經由傾倒冷凍(dump freezing)、速率受控冷凍方法及/或非速率受控冷凍方法來冷凍。
在特定實施例中，培養基包含葡萄糖、pH值指示劑、一或多種鹽、一或多種胺基酸及一或多種維生素。pH值指示劑之實例至少包括酚紅、溴酚藍、甲基橙、溴甲酚紫、剛果紅(Congo red)等。鹽之實例至少包括氯化鈉、碳酸氫鈉、磷酸二鈉、氯化鉀、硫酸鎂、硝酸鈣或其組合。胺基酸之實例包括麩醯胺酸、精胺酸、天冬醯胺、半胱胺酸、白胺酸、異白胺酸、離胺酸、絲胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、羥脯胺酸、脯胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、纈胺酸、組胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、色胺酸、還原麩胱甘肽或其組合。在一些實施例中，一或多種胺基酸在培養基中之量大於一或多種其他胺基酸，而一或多種其他胺基酸在培養基中可呈相同量。舉例而言，在培養基中，麩醯胺酸之量可為或可不為最大的，量第二大的為精胺酸。在培養基中，天冬醯胺、半胱胺酸、白胺酸、異白胺酸或其組合的量可或可不實質上相同。在培養基中，天冬胺酸、麩胺酸、羥脯胺酸、脯胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、纈胺酸或其組合的量可或可不實質上相同。在培養基中，組胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸或其組合的量可或可不實質上相同。一或多種特定維生素可存在於培養基中，包括i-肌醇(i-inositol)；氯化膽鹼；對胺基苯甲酸、葉酸、菸鹼醯胺、鹽酸吡哆醇、鹽酸噻胺；泛酸鈣；生物素；核黃素；氰鈷胺素；或其組合可存在於培養基中。維生素可以或可不以特定量存在於培養基中。舉例而言，i-肌醇可以最大量存在，量第二大的為氯化膽鹼。在一些情況下，某些維生素在培養基中可實質上等量，包括對胺基苯甲酸、葉酸、菸鹼醯胺、鹽酸吡哆醇、鹽酸噻胺或其組合。生物素及核黃素在培養基中之量可或可不基本上相等。氰鈷胺素可或可不作為培養基中量最少之任何維生素存在。
在一些實施例中，細胞可在實質上類似於或等同於RPMI 1640培養基(亦稱為RPMI培養基)之培養基中培養，該培養基為由Moore等人(Moore GE、Gerner RE、Franklin HA (1967)「正常人類白血球之培養(Culture of normal human leukocytes)」.JAMA . 199 (8): 519-524)在洛斯維·帕克紀念研究所(Roswell Park Memorial Institute)所研發之生長培養基。
在一特定實例中，一公升RPMI 1640含有或包含以下：
葡萄糖(2 g)；pH值指示劑(酚紅，5 mg)；鹽(6 g氯化鈉、2 g碳酸氫鈉、1.512 g磷酸二鈉、400 mg氯化鉀、100 mg硫酸鎂及100 mg硝酸鈣)；胺基酸(300 mg麩醯胺酸；200 mg精胺酸；50 mg各天冬醯胺、胱胺酸、白胺酸及異白胺酸；40 mg離胺酸鹽酸鹽；30 mg絲胺酸；20 mg各天冬胺酸、麩胺酸、羥脯胺酸、脯胺酸、蘇胺酸、酪胺酸及纈胺酸；15 mg各組胺酸、甲硫胺酸及苯丙胺酸；10 mg甘胺酸；5 mg色胺酸；及1 mg還原麩胱甘肽)；及維生素(35 mg i-肌醇；3 mg氯化膽鹼；1 mg各對胺基苯甲酸、葉酸、菸鹼醯胺、鹽酸吡哆醇及鹽酸噻胺；0.25 mg泛酸鈣；0.2 mg各生物素及核黃素；及0.005 mg氰鈷胺素)。
在特定實施例中，組合物包含：a)血小板溶解產物、PlasmaLyte及洛斯維·帕克紀念研究所(RPMI)培養基中之一或多者；(b)可調配於右旋糖或生理鹽水(例如)中之聚葡萄糖、白蛋白及DMSO中之一或多者；及(c) IL-2、IL-15及IL-21中之一或多者。在特定實施例中，任何組合物包含組合物之50%與90%之間(包括組合物之約50%或組合物之約90%)的血小板溶解產物。在利用PlasmaLyte之情況下，其可介於組合物的約32.5%與70%之間，包括組合物的約32.5%、35%、50%或70%。RPMI可在組合物的32.5%與50%之間，包括組合物之約32.5%、35%或50%。在利用聚葡萄糖之情況下，聚葡萄糖可為組合物的約25-40%，包括組合物的約25%或約40%。在利用白蛋白之情況下，其可為組合物的約1-99%，包括組合物的約20%。在利用DMSO之情況下，其可為組合物的約5-7.5%，特定地包括組合物的約5%或7.5%。  III. 用於冷凍保存之細胞
待冷凍保存之細胞可為任何種類，包括原核或真核細胞，但在特定實施例中，細胞為哺乳動物細胞。在特定實施例中，哺乳動物細胞係自一或多個個體獲得。哺乳動物細胞可用於任何種類之研究或治療目的。在特定實施例中，細胞為任何種類之免疫細胞，包括NK細胞、T細胞、NK T細胞、PBMC、抗原呈現細胞(APC)、B細胞、單核細胞、樹突狀細胞、單核球、嗜中性白血球、誘導性多能幹細胞(iPSC)或衍生自iPSC的任何細胞、MSC、來自任何器官之分化或定向細胞、任何纖維母細胞等。在一些實例中，細胞可為或可不為幹細胞。
特定實施例中之細胞在冷凍保存之前及/或之後經修飾。舉例而言，其可使用載體轉染或轉導，或使用編碼特定基因產物(諸如向細胞賦予治療活性之基因產物)之質體電穿孔。在特定實施例中，細胞使用一或多種抗原受體(包括T細胞受體或嵌合抗原受體(CAR)、細胞介素、歸巢受體(homing receptor)或任何其他基因)轉染或轉導或電穿孔。在特定情況下，細胞為表現CAR之免疫細胞，諸如表現CAR之NK細胞。
在某些實施例中，NK細胞係藉由此項技術中熟知之方法衍生自人類外周血液單核細胞(PBMC)、未刺激之白血球去除術產物(PBSC)、人類胚胎幹細胞(hESC)、誘導性多能幹細胞(iPSC)、骨髓或臍帶血。特定言之，可自臍帶血(CB)、末梢血液(PB)、骨髓或幹細胞分離NK細胞。在特定實施例中，自混合CB分離免疫細胞。CB可自2、3、4、5、6、7、8、10個或更多個單位彙集。免疫細胞可為自體的或同種異體的。經分離之NK細胞可與待投與細胞療法之個體完全匹配、完全不匹配、單倍型匹配(半匹配)或超過單倍型但小於完全匹配。NK細胞可藉由特定表面標記物，諸如人類中之CD16及CD56偵測。
在某些態樣中，NK細胞之起始群體可藉由使用菲科爾密度梯度離心(ficoll density gradient centrifugation)來分離單核細胞而獲得。可去除細胞培養物中表現CD3、CD14及/或CD19細胞之任何細胞，且可對細胞培養物進行表徵以判定CD56+ /CD3- 細胞或NK細胞之百分比。在某些程序中，其亦可用CD56或其他特異性NK細胞抗體進行正選擇。
細胞可在APC，諸如通用APC存在下擴增。擴增可持續約2-30天或更長，諸如3-20天，尤其12-16天，諸如12、13、14、15、16、17、18或19天，尤其約14天。NK細胞及APC可以約3:1至1:3，諸如2:1、1:1、1:2，尤其約1:2之比率存在。擴增培養物可進一步包含細胞介素以促進擴增，該等細胞介素諸如IL-2、IL-2、IL-15、IL-21及/或IL-18。細胞介素可以約10至500 U/mL，諸如100至300 U/mL，尤其約200 U/mL之濃度存在。可在擴增培養物中諸如每2至3天補充一次細胞介素。可至少再一次向培養物中添加APC，諸如在CAR轉導之後。在特定實施例中，細胞介素以避免在接受細胞後向個體提供治療作用之含量存在於冷凍保存培養基中，例如若及當向個體投與細胞時與細胞一起包括培養基時。由於在製備用於投與之細胞時殘餘之培養基，細胞可包含於至少一些冷凍保存培養基中，或細胞可根據預期設計包含於至少一些冷凍保存培養基中。在解凍細胞之後，可或可不在向個體投與之前洗滌細胞。
在一個實施例中，細胞之起始群體為藉由菲科爾密度梯度自單個CB單位分離之MNC。接著可洗滌細胞且從中去除CD3、CD14及CD19陽性細胞，諸如藉由使用CliniMACS免疫磁性珠粒(Miltenyi Biotec)。可收集未標記之富集CB-NK細胞，用CliniMACS緩衝劑洗滌，計數且諸如以1:2比率與經照射(例如100 Gy) APC合併。細胞混合物(例如1×106 個細胞/毫升)可轉移至含有NK完全培養基(例如90%幹細胞生長培養基、10% FBS、2mM L-麩醯胺酸)及IL-2 (諸如50至500，諸如100至300，諸如200 U/mL)之細胞培養燒瓶中。細胞可在37℃下在5% CO2 中培育。在第3天，可藉由離心收集細胞且將其再懸浮於含有IL-2 (諸如50至500，諸如100至300，諸如200 U/mL)之NK完全培養基(例如1×106 個細胞/毫升)中來更換培養基。細胞可在37℃下在5% CO2 中培育。在第5天，Retronectin轉導所需的孔數目可藉由培養物中之CB-NK細胞數目來確定。可以將RetroNectin溶液塗鋪至24孔培養盤之孔中。可密封該等盤且儲存於4℃冰箱中。
在第6天，如第0天所述之第2 NK選擇可在CB-NK細胞之轉導之前進行。細胞可用CliniMACS緩衝劑洗滌，離心且以0.5×106 /mL與IL-2 (諸如100至1000，尤其600 U/mL)再懸浮於NK完全培養基中。接著可以用NK完全培養基洗滌RetroNectin盤且在37℃下培育直至使用。各孔中之NK完全培養基可用反轉錄病毒上清液置換，隨後在32℃下離心盤。隨後可抽吸反轉錄病毒上清液且用新鮮反轉錄病毒上清液置換。含有0.5×106 個細胞及600 U/mL IL-2之CB-NK細胞懸浮液可添加至各孔，且盤可經離心。可隨後在37℃及5% CO2 下培育盤。在第9天，CAR轉導之CB-NK細胞可自轉導盤移除，藉由離心收集且在具有200 U/mL IL-2之NK完全培養基中用經照射(例如，100 Gy) aAPC刺激，諸如以1:2之比。在37℃下在5% CO2 下培育細胞培養燒瓶。在第12天，可進行培養基更換。在第14天，可藉由離心收集細胞，可抽吸上清液且可將細胞再懸浮於含有200 U/mL IL-2之新鮮NK完全培養基中。在37℃下在5% CO2 下培育細胞培養燒瓶。若存在超過1×105 個CD3+ 細胞/公斤，則可以使用CliniCliniMACS CD3試劑進行CD3+ 細胞之磁性免疫耗乏。在第15天，收集細胞且製備最終產物以用於輸注或冷凍保存。
經擴增NK細胞可分泌諸如干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α及顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)之I型細胞介素，該等I型細胞介素活化先天性免疫細胞及後天性免疫細胞兩者，其他細胞介素及趨化因子同樣如此。此等細胞介素的量測值可用於判定NK細胞之活化狀態。另外，此項技術中已知之用於測定NK細胞活化之其他方法可用於表徵本發明之NK細胞。
在特定實施例中，操縱細胞以表現一或多種經工程改造之抗原受體(包括一或多種嵌合抗原受體及/或一或多種經工程改造之TCR)；一或多種細胞介素；一或多種自殺基因；CD47；HLA-G；HLA-E；或其組合。  A. 嵌合抗原受體
在一些實施例中，在冷凍保存之前及/或在冷凍保存之後，操縱待冷凍保存之細胞以表現一或多種CAR。在特定實施例中，CAR包含：a)至少一個細胞內信號傳導域，b)跨膜域，及c)包含至少一個抗原結合區之細胞外域。視情況，CAR可包含一或多個協同刺激域。
在一些實施例中，經工程改造之抗原受體包括CAR，其包括活化或刺激CAR、協同刺激CAR (參見WO 2014/055668)及/或抑制CAR (iCAR，參見Fedorov等人，2013)。CAR一般包括細胞外抗原(或配位體)結合域，其連接至一或多種細胞內信號傳導組件，在一些態樣中經由連接子及/或一或多個跨膜域。此類分子通常模仿或接近經由天然抗原受體之信號、經由此類受體與協同刺激受體組合之信號及/或單獨經由協同刺激受體之信號。
本發明之某些實施例係關於使用核酸，包括編碼抗原特異性CAR多肽之核酸，包括已經人類化以降低免疫原性之CAR (hCAR)，包含細胞內信號傳導域、跨膜域及包含一或多個信號傳導模體之細胞外域。在某些實施例中，CAR可識別包含一或多個抗原之間的共用空間之抗原決定基。在某些實施例中，結合區可包含單株抗體之互補決定區、單株抗體之可變區及/或其抗原結合片段。在另一實施例中，特異性來源於結合至受體之肽(例如細胞介素)。
經考慮，人類CAR核酸可為用於增強人類患者之細胞免疫療法之人類基因。在一特定實施例中，本發明包括全長CAR cDNA或編碼區。抗原結合區或域可包含衍生自特定人類單株抗體之單鏈可變片段(scFv)之VH 及VL 鏈之片段，諸如以引用的方式併入本文中之美國專利7,109,304中所描述者。該片段亦可為人類抗原特異性抗體之任何數目之不同抗原結合域。在一更特定實施例中，該片段為由序列編碼之抗原特異性scFv，該序列針對用於在人類細胞中表現之人類密碼子使用而最佳化。CAR可對兩個不相同抗原目標具有雙特異性或對三個不相同抗原目標具有三特異性等。
配置可為多聚的，諸如雙功能抗體或多聚體。多聚體最可能由輕鏈及重鏈之可變部分交叉配對為雙功能抗體來形成。構築體之鉸鏈部分可具有自完全缺失至維持第一半胱胺酸、至取代脯胺酸而非絲胺酸、至截斷至第一半胱胺酸之多個替代物。Fc部分可缺失。穩定及/或二聚化之任何蛋白質均可供用於此目的。可僅使用Fc域中之一者，例如來自人類免疫球蛋白之CH2或CH3域。亦可使用已經修飾以改良二聚化之人類免疫球蛋白之鉸鏈、CH2及CH3區。亦可僅使用免疫球蛋白之鉸鏈部分。亦可使用CD8α之部分。
在一些實施例中，CAR核酸包含編碼其他協同刺激受體之序列，該等協同刺激受體諸如跨膜域及經修飾之CD28細胞內信號傳導域。其他協同刺激受體包括但不限於CD28、CD27、OX-40 (CD134)、DAP10、DAP12、CD40配位體及4-1BB (CD137)中之一或多者。除藉由CD3ζ引發之初級信號以外，由插入於人類CAR中之人類協同刺激受體提供之額外信號對於NK細胞之完全活化為重要的，且可幫助提高過繼免疫療法之活體內持久性及治療成效。
在一些實施例中，CAR經構築具有針對特定抗原(或標記物或配位體)之特異性，該特定抗原諸如在待由過繼療法靶向之特定細胞類型中表現之抗原，例如癌症標記物，及/或意欲誘導抑制反應之抗原，諸如在正常或非病變細胞類型上表現之抗原。因此，CAR在其細胞外部分中通常包括一或多個抗原結合分子，諸如一或多個抗原結合片段、域或部分，或一或多個抗體可變域及/或抗體分子。在一些實施例中，CAR包括抗原結合部分或抗體分子部分，諸如衍生自單株抗體(mAb)之可變重(VH)及可變輕(VL)鏈的單鏈抗體片段(scFv)。
在嵌合抗原受體之某些實施例中，受體之抗原特異性部分(其可稱為包含抗原結合區之細胞外域)包含腫瘤相關抗原或病原體特異性抗原結合域。抗原包括由模式識別受體，諸如C型凝集素-1 (Dectin-1)識別之碳水化合物抗原。腫瘤相關抗原可為任何種類，只要其表現於腫瘤細胞之細胞表面上即可。腫瘤相關抗原之例示性實施例包括CD19、CD20、癌胚抗原、α胎蛋白、CA-125、MUC-1、CD56、EGFR、c-Met、AKT、Her2、Her3、上皮腫瘤抗原、黑素瘤相關抗原、突變p53、突變ras等。在某些實施例中，當存在少量腫瘤相關抗原時，CAR可與細胞介素共表現以提高持久性。舉例而言，CAR可與IL-15一起共表現。
編碼嵌合受體之開放閱讀框架之序列可獲自基因體DNA來源、cDNA來源，或可合成(例如經由PCR)，或其組合。視基因體DNA之尺寸及內含子之數目而定，可能需要使用cDNA或其組合，因為發現內含子使mRNA穩定。另外，使用內源性或外源性非編碼區以使mRNA穩定可為進一步有利的。
經考慮，嵌合構築體可以裸DNA、質體形式或在適合載體中引入免疫細胞中。藉由電穿孔使用裸DNA或質體穩定轉染細胞之方法為此項技術中已知的。參見例如美國專利第6,410,319號。裸DNA一般係指編碼嵌合受體之DNA，該嵌合受體以對於表現適當之定向含於質體表現載體中。
或者，病毒載體(例如反轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體或慢病毒載體)可用於將嵌合構築體引入至免疫細胞中。根據本發明方法使用之適合之載體在免疫細胞中為非複製的。已知大量載體係基於病毒，其中維持在細胞中之病毒的複本數足夠低以維持細胞存活率，諸如基於HIV、SV40、EBV、HSV或BPV之載體。
在一些態樣中，抗原特異性結合或識別組件連接至一或多個跨膜及細胞內信號傳導域。在一些實施例中，CAR包括融合至CAR之細胞外域之跨膜域。在一個實施例中，使用與CAR中之域中之一者天然相關之跨膜域。在一些情況下，跨膜域經選擇或藉由胺基酸取代修飾以避免此類域結合至相同或不同表面膜蛋白質之跨膜域，以使與受體複合物之其他成員的相互作用最小化。
在一些實施例中，跨膜域來源於天然或合成來源。在來源為天然的情況下，在一些態樣中，域來源於任何膜結合或跨膜蛋白。跨膜區包括來源於以下之跨膜區(亦即包含至少以下之一或多個跨膜區)：T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3 ζ、CD3 ε、CD3 γ、CD3 δ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、ICOS/CD278、GITR/CD357、NKG2D及DAP分子。或者，在一些實施例中，跨膜域為合成的。在一些態樣中，合成跨膜域主要包含疏水性殘基，諸如白胺酸及纈胺酸。在一些態樣中，將在合成跨膜域之各端發現苯丙胺酸、色胺酸及纈胺酸之三聯體。
在某些實施例中，用於遺傳修飾免疫細胞，諸如NK細胞之本文揭示之平台技術包含(i)使用電穿孔裝置(例如核轉染儀)之非病毒基因轉移，(ii)經由胞內域(例如CD28/CD3-ζ、CD137/CD3-ζ或其他組合)傳導信號之CAR，(iii)連接抗原識別域與細胞表面之細胞外域之具有可變長度的CAR，及在一些情況下，(iv)能夠穩固地且在數值上擴增CAR+ 免疫細胞之衍生自K562之人工抗原呈現細胞(aAPC) (Singh等人，2008；Singh等人，2011)。  B. T細胞受體
在一些實施例中，細胞包含經基因工程改造之抗原受體，包括重組TCR及/或自天然存在之T細胞選殖之TCR。「T細胞受體」或「TCR」係指含有可變α及β鏈(亦分別稱為TCRα及TCRβ)或可變γ及δ鏈(亦分別稱為TCRγ及TCRδ)且能夠特異性結合於與MHC受體結合之抗原肽的分子。在一些實施例中，TCR呈αβ形式。在替代性實施例中，細胞不具有經工程改造之TCR；舉例而言，細胞中之內源性TCR可靶向癌症或感染性疾病(例如，具有內源性TCR之CMV或EBV特異性T細胞)。
通常，呈αβ及γδ形式存在之TCR一般結構上類似，但表現其之T細胞可具有不同解剖學位置或功能。TCR可發現於細胞表面上或呈可溶形式。一般而言，TCR發現於T細胞(或T淋巴球)的表面上，在此其一般負責識別結合於主要組織相容複合物(MHC)分子之抗原。在一些實施例中，TCR亦可含有恆定域、跨膜域及/或短胞質尾區(參見例如Janeway等人，1997)。舉例而言，在一些態樣中，TCR之各鏈可具有一個N端免疫球蛋白可變域、一個免疫球蛋白恆定域、跨膜區及C末端處之短胞質尾區。在一些實施例中，TCR與涉及介導信號轉導之CD3複合物之不變蛋白質相關。除非另外說明，否則術語「TCR」應理解為涵蓋其功能TCR片段。術語亦涵蓋完整或全長TCR，包括呈αβ形式或γδ形式之TCR。
因此，出於本文之目的，TCR之提及包括任何TCR或功能片段，諸如結合於MHC分子中結合之特定抗原肽，亦即MHC-肽複合物之TCR的抗原結合部分。可互換使用之TCR之「抗原結合部分」或「抗原結合片段」係指含有TCR之結構域之部分，但結合完全TCR所結合之抗原(例如MHC-肽複合物)的分子。在一些情況下，抗原結合部分含有TCR之可變域，諸如TCR之可變α鏈及可變β鏈，足以形成結合於特定MHC-肽複合物之結合位點，諸如一般其中各鏈含有三個互補決定區。
在一些實施例中，TCR鏈之可變域結合形成環，或類似於免疫球蛋白之互補決定區(CDR)，其藉由形成TCR分子之結合位點而賦予抗原識別且決定肽特異性，且決定肽特異性。通常，如免疫球蛋白，該等CDR係由框架區(FR)分隔開(參見例如Jores等人1990；Chothia等人，1988；Lefranc等人，2003)。在一些實施例中，CDR3係負責識別加工抗原之主要CDR，儘管α鏈之CDR1亦已顯示與抗原肽之N端部分相互作用，而β鏈之CDR1與該肽之C端部分相互作用。CDR2被認為識別MHC分子。在一些實施例中，β鏈之可變區可含有另一高變(HV4)區。
在一些實施例中，TCR鏈含有恆定域。舉例而言，如免疫球蛋白，TCR鏈(例如α鏈、β鏈)之細胞外部分可含有兩個免疫球蛋白域，N端之可變域(例如Va 或Vp；通常為基於Kabat編號之胺基酸1至116，Kabat等人，「免疫學相關之蛋白質序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)」，美國衛生及公共服務部(US Dept. Health and Human Services)，國立衛生研究院公共衛生處(Public Health Service National Institutes of Health)，1991，第5版)，及鄰近細胞膜之恆定域(例如α鏈恆定域或Ca ，通常為基於Kabat之胺基酸117至259，β鏈恆定域或Cp，通常為基於Kabat之胺基酸117至295)。舉例而言，在一些情況下，藉由兩個鏈形成之TCR之細胞外部分含有兩個近膜恆定域及兩個含有CDR之遠膜可變域。TCR域之恆定域含有短連接序列，其中半胱胺酸殘基形成二硫鍵，在兩個鏈之間產生連接。在一些實施例中，TCR之α及β鏈可各具有另外半胱胺酸殘基，使得TCR在恆定域中含有兩個二硫鍵。
在一些實施例中，TCR鏈可含有跨膜域。在一些實施例中，跨膜域帶正電。在一些情況下，TCR鏈含有胞質尾區。在一些情況下，結構允許TCR與如CD3之其他分子結合。舉例而言，含有具有跨膜區之恆定域之TCR可將蛋白質錨定於細胞膜中且與CD3信號傳導設備或複合物之不變次單位結合。
一般而言，CD3係可具有哺乳動物中之三個不同鏈(γ、δ及ε)及ζ鏈之多蛋白質複合物。舉例而言，在哺乳動物中，複合物可含有CD3γ鏈、CD3δ鏈、兩個CD3ε鏈及CD3ζ鏈之均二聚體。CD3γ、CD3δ及CD3ε鏈係含有單一免疫球蛋白域之免疫球蛋白超家族之高度相關細胞表面蛋白質。CD3γ、CD3δ及CD3ε鏈之跨膜區帶負電，其為允許此等鏈與帶正電T細胞受體鏈結合之特徵。CD3γ、CD3δ及CD3ε鏈之細胞內尾區各自含有稱為基於免疫受體酪胺酸之活化模體或ITAM之單一保守模體，而各CD3ζ鏈具有三個。一般而言，ITAM涉及TCR複合物之信號傳導能力。此等輔助分子具有帶負電跨膜區且在將信號自TCR傳播至細胞中起作用。CD3鏈及ζ鏈與TCR一起形成被稱為T細胞受體複合物之物體。
在一些實施例中，TCR可為兩個鏈α及β (或視情況γ及δ)之雜二聚體或其可為單鏈TCR構築體。在一些實施例中，TCR係含有諸如藉由一或多個二硫鍵連接之兩個分開的鏈(α及β鏈或γ及δ鏈)之雜二聚體。在一些實施例中，鑑別且將目標抗原(例如癌症抗原)之TCR引入細胞中。在一些實施例中，編碼TCR之核酸聚合物可獲自多種來源，諸如藉由公開可用的TCR DNA序列之聚合酶鏈反應(PCR)擴增。在一些實施例中，TCR係獲自生物來源，諸如獲自細胞，諸如獲自T細胞(例如，細胞毒性T細胞)、T細胞融合瘤或其他公開可用的來源。在一些實施例中，T細胞可獲自活體內分離之細胞。在一些實施例中，可自患者分離高親和力T細胞純系，且分離TCR。在一些實施例中，T細胞可為經培養之T細胞融合瘤或純系。在一些實施例中，目標抗原之TCR純系已在用人類免疫系統基因(例如人類白血球抗原系統或HLA)工程改造之轉基因小鼠中產生。參見例如腫瘤抗原(參見例如Parkhurst等人，2009及Cohen等人，2005)。在一些實施例中，噬菌體呈現用於針對目標抗原分離TCR (參見例如Varela-Rohena等人，2008及Li，2005)。在一些實施例中，TCR或其抗原結合部分可由TCR之序列之知識合成產生。  C. 抗原呈現細胞
抗原呈現細胞可用本文所涵蓋之培養基冷凍保存。包括巨噬細胞、B淋巴球及樹突狀細胞之抗原呈現細胞藉由其特定MHC分子之表現區分。APC內化抗原且與MHC分子一起在其外部細胞膜上再表現該抗原之一部分。MHC為具有多個基因座之較大基因複合物。MHC基因座編碼兩個主要類別之MHC膜分子，稱為I類及II類MHC。T輔助淋巴球一般識別與MHC II類分子相關之抗原，且T細胞毒性淋巴球識別與MHC I類分子相關之抗原。在人體內，MHC稱為HLA複合物且在小鼠中稱為H-2複合物。
在一些情況下，aAPC適用於製備實施例之治療組合物及細胞療法產物。對於關於製備及使用抗原呈現系統之通用指導，參見例如美國專利第6,225,042號、第6,355,479號、第6,362,001號及第6,790,662號；美國專利申請公開案第2009/0017000號及第2009/0004142號；以及國際公開案第WO2007/103009號。
aAPC系統可包含至少一種外源性輔助分子。可採用任何適合之輔助分子之數目及組合。輔助分子可選自諸如協同刺激分子及黏附分子之輔助分子。例示性協同刺激分子包括CD86、CD64 (FcγRI)、41BB配位體及IL-21。黏附分子可包括結合碳水化合物之糖蛋白，諸如選擇素；跨膜結合糖蛋白，諸如整合素；鈣依賴性蛋白，諸如鈣黏素；及單程跨膜免疫球蛋白(Ig)超家族蛋白，諸如細胞間黏附分子(ICAM)，其促進例如單元至單元或細胞至基質接觸。例示性黏附分子包括LFA-3及ICAM，諸如ICAM-1。在例如美國專利第6,225,042號、第6,355,479號及第6,362,001號中例示適用於選擇、選殖、製備及表現包括協同刺激分子及黏附分子之例示性輔助分子之技術、方法及試劑。  D. 抗原
在由經基因工程改造之抗原受體靶向之抗原中的為在待經由過繼細胞療法靶向之疾病、病狀或細胞類型之情形下表現的彼等抗原。在疾病及病狀當中有增生性、贅生性及惡性疾病及病症，包括癌症及腫瘤，包括血液癌、免疫系統癌症，諸如淋巴瘤、白血病及/或骨髓瘤，諸如B、T及骨髓白血病、淋巴瘤及多發性骨髓瘤。在一些實施例中，相比於正常或非靶向細胞或組織，抗原選擇性地表現或過度表現於疾病或病狀之細胞，例如腫瘤或病原性細胞上。在其他實施例中，抗原表現於正常細胞上及/或表現於經工程改造之細胞上。
任何適合之抗原可用於本發明方法中。例示性抗原包括但不限於來自感染物之抗原分子、自體/自身抗原、腫瘤/癌症相關抗原及腫瘤新抗原(Linnemann等人，2015)。在特定態樣中，抗原包括BCMA、NY-ESO、EGFRvIII、Muc-1、Her2、CA-125、WT-1、Mage-A3、Mage-A4、Mage-A10、TRAIL/DR4及CEA。在特定態樣中，兩種或更多種抗原受體之抗原包括但不限於CD19、EBNA、WT1、CD123、NY-ESO、EGFRvIII、MUC1、HER2、CA-125、WT1、Mage-A3、Mage-A4、Mage-A10、TRAIL/DR4及/或CEA。此等抗原之序列在此項技術中已知，例如CD19 (寄存編號NG_007275.1)、EBNA (寄存編號NG_002392.2)、WT1 (寄存編號NG_009272.1)、CD123 (寄存編號NC_000023.11)、NY-ESO (寄存編號NC_000023.11)、EGFRvIII (寄存編號NG_007726.3)、MUC1 (寄存編號NG_029383.1)、HER2 (寄存編號NG_007503.1)、CA-125 (寄存編號NG_055257.1)、WT1 (寄存編號NG_009272.1)、Mage-A3 (寄存編號NG_013244.1)、Mage-A4 (寄存編號NG_013245.1)、Mage-A10 (寄存編號NC_000023.11)、TRAIL/DR4 (寄存編號NC_000003.12)及/或CEA (寄存編號NC_000019.10)。
腫瘤相關抗原可衍生自前列腺癌、乳癌、大腸直腸癌、肺癌、胰臟癌、腎癌、間皮瘤、卵巢癌或黑素瘤。例示性腫瘤相關抗原或腫瘤細胞衍生抗原包括MAGE 1、3及MAGE 4 (或其他MAGE抗原，諸如國際專利公開案第WO99/40188號中所揭示之彼等MAGE抗原)；PRAME；BAGE；RAGE，Lage (亦稱為NY ESO 1)；SAGE；及HAGE或GAGE。腫瘤抗原之此等非限制性實例表現於廣泛範圍之腫瘤類型，諸如黑素瘤、肺癌、肉瘤及膀胱癌中。參見例如美國專利第6,544,518號。前列腺癌腫瘤相關抗原包括例如前列腺特異性膜抗原(PSMA)、前列腺特異性抗原(PSA)、前列腺酸磷酸鹽、NKX3.1及前列腺之六跨膜上皮抗原(STEAP)。
其他腫瘤相關抗原包括Plu-1、HASH-1、HasH-2、Cripto及Criptin。另外，腫瘤抗原可為自身肽激素，諸如全長促性腺激素釋放激素(GnRH)，一種適用於治療許多癌症之長度為10個胺基酸的短肽。
腫瘤抗原包括衍生自特徵在於腫瘤相關抗原表現，諸如HER-2/neu表現之癌症的腫瘤抗原。相關腫瘤相關抗原包括譜系特異性腫瘤抗原，諸如黑素細胞-黑素瘤譜系抗原MART-1/Melan-A、gp100、gp75、mda-7、酪胺酸酶及酪胺酸酶相關蛋白質。說明性腫瘤相關抗原包括但不限於衍生自或包含以下中之任何一或多者之腫瘤抗原：p53、Ras、c-Myc、細胞質絲胺酸/蘇胺酸激酶(例如A-Raf、B-Raf及C-Raf、細胞週期素依賴性激酶)、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、MART-1、BAGE、DAM-6、-10、GAGE-1、-2、-8、GAGE-3、-4、-5、-6、-7B、NA88-A、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、酪胺酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC2、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)、TRK受體、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、威耳姆士腫瘤抗原(Wilms' tumor antigen；WT1)、AFP、-連環蛋白/m、凋亡蛋白酶-8/m、CEA、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌凝蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、磷脂結合蛋白II、CDC27/m、TPI/mbcr-abl、BCR-ABL、干擾素調節因子4 (IRF4)、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RAR、腫瘤相關鈣信號轉導蛋白1 (TACSTD1) TACSTD2、受體酪胺酸激酶(例如表皮生長因子受體(EGFR) (特定言之，EGFRvIII)、血小板衍生生長因子受體(PDGFR)、血管內皮生長因子受體(VEGFR)、細胞質酪胺酸激酶(例如src-家族、syk-ZAP70家族)、整合素連接激酶(ILK)、轉錄STAT3之信號轉導蛋白及活化因子、STATS及STATE、低氧誘導因子(例如HIF-1及HIF-2)、核因子-κB(NF-B)、Notch受體(例如Notch1-4)、c-Met、雷帕黴素之哺乳動物目標(mTOR)、WNT、細胞外信號調節激酶(ERK)及其調節次單位、PMSA、PR-3、MDM2、間皮素、腎細胞癌-5T4、Sm22-α、碳酸酐酶I (CAI)及IX (CAIX) (亦稱為G250)、STEAD、TEL/AML1、GD2、蛋白酶3、hTERT、肉瘤移位斷點、EphA2、ML-IAP、EpCAM、ERG (TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、ALK、雄激素受體、細胞週期素B1、聚唾液酸、MYCN、RhoC、GD3、岩藻糖基GM1、間皮素(mesothelian)、PSCA、sLe、PLAC1、GM3、BORIS、Tn、GLoboH、NY-BR-1、RGsS、SART3、STn、PAX5、OY-TES1、精子蛋白17、LCK、HMWMAA、AKAP-4、SSX2、XAGE 1、B7H3、豆莢蛋白、TIE2、Page4、MAD-CT-1、FAP、MAD-CT-2、fos相關抗原1、CBX2、CLDN6、SPANX、TPTE、ACTL8、ANKRD30A、CDKN2A、MAD2L1、CTAG1B、SUNC1、LRRN1及個體基因型。
抗原可包括抗原決定基區或抗原決定基肽，其衍生自腫瘤細胞中突變之基因或衍生自相比於正常細胞在腫瘤細胞中以不同層級轉錄之基因，諸如端粒酶、存活素、間皮素、突變ras、bcr/abl重排、Her2/neu、突變或野生型p53、細胞色素P450 1B1，及異常表現之內含子序列，諸如N-乙醯胺基葡萄糖轉移酶-V；在骨髓瘤及B細胞淋巴瘤中產生獨特個體基因型之免疫球蛋白基因之純系重排；包括衍生自癌病毒過程之抗原決定基區或抗原決定基肽之腫瘤抗原，諸如人類乳頭狀瘤病毒蛋白E6及E7；艾巴二氏病毒蛋白(Epstein bar virus protein) LMP2；具有腫瘤選擇性表現之非變異癌胚蛋白，諸如癌胚抗原及α-胎蛋白。
在其他實施例中，抗原獲自或衍生自病原性微生物體或機會性病原性微生物體(在本文中亦稱作感染性疾病微生物體)，諸如病毒、真菌、寄生蟲及細菌。在某些實施例中，衍生自此類微生物體之抗原包括全長蛋白質。
其抗原考慮用於本文所述之方法的說明性病原性生物體包括人類免疫不全病毒(HIV)、單純疱疹病毒(HSV)、呼吸道融合病毒(RSV)、巨細胞病毒(CMV)、艾-巴二氏病毒(EBV)、A型、B型及C型流感、水泡性口炎病毒(VSV)、水泡性口炎病毒(VSV)、多瘤病毒(例如BK病毒及JC病毒)、腺病毒、包括抗甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcus aureus ；MRSA)之葡萄球菌屬(Staphylococcus species)及包括肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae )之鏈球菌屬(Streptococcus species)。如熟習此項技術者將理解，衍生自此等及其他病原性微生物體、用作如本文所描述之抗原的蛋白質及編碼蛋白質之核苷酸序列可在公開案及公開資料庫，諸如GENBANK®、SWISS-PROT®及TREMBL®中鑑別。
衍生自人類免疫不全病毒(HIV)之抗原包括以下中之任一者：HIV病毒粒子結構蛋白(例如gp120、gp41、p17、p24)、蛋白酶、逆轉錄酶或由tat、rev、nef、vif、vpr及vpu編碼之HIV蛋白。
衍生自單純疱疹病毒(例如HSV 1及HSV2)之抗原包括但不限於表現自HSV晚期基因之蛋白質。晚期基因組主要編碼形成病毒粒子之蛋白質。此類蛋白質包括形成病毒衣殼之來自(UL)之五種蛋白質：UL6、UL18、UL35、UL38及主要衣殼蛋白UL19、UL45及UL27，其中每一者可用作如本文所述之抗原。考慮用作本文中之抗原的其他說明性HSV蛋白包括ICP27 (H1、H2)、醣蛋白B (gB)及醣蛋白D (gD)蛋白。HSV基因體包含至少74個基因，各自編碼可潛在地用作抗原之蛋白質。
衍生自巨細胞病毒(CMV)之抗原包括CMV結構蛋白、在病毒複製之即刻早期及早期期間表現之病毒抗原、醣蛋白I及III、衣殼蛋白、鞘蛋白、低基質蛋白pp65 (ppUL83)、p52 (ppUL44)、IE1及1E2 (UL123及UL122)、來自UL128-UL150基因集群之蛋白質產物(Rykman等人，2006)、包膜醣蛋白B (gB)、gH、gN及pp150。如熟習此項技術者將理解，用作本文所述之抗原的CMV蛋白質可在公開資料庫，諸如GENBANK®、SWISS-PROT®及TREMBL®中鑑別(參見例如Bennekov等人，2004；Loewendorf等人，2010；Marschall等人，2009)。
考慮用於某些實施例之衍生自艾-巴二氏病毒(EBV)之抗原包括EBV溶解蛋白gp350及gp110、在潛伏週期感染期間產生之EBV蛋白，包括艾-巴二氏核抗原(EBNA)-1、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNA-前導蛋白(EBNA-LP)及潛伏膜蛋白(LMP)-1、LMP-2A及LMP-2B(參見例如Lockey等人，2008)。
考慮用於本文中之衍生自呼吸道融合病毒(RSV)之抗原包括由RSV基因體編碼之十一種蛋白質，或其抗原性片段中之任一者：NS 1、NS2、N (核衣殼蛋白)、M (基質蛋白)SH、G及F (病毒鞘蛋白)、M2 (第二基質蛋白)、M2-1 (延長因子)、M2-2 (轉錄調節)、RNA聚合酶及磷蛋白P。
考慮使用之衍生自水泡性口炎病毒(VSV)之抗原包括由VSV基因體編碼之五種主要蛋白，及其抗原性片段中之任一者：大蛋白(L)、醣蛋白(G)、核蛋白(N)、磷蛋白(P)及基質蛋白(M) (參見例如Rieder等人，1999)。
考慮用於某些實施例之衍生自流感病毒之抗原包括血球凝集素(HA)、神經胺糖酸苷酶(NA)、核蛋白(NP)、基質蛋白M1及M2、NS1、NS2 (NEP)、PA、PB1、PB1-F2及PB2。
例示性病毒抗原亦包括但不限於腺病毒多肽、α病毒多肽、杯狀病毒多肽(例如杯狀病毒衣殼抗原)、冠狀病毒多肽、犬瘟熱病毒多肽、伊波拉病毒多肽、腸病毒多肽、黃病毒多肽、肝炎病毒(AE)多肽(B型肝炎核或表面抗原、C型肝炎病毒E1或E2醣蛋白、核或非結構蛋白)、疱疹病毒多肽(包括單純疱疹病毒或水痘帶狀皰狀病毒醣蛋白)、感染性腹膜炎病毒多肽、白血病病毒多肽、馬堡病毒(Marburg virus)多肽、正黏液病毒多肽、乳頭狀瘤病毒多肽、副流感病毒多肽(例如血球凝集素及神經胺糖酸苷酶多肽)、副黏病毒多肽、小病毒多肽、瘟病毒多肽、病毒科病毒多肽(例如脊髓灰白質炎病毒衣殼多肽)、痘病毒多肽(例如痘瘡病毒多肽)、狂犬病病毒多肽(例如狂犬病病毒醣蛋白G)、里奧病毒(reovirus)多肽、反轉錄病毒多肽及輪狀病毒多肽。
在某些實施例中，抗原可為細菌抗原。在某些實施例中，相關細菌抗原可為分泌多肽。在其他某些實施例中，細菌抗原包括具有暴露於細菌之外細胞表面上之多肽之一或多個部分的抗原。
考慮使用之衍生自包括抗甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)之葡萄球菌屬之抗原包括毒性調節子，諸如Agr系統、Sar及Sae、Arl系統、Sar同系物(Rot、MgrA、SarS、SarR、SarT、SarU、SarV、SarX、SarZ及TcaR)、Srr系統及TRAP。可充當抗原之其他葡萄球菌蛋白質包括Clp蛋白質、HtrA、MsrR、烏頭酸酶、CcpA、SvrA、Msa、CfvA及CfvB (參見例如Staphylococcus : Molecular Genetics, 2008 Caister Academic Press, Jodi Lindsay編)。金黃色葡萄球菌之兩個物種(N315及Mu50)之基因體已定序且公開可用，例如在PATRIC (PATRIC: The VBI PathoSystems Resource Integration Center, Snyder等人，2007)。如熟習此項技術者將理解，用作抗原之葡萄球菌蛋白質亦可在其他公開資料庫，諸如GenBank®、Swiss-Prot®及TrEMBL®中鑑別。
考慮用於本文所述之某些實施例的衍生自肺炎鏈球菌之抗原包括肺炎鏈球菌溶血素、PspA、膽鹼-結合蛋白A (CbpA)、NanA、NanB、SpnHL、PavA、LytA、Pht及菌毛蛋白(RrgA；RrgB；RrgC)。肺炎鏈球菌之抗原性蛋白質亦為此項技術中已知的且可在一些實施例中用作抗原(參見例如Zysk等人，2000)。肺炎鏈球菌之毒性菌株之完整基因體序列已定序且如熟習此項技術者應理解，本文中所用之肺炎鏈球菌蛋白質亦可在其他公開資料庫，諸如GENBANK®、SWISS-PROT®及TREMBL®中鑑別。用於根據本發明之抗原的尤其相關之蛋白質包括預測暴露於肺炎球菌(pneumococci)表面之毒性因子及蛋白質(參見例如Frolet等人，2010)。
可用作抗原之細菌抗原之實例包括但不限於放線菌(Actinomyces )多肽、芽孢桿菌(Bacillus )多肽、擬桿菌(Bacteroides )多肽、鮑特氏菌(Bordetella )多肽、巴爾通體(Bartonella )多肽、疏螺旋體(Borrelia )多肽(例如伯氏疏螺旋體(B. burgdorferi ) OspA)、布氏桿菌(Brucella )多肽、曲狀桿菌(Campylobacter )多肽、二氧化碳嗜纖維菌(Capnocytophaga)多肽、披衣菌(Chlamydia )多肽、棒狀桿菌(Corynebacterium )多肽、考克斯氏體(Coxiella )多肽、潛蚤(Dermatophilus )多肽、腸球菌(Enterococcus )多肽、艾利希體(Ehrlichia )多肽、艾氏菌(Escherichia )多肽、弗朗西斯氏菌(Francisella )多肽、梭桿菌(Fusobacterium )多肽、血巴爾通氏體(Haemobartonella )多肽、嗜血桿菌(Haemophilus )多肽(例如流感嗜血桿菌b型外膜蛋白質)、螺旋桿菌(Helicobacter )多肽、克雷伯氏菌(Klebsiella )多肽、L-形式細菌多肽、鉤端螺旋體(Leptospira )多肽、李斯特菌(Listeria )多肽、分枝桿菌(Mycobacteria )多肽、黴漿菌(Mycoplasma )多肽、奈瑟氏菌(Neisseria )多肽、新立克次體(Neorickettsia )多肽、諾卡菌(Nocardia )多肽、巴氏桿菌(Pasteurella )多肽、消化球菌(Peptococcus )多肽、消化鏈球菌(Peptostreptococcus )多肽、肺炎球菌(Pneumococcus )多肽(亦即肺炎鏈球菌(S. pneumoniae )多肽)(參見本文描述)、變形桿菌(Proteus )多肽、假單胞菌(Pseudomonas )多肽、立克次體(Rickettsia )多肽、羅克利馬體(Rochalimaea )多肽、沙門氏菌(Salmonella )多肽、志賀桿菌(Shigella )多肽、葡萄球菌(Staphylococcus )多肽、A組鏈球菌(Streptococcus )多肽(例如化膿性鏈球菌(S. pyogenes ) M蛋白)、B組鏈球菌(無乳鏈球菌(S. agalactiae ))多肽、密螺旋體(Treponema )多肽及耶爾森菌(Yersinia )多肽(例如鼠疫耶爾森菌(Y. pestis )F1及V抗原)。
真菌抗原之實例包括但不限於犁頭黴(Absidia )多肽、枝頂孢(Acremonium )多肽、交鏈孢(Alternaria )多肽、麴菌(Aspergillus )多肽、蛙糞黴菌(Basidiobolus )多肽、平臍蠕孢(Bipolaris )多肽、芽生菌(Blastomyces )多肽、念珠菌(Candida )多肽、粗球菌(Coccidioides )多肽、耳黴(Conidiobolus )多肽、隱球菌(Cryptococcus )多肽、彎孢黴(Curvalaria )多肽、表皮癬菌(Epidermophyton )多肽、外瓶黴(Exophiala )多肽、地絲菌(Geotrichum )多肽、組織漿菌(Histoplasma )多肽、馬杜拉分支菌(Madurella )多肽、馬拉色菌(Malassezia )多肽、小芽孢菌(Microsporum )多肽、小叢梗孢(Moniliella )多肽、被孢黴(Mortierella )多肽、白黴菌(Mucor )多肽、擬青黴菌(Paecilomyces )多肽、青黴菌(Penicillium )多肽、單胞瓶黴(Phialemonium )多肽、瓶黴(Phialophora )多肽、原壁菌(Prototheca )多肽、假埃希氏菌(Pseudallescheria )多肽、假小托菌(Pseudomicrodochium )多肽、腐黴菌(Pythium )多肽、鼻孢子蟲(Rhinosporidium )多肽、根黴菌(Rhizopus )多肽、線狀擔子菌(Scolecobasidium )多肽、孢子絲菌(Sporothrix )多肽、匍柄黴(Stemphylium )多肽、發癬菌(Trichophyton )多肽、毛芽胞菌(Trichosporon )多肽及木絲黴(Xylohypha )多肽。
原蟲寄生蟲抗原之實例包括但不限於巴倍蟲(Babesia )多肽、腸袋蟲(Balantidium )多肽、貝諾孢子蟲(Besnoitia )多肽、隱胞子蟲(Cryptosporidium )多肽、艾美球蟲(Eimeria )多肽、腦胞內原蟲(Encephalitozoon )多肽、內阿米巴(Entamoeba )多肽、梨形鞭毛蟲(Giardia )多肽、哈蒙德蟲(Hammondia )多肽、肝簇蟲(Hepatozoon )多肽、等孢子球蟲(Isospora )多肽、利什曼原蟲(Leishmania )多肽、微孢子蟲(Microsporidia )多肽、新孢子蟲(Neospora )多肽、小孢子蟲(Nosema )多肽、五鞭毛蟲(Pentatrichomonas )多肽、瘧原蟲(Plasmodium )多肽。蠕蟲寄生蟲抗原之實例包括但不限於棘唇(Acanthocheilonema )多肽、貓圓線蟲(Aelurostrongylus )多肽、鉤蟲(Ancylostoma )多肽、血管圓線蟲(Angiostrongylus )多肽、蛔蟲(Ascaris )多肽、布魯線蟲(Brugia )多肽、仰口線蟲(Bunostomum )多肽、毛細線蟲(Capillaria )多肽、夏氏線蟲(Chabertia )多肽、古柏線蟲(Cooperia )多肽、環體線蟲(Crenosoma )多肽、網尾線蟲(Dictyocaulus )多肽、膨結線蟲(Dioctophyme )多肽、雙板線蟲(Dipetalonema )多肽、裂頭絛蟲(Diphyllobothrium )多肽、複孔絛蟲(Diplydium )多肽、絲蟲(Dirofilaria )多肽、龍線(Dracunculus )多肽、蟯蟲(Enterobius )多肽、類絲蟲(Filaroides )多肽、撚轉血茅線蟲(Haemonchus )多肽、兔唇蛔(Lagochilascaris )多肽、羅阿線蟲(Loa )多肽、曼森線蟲(Mansonella )多肽、繆勒線蟲(Muellerius )多肽、侏形吸蟲(Nanophyetus )多肽、鉤蟲(Necator )多肽、細頸線蟲(Nematodirus )多肽、結節線蟲(Oesophagostomum )多肽、盤尾絲蟲(Onchocerca )多肽、後睾吸蟲(Opisthorchis )多肽、奧斯特線蟲(Ostertagia )多肽、副絲蟲(Parafilaria )多肽、並殖吸蟲(Paragonimus )多肽、副蛔蟲(Parascaris )多肽、泡翼線蟲(Physaloptera )多肽、原圓線蟲(Protostrongylus )多肽、狗尾草(Setaria )多肽、旋尾線蟲(Spirocerca )多肽、迭宮絛蟲(Spirometra )多肽、冠絲蟲(Stephanofilaria )多肽、類圓線蟲(Strongyloides )多肽、圓蟲(Strongylus )多肽、吸吮線蟲(Thelazia )多肽、蛔線蟲(Toxascaris )多肽、弓蛔蟲(Toxocara )多肽、旋毛蟲(Trichinella )多肽、毛樣圓蟲(Trichostrongylus )多肽、鞭蟲(Trichuris )多肽、鉤蟲(Uncinaria )多肽及吳策線蟲(Wuchereria )多肽。(例如惡性瘧原蟲(P. falciparum )環子孢子(PfCSP))、子孢子表面蛋白2 (PfSSP2)、肝狀態抗原1之羧基末端(PfLSA1 c-term)及輸出蛋白1 (PfExp-1)、肺囊蟲(Pneumocystis )多肽、肉孢子蟲(Sarcocystis )多肽、住血吸蟲(Schistosoma )多肽、泰累爾犁漿蟲(Theileria )多肽、弓蟲(Toxoplasma )多肽及錐蟲(Trypanosoma )多肽。
外部寄生蟲抗原之實例包括但不限於來自以下之多肽(包括抗原以及過敏原)：跳蚤；蜱，包括硬蜱及軟蜱；蒼蠅，諸如蠓、蚊子、白蛉、黑蠅、馬蠅、角蠅、鹿蠅、舌蠅、廄螫蠅、引起蠅蛆病之蒼蠅及庫蠓；螞蟻；蜘蛛、虱；蟎；以及蝽，諸如床虱及接吻蟲。  E. 自殺基因
在一些實施例中，細胞涵蓋表現一或多種自殺基因之核酸。可在冷凍保存及解凍之前或之後操縱細胞以表現自殺基因。本發明之例示性免疫細胞之CAR可包含一或多種自殺基因。如本文所用，術語「自殺基因」定義為在投與前藥時實現基因產物向殺滅其宿主細胞之化合物之轉變的基因。可使用之自殺基因/前藥組合之實例為單純疱疹病毒-胸苷激酶(HSV-tk)及更昔洛韋(ganciclovir)、阿昔洛韋(acyclovir)或FIAU；氧化還原酶及環己醯亞胺；胞嘧啶脫胺酶及5-氟胞嘧啶；胸苷激酶胸苷酸激酶(Tdk::Tmk)及AZT；及去氧胞苷激酶及胞嘧啶阿拉伯糖苷。
大腸桿菌(E. coli )嘌呤核苷磷酸化酶，所謂的自殺基因，其將前藥6-甲基嘌呤去氧核糖苷轉化為有毒嘌呤6-甲基嘌呤。與前藥療法一起使用之自殺基因之其他實例為大腸桿菌胞嘧啶脫胺酶基因及HSV胸苷激酶基因。
例示性自殺基因包括CD20、突變TNF-α (例如非分泌型突變體)、CD52、EGFRv3或誘導性凋亡蛋白酶9。在一個實施例中，EGFR變異體III (EGFRv3)之截短型式可用作可藉由西妥昔單抗(Cetuximab)切除之自殺抗原。可用於本發明中之此項技術中已知之其他自殺基因包括：嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、細胞色素p450酶(CYP)、羧肽酶(CP)、羧酸酯酶(CE)、硝基還原酶(NTR)、鳥嘌呤核糖基轉移酶(XGRTP)、糖苷酶、甲硫胺酸-α,γ-解離酶(MET)及胸苷磷酸化酶(TP)。  F. 遞送方法
在冷凍保存後解凍之前或之後，本文中涵蓋之細胞可攜帶重組載體。熟習此項技術者將充分配備以經由用於表現本發明之抗原受體之標準重組技術構築載體(參見例如Sambrook等人，2001及Ausubel等人，1996，兩者均以引用的方式併入本文中)。載體包括但不限於質體、黏質體、病毒(噬菌體、動物病毒及植物病毒)及人工染色體(例如，YAC)，諸如反轉錄病毒載體(例如，衍生自莫洛尼鼠類白血病病毒載體(Moloney murine leukemia virus vector，MoMLV)、MSCV、SFFV、MPSV、SNV等之載體)、慢病毒載體(例如，衍生自HIV-1、HIV-2、SIV、BIV、FIV等之載體)、腺病毒(Ad)載體(包括其複製勝任形式、複製缺陷形式及無腸形式)、腺相關病毒(AAV)載體、猴病毒40 (SV-40)載體、牛乳頭狀瘤病毒載體、艾-巴二氏病毒載體、疱疹病毒載體、痘瘡病毒載體、哈維鼠類肉瘤病毒(Harvey murine sarcoma virus)載體、鼠類乳房腫瘤病毒載體、勞氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)載體、小病毒載體、脊髓灰質炎病毒載體、水泡性口炎病毒載體、馬拉巴病毒(maraba virus)載體及B組腺病毒恩那希瑞載體(group B adenovirus enadenotucirev vector)。  a. 病毒載體
本發明之某些態樣中可提供編碼抗原受體之病毒載體。在產生重組病毒載體時，通常用異源(或非原生)蛋白質之基因或編碼序列置換非必需基因。病毒載體係利用病毒序列將核酸且有可能蛋白質引入細胞中的一類表現構築體。某些病毒經由受體介導之內飲作用感染細胞或進入細胞，並整合至宿主細胞基因體中並且穩定且有效表現病毒基因的能力使其成為用於將外源核酸轉移至細胞(例如，哺乳動物細胞)中的有吸引力的候選物。下文描述可用於遞送本發明之某些態樣之核酸的病毒載體的非限制性實例。
慢病毒為複合反轉錄病毒，除常見反轉錄病毒基因gag 、pol 及env 以外，慢病毒亦含有其他具有調節或結構性功能之基因。慢病毒載體為此項技術中所熟知的(參見例如美國專利6,013,516及5,994,136)。
重組慢病毒載體能夠感染非分裂細胞，且可用於活體內及離體基因轉移及核酸序列之表現。舉例而言，美國專利5,994,136中描述了能夠感染非分裂細胞之重組慢病毒，其中適合之宿主細胞經兩個或更多個具有封裝功能(亦即gag、pol及env，以及rev及tat)之載體轉染，該專利以引用之方式併入本文中。  b. 調節元件
包括於適用於本發明之載體中的表現卡匣尤其含有(以5'至3'方向)可操作地連接於蛋白質編碼序列之真核轉錄啟動子、包括介入序列之剪接信號及轉錄終止/聚腺苷酸化序列。控制真核細胞中之蛋白質編碼基因之轉錄的啟動子及強化子由多個基因元件構成。細胞機制能夠聚集且整合由各元件輸送之調節資訊，從而允許不同基因演進出不同的、通常複雜的轉錄調節模式。在本發明之上下文中所使用之啟動子包括組成性、誘導性及組織特異性啟動子。  c. 啟動子/強化子
本文所提供之表現構築體包含驅動抗原受體之表現的啟動子。啟動子一般包含用於定位RNA合成之起始位點之序列。此之最佳已知實例為TATA盒，但在不具有TATA盒之一些啟動子(諸如哺乳動物末端去氧核苷酸轉移酶基因之啟動子及SV40晚期基因之啟動子)中，上覆於起始位點本身之離散元件有助於固定起始之位置。額外啟動子元件調節轉錄起始頻率。通常，此等元件位於起始位點上游30110 bp之區域中，但多種啟動子已展示亦含有起始位點下游之功能元件。為「在啟動子控制下」引入編碼序列，將轉錄閱讀框架之轉錄起始位點之5'端置於所選擇的啟動子之「下游」(亦即3'端)。「上游」啟動子刺激DNA之轉錄且促進所編碼RNA之表現。
啟動子元件之間的間距通常為靈活的，使得當元件倒置或相對於彼此移動時保留啟動子功能。在tk啟動子中，啟動子元件之間的間距可在活性開始下降之前增加至相隔50 bp。視啟動子而定，似乎個別元件可合作地或獨立地起作用以活化轉錄。啟動子可或可不與「強化子」(其係指涉及核酸序列之轉錄活化的順式作用調節序列)結合使用。
啟動子可為天然地與核酸序列相關之一種啟動子，如可藉由分離位於編碼區段及/或外顯子上游之5'端非編碼序列而獲得。此類啟動子可稱為「內源」的。類似地，強化子可為天然地與核酸序列相關，位於彼序列下游或上游之一種強化子。或者，某些優勢將藉由將編碼核酸區段置於重組或異源啟動子(其係指在其天然環境中通常不與核酸序列相關之啟動子)控制下來獲得。重組或異源強化子亦指在其天然環境中通常不與核酸序列相關之強化子。此類啟動子或強化子可包括其他基因之啟動子或強化子，及自任何其他病毒或原核或真核細胞分離之啟動子或強化子，及不「天然存在」之啟動子或強化子，亦即含有不同轉錄調節區之不同元件，及/或改變表現之突變。舉例而言，最常用於重組DNA構築之啟動子包括β內醯胺酶(青黴素酶)、乳糖及色胺酸(trp-)啟動子系統。除合成地產生啟動子及強化子之核酸序列以外，可結合本文所揭示之組合物使用重組選殖及/或核酸擴增技術(包括PCR™)產生序列。此外，經考慮，亦可採用引導非核細胞器(諸如粒線體、葉綠體及其類似物)內之序列之轉錄及/或表現之控制序列。
自然地，使用有效引導DNA區段在選擇用於表現之細胞器、細胞類型、組織、器官或生物體中之表現的啟動子及/或強化子很重要。熟習分子生物學技術者一般已知使用啟動子、強化子及細胞類型組合來進行蛋白質表現(參見例如Sambrook等人1989，其以引用的方式併入本文中)。所用啟動子可為組成性、組織特異性、誘導性及/或適用於在適當條件下引導所引入之DNA區段的高度表現，諸如有利於大規模產生重組蛋白質及/或肽。啟動子可為異源或內源性。
另外，任何啟動子/強化子組合(按照例如真核啟動子資料庫(Eukaryotic Promoter Data Base) EPDB，經由全球資訊網epd.isb-sib.ch/)亦可用於驅動表現。另一可能實施例為使用T3、T7或SP6細胞質表現系統。若提供適當細菌聚合酶，則真核細胞可支持自某些細菌啟動子之細胞質轉錄，作為遞送複合物之一部分或作為額外基因表現構築體。
啟動子之非限制性實例包括早期或晚期病毒啟動子，諸如SV40早期或晚期啟動子、細胞巨大病毒(CMV)即刻早期啟動子、勞斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus，RSV)早期啟動子；真核細胞啟動子，諸如β肌動蛋白啟動子、GADPH啟動子、金屬硫蛋白啟動子；及串聯反應元件啟動子，諸如環狀AMP反應元件啟動子(cre)、血清反應元件啟動子(sre)、佛波醇酯(phorbol ester)啟動子(TPA)及靠近最小TATA盒之反應元件啟動子(tre)。亦有可能使用人類生長激素啟動子序列(例如Genbank，寄存編號X05244，核苷酸283-341處所描述之人類生長激素最小啟動子)或小鼠乳房腫瘤啟動子(可購自ATCC，目錄號ATCC 45007)。在某些實施例中，啟動子為CMV IE、C型凝集素-1、C型凝集素-2、人類CD11c、F4/80、SM22、RSV、SV40、Ad MLP、β-肌動蛋白、MHC I類或MHC II類啟動子，然而適用於驅動治療性基因表現之任何其他啟動子均可適用於實施本發明。
在某些態樣中，本發明之方法亦關於強化子序列，亦即，提高啟動子活性且具有順式作用潛力之核酸序列，且即使在相當長距離(遠離目標啟動子多達幾千個鹼基)下也不受方向影響。然而，強化子功能不一定受限於此類長距離，因為其等在非常接近特定啟動子下仍可具有功能。  d. 起始信號及連接表現
特定起始信號亦可用於本發明中所提供之表現構築體中以便有效轉譯編碼序列。此等信號包括ATG起始密碼子或相鄰序列。可能需要提供包括ATG起始密碼子之外源性轉譯控制信號。一般熟習此項技術者將容易地能夠判定此且提供必需信號。熟知起始密碼子必須在所要編碼序列之閱讀框架「框內」，以確保整個插入序列之轉譯。外源性轉譯控制信號及起始密碼子可為天然或合成的。表現效率可藉由包括適當轉錄強化子元件來增強。
在某些實施例中，使用內部核糖體入口位點(IRES)元件之用途產生多基因或多順反子訊息。IRES元件能夠繞過5'甲基化封端依賴性轉譯之核糖體掃描模型且在內部位點開始轉譯。已描述來自小核糖核酸病毒家族(脊髓灰質炎及腦心肌炎)之兩個成員的IRES元件以及來自哺乳動物訊息之IRES。IRES元件可連接至異源開放閱讀框架。多個開放閱讀框架可轉錄在一起，各自藉由IRES分離，產生多順反子訊息。藉助於IRES元件，各開放閱讀框架可接近核糖體以便有效轉譯。多個基因可使用單一啟動子/強化子以轉錄單一訊息來有效表現。
另外，某些2A序列元件可用於在本發明中所提供之構築體中產生基因之連接表現或共表現。舉例而言，裂解序列可用於藉由連接開放閱讀框架以形成單一順反子來共表現基因。例示性裂解序列為F2A (口蹄疫病毒2A)或「2A樣」序列(例如，明脈扁刺蛾β四體病毒(Thosea asigna virus) 2A；T2A)。  e. 複製起點  為了在宿主細胞中傳播載體，其可含有一或多個複製位點起點(常常稱為「ori」)，例如，對應於如上文所描述之EBV之oriP，或在程式化中具有類似或較高功能的經基因工程改造之oriP的核酸序列，其為複製起始之特定核酸序列。或者，可採用如上文所述之其他超染色體複製病毒或自主複製序列(ARS)之複製起點。 f. 選擇及可篩選標記物
在一些實施例中，含有本發明之構築體之細胞可藉由在表現載體中包括標記物活體外或活體內鑑別。此類標記物將賦予細胞可鑑別之變化，允許容易地鑑別含有表現載體之細胞。一般而言，選擇標記物為賦予允許選擇之特性的一種標記物。陽性選擇標記物為其中標記物之存在允許其選擇之一種標記物，而陰性選擇標記物為其中其存在阻止其選擇之一種標記物。陽性選擇標記物之實例為抗藥性標記物。
通常，包括藥物選擇標記物有助於選殖及鑑別轉化體，例如賦予新黴素、嘌呤黴素、潮黴素、DHFR、GPT、吉歐黴素及組胺醇抗性之基因為適用選擇標記物。除了賦予允許基於條件之實施區分轉化體之表型的標記物之外，亦考慮其他類型之標記物，包括基於比色分析之可篩選標記物，諸如GFP。或者，可利用可篩選酶作為陰性選擇標記物，諸如單純疱疹病毒胸苷激酶(tk )或氯黴素乙醯基轉移酶(CAT)。熟習此項技術者亦將知道如何使用免疫標記物，可能結合FACS分析。不認為所用標記物很重要，只要其能夠與編碼基因產物之核酸同時表現即可。選擇及可篩選標記物之其他實例為熟習此項技術者所熟知的。  g. 核酸遞送之其他方法
除病毒遞送編碼抗原受體之核酸以外，以下為向給定宿主細胞遞送重組基因的額外方法，且因此在本發明中考慮。
如本文所描述或如一般熟習此項技術者將已知，可使用任何適合的用於轉化細胞之核酸遞送方法來將諸如DNA或RNA之核酸引入本發明之免疫細胞中。此類方法包括但不限於諸如藉由以下方式直接遞送DNA：離體轉染；注射，包括顯微注射；電穿孔；磷酸鈣沈澱；使用DEAE-聚葡萄糖，接著使用聚乙二醇；直接音波加載；脂質體介導之轉染及受體介導之轉染；微彈轟擊；與碳化矽纖維一起進行攪拌；農桿菌(Agrobacterium )介導之轉化；乾化/抑制介導之DNA攝取；及此類方法之任何組合。經由應用諸如此等方法之技術，一或多種細胞器、一或多種細胞、一或多種組織或一或多種生物體可穩定或暫時地轉化。  G. 基因表現之修飾
在一些實施例中，經冷凍保存之本發明免疫細胞經修飾以具有某些基因(諸如糖皮質激素受體、TGFβ受體(例如TGFβ-RII)及/或CISH)之改變的表現。在一個實施例中，免疫細胞可經修飾以表現顯性陰性TGFβ受體II (TGFβRIIDN)，其可充當細胞介素接收槽(cytokine sink)以耗乏內源性TGFβ。
細胞介素信號傳導對於造血細胞之正常功能係至關重要的。蛋白之SOCS家族在細胞介素信號傳導之負調節中起重要作用，充當內源性制動因子(intrinsic brake)。CIS，一個由CISH基因編碼之蛋白質之SOCS家族成員，已鑑別為小鼠中NK細胞中之重要檢查點分子。因此，在一些實施例中，本發明係關於例如CISH在免疫細胞中之基因剔除以改良NK細胞及CD8+ T細胞之細胞毒性。此方法可單獨使用或與其他檢查點抑制劑組合使用以提高抗腫瘤活性。
在一些實施例中，改變之基因表現係藉由進行基因中之破壞實現，該破壞諸如基因剔除、插入、誤義或讀框轉移突變，諸如雙對偶基因讀框轉移突變、基因之全部或部分，例如一或多個外顯子或部分缺失，因此，及/或基因嵌入。舉例而言，經改變之基因表現可由序列特異性或靶向核酸酶實現，該等核酸酶包括結合DNA之靶向核酸酶，諸如鋅指核酸酶(ZFN)及轉錄活化因子樣效應核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)，及RNA引導之核酸酶，諸如CRISPR相關核酸酶(Cas)，特定設計以靶向基因或其部分之序列。
在一些實施例中，基因之表現、活性及/或功能之改變係藉由破壞基因來進行。在一些態樣中，基因經修飾以使得與在不存在基因修飾的情況下或在不存在引入以實現修飾之組分的情況下之表現相比，其表現降低至少或約20%、30%或40%，一般至少或約50%、60%、70%、80%、90%或95%。
在一些實施例中，改變為暫時或可逆的，使得基因之表現稍後恢復。在其他實施例中，改變並非可逆或暫時的，例如為永久的。
在一些實施例中，基因改變係藉由誘導基因中之一或多個雙股斷裂及/或一或多個單股斷裂來進行，通常以靶向方式進行。在一些實施例中，雙股或單股斷裂係藉由核酸酶(例如核酸內切酶，諸如靶向基因之核酸酶)進行。在一些態樣中，在基因之編碼區中，例如在外顯子中誘導斷裂。舉例而言，在一些實施例中，誘導發生在編碼區之N端部分附近，例如發生在第一外顯子中、第二外顯子中或後續外顯子中。
在一些態樣中，雙股或單股斷裂經由細胞修復過程，諸如藉由非同源末端接合(NHEJ)或同源定向修復(HDR)進行修復。在一些態樣中，修復過程易出錯且引起基因之破壞，諸如讀框轉移突變，例如雙對偶基因讀框轉移突變，其可引起基因之完全基因剔除。舉例而言，在一些態樣中，破壞包含誘發缺失、突變及/或插入。在一些實施例中，破壞使得存在早期終止密碼子。在一些態樣中，插入、缺失、移位、讀框轉移突變及/或過早終止密碼子之存在引起基因之表現、活性及/或功能之破壞。
在一些實施例中，使用反義技術達成基因改變，諸如藉由RNA干擾(RNAi)、短干擾RNA (siRNA)、短髮夾(shRNA)，及/或核糖核酸酶(ribozyme)用於選擇性抑制或壓制基因表現。siRNA技術為採用具有與自基因轉錄之mRNA之核苷酸序列同源之序列，及與核苷酸序列互補之序列的雙股RNA分子之RNAi。siRNA一般與自基因轉錄之mRNA之一個區域同源/互補，或可為包括複數個與不同區域同源/互補之RNA分子的siRNA。在一些態樣中，siRNA包含於多順反子構築體中。  1. ZFP及ZFN
在一些實施例中，靶向DNA之分子包括與效應蛋白(諸如核酸內切酶)融合之DNA結合蛋白，諸如一或多種鋅指蛋白(ZFP)或轉錄活化因子樣蛋白(TAL)。實例包括ZFN、TALE及TALEN。
在一些實施例中，靶向DNA之分子包含一或多種以序列特異性方式結合於DNA之鋅指蛋白(ZFP)或其域。ZFP或其域為經由一或多個鋅指以序列特異性方式結合DNA之蛋白質或較大蛋白質內之域，鋅指係指結構經由鋅離子之配位來穩定之結合域內之胺基酸序列區。術語鋅指DNA結合蛋白通常縮寫為鋅指蛋白或ZFP。ZFP當中有靶向特定DNA序列之人工ZFP域，其長度通常為9至18個核苷酸，由個別指之組裝產生。
ZFP包括其中單一指域長度為大約30個胺基酸，且含有含經由鋅與單一β轉角之兩個半胱胺酸配位之兩個不變組胺酸殘基的α螺旋，及具有兩個、三個、四個、五個或六個指的ZFP。一般而言，ZFP之序列特異性可藉由在鋅指識別螺旋上之四個螺旋位置(-1、2、3及6)處進行胺基酸取代而改變。因此，在一些實施例中，ZFP或含ZFP分子為非天然存在的，例如經工程改造以結合至所選目標位點。
在一些實施例中，靶向DNA之分子為或包含與DNA裂解域融合以形成鋅指核酸酶(ZFN)之鋅指DNA結合域。在一些實施例中，融合蛋白包含來自至少一種liS型限制酶之裂解域(或裂解半域)及一或多個鋅指結合域，其可或可不經工程改造。在一些實施例中，裂解域係來自liS型限制性核酸內切酶Fok I。Fok I一般在距一個股上其識別位點9個核苷酸處，及距另一股上其識別位點13個核苷酸處催化DNA之雙股裂解。
許多基因特異性經工程改造之鋅指為市售的。舉例而言，Sangamo Biosciences (Richmond, CA, USA)已與Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)合作研發出鋅指構築平台(CompoZr)，允許研究人員完全略過鋅指構築及驗證，且為數千種蛋白質提供特異性靶向之鋅指(Gaj等人，Trends in Biotechnology , 2013, 31(7), 397-405)。在一些實施例中，使用或定製設計市售之鋅指。(參見例如Sigma-Aldrich目錄號CSTZFND、CSTZFN、CTil-lKT及PZD0020)。  2. TAL、TALE及TALEN
在一些實施例中，靶向DNA之分子包含天然存在或經工程改造之(非天然存在之)轉錄活化因子樣蛋白(TAL) DNA結合域，諸如在轉錄活化因子樣蛋白效應(TALE)蛋白中，參見例如美國專利公開案第2011/0301073號，其以全文引用的方式併入本文中。
TALE DNA結合域或TALE為包含一或多個TALE重複域/單元之多肽。重複域涉及TALE與其同源目標DNA序列之結合。單一「重複單元」(亦稱為「重複序列」)之長度通常為33-35個胺基酸，且與天然存在之TALE蛋白內之其他TALE重複序列展現至少一些序列同源性。各TALE重複單元包括構成重複序列可變二殘基(RVD)之1或2個DNA結合殘基，通常在重複序列之位置12及/或13處。已確定此等TALE之DNA識別之天然(典型)碼，以使得位置12及13處之HD序列使得結合至胞嘧啶(C)，NG結合至T，NI結合至A，NN結合至G或A，且NO結合至T，且非典型(非常型) RVD亦為已知的。在一些實施例中，可藉由設計對目標DNA序列具有特異性之TAL陣列使TALE靶向任何基因。目標序列通常以胸苷開始。
在一些實施例中，分子為DNA結合核酸內切酶，諸如TALE核酸酶(TALEN)。在一些態樣中，TALEN為包含來源於TALE之DNA結合域及核酸酶催化域以裂解核酸目標序列的融合蛋白。
在一些實施例中，TALEN識別且裂解基因中之目標序列。在一些態樣中，DNA之裂解引起雙股斷裂。在一些態樣中，斷裂刺激同源重組或非同源末端接合(NHEJ)之速率。一般而言，NHEJ為不完美的修復方法，其通常使得DNA序列在裂解位點變化。在一些態樣中，修復機制涉及經由直接重新接合或經由所謂的微小同源性介導之末端接合重新接合兩個DNA末端之剩餘部分。在一些實施例中，經由NHEJ修復得到較小插入或缺失且可用於破壞且從而抑制基因。在一些實施例中，修飾可為至少一個核苷酸之取代、缺失或添加。在一些態樣中，已發生裂解誘導之突變誘發事件，亦即與NHEJ事件相連續之突變誘發事件的細胞可藉由此項技術中熟知之方法鑑別及/或選擇。
在一些實施例中，TALE重複序列經組裝以特異性靶向基因。(Gaj等人，2013)。已構築靶向18,740種編碼人類蛋白之基因之TALEN的庫(Kim等人，2013)。定製設計之TALE陣列可經由Cellectis Bioresearch (Paris, France)、Transposagen Biopharmaceuticals (Lexington, KY, USA)及Life Technologies (Grand Island, NY, USA)購得。特定言之，靶向CD38之TALEN為市售的(參見Gencopoeia，目錄號HTN222870-l、HTN222870-2及HTN222870-3)。例示性分子描述於例如美國專利公開案第US 2014/0120622號及第2013/0315884號中。
在一些實施例中，以由一或多種質體載體編碼之反式基因形式引入TALEN。在一些態樣中，質體載體可含有選擇標記物，其提供接受該載體之細胞之鑑別及/或選擇。  3. RGEN (CRISPR/Cas系統)
在一些實施例中，改變使用一或多種DNA結合核酸進行，諸如經由RNA引導之核酸內切酶(RGEN)之改變。舉例而言，改變可使用成簇規律間隔短回文重複序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR)及CRISPR相關(Cas)蛋白質進行。一般而言，「CRISPR系統」係共同地指涉及CRISPR相關(「Cas」)基因之表現或引導其活性的轉錄物及其他元件，包括編碼Cas基因之序列、反向活化CRISPR (tracr)序列(例如tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr配對序列(在內源性CRISPR系統之情形下涵蓋「直接重複序列」及經tracrRNA處理之部分直接重複序列)、引導序列(在內源性CRISPR系統之情形下亦稱為「間隔子」)，及/或來自CRISPR基因座之其他序列及轉錄物。
CRISPR/Cas核酸酶或CRISPR/Cas核酸酶系統可包括非編碼RNA分子(引導) RNA，其序列特異性地結合於DNA；及具有核酸酶官能基(例如兩個核酸酶域)之Cas蛋白質(例如Cas9)。CRISPR系統之一或多個元件可來源於I型、II型或III型CRISPR系統，例如來源於包含內源性CRISPR系統之特定生物體，諸如化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)。
在一些態樣中，將Cas核酸酶及gRNA (包括對目標序列具有特異性之crRNA及固定tracrRNA (fixed tracrRNA)之融合物)引入細胞中。一般而言，gRNA之5'端處之目標位點使用互補鹼基配對將Cas核酸酶靶向至目標位點，例如基因。可基於其緊接在前間隔子鄰近模體(PAM)序列(諸如通常為NGG或NAG)之5'端之位置選擇目標位點。在此態樣中，藉由修飾引導RNA之前20、19、18、17、16、15、14、14、12、11或10個核苷酸以對應於目標DNA序列而將gRNA靶向至所要序列。一般而言，CRISPR系統之特徵在於促進在目標序列位點形成CRISPR複合物之元件。通常，「目標序列」一般係指引導序列設計成與其具有互補性之序列，其中目標序列與引導序列之間的雜交促進CRISPR複合物之形成。未必需要完全互補性，其限制條件為存在足夠的互補性以引起雜交且促進形成CRISPR複合物。
CRISPR系統可在目標位點處誘導雙股斷裂(DSB)，繼之以如本文所論述之破壞或改變。在其他實施例中，稱作「切口酶」之Cas9變異體用於在目標位點處對單股進行切口。可使用成對之切口酶，例如以提高特異性，其各自由一對不同gRNA靶向序列引導，以使得在同時引入切口時，引入5'懸垂物。在其他實施例中，催化非活性Cas9融合至異源效應子域，諸如轉錄抑制因子或活化因子，以影響基因表現。
目標序列可包含任何聚核苷酸，諸如DNA或RNA聚核苷酸。目標序列可位於細胞之細胞核或細胞質中，諸如位於細胞之細胞器內。一般而言，可用於重組至包含目標序列之所靶向基因座中之序列或模板稱為「編輯模板」或「編輯聚核苷酸」或「編輯序列」。在一些態樣中，外源性模板聚核苷酸可稱為編輯模板。在一些態樣中，重組為同源重組。
通常，在內源性CRISPR系統之情形下，形成CRISPR複合物(包含與目標序列雜交且與一或多種Cas蛋白質複合之引導序列)使得在目標序列中或附近(例如距1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或更多個鹼基對內)的一個或兩個股裂解。可包含野生型tracr序列之全部或一部分(例如約或超過約20、26、32、45、48、54、63、67、85或更多個野生型tracr序列之核苷酸)或由其組成的tracr序列亦可形成CRISPR複合物之一部分，諸如藉由沿著tracr序列之至少一部分與可操作地連接於引導序列之tracr配對序列之全部或一部分雜交。tracr序列與tracr配對序列具有足夠互補性以雜交且參與CRISPR複合物之形成，諸如當最佳比對時，沿著tracr配對序列長度至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%的序列互補性。
可將驅動CRISPR系統之一或多個元件之表現的一或多個載體引入至細胞中，使得CRISPR系統之元件之表現引導在一或多個目標位點處形成CRISPR複合物。組件亦可作為蛋白質及/或RNA遞送至細胞。舉例而言，Cas酶、連接於tracr配對序列之引導序列及tracr序列可各自可操作地連接於獨立載體上之獨立調節元件。或者，由相同或不同調節元件所表現之元件中之兩者或更多者可組合於單一載體中，並且一或多個額外載體提供不包括於第一載體中之CRISPR系統的任何組件。載體可包含一或多個插入位點，諸如限制性核酸內切酶識別序列(亦稱為「選殖位點」)。在一些實施例中，一或多個插入位點位於一或多個載體之一或多個序列元件上游及/或下游。當使用多個不同引導序列時，可使用單個表現構築體將CRISPR活性靶向至細胞內之多個不同對應目標序列。
載體可包含可操作地連接於編碼CRISPR酶，諸如Cas蛋白質之酶編碼序列的調節元件。Cas蛋白質之非限制性實例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9 (亦稱為Csn1及Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4，其同系物或其經修飾型式。此等酶為已知的；舉例而言，化膿性鏈球菌Cas9蛋白質之胺基酸序列可以寄存編號Q99ZW2見於SwissProt資料庫中。
CRISPR酶可為Cas9 (例如來自化膿性鏈球菌或肺炎鏈球菌)。CRISPR酶可在目標序列之位置，諸如在目標序列內及/或在目標序列之互補序列內引導一個或兩個股之裂解。載體可編碼相對於相應野生型酶突變之CRISPR酶，該突變使得突變CRISPR酶不具有裂解含有目標序列之目標聚核苷酸的一個或兩個股的能力。舉例而言，來自化膿性鏈球菌之Cas9之RuvC I催化域中之天冬胺酸至丙胺酸取代(D10A)將Cas9自裂解兩股之核酸酶轉化為切口酶(裂解單股)。在一些實施例中，Cas9切口酶可與一或多個引導序列(例如兩個引導序列，其分別靶向DNA目標之有義股及反義股)組合使用。此組合允許兩股被切口且用於誘導NHEJ或HDR。
在一些實施例中，編碼CRISPR酶之酶編碼序列針對特定細胞，諸如真核細胞中之表現進行密碼子最佳化。真核細胞可為特定生物體之真核細胞或來源於特定生物體，諸如哺乳動物，包括但不限於人類、小鼠、大鼠、兔、犬、綿羊或非人類靈長類動物。一般而言，密碼子最佳化係指一種修飾核酸序列以增強在相關宿主細胞中之表現的過程，其係藉由用更常或最常用於該宿主細胞之基因中之密碼子置換原生序列之至少一個密碼子，同時維持原生胺基酸序列。各種物種對特定胺基酸之某些密碼子展現出特定傾向。密碼子傾向(生物體之間在密碼子使用方面之差異)通常與信使RNA (mRNA)之轉譯效率相關，其繼而咸信尤其取決於所轉譯之密碼子之特性及特定轉移RNA (tRNA)分子之可用性。所選tRNA在細胞中佔優勢一般為肽合成中最常使用的密碼子的反映。因此，為了既定生物體中的最佳基因表現，可基於密碼子最佳化調整基因。
一般而言，引導序列是與目標聚核苷酸序列具有足夠互補性以與目標序列雜交且引導CRISPR複合物與目標序列的序列特異性結合之任何聚核苷酸序列。在一些實施例中，當使用適合比對演算法最佳比對時，引導序列與其相應目標序列之間的互補程度為約或大於約50%、60%、75%、80%、85%、90%、95%、97.5%、99%或更高。
NR3CS (糖皮質激素受體)之例示性gRNA序列包括Ex3 NR3C1 sG1 5-TGC TGT TGA GGA GCT GGA-3 (SEQ ID NO:1)及Ex3 NR3C1 sG2 5-AGC ACA CCA GGC AGA GTT-3 (SEQ ID NO:2)。TGF-β受體2之例示性gRNA序列包括EX3 TGFBR2 sG1 5-CGG CTG AGG AGC GGA AGA-3 (SEQ ID NO:3)及EX3 TGFBR2 sG2 5-TGG-AGG-TGA-GCA-ATC-CCC-3 (SEQ ID NO:4)。T7啟動子、目標序列及重疊序列可具有序列TTAATACGACTCACTATAGG (SEQ ID NO:5)+目標序列+gttttagagctagaaatagc (SEQ ID NO:6)。
最佳比對可藉由使用任何適用於比對序列之演算法來測定，其非限制性實例包括史密斯-沃特曼演算法(Smith-Waterman algorithm)、尼德曼-翁施演算法(Needleman-Wunsch algorithm)、基於巴羅斯-惠勒變換(Burrows-Wheeler Transform)之演算法(例如巴羅斯惠勒比對器)、Clustal W、Clustal X、BLAT、Novoalign (Novocraft Technologies, ELAND (Illumina, San Diego, Calif.)、SOAP (可於soap.genomics.org.cn獲得)及Maq (可於maq.sourceforge.net獲得)。
CRISPR酶可為包含一或多個異源蛋白域之融合蛋白質之一部分。CRISPR酶融合蛋白可包含任何額外蛋白質序列，且視情況包含在任何兩個域之間的連接序列。可融合至CRISPR酶之蛋白域之實例包括但不限於抗原決定基標籤、報導基因序列及具有以下活性中之一或多者的蛋白域：甲基化酶活性、去甲基酶活性、轉錄活化活性、轉錄抑制活性、轉錄釋放因子活性、組蛋白修飾活性、RNA裂解活性及核酸結合活性。抗原決定基標籤之非限制性實例包括組胺酸(His)標籤、V5標籤、FLAG標籤、流感血球凝集素(HA)標籤、Myc標籤、VSV-G標籤及硫化還原蛋白(thioredoxin，Trx)標籤。報導基因之實例包括但不限於麩胱甘肽-5-轉移酶(GST)、辣根過氧化酶(HRP)、氯黴素乙醯基轉移酶(CAT) β半乳糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、螢光素酶、綠色螢光蛋白(GFP)、HcRed、DsRed、強化型藍螢光蛋白質(CFP)、黃色螢光蛋白(YFP)及包括藍色螢光蛋白(BFP)之自發螢光蛋白。CRISPR酶可融合至編碼結合DNA分子或結合其他細胞分子之蛋白質或蛋白質片段的基因序列，該蛋白質包括但不限於麥芽糖結合蛋白(MBP)、S-標籤、Lex A DNA結合域(DBD)融合物、GAL4A DNA結合域融合物及單純疱疹病毒(HSV) BP16蛋白質融合物。可以形成包含CRISPR酶之融合蛋白之一部分的額外域描述於以引用的方式併入本文中之US 20110059502中。  IV. 治療方法
在一些實施例中，本發明提供用於免疫療法之方法，其包含在解凍後投與有效量之本發明之冷凍保存細胞。在一個實施例中，醫學疾病或病症藉由轉移先前冷凍保存之細胞群體，諸如引發免疫反應之NK細胞群體來治療。在向個體投與細胞之前，可或可不洗滌解凍後的細胞以移除實質上所有冷凍保存培養基。解凍後之細胞可在無洗滌及輸注之情況下稀釋。細胞可在解凍後實質上立即遞送至個體，或在遞送之前可延遲約1至24小時或1天或更多天，例如包括在輸注之前洗滌細胞之情況下。遞送可藉由任何途徑且可視所治療之醫學病狀而定。遞送可為局部或全身性遞送。關於所遞送劑量之細胞之輸注體積，輸注體積可或可不取決於個體是否已接受一定劑量之細胞。舉例而言，細胞之第一劑量之體積可以大於或可以不大於後續劑量。多個輸注體積可具有相同體積。在一些實施例中，細胞之輸注體積為1、5、10、15、20、30、40、50、60、70、75、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275或300 mL或更大。其中懸浮細胞以用於輸注之液體可為任何種類。在特定實施例中，液體為PLASMA-LYTE A或類似溶液。其中懸浮細胞以用於輸注之液體可包含或可不包含例如人類血清白蛋白。白蛋白為亦可用作非血清替代物之冷凍保護劑，因此其具有雙重作用。在遞送至有需要之個體之前，可測試解凍細胞之一或多個特徵，諸如微生物之存在，例如由污染產生的微生物之存在；存活率；細胞計數等。在特定實施例中，用於輸注之細胞包含於包含一或多種除細胞本身外之其他治療劑之溶液中。
在本發明之某些實施例中，癌症或感染藉由轉移引發免疫反應的冷凍保存且解凍之群體，諸如NK細胞群體來治療。本文提供用於治療個體之癌症或延緩其進展之方法，其包含向個體投與有效量之抗原特異性細胞療法。本發明方法可應用於治療免疫病症、實體癌症、血液癌症、病毒感染，及應用於再生醫學。
本發明之治療方法適用之腫瘤包括任何惡性細胞類型，諸如發現於實體腫瘤或血液腫瘤中之彼等惡性細胞類型。例示性實體腫瘤可包括但不限於選自由以下組成之群之器官的腫瘤：胰臟、結腸、盲腸、胃、腦、頭、頸、卵巢、腎、喉、肉瘤、肺、膀胱、黑素瘤、前列腺及乳房。例示性血液腫瘤包括骨髓腫瘤、T細胞或B細胞惡性腫瘤、白血病、淋巴瘤、母細胞瘤、骨髓瘤及其類似物。可使用本文所提供之方法治療之癌症之另外實例包括但不限於肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及肺鱗狀癌)、腹膜癌、胃癌(gastric/stomach cancer)(包括胃腸癌及胃腸基質癌)、胰臟癌、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、大腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌(kidney/renal cancer)、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、各種類型之頭頸癌及黑素瘤。
癌症可特定為以下組織學類型，儘管其不限於此等：惡性贅瘤；癌瘤；未分化癌瘤；巨細胞及梭狀細胞癌；小細胞癌；乳頭狀癌；鱗狀細胞癌；淋巴上皮癌；基底細胞癌；毛母質癌；移行細胞癌；乳頭狀移行細胞癌；腺癌；惡性胃泌素瘤；膽管癌；肝細胞癌；組合之肝細胞癌及膽管癌；小樑腺癌；腺樣囊性癌症；腺瘤息肉中之腺癌；家族性結腸息肉腺癌；實體癌瘤；惡性類癌；細支氣管肺泡腺癌；乳頭狀腺癌；嫌色細胞癌；嗜酸性癌；嗜氧性腺癌；嗜鹼性癌瘤；透明細胞腺癌；粒狀細胞癌；濾泡腺癌；乳頭狀及濾泡腺癌；無包膜硬化性癌瘤；腎上腺皮質癌；子宮內膜樣癌；皮膚附屬器癌；頂泌腺癌；皮脂腺癌；耵聹腺癌；黏液表皮樣癌瘤；囊腺癌；乳頭狀囊腺癌；乳頭狀漿液性囊腺癌；黏液性囊腺癌；黏液性腺癌；戒環細胞癌；浸潤性導管癌；髓樣癌；小葉癌；炎性癌；乳房佩吉特氏病(paget's disease, mammary)；腺泡細胞癌；腺鱗癌；腺癌伴鱗狀化生；惡性胸腺瘤；惡性卵巢基質腫瘤；惡性泡膜細胞瘤；惡性粒層細胞瘤；惡性睾丸母細胞瘤；塞特利細胞癌(sertoli cell carcinoma)；惡性雷迪格細胞瘤(leydig cell tumor, malignant)；惡性脂質細胞瘤；惡性副神經節瘤；惡性乳房外副神經節瘤；嗜鉻細胞瘤；血管球肉瘤；惡性黑素瘤；無黑色素性黑素瘤；淺表擴散性黑素瘤；雀斑惡性黑素瘤；肢端雀斑狀黑素瘤；結節性黑素瘤；巨大色素痣內惡性黑素瘤；上皮狀細胞黑素瘤；惡性藍痣；肉瘤；纖維肉瘤；惡性纖維性組織細胞瘤；黏液肉瘤；脂肉瘤；平滑肌肉瘤；橫紋肌肉瘤；胚胎性橫紋肌肉瘤；肺泡橫紋肌肉瘤；基質肉瘤；惡性混合瘤；苗勒混合瘤(mullerian mixed tumor)；腎母細胞瘤；肝母細胞瘤；癌肉瘤；惡性間質瘤；惡性布倫納瘤(brenner tumor, malignant)；惡性葉狀腫瘤；滑膜肉瘤；惡性間皮瘤；無性細胞瘤；胚胎性癌；惡性畸胎瘤；惡性卵巢甲狀腺瘤；絨毛膜癌；惡性中腎瘤；血管肉瘤；惡性血管內皮瘤；卡波西氏肉瘤(kaposi's sarcoma)；惡性血管外皮瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮質旁骨肉瘤；軟骨肉瘤；惡性軟骨母細胞瘤；間葉軟骨肉瘤；骨巨細胞瘤；尤文氏肉瘤(ewing's sarcoma)；惡性牙源性腫瘤；成釉細胞牙肉瘤；惡性成釉細胞瘤；成釉細胞纖維肉瘤；惡性松果體瘤；脊索瘤；惡性神經膠質瘤；室管膜瘤；星形細胞瘤；原生質星形細胞瘤；纖維型星形細胞瘤；星形母細胞瘤；神經膠母細胞瘤；少突神經膠質瘤；成少突神經膠質細胞瘤；原始神經外胚層；小腦肉瘤；成神經節細胞瘤；成神經細胞瘤；視網膜母細胞瘤；嗅覺神經性腫瘤；惡性腦膜瘤；神經纖維肉瘤；惡性神經鞘瘤；惡性粒狀細胞瘤；惡性淋巴瘤；霍奇金氏病(hodgkin's disease)；霍奇金氏；類肉芽腫；小淋巴球性惡性淋巴瘤；大細胞瀰漫性惡性淋巴瘤；濾泡性惡性淋巴瘤；蕈樣黴菌病；其他指定非霍奇金氏淋巴瘤；B細胞淋巴瘤；低級/濾泡性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴球性(SL) NHL；中級/濾泡性NHL；中級瀰漫性NHL；高級免疫母細胞性NHL；高級淋巴母細胞性NHL；高級小非裂解細胞NHL；巨瘤症(bulky disease) NHL；套細胞淋巴瘤；AIDS相關淋巴瘤；瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)；惡性組織細胞增多病；多發性骨髓瘤；肥大細胞肉瘤；免疫增殖性小腸疾病；白血病；淋巴白血病；漿細胞白血病；紅白血病；淋巴肉瘤細胞白血病；骨髓白血病；嗜鹼性白血病；嗜伊紅血球白血病；單核球性白血病；肥大細胞白血病；巨核母細胞白血病；骨髓肉瘤；毛細胞白血病；慢性淋巴球性白血病(CLL)；急性淋巴母細胞白血病(ALL)；急性骨髓性白血病(AML)；及慢性骨髓母細胞白血病。
特定實施例係關於白血病之治療方法。白血病為血液癌症或骨髓癌症，且特徵在於血球，通常白血球，但可涉及紅血球(紅白血病)之異常增殖(倍增產生)。其為稱為血液贅瘤之廣泛疾病群的一部分。白血病為廣義術語，涵蓋一系列疾病。白血病在臨床上及病理上分成急性及慢性形式。
在本發明之某些實施例中，免疫細胞遞送至有需要之個體，諸如患有癌症或感染之個體。隨後，該等細胞增強個體之免疫系統以攻擊各別癌細胞或病理細胞。在一些情況下，向個體提供一或多劑量之免疫細胞。在向個體提供兩或更多劑量之免疫細胞的情況下，投藥之間的期間應足以允許在個體中傳播之時間，且在特定實施例中，劑量之間的期間為1、2、3、4、5、6、7天或更多天。
本發明之某些實施例提供治療或預防免疫介導之病症之方法。在一個實施例中，個體患有自體免疫疾病。自體免疫疾病之非限制性實例包括：斑禿、僵直性脊椎炎、抗磷脂症候群、自體免疫性艾迪森氏病(autoimmune Addison's disease)、腎上腺之自體免疫疾病、自體免疫性溶血性貧血、自體免疫性肝炎、自體免疫性卵巢炎及睾丸炎、自體免疫性血小板減少症、白塞氏病(Behcet's disease)、大皰性類天疱瘡、心肌病、口炎性腹瀉-皮炎(celiac spate-dermatitis)、慢性疲勞免疫功能障礙症候群(CFIDS)、慢性發炎性脫髓鞘性多發性神經病變、查格-施特勞斯氏症候群(Churg-Strauss syndrome)、瘢痕性類天疱瘡、CREST症候群、冷凝集素病、克隆氏病(Crohn's disease)、盤狀狼瘡、自發性混合型冷凝球蛋白血症、纖維肌痛-纖維肌炎、絲球體腎炎、格雷夫氏病(Graves' disease)、格林-巴利(Guillain-Barre)、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、特發性肺部纖維化、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、IgA神經病變、幼年期關節炎、扁平苔癬、紅斑狼瘡(lupus erthematosus)、梅尼爾氏病(Meniere's disease)、混合性結締組織病、多發性硬化症、1型或免疫介導糖尿病、重症肌無力、腎病症候群(諸如微小病變疾病、局灶性腎小球硬化或膜性腎病)、尋常天疱瘡、惡性貧血、結節性多動脈炎、多軟骨炎、多腺症候群、風濕性多肌痛、多發性肌炎及皮肌炎、原發性無γ球蛋白血症、原發性膽汁性肝硬化、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、雷諾氏現象(Raynaud's phenomenon)、萊特氏症候群(Reiter's syndrome)、類風濕性關節炎、類肉瘤病、硬皮病、休格連氏症候群(Sjogren's syndrome)、僵人症候群、全身性紅斑性狼瘡症、紅斑狼瘡(lupus erythematosus)、潰瘍性結腸炎、葡萄膜炎、血管炎(諸如結節性多動脈炎、高安氏動脈炎(takayasu arteritis)、顳動脈炎/巨細胞動脈炎，或疱疹樣皮炎血管炎)、白斑病，及韋格納氏肉芽腫病(Wegener's granulomatosis)。因此，可使用本文所揭示之方法治療之自體免疫疾病之一些實例包括(但不限於)多發性硬化症、類風濕性關節炎、全身性紅斑狼瘡、I型糖尿病、克隆氏病；潰瘍性結腸炎、重症肌無力、絲球體腎炎、僵直性脊椎炎、血管炎或牛皮癬。個體亦可患有過敏性病症，諸如哮喘。
在又一實施例中，個體為移植器官或幹細胞之接受者且免疫細胞用於預防及/或治療排斥反應。在特定實施例中，個體患有移植物抗宿主疾病或處於罹患移植物抗宿主疾病之風險下。GVHD為使用或含有來自相關或無關供體之幹細胞之任何移植體的可能併發症。存在兩種類型之GVHD，急性及慢性GVHD。急性GVHD在移植後前三個月內出現。急性GVHD之病症包括最初涉及很小身體區域(胸部、背部、手臂、腿)之微紅皮疹，其可擴散且變得更為嚴重，涵蓋身體之＞80%，伴以脫皮或皮膚起泡。急性GVHD亦可影響胃腸(GI)道，在此情況下存在噁心及嘔吐(上GI GVHD)及/或腹部痙攣及腹瀉(下GI GVHD)。皮膚及眼睛發黃(黃疸)指示急性GVHD已影響肝臟。慢性GVHD係基於其嚴重程度分級：階段/級別1為輕度；階段/級別4為重度。慢性GVHD在移植之後三個月或更晚產生。慢性GVHD之症狀與急性GVHD之症狀類似，但此外慢性GVHD亦可影響眼睛中之黏液腺、口腔中之唾液腺及潤滑胃黏膜及腸之腺體。可利用本文揭示之免疫細胞群體中之任一者。移植器官之實例包括實體器官移植體，諸如腎、肝、皮膚、胰臟、肺及/或心，或細胞移植體，諸如胰島、肝細胞、肌母細胞、骨髓或造血或其他幹細胞。移植體可為複合移植體，諸如面部組織。免疫細胞可在移植之前、與移植同時或在移植之後投與。在一些實施例中，免疫細胞在移植體之前投與，諸如在移植體之前至少1小時、至少12小時、至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少1週、至少2週、至少3週、至少4週或至少1個月。在一個特定非限制性實例中，治療有效量之免疫細胞之投與在移植之前3至5天發生。
在一些實施例中，可在免疫細胞療法之前向個體投與非清髓性淋巴球耗乏化學療法。非清髓性淋巴球耗乏化學療法可為任何適合之此類療法，其可藉由任何適合之途徑投與。非清髓性淋巴球耗乏化學療法可包含例如投與環磷醯胺及氟達拉賓(fludarabine)，尤其在癌症係可為轉移性之黑素瘤之情況下。投與環磷醯胺及氟達拉賓之例示性途徑係靜脈內投與。同樣地，可投與任何適合劑量之環磷醯胺及氟達拉賓，且其為在投與CAR-T細胞或CAR-NK細胞之前作為淋巴球耗乏化學療法的最常見方案。在特定態樣中，持續兩天投與約60 mg/kg環磷醯胺，其後持續五天投與約25 mg/m2 氟達拉賓。
在某些實施例中，與免疫細胞同時或在免疫細胞之後向個體投與促進免疫細胞生長及活化之生長因子。免疫細胞生長因子可為促進免疫細胞生長及活化之任何適合之生長因子。適合之免疫細胞生長因子之實例包括介白素(IL)-2、IL-7、IL-15及IL-12，其可單獨或以各種組合使用，該等組合諸如IL-2及IL-7，IL-2及IL-15，IL-7及IL-15，IL-2、IL-7及IL-15，IL-12及IL-7，IL-12及IL-15，或IL-12及IL2。
治療有效劑量之免疫細胞可藉由多種途徑投與，包括非經腸投與，例如靜脈內、腹膜內、肌肉內、胸骨內或關節內注射或輸注。
用於過繼細胞療法之免疫細胞的治療有效劑量為在所治療之個體中達成所要作用的量。舉例而言，此可為抑制自體免疫或同種免疫疾病之進展，或使其消退必需之免疫細胞之劑量，或其能夠緩解由自體免疫疾病引起之症狀，諸如疼痛及發炎。其可為緩解與發炎相關之症狀，諸如疼痛、水腫及體溫升高必需之量。其亦可為減輕或預防移植器官之排斥反應必需之量。
免疫細胞群體可以符合疾病之治療方案投與，例如經一天至若干天之單一劑量或若干劑量以改善疾病狀態，或經延長時間之週期性劑量以抑制疾病進展及預防疾病復發。待用於調配物中之精確劑量亦將視投藥途徑及疾病或病症之嚴重性而定，且應根據醫師之判斷及各患者之情況來決定。免疫細胞之治療有效劑量將視所治療之個體、病痛之嚴重程度及類型以及投與方式而定。在一些實施例中，可用於治療人類個體之劑量在至少3.8×104 、至少3.8×105 、至少3.8×106 、至少3.8×107 、至少3.8×108 、至少3.8×109 或至少3.8×1010 個免疫細胞/m2 之範圍內。在某一實施例中，用於治療人類個體之劑量在約3.8×109 至約3.8×1010 個免疫細胞/m2 範圍內。在額外實施例中，免疫細胞之治療有效量可在每公斤體重約5×106 個細胞至每公斤體重約7.5×108 個細胞之範圍內變化，諸如每公斤體重約2×107 個細胞至約5×108 個細胞，或每公斤體重約5×107 個細胞至約2×108 個細胞。熟習此項技術者基於個體之年齡、重量、性別及生理條件容易地確定免疫細胞之精確量。有效劑量可自來源於活體外或動物模型測試系統之劑量反應曲線外推得到。
免疫細胞可與一或多種其他治療劑組合投與以治療免疫介導之病症。組合療法可包括但不限於一或多種抗微生物劑(例如抗生素、抗病毒劑及抗真菌劑)、抗腫瘤劑(例如氟尿嘧啶、甲胺喋呤、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、氟達拉賓、依託泊苷(etoposide)、小紅莓(doxorubicin)或長春新鹼(vincristine))、免疫耗乏劑(例如氟達拉賓、依託泊苷、小紅莓或長春新鹼)、免疫抑制劑(例如硫唑嘌呤或糖皮質激素，諸如地塞米松(dexamethasone)或潑尼松(prednisone))、消炎劑(例如糖皮質激素，諸如氫皮質酮、地塞米松或潑尼松，或非類固醇消炎劑，諸如乙醯水楊酸、布洛芬(ibuprofen)或萘普生鈉(naproxen sodium))、細胞介素(例如介白素-10或轉化生長因子-β)、激素(例如雌激素)或疫苗。另外，可投與免疫抑制劑或耐受劑，包括但不限於鈣調神經磷酸酶抑制劑(例如環孢素及他克莫司(tacrolimus))；mTOR抑制劑(例如雷帕黴素(Rapamycin))；黴酚酸嗎啉乙酯，抗體(例如識別CD3、CD4、CD40、CD154、CD45、IVIG或B細胞)；化學治療劑(例如甲胺喋呤、曲奧舒凡(Treosulfan)、白消安(Busulfan))；照射；或趨化因子、介白素或其抑制劑(例如BAFF、IL-2、抗IL-2R、IL-4、JAK激酶抑制劑)。此類額外醫藥試劑可取決於所要作用而在投與免疫細胞之前、期間或之後投與。細胞及試劑之此投與可藉由相同途徑或藉由不同途徑，且在相同部位或在不同部位進行。  V. 醫藥組合物
本文亦提供包含經受冷凍保存之細胞，諸如免疫細胞(例如，T細胞或NK細胞)及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物及調配物。
如本文所述之醫藥組合物及調配物可藉由混合具有所要純度之活性成分(諸如細胞)與一或多種視情況選用之醫藥學上可接受之載劑(雷明頓氏醫藥科學(Remington's Pharmaceutical Sciences)第22版，2012)，以凍乾調配物或水性溶液形式來製備。醫藥學上可接受之載劑在所採用之劑量及濃度下一般對接受者無毒性，且包括但不限於：緩衝劑，諸如磷酸酯、檸檬酸酯及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基苯甲基氯化銨；氯化六羥季銨；苯紮氯銨；苄索氯銨；丁基苯酚或苄醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽抗衡離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子界面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。本文中之例示性醫藥學上可接受之載劑進一步包括間質藥物分散劑，諸如可溶性中性活性玻尿酸酶醣蛋白(sHASEGP)，例如人類可溶性PH-20玻尿酸酶醣蛋白，諸如rHuPH20 (HYLENEX® ，Baxter International公司)。某些例示性sHASEGP (包括rHuPH20)及使用方法描述於美國專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號中。在一個態樣中，sHASEGP與一或多種額外的葡萄糖胺聚糖酶，諸如軟骨素酶組合。  VI. 組合療法
在某些實施例中，本發明實施例之組合物及方法涉及先前冷凍保存之細胞群體與至少一種額外療法的組合。額外療法可為放射療法、手術(例如乳房腫瘤切除術及乳房切除術)、化學療法、基因療法、DNA療法、病毒療法、RNA療法、免疫療法、骨髓移植、奈米療法、單株抗體療法或前述療法之組合。額外療法可呈佐劑或新輔助療法形式。
在一些實施例中，額外療法為投與小分子酶抑制劑或抗轉移劑。在一些實施例中，額外療法為投與副作用限制劑(例如意欲減少治療副作用之出現及/或嚴重程度的試劑，諸如抗噁心劑等)。在一些實施例中，額外療法為放射療法。在一些實施例中，額外療法為手術。在一些實施例中，額外療法為放射療法與手術之組合。在一些實施例中，額外療法為γ照射。在一些實施例中，額外療法為靶向PBK/AKT/mTOR路徑之療法、HSP90抑制劑、微管蛋白抑制劑、細胞凋亡抑制劑及/或化學預防劑。額外療法可為此項技術中已知之化學治療劑中之一或多者。
免疫細胞療法可在相對於額外癌症療法，諸如免疫檢查點療法之前、期間、之後或以各種組合投與。投藥可以在同時至數分鐘至數天至數週範圍內之時間間隔進行。在其中免疫細胞療法與額外治療劑分開地提供給患者之實施例中，一般將確保在各遞送時間之間不經歷很長時間，使得兩種化合物將仍能夠對患者發揮有利的組合作用。在此類情況下，經考慮，可在距彼此約12小時至24小時或72小時內(且更特定言之，在距彼此約6小時至12小時內)向患者提供抗體療法及抗癌療法。在一些情況下，可能需要顯著地延長治療時間段，其中在各別投藥之間會流逝若干天(2、3、4、5、6或7)至若干週(1、2、3、4、5、6、7或8)。
可使用各種組合。在下文實例中，免疫細胞療法為「A」且抗癌療法為「B」： A/B/A   B/A/B   B/B/A   A/A/B   A/B/B   B/A/A   A/B/B/B   B/A/B/B B/B/B/A   B/B/A/B   A/A/B/B   A/B/A/B   A/B/B/A   B/B/A/A B/A/B/A   B/A/A/B   A/A/A/B   B/A/A/A   A/B/A/A   A/A/B/A
考慮到試劑之毒性(若存在)，向患者投與本發明實施例之任何化合物或療法將遵循用於投與此類化合物之一般方案。因此，在一些實施例中，存在監測可歸因於組合療法之毒性的步驟。 A. 化學療法
可根據本發明實施例使用廣泛多種化學治療劑。術語「化學療法」係指使用藥物治療癌症。「化學治療劑」用於意味在癌症治療中投與之化合物或組合物。此等試劑或藥物藉由其在細胞內之活性模式分類，例如其是否且在哪一階段影響細胞週期。或者，試劑可基於其直接交聯DNA、插入DNA中或藉由影響核酸合成來誘導染色體及有絲分裂失常之能力表徵。
化學治療劑之實例包括烷基化劑，諸如噻替派及環磷醯胺；磺酸烷基酯，諸如白消安、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，諸如苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)及尤利多巴(uredopa)；乙烯亞胺及甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三伸乙基蜜胺、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫代磷醯胺及三甲密胺；多聚乙醯(尤其布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone))；喜樹鹼(camptothecin) (包括合成類似物拓朴替康(topotecan))；苔蘚抑素；卡利他汀(callystatin)；CC-1065 (包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)及比折來新(bizelesin)合成類似物)；念珠藻環肽(特定言之念珠藻環肽1及念珠藻環肽8)；海兔毒素(dolastatin)；倍癌黴素(duocarmycin) (包括合成類似物KW-2189及CB1-TM1)；軟珊瑚醇(eleutherobin)；水鬼蕉鹼(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海綿抑制素(spongistatin)；氮芥，諸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷醯胺、雌氮芥、異環磷醯胺、二氯甲基二乙胺、氧化二氯甲基二乙胺鹽酸鹽、美法侖、新氮芥、膽甾醇對苯乙酸氮芥(phenesterine)、潑尼氮芥(prednimustine)、曲洛磷胺(trofosfamide)及尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亞硝基脲，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，諸如烯二炔抗生素(例如卡奇黴素(calicheamicin)，尤其卡奇黴素γlI及卡奇黴素ωI1)；達內黴素(dynemicin)，包括達內黴素A；雙膦酸鹽，諸如氯屈膦酸鹽(clodronate)；埃斯培拉黴素(esperamicin)；以及新抑癌蛋白發色團(neocarzinostatin chromophore)及相關色蛋白烯二炔抗生素發色團)、阿克拉黴素(aclacinomysin)、放線菌素(actinomycin)、奧納黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸、博來黴素(bleomycin)、放線菌素C、卡柔比星(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycinis)、更生黴素(dactinomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、小紅莓(包括N-嗎啉基-小紅莓、氰基-N-嗎啉基-小紅莓、2-吡咯啉基-小紅莓及去氧小紅莓)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、艾達黴素(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(諸如絲裂黴素C)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycins)、培洛黴素(peplomycin)、潑非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素、奎那黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素、鏈脲菌素、殺結核菌素、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)及左柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如甲胺喋呤及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如迪諾特寧(denopterin)、蝶羅呤(pteropterin)及曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉賓、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)及硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、雙去氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱(enocitabine)及氟尿苷；雄激素(androgen)，諸如卡魯睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)及睾內酯(testolactone)；抗腎上腺藥，諸如米托坦(mitotane)及曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如亞葉酸；乙醯葡醛酯；醛磷醯胺醣苷；胺基乙醯丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；貝斯布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；艾達曲克(edatraxate)；地磷醯胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾福米辛(elformithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；埃坡黴素(epothilone)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥脲；磨菇多糖(lentinan)；氯尼達明(lonidainine)；類美登素(maytansinoid)，諸如美登素(maytansine)及安絲菌素(ansamitocins)；丙脒腙；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫比達摩(mopidanmol)；二胺硝吖啶；噴司他丁(pentostatin)；苯來美特(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸；2-乙基醯肼；甲基苄肼；PSK多醣複合物；雷佐生(razoxane)；根黴素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2''-三氯三乙胺；單端孢黴烯(trichothecene) (尤其T-2毒素、黏液黴素A (verracurin A)、桿孢菌素A (roridin A)及蛇形菌素(anguidine))；尿烷(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴𠯤(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿拉伯糖苷(「Ara-C」)；環磷醯胺；類紫杉醇(taxoid)，例如太平洋紫杉醇及多烯紫杉醇吉西他濱(docetaxel gemcitabine)；6-硫代鳥嘌呤；巰基嘌呤；鉑配位錯合物，諸如順鉑、奧沙利鉑(oxaliplatin)及卡鉑；長春鹼；鉑；依託泊苷(VP-16)；異環磷醯胺；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新鹼；長春瑞賓(vinorelbine)；米托蒽醌(novantrone)；替尼泊甙(teniposide)；依達曲沙(edatrexate)；柔紅黴素(daunomycin)；胺基喋呤(aminopterin)；截瘤達(xeloda)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；伊立替康(irinotecan) (例如CPT-11)；拓樸異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；類視黃素，諸如視黃酸；卡培他濱(capecitabine)；卡鉑、丙卡巴肼(procarbazine)、普爾黴素(plicomycin)、吉西他濱(gemcitabien)、溫諾平(navelbine)、法呢基-蛋白質轉移酶抑制劑(farnesyl-protein tansferase inhibitor)、反鉑，及以上任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。 B. 放射療法
引起DNA損壞且已廣泛使用之其他因素包括通常稱為γ射線、X射線及/或將放射性同位素定向遞送至腫瘤細胞之因素。亦考慮DNA損壞因素之其他形式，諸如微波、質子束照射(美國專利5,760,395及4,870,287)及UV照射。最可能的是，所有此等因素對DNA、DNA之前驅體、DNA之複製及修復及染色體之組裝及維持造成大範圍的損壞。X射線之劑量範圍在50至200倫琴之日劑量持續較長時段(3至4週)到2000至6000倫琴之單次劑量範圍內。放射性同位素之劑量範圍變化極大，且視同位素之半衰期、所發射輻射之強度及類型及贅生性細胞之攝取而定。 C. 免疫療法
熟習此項技術者應瞭解，額外免疫療法可與實施例之方法組合或結合使用。在癌症治療之情形下，免疫治療劑一般依賴於使用免疫效應細胞及分子靶向及除滅癌細胞。利妥昔單抗(Rituximab)(RITUXAN®)係此類實例。免疫效應子可例如為對腫瘤細胞表面上之一些標記物具有特異性之抗體。單獨抗體可充當療法之效應子或其可募集其他細胞以實際上影響細胞殺滅。抗體亦可結合於藥物或毒素(化學治療劑、放射性核種、蓖麻毒素A鏈、霍亂毒素、百日咳毒素等)且充當靶向劑。或者，效應子可為攜帶直接或間接與腫瘤細胞目標相互作用之表面分子的淋巴球。各種效應細胞包括細胞毒性T細胞及NK細胞。
抗體-藥物結合物已作為癌症療法之研發之突破性方法出現。癌症係世界上死亡主要原因中之一者。抗體-藥物結合物(ADC)包含共價連接至細胞殺滅藥物之單株抗體(MAb)。此方法組合MAb針對其抗原目標之高特異性與高度有效之細胞毒性藥物，產生將有效負載物(藥物)遞送至具有富集含量之抗原之腫瘤細胞的「武裝」MAb。藥物之靶向遞送亦使其在正常組織中之暴露降到最低，產生降低之毒性及提高之治療指數。FDA對兩種ADC藥物，2011年之ADCETRIS® (貝倫妥單抗維多汀(brentuximab vedotin))及2013年之KADCYLA® (曲妥珠單抗恩他新(trastuzumab emtansine)或T-DM1)的批准證實方法。當前在癌症治療之臨床試驗之各種階段存在超過30種ADC候選藥物(Leal等人，2014)。隨著抗體工程改造及連接子有效負載最佳化變得愈來愈成熟，新穎ADC之發現及發展愈來愈取決於適合於此方法之新穎目標之鑑別及驗證及靶向MAb之產生。ADC目標之兩個標準係腫瘤細胞中之上調/高水準表現及穩固內化。
在免疫療法之一個態樣中，腫瘤細胞必須帶有一些適合於靶向，亦即不存在於大部分其他細胞上之標記物。存在許多腫瘤標記物且此等標記物中之任一者可適用於在本發明實施例之情形下靶向。常見腫瘤標記物包括CD19、CD20、CA-125、癌胚抗原、酪胺酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸基Lewis抗原、MucA、MucB、PLAP、層黏連蛋白受體、erb B及p155。免疫療法之替代態樣為組合抗癌作用與免疫刺激作用。亦存在免疫刺激分子，包括：細胞介素，諸如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN；趨化因子，諸如MIP-1、MCP-1、IL-8及生長因子，諸如FLT3配位體。
當前在研究中或在使用中之免疫療法之實例為免疫佐劑，例如牛分支桿菌、惡性瘧原蟲、二硝基氯苯及芳族化合物(美國專利5,801,005及5,739,169；Hui及Hashimoto, 1998；Christodoulides等人，1998)；細胞介素療法，例如干擾素α、β及γ、IL-1、GM-CSF及TNF (Bukowski等人，1998；Davidson等人，1998；Hellstrand等人，1998)；基因療法，例如TNF、IL-1、IL-2及p53 (Qin等人，1998；Austin-Ward及Villaseca, 1998；美國專利5,830,880及5,846,945)；及單株抗體，例如抗CD20、抗神經節苷脂GM2及抗p185 (Hollander, 2012；Hanibuchi等人，1998；美國專利5,824,311)。經考慮，一或多種抗癌療法可與本文所述之抗體療法一起使用。
在一些實施例中，免疫療法可為免疫檢查點抑制劑。免疫檢查點增強信號(例如協同刺激分子)或減弱信號。可由免疫檢查點阻斷靶向之抑制性免疫檢查點包括腺苷A2A受體(A2AR)、B7-H3 (亦稱為CD276)、B及T淋巴球弱化子(BTLA)、細胞毒性T淋巴球相關蛋白4 (CTLA-4，亦稱為CD152)、吲哚胺2,3-二加氧酶(IDO)、殺手細胞免疫球蛋白(KIR)、淋巴球活化基因-3 (LAG3)、計劃性死亡1 (PD-1)、T細胞免疫球蛋白域及黏蛋白域3 (TIM-3)及T細胞活化之V域Ig抑制因子(VISTA)。詳言之，免疫檢查點抑制劑靶向PD-1軸及/或CTLA-4。
免疫檢查點抑制劑可為諸如小分子之藥物、配位體或受體之重組形式，或特定言之為抗體，諸如人類抗體(例如國際專利公開案WO2015016718；Pardoll,Nat Rev Cancer , 12(4): 252-64, 2012；兩者以引用之方式併入本文中)。可使用免疫檢查點蛋白或其類似物之已知抑制劑，特定言之可使用抗體之嵌合、人類化或人類形式。如熟習此項技術者將知曉，替代及/或等效名稱可用於本發明中提及之某些抗體。此類替代及/或等效名稱在本發明之上下文中為可互換的。舉例而言，已知拉立珠單抗(lambrolizumab)亦以替代及等效名稱MK-3475及派立珠單抗(pembrolizumab)已知。
在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑為抑制PD-1與其配位體結合搭配物結合之分子。在一特定態樣中，PD-1配位體結合搭配物為PDL1及/或PDL2。在另一實施例中，PDL1結合拮抗劑為抑制PDL1與其結合搭配物結合之分子。在一具體態樣中，PDL1結合搭配物為PD-1及/或B7-1。在另一實施例中，PDL2結合拮抗劑為抑制PDL2與其結合搭配物結合之分子。在一特定態樣中，PDL2結合搭配物為PD-1。拮抗劑可為抗體、其抗原結合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。例示性抗體描述於美國專利第US8735553號、第US8354509號及第US8008449號中，其皆以引用之方式併入本文中。用於本文所提供之方法之其他PD-1軸拮抗劑為此項技術中已知的，諸如描述於美國專利申請案第US20140294898號、第US2014022021號及第US20110008369號中，所有文獻皆以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑為抗PD-1抗體(例如人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體)。在一些實施例中，抗PD-1抗體選自由納武單抗(nivolumab)、派立珠單抗及CT-011組成之群。在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑為免疫黏附素(例如包含融合至恆定區(例如免疫球蛋白序列之Fc區)的PDL1或PDL2之細胞外或PD-1結合部分的免疫黏附素)。在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑為AMP-224。納武單抗，亦稱為MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558及OPDIVO® ，為WO2006/121168中所描述之抗PD-1抗體。派立珠單抗，亦稱為MK-3475、Merck 3475、拉立珠單抗、KEYTRUDA® 及SCH-900475，為WO2009/114335中所描述之抗PD-1抗體。CT-011，亦稱為hBAT或hBAT-1，為WO2009/101611中所描述之抗PD-1抗體。AMP-224，亦稱為B7-DCIg，為WO2010/027827及WO2011/066342中所描述之PDL2-Fc融合可溶受體。
在本文中提供之方法中可靶向之另一免疫檢查點為細胞毒性T淋巴球相關蛋白4 (CTLA-4)，亦稱為CD152。人類CTLA-4之完整cDNA序列具有Genbank寄存編號L15006。CTLA-4發現於T細胞之表面上且在結合於抗原呈現細胞之表面上之CD80或CD86時充當「關閉」開關。CTLA4係表現於輔助T細胞之表面上之免疫球蛋白超家族的成員且將抑制信號傳輸至T細胞。CTLA4類似於T細胞協同刺激蛋白質CD28，且兩種分子均結合於抗原呈現細胞上之亦分別稱為B7-1及B7-2的CD80及CD86。CTLA4將抑制信號傳輸至T細胞，而CD28傳輸刺激信號。細胞內CTLA4亦發現於調節T細胞中且對其功能可為重要的。經由T細胞受體及CD28之T細胞活化引起B7分子之抑制性受體CTLA-4之表現增加。
在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係抗CTLA-4抗體(例如人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體)、其抗原結合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。
適用於本發明方法之抗人類-CTLA-4抗體(或自其衍生之VH及/或VL域)可使用此項技術中熟知之方法產生。或者，可使用此項技術中公認之抗CTLA-4抗體。舉例而言，以下中所揭示之抗CTLA-4抗體可用於本文所揭示之方法：US 8,119,129、WO 01/14424、WO 98/42752；WO 00/37504 (CP675,206，亦稱為曲美單抗(tremelimumab)；以前稱替西單抗(ticilimumab))、美國專利第6,207,156號；Hurwitz等人(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95(17): 10067-10071；Camacho等人(2004)J Clin Oncology 22(145): 摘要編號2505 (抗體CP-675206)；以及Mokyr等人(1998)Cancer Res 58:5301-5304。前述公開案中之每一者之教示內容以引用之方式併入本文中。亦可使用與此等此項技術中公認的抗體中之任一者競爭結合至CTLA-4之抗體。舉例而言，人類化CTLA-4抗體描述於國際專利申請案第WO2001014424號、第WO2000037504號及美國專利第8,017,114號中；所有文獻皆以引用之方式併入本文中。
例示性抗CTLA-4抗體係伊派利單抗(ipilimumab)(亦稱為10D1、MDX-010、MDX-101及Yervoy®)或其抗原結合片段及變異體(參見例如WO 01/14424)。在其他實施例中，抗體包含伊派利單抗之重鏈及輕鏈CDR或VR。因此，在一個實施例中，抗體包含伊派利單抗之VH區之CDR1、CDR2及CDR3域，及伊派利單抗之VL區之CDR1、CDR2及CDR3域。在另一實施例中，抗體競爭與與上文所提及之抗體相同之CTLA-4上的抗原決定基結合及/或結合於與上文所提及之抗體相同之CTLA-4上的抗原決定基。在另一實施例中，抗體與上文所提及之抗體具有至少約90%可變區胺基酸序列一致性(例如與伊派利單抗之至少約90%、95%或99%可變區一致性)。
用於調節CTLA-4之其他分子包括諸如描述於美國專利第US5844905號、第US5885796號及國際專利申請案第WO1995001994號及第WO1998042752號中之CTLA-4配位體及受體；所有文獻皆以引用之方式併入本文中，及諸如描述於美國專利第US8329867號中之免疫黏附素，其以引用之方式併入本文中。  D. 手術
大約60%患有癌症的人將經歷一些類型之手術，其包括預防性、診斷或分期、治癒性及姑息性手術。治癒性手術包括切除，其中癌組織的所有或一部分經物理移除、切除及/或破壞，且可與其他療法結合使用，該等其他療法諸如本發明實施例之治療、化學療法、放射療法、激素療法、基因療法、免疫療法及/或替代療法。腫瘤切除係指物理移除腫瘤之至少一部分。除腫瘤切除以外，手術治療包括雷射手術、冷凍手術、電手術及顯微鏡控制手術(microscopically-controlled surgery) (莫氏手術(Mohs' surgery))。
在切除癌細胞、組織或腫瘤的一部分或所有時，可在體內形成空腔。治療可藉由用額外抗癌療法對區域進行灌注、直接注射或局部施用而實現。可例如每1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天，或每1週、2週、3週、4週及5週或每1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、或12個月重複此類治療。此等治療亦可具有不同劑量。 E. 其他試劑
經考慮，其他試劑可與本發明實施例之某些態樣組合使用以提高治療之治療功效。此等額外試劑包括影響細胞表面受體及GAP連接之上調之試劑、細胞生長抑制劑及分化劑、細胞黏附抑制劑、提高過度增殖細胞對細胞凋亡誘導物之敏感性之試劑或其他生物試劑。藉由升高GAP連接之數目增加細胞間信號傳導將增加對相鄰過度增殖細胞群體之抗過度增殖作用。在其他實施例中，細胞生長抑制劑或分化劑可與本發明實施例之某些態樣組合使用以提高治療之抗過度增殖功效。考慮細胞黏附抑制劑以提高本發明實施例之功效。細胞黏附抑制劑之實例為局部黏附斑激酶(FAK)抑制劑及洛伐他汀(Lovastatin)。進一步經考慮，增加過度增殖細胞對細胞凋亡之敏感性的其他試劑，諸如抗體c225，可與本發明實施例之某些態樣組合使用以提高治療功效。 VII. 製品或套組
提供一種製品或套組，其包含冷凍保存培養基或其組分及視情況存在之免疫細胞。該製品或套組可進一步包含藥品說明書，其包含使用冷凍保存及/或免疫細胞治療個體之癌症或延遲其進展或增強患有癌症之個體之免疫功能的說明。本文所述之任何冷凍保存培養基組分及視情況存在之抗原特異性免疫細胞可包括於製品或套組中。適合容器包括例如瓶、小瓶、袋及注射器。容器可由多種材料形成，該等材料諸如玻璃、塑膠(諸如聚氯乙烯或聚烯烴)或金屬合金(諸如不鏽鋼或赫史特合金(hastelloy))。在一些實施例中，容器容納調配物，且在容器上或與容器結合之標籤可指示使用說明。製品或套組可進一步包括自商業及使用者角度來看需要之其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針、注射器及具有使用說明之藥品說明書。在一些實施例中，製品進一步包括一或多種另一試劑(例如化學治療劑及抗贅生劑)。用於一或多種試劑之適合容器包括例如瓶、小瓶、袋及注射器。  VIII. 實例
包括以下實例以展現本發明之較佳實施例。熟習此項技術者應瞭解，以下實例中所揭示之技術表示由本發明人發現在本發明之實踐中運作良好之技術，且因此可視為構成其實踐之較佳模式。然而，依據本發明，熟習此項技術者應瞭解，在不脫離本發明之精神及範疇之情況下可在所揭示之特定實施例中作出許多改變且仍獲得相同或類似結果。實例 1- 冷凍保存 NK-CAR 細胞
在特定實施例中，在適合時間，可收集，洗滌且冷凍保存包含NK-CAR細胞(作為細胞之實例)之輸注產物。在需要時，諸如在擴增細胞之適合時間之後，收集細胞。在一些情況下，可移出樣品以進行細胞計數及得到存活率，及進行流式細胞量測術以表徵經擴增細胞之表型。作為一個實例，亦可自培養物移出樣品以進行黴漿菌測試(例如用PCR及MycoAlert)。通常進行革蘭氏染色(gram stain)以確保不存在細菌。若細胞存活率＞70%，則可藉由離心收集細胞且可自上清液移出樣品以進行藉由基於細胞培養物之分析的PCR測試(若認為必要)。
細胞產物可例如用含有0.5%人類血清白蛋白(HSA)之Plasma-Lyte A洗滌以移除培養基試劑。收集樣品以用於釋放及非釋放測試。可藉由用含有10%人類AB血清之Plasma-Lyte A之混合物洗滌來製備最終細胞懸浮液以用於冷凍保存。細胞在含有5% DMSO、IL-2 400 U/mL及IL-21 20 ng/mL之95%人類AB血清之混合物中冷凍保存。將細胞儲存於氣相液氮中直至準備好輸注。釋放測試包括測試純度、革蘭氏染色、黴漿菌(MycoAlert)、目視檢查、存活率(7AAD)、免疫表型分型及內毒素(LAL)。非釋放測試包括藉由PCR (第15天)進行之黴漿菌測試及藉由QPCR (第15天)進行之載體複本數(VCN)分析。實例 2- 準備冷凍保存之 NK-CAR 細胞以用於輸注
在輸注當天，將冷凍保存之細胞在37℃下解凍。用含有0.5% HSA之Plasma-Lyte A之混合物洗滌細胞兩次。收集樣品以用於細胞計數、免疫表型分型及存活率(7AAD)。隨後以所需劑量水準將細胞產物再懸浮於含有0.5% HSA之Plasma-Lyte A中。最終輸注體積可為劑量1大約20 mL及劑量2及劑量3大約100 mL。自最終輸注產物移出樣品以用於釋放測試，其包括測試目視檢查、存活率(7AAD)、革蘭氏染色、免疫表型分型及細胞計數(細胞劑量)。非釋放測試包括無菌性測試(BD Bactec)。實例 3- 冷凍保存實施例
僅作為實例，冷凍保存方法用於來源於臍帶血(CB)之NK細胞，且在此情況下，該等細胞之特異性藉由對其進行基因工程改造而再導向，以表現腫瘤特異性嵌合抗原受體(CAR)，其可增強該等細胞之抗腫瘤活性而不增加移植物抗宿主病(GVHD)之風險。此允許提供用於療法，諸如表現目標之任何癌症之免疫療法之『現成』細胞來源。
對於冷凍保存，將CB NK細胞懸浮於包含5% DMSO、95%人類AB血清、400單位IL-2/ml及20 ng IL-21/ml之GMP冷凍保存培養基中，且使用速率受控方法將細胞冷凍於液氮中。
在解凍已冷凍之經培養之CB-NK細胞作為最終產物之後，表徵細胞。在解凍後，細胞存活率大於80%且細胞回收率大於85%。此外，在FMC中冷凍保存之NK細胞與在單獨FM中冷凍保存之NK細胞相比發揮顯著更佳之針對K562及Raji目標之細胞毒性(分別p=0.02及p=0.0004)。
因此，例示性經CAR轉導的來源於臍帶血之NK細胞可提供個人化NK細胞之現成來源，該等個人化NK細胞可識別及攻擊許多癌症，包括液體及實體腫瘤。來源於臍帶血之自然殺手細胞之反轉錄病毒轉導允許用於許多癌症之免疫療法且潛在地用於治療多種病毒感染的經工程改造之細胞之更長持久性及提高之功效。
藉由進一步研究，測試在包含不同細胞介素組合之九種不同冷凍培養基中冷凍保存之CB-NK之存活率，其中許多具有相比於標準冷凍培養基統計學上顯著之存活率(圖1)。標準冷凍培養基為95%人類AB血清+5% DMSO。在圖1中，細胞介素之組合包括以下：(1)標準冷凍培養基；(2)單獨IL2；(3)單獨IL15；(4)單獨IL21；(5) IL2+IL21；(6) IL2+IL15；(7) IL21+IL15；(8) IL2+IL15+IL21；及(9)研究級冷凍培養基(Sigma)。
圖2展示在GMP標準冷凍培養基中冷凍保存之NK細胞與新鮮NK細胞之比較。在GMP冷凍培養基中冷凍保存之NK細胞相比於新鮮NK細胞在解凍後針對K562目標發揮更差之細胞毒性。相比之下，在GMP冷凍培養基及細胞介素中冷凍保存之NK細胞相比於新鮮NK細胞在解凍後針對K562目標發揮類似之細胞毒性(圖3)。測試表現嵌合抗原受體(CAR)之NK細胞，圖4展示在GMP標準冷凍培養基中冷凍保存之表現CAR之NK細胞相比於新鮮表現CAR之NK細胞在解凍後針對Raji目標發揮更差之細胞毒性。然而，在GMP冷凍培養基及細胞介素中冷凍保存之表現CAR之NK細胞相比於新鮮表現CAR之NK細胞在解凍後針對Raji目標發揮類似之細胞毒性(n=3)。類似地，在GMP標準冷凍培養基及細胞介素中冷凍保存之表現CAR之NK細胞相比於新鮮表現CAR之NK細胞在解凍後針對Raji目標發揮類似之細胞毒性，且其優於在標準GMP冷凍培養基中冷凍之表現CAR之NK細胞(圖6)。冷凍於包括細胞介素之本發明之冷凍保存培養基中且在解凍後立即輸注至移植Raji之小鼠中的表現CAR之NK細胞發揮疾病控制作用。圖8展示冷凍於包括細胞介素之本發明之冷凍保存培養基(FM+細胞介素)中且在解凍後立即輸注至移植Raji之小鼠中的表現CAR之NK細胞發揮與新鮮表現CAR之NK細胞類似之疾病控制作用，且其優於在標準GMP冷凍培養基(FM)中冷凍之表現CAR之NK細胞。實例 4- 用於現成免疫療法之符合 GMP 之 CAR-NK 細胞 產物之穩固冷凍保存
本發明實例係關於產生冷凍細胞產物，其可用作可解凍且輸注至有需要之個體中而無產生所需之延遲之「現成」細胞療法。方法及組合物可應用於任何類型之細胞，包括NK細胞，諸如來源於臍帶血之自然殺手(CB-NK)細胞。細胞可用一或多種類型之載體，包括病毒載體，諸如反轉錄病毒載體轉導。在特定實施例中，載體在細胞中產生基因產物，其允許細胞靶向癌症，諸如經由癌症抗原靶向癌症。目標之特定實例包括CD19+淋巴癌症、骨髓腫瘤及實體腫瘤癌症抗原。
在某些實施例中，本發明尤其適合於在正常情況下不允許『現成』方法之來源於末梢血液之NK細胞。此係因為在各情況下，必須鑑別供體之NK細胞。在特定實施例中，經嵌合抗原受體(CAR)工程改造之NK細胞尤其適合於本發明之方法及組合物。儘管此項技術中已知經CAR工程改造之NK92細胞，但NK92為來源於淋巴瘤患者之NK細胞株，其不具有對NK細胞的細胞毒性很重要之許多NK細胞受體。因為細胞株來源於淋巴瘤患者，所以其必須在輸注之前經照射，否則存在其將在接受者中引發淋巴瘤的風險。輻射將顯著降低其增殖及存留之能力。因此，此等細胞可能不如表現NK細胞受體之完整陣列之經CAR修飾之CB-NK細胞有效。
本發明提供用於癌細胞之免疫療法的細胞之現成來源。優於CAR-T細胞之主要優勢為NK細胞引起移植物抗宿主病(GVHD)之可能性小得多，而在現成的CAR T細胞，在不存在完全HLA匹配之情況下，若輸注至患者中很可能引起致死性GVHD。優於來源於末梢血液之CAR-NK細胞之優勢為世界範圍內CB庫之可用性，其將允許現成的用於免疫療法的經CAR工程改造之來源於臍帶血之NK細胞來源，而無需募集供體以收集NK細胞。經CAR工程改造之NK細胞比NK92-CAR轉導細胞更可能有效，因為後者與前者相比不具有NK細胞殺滅之完全機制且需要在輸注之前經受照射，因此不利地影響其持久性及增殖。此外，冷凍保存NK細胞，以使得解凍後其保留與其新鮮對應物相同之效能的能力極有價值，因為其將允許此類型之免疫療法用作用於癌症患者之現成療法。
該等方法及組合物之特定實施例至少包括以下：在包含通用抗原呈現細胞(uAPC)或其他飼養細胞及細胞介素(包括介白素(IL)-2)之共培養物中，NK細胞由冷凍/解凍CB單位之穩固擴增；使用CAR構築體之NK細胞之高且恆定轉導水準；可新鮮輸注或冷凍以用於後續輸注之高度有效CB-NK-CAR細胞之快速產生。所產生之冷凍NK-CAR產物將提供真正的「現成」細胞療法，其可任意解凍且輸注至患者中且無需推遲治療並等待細胞產生。
在一個實例中，自健康供體之臍帶血(CB)分離之NK細胞與抗原呈現細胞(APC)，諸如基於K562之飼養細胞或其他飼養細胞(諸如類淋巴母細胞細胞株或珠粒)共培養，且此在一或多種細胞介素，包括IL-2之存在下進行。NK細胞接著用反轉錄病毒或慢病毒載體(作為實例)轉導，或用休眠式(sleeping beauty)或背馱式(piggy-back)構築體電穿孔，且此等構築體或載體允許細胞靶向血液及實體癌症。經轉導細胞接著與APC或其他飼養細胞及IL-2 (或一或多種其他細胞介素)在共培養物中進一步擴增以獲得強效CB-NK細胞。在一個特定情況下，NK細胞為經CAR轉導之NK細胞。彼等細胞可新鮮輸注或可冷凍於包含細胞介素之培養基中以便日後進行解凍及輸注。相同或類似方法可用於自健康供體之末梢血液(PB)或自患者PB、自NK細胞株(諸如NK92細胞)、自誘導性多能幹細胞或造血幹細胞或自骨髓產生及冷凍保存經CAR轉導的NK細胞。用於產生所要NK細胞(諸如用反轉錄病毒載體遺傳修飾之CB-NK細胞)之程序如下：
CAR-NK 細胞 冷凍保存 . 在一系列全面研究中，本發明人已最佳化CAR-NK細胞之冷凍保存。與標準冷凍保存技術相比，添加聚葡萄糖及白蛋白(細胞外冷凍保護劑)及DMSO (細胞內冷凍保護劑)已展示保持且甚至提高在解凍後CAR NK細胞針對腫瘤細胞之細胞毒性。
本發明人使用存活率及活體外殺滅分析比較不同濃度之PlasmaLyte、細胞外冷凍保護劑(聚葡萄糖及人類白蛋白)及細胞內冷凍保護劑濃度(DMSO 5%相對於7.5%)+/-細胞介素(單獨IL-2或IL15，或IL-2/IL-15或IL-2/IL-21之組合)。
研究設計之一實例展示於圖9中，其中CAR-NK細胞冷凍於包含各種濃度之PlasmaLyte、RPMI、聚葡萄糖、人類白蛋白及DMSO之冷凍培養基中。額外實驗細節概述於圖10中，包括比較RPMI相對於PlasmaLyte、不同細胞外冷凍保護劑(聚葡萄糖及人類白蛋白)、向冷凍培養基中添加細胞介素(IL-2/IL-15)及比較不同細胞內冷凍保護劑濃度(DMSO 5%相對於7.5%)。解凍後即刻或解凍後4小時的CAR-NK細胞存活率及回收率展示於圖11，展現在此等條件當中無重大差異。圖12展示在各種條件當中無顯著差異之解凍後CAR表現。圖13展示在各種條件當中無顯著差異之解凍後CD16表現。圖14展示在各種條件當中無顯著差異之解凍後CD56表現。圖15展示對於所有所測試條件，在解凍後即刻針對Raji及K562目標展現極佳細胞毒性。在圖16中，展現細胞外細胞保護劑(CPA)聚葡萄糖之最佳濃度為40%或更低，且在解凍後4小時，當與在90%血小板(PLT)溶解產物+10% DMSO+IL2/IL-15或聚葡萄糖70%中冷凍的CAR NK細胞相比時，在含有40%聚葡萄糖或更少之條件下冷凍之CAR NK細胞具有針對K562及Raji目標之優良細胞毒性。圖17展示IncuCyte分析中對於所有所測試條件極佳之Raji及K562目標殺滅。再次在圖18中使用IncuCyte分析，本發明人證實，在與Raji共培養之後在解凍後隨著時間推移觀測到最小CAR NK細胞死亡(＜20%)，其中在前24小時內觀測到最大細胞凋亡。圖19藉由磷脂結合蛋白染色展示所有條件之解凍後4小時的最小CAR NK細胞死亡(＜20%)。
隨後測試影響，將血小板溶解產物(PLT Lys)或AB血清添加至含細胞外及細胞內CPA之Plasmalyte相對於RMPI，並且具有不同細胞介素組合(IL-2/IL-15相對於IL-2/IL-21)。在冷凍保存之前擴增CAR NK細胞15天或22天。更詳細實驗設計展示於圖20中，其描述用於擴增15天相對於22天之CAR NK細胞之冷凍條件之評價。圖21展現對於擴增15天且使用不同條件冷凍保存之CAR NK細胞，極佳解凍後存活率(＞85%)及回收率。圖22展現將血小板溶解產物及AB血清添加至冷凍培養基中在解凍後保持CAR表現，其中在不同細胞介素組合(IL-2/IL-15相對於IL-2/IL-21)下觀測到的CAR表現無差異。圖23展現在將血小板溶解產物或AB血清加細胞介素添加至冷凍培養基之條件下觀測到的最高CD16。圖24展現對於所有所測試條件之高且穩定的CD56表現。圖25展示擴增22天且使用不同條件冷凍保存的CAR NK細胞在IncuCyte分析中在解凍後即刻保持極佳針對Raji細胞的細胞毒性。圖26展示在與Raji共培養之後在解凍後隨著時間推移在IncuCyte分析中觀測到之最小CAR NK細胞死亡(＜20%)。
本發明人隨後選擇滴定擴增15天相對於22天的冷凍CAR NK細胞中之細胞外冷凍保護劑之組分：特定言之，添加至冷凍培養基中之血小板溶解產物之濃度(25%相對於50%)；聚葡萄糖之濃度(25%相對於50%)及稀釋劑(NACL相對於右旋糖)；及人類白蛋白之濃度(20%相對於45%相對於70%)。所有條件在添加IL-2/IL-15細胞介素之組合的情況下進行測試。圖27展示此等研究之詳細方案。圖28對於所有所測試條件展示極佳解凍後存活率(＞87%)。圖29在解凍後4小時使用磷脂結合蛋白染色展示所測試之大部分條件的最小CAR NK細胞死亡(＜20%)，除了其中冷凍培養基含有：(i) 25%聚葡萄糖於右旋糖中加70%人類白蛋白加5% DMSO，及(ii) 50%聚葡萄糖於右旋糖中加45%人類白蛋白加5% DMSO，其中NK細胞的細胞凋亡在解凍後為約30%。圖30展示IncuCyte分析中對於所有所測試條件極佳之Raji及K562細胞殺滅。圖31展示大部分條件的隨著時間推移觀測到之最小CAR NK細胞死亡，除了細胞冷凍於25%聚葡萄糖於右旋糖中加70%人類白蛋白加5% DMSO中，其中＞40%在與Raji共培養之後在解凍後經歷細胞凋亡，其中在前16小時內觀測到最大細胞凋亡。圖32展示下一系列研究之方案，其中各種冷凍調配物包括兩種細胞介素之組合(IL-2/IL-15)。圖33展示對於所有所測試條件，在解凍後即刻的CAR NK細胞之極佳存活率(＞89%)。圖34展示解凍後4小時CAR NK細胞類似之CAR表現。圖35展示在以下3個條件下冷凍保存的在解凍後即刻CAR NK細胞較差之細胞毒性：
25%聚葡萄糖於右旋糖中；70%人類白蛋白；5% DMSO (黑色圓形)
25%聚葡萄糖於NACL中；70%人類白蛋白；5% DMSO+IL-2/IL-15 (橙色菱形)
50%聚葡萄糖於右旋糖中，45%人類白蛋白；5% DMSO (藍色三角形)
圖36符合圖35中51鉻釋放分析下之資料，使用Incucyte殺滅分析之活體成像確認在以下2個條件下冷凍保存之CAR NK細胞針對K562目標之較差細胞毒性：
25%聚葡萄糖於右旋糖中；70%人類白蛋白；5% DMSO (黑色圓形)
50%聚葡萄糖於右旋糖中，45%人類白蛋白；5% DMSO (藍色三角形)
圖37至圖40展示在各種冷凍調配物中評價臨床CAR-NK細胞產物之後續研究的詳細方案。此等研究展現在上文所述之最佳化調配物的情況下穩固且可再現之存活率及殺滅。總之，此等研究證實包含新穎濃度之細胞內及細胞外冷凍保護劑以及細胞介素之冷凍保存調配物，在解凍之後產生具有極佳存活率、回收率及活體外細胞毒性之穩固的CAR-NK產物。
此等結果已在異種鼠類模型中再現，其中針對Raji淋巴瘤細胞具有給人深刻印象的抗腫瘤活性，其與用新鮮CAR-NK細胞所觀測到之活性相當，如藉由生物發光及存活分析所展示(圖41)。簡言之，為了鑑別冷凍保存CAR NK細胞的最佳冷凍培養基，本發明人用2×10e4個Raji細胞接種13組NSG小鼠。在同一天(第0天)，一組接受1×10e7個新鮮CD19 CAR NK細胞(陽性對照組)，11組接受1×10e7個在如表1 (圖41)中所詳述的冷凍培養基中冷凍保存之冷凍CAR NK細胞之2次輸注(第0天及第7天)，且輸注在解凍後立即進行。一組未接受CAR NK細胞(陰性組)。無關於用於冷凍保存CAR細胞之冷凍培養基，接受CAR NK細胞之小鼠相較於未處理的小鼠具有統計學上顯著之優良存活率(圖42)，然而對於第6組、第8組及第11組，存活率明顯地不如接受新鮮CAR NK細胞之小鼠之存活率(圖42)。
為進一步評估新鮮與冷凍產物之間的可能差異，對存活率利用Cox回歸模型。第1組(HR=0.811，p=0.78)、第2組(HR=0.6，p=0.49)、第3組(HR=0.916，p=0.90)、第4組(HR=0.859，p=0.83)及第7組(HR=0.883，p=0.87)中經處理之小鼠具有優良存活率，但與用新鮮CAR NK細胞產物處理之小鼠相比，其在統計學上不顯著。
測定腫瘤生長之生物發光成像呈現於圖43中。與分別作為陽性及陰性對照組之用新鮮CAR NK細胞處理或無處理小鼠相比，呈現使用圖41中所列之不同條件冷凍之CAR NK細胞處理之小鼠的平均輻射量。ROI不可用於用Raji單獨處理超出第17天之動物，因為其皆在安排在第22天之BLI之前死於疾病。對於所有所測試條件，用冷凍CAR NK細胞處理之小鼠，腫瘤對照組之ROI值與對新鮮CAR NK組觀測到的相等或比其更好。
利用本發明之方法及組合物，經CAR轉導的來源於臍帶血之NK細胞可提供個人化NK細胞之現成來源，該等個人化NK細胞可識別及攻擊許多癌症，包括液體及實體腫瘤。來自任何來源(臍帶血、末梢血液、骨髓、細胞株，諸如NK92細胞、HSC衍生之細胞株、iPSC衍生之細胞株)之自然殺手細胞之CAR轉導或基因編輯允許用於許多癌症之免疫療法且潛在地用於治療許多病毒感染的經工程改造之細胞之更長持久性及提高之功效。冷凍保存NK細胞，以使得解凍後其保留與其新鮮對應物相同之效能的能力極有價值，因為其將允許此類型之免疫療法用作用於癌症患者之現成療法。值得注意的是，NK細胞傳統上非常難以冷凍且目前不存在可用於冷凍保存NK細胞之商業或理論冷凍方案。  實例5-冷凍保存培養基之特定調配物
本實例提供用於冷凍保存培養基之特定調配物。
50% RPMI；25%聚葡萄糖；20%人類白蛋白，5% DMSO
50% RPMI；25%聚葡萄糖；20%人類白蛋白，5% DMSO + IL-2/IL-15
35% RPMI；40%聚葡萄糖；20%人類白蛋白，5% DMSO
35% RPMI；40%聚葡萄糖；20%人類白蛋白，5% DMSO + IL-2/IL-15
32.5% RPMI；40%聚葡萄糖；20%人類白蛋白，7.5% DMSO
32.5% RPMI；40%聚葡萄糖；20%人類白蛋白，7.5% DMSO + IL-2/IL-15
50% PlasmaLyte；25%聚葡萄糖；20%人類白蛋白，5% DMSO
50% PlasmaLyte；25%聚葡萄糖；20%人類白蛋白，5% DMSO + IL-2/IL-15
35% PlasmaLyte；40%聚葡萄糖；20%人類白蛋白，5% DMSO
35% PlasmaLyte；40%聚葡萄糖；20%人類白蛋白，5% DMSO + IL-2/IL-15
32.5% PlasmaLyte；40%聚葡萄糖；20%人類白蛋白，7.5% DMSO
32.5% PlasmaLyte；40%聚葡萄糖；20%人類白蛋白，7.5% DMSO + IL-2/IL-15
70% PlasmaLyte；25%聚葡萄糖；5% DMSO + IL-2/IL-15
90% PLT Lys+ 10% DMSO + IL-2/IL-15
50% PLT lys + 25%聚葡萄糖+20%人類白蛋白+5% DMSO + IL-2/IL-15
50% AB血清+25%聚葡萄糖+20%人類白蛋白+5% DMSO + IL-2/IL-15
50% PLT lys + 25%聚葡萄糖+20%人類白蛋白+5% DMSO + IL-2/IL-21
50% RPMI + 25%聚葡萄糖+20%人類白蛋白+5% DMSO + IL-2/IL-21
50% PlasmaLyte + 25%聚葡萄糖+20%人類白蛋白+5% DMSO + IL-2/IL-21
50%AB血清+25%聚葡萄糖+20%人類白蛋白+5% DMSO + IL-2/IL-21
50% PLT Lys；25%聚葡萄糖於NACL中；20%人類白蛋白；5% DMSO+IL-2/IL-15
50% PLT Lys；25%聚葡萄糖於右旋糖中；20%人類白蛋白；5% DMSO+IL-2/IL-15
25% PLT Lys；50%聚葡萄糖於NACL中；20%人類白蛋白；5% DMSO+IL-2/IL-15
25% PLT Lys；50%聚葡萄糖於右旋糖中；20%人類白蛋白；5% DMSO+IL-2/IL-15
25%聚葡萄糖於NACL中；70%人類白蛋白；5% DMSO+IL-2/IL-15
25%聚葡萄糖於右旋糖中；70%人類白蛋白；5% DMSO+IL-2/IL-15
50%聚葡萄糖於NACL中；45%人類白蛋白；5% DMSO+IL-2/IL-15
50%聚葡萄糖於右旋糖中；45%人類白蛋白；5% DMSO+IL-2/IL-15
50% Plasmalyte；45%人類白蛋白；5% DMSO+IL-2/IL-15
25% Plasmalyte；70%人類白蛋白；5% DMSO+IL-2/IL-15
具有某些濃度之特定調配物之實例可如下利用：
50%血小板溶解產物；25%聚葡萄糖於NACL中；20%人類白蛋白；5% DMSO；加200 iu之介白素2及10 ng/ml之介白素15
50%血小板溶解產物；25%聚葡萄糖於右旋糖中；20%人類白蛋白；5% DMSO；加200 iu之介白素2及10 ng/ml之介白素15
25%血小板溶解產物；50%聚葡萄糖於NACL中；20%人類白蛋白；5% DMSO；加200 iu之介白素2及10 ng/ml之介白素15
25%血小板溶解產物；50%聚葡萄糖於右旋糖中；20%人類白蛋白；5% DMSO；加200 iu之介白素2及10 ng/ml之介白素15
25%聚葡萄糖於NACL中；70%人類白蛋白；5% DMSO；加200 iu之介白素2及10 ng/ml之介白素15
25%聚葡萄糖於右旋糖中；70%人類白蛋白；5% DMSO；加200 iu之介白素2及10 ng/ml之介白素15
50%聚葡萄糖於NACL中；45%人類白蛋白；5% DMSO；加200 iu之介白素2及10 ng/ml之介白素15
50%聚葡萄糖於右旋糖中；45%人類白蛋白；5% DMSO；加200 iu之介白素2及10 ng/ml之介白素15
50% Plasmalyte；45%人類白蛋白；5% DMSO；加200 iu之介白素2及10 ng/ml之介白素15
25% Plasmalyte；70%人類白蛋白；5% DMSO；加200 iu之介白素2及10 ng/ml之介白素15
90%血小板溶解產物，10% DMSO
* * *
本文中所揭示及主張之所有方法均可根據本發明製造及執行，無需過度實驗。雖然已根據較佳實施例描述本發明之組合物及方法，但熟習此項技術者應清楚變化可在不脫離本發明之概念、精神及範疇的情況下應用於本文所述之方法及步驟中或方法步驟之順序中。更特定言之，顯而易見在化學上及生理上相關之某些試劑可取代本文所描述之試劑，同時將實現相同或類似結果。對熟習此項技術者顯而易見的所有此類類似取代及修改視為在由隨附申請專利範圍所定義之本發明之精神、範疇及概念內。
以下圖式形成本說明書之一部分且包括該等圖式以進一步展現本發明之某些態樣。結合本文中呈現之特定實施例之詳細描述，參考此等圖式中之一或多者，可更好地理解本發明之主題。
圖1展示在含有細胞介素之不同組合之9種不同冷凍培養基調配物中冷凍保存之CB-NK之存活率(n=4)。
圖2展現在良好生產規範(good manufacturing practice，GMP)冷凍培養基中冷凍保存之NK細胞相比於新鮮NK細胞在解凍後針對K562目標發揮更差之細胞毒性(n=3)。
圖3展示在GMP冷凍培養基及細胞介素中冷凍保存之NK細胞相比於新鮮NK細胞在解凍後針對K562目標發揮類似之細胞毒性(n=3)。
圖4展現在GMP冷凍培養基中冷凍保存之表現嵌合抗原受體(CAR)之NK細胞相比於新鮮CAR NK細胞在解凍後針對Raji目標發揮更差之細胞毒性(n=3)。
圖5展示在GMP冷凍培養基及細胞介素中冷凍保存之表現CAR之NK細胞相比於新鮮CAR NK細胞在解凍後針對Raji目標發揮類似之細胞毒性(n=3)。
圖6提供在GMP冷凍培養基及細胞介素中冷凍保存之表現CAR之NK細胞相比於新鮮CAR NK細胞在解凍後針對Raji目標發揮類似之細胞毒性，且優於在標準冷凍培養基中冷凍之CAR NK細胞(n=3)。
圖7展示冷凍於新穎冷凍培養基+細胞介素中且在解凍後立即輸注至移植Raji之小鼠中的表現CAR之NK細胞發揮疾病控制作用。
圖8展示冷凍於新穎冷凍培養基+細胞介素中且在解凍後立即輸注至移植Raji之小鼠中的表現CAR之NK細胞發揮與新鮮表現CAR之NK細胞類似之疾病控制作用，且其優於在標準GMP冷凍培養基中冷凍之表現CAR之NK細胞。
圖9提供使用不同冷凍培養基條件冷凍保存CAR NK細胞之研究設計之實例。
圖10展示具有諸如以下之變數之多種冷凍條件：(1) RPMI相對於PlasmaLyte之比較；(2)不同細胞外冷凍保護劑(聚葡萄糖及人類白蛋白)之比較；(3)細胞介素(IL-2/IL-15)之比較；及(4)不同細胞內冷凍保護劑濃度(DMSO 5%相對於7.5%)之比較。
圖11提供在多種不同培養基中冷凍之CAR-NK細胞之解凍後存活率及回收率，其中具有不同濃度之PlasmaLyte、細胞外冷凍保護劑(CPA) (聚葡萄糖及人類白蛋白)；細胞內CPA (DMSO 5%相對於7.5%)+/-細胞介素(IL-2/IL-15)之比較。解凍後立即或解凍後4小時進行存活率及回收率之量測。
圖12展示解凍後即刻或解凍後4小時，在含有不同濃度之PlasmaLyte、細胞外CPA (聚葡萄糖及人類白蛋白)；細胞內CPA (DMSO 5%相對於7.5%)+/-細胞介素(IL-2/IL-15)之培養基中冷凍保存之NK細胞上CAR之表現。
圖13展示解凍後即刻或解凍後4小時，在含有不同濃度之PlasmaLyte、細胞外CPA (聚葡萄糖及人類白蛋白)；細胞內CPA (DMSO 5%相對於7.5%)+/-細胞介素(IL-2/IL-15)之培養基中冷凍保存之NK細胞上CD16之表現。
圖14展示解凍後即刻或解凍後4小時，在含有不同濃度之PlasmaLyte、細胞外CPA (聚葡萄糖及人類白蛋白)；細胞內CPA (DMSO 5%相對於7.5%)+/-細胞介素(IL-2/IL-15)之培養基中冷凍保存之NK細胞上CD56之表現。
圖15展示解凍後即刻，在含有不同濃度之PlasmaLyte、細胞外CPA (聚葡萄糖及人類白蛋白)；細胞內CPA (DMSO 5%相對於7.5%)+/-細胞介素(IL-2/IL-15)之冷凍培養基中冷凍之CAR NK細胞針對Raji及K562目標之細胞毒性。
圖16展示解凍後4小時，在含有不同濃度之PlasmaLyte、細胞外CPA (聚葡萄糖及人類白蛋白)；細胞內CPA (DMSO 5%相對於7.5%)+/-細胞介素(IL-2/IL-15)之冷凍培養基中冷凍之CAR NK細胞針對Raji及K562目標之細胞毒性。
圖17提供IncuCyte活體成像細胞毒性分析(IncuCyte live imaging cytotoxicity assay)，其展示由在含有不同濃度之PlasmaLyte、細胞外CPA (聚葡萄糖及人類白蛋白)；細胞內CPA (DMSO 5%相對於7.5%)+/-細胞介素(IL-2/IL-15)之培養基中冷凍之CAR NK細胞進行的K562及Raji目標殺滅之動力學。
圖18提供IncuCyte活體成像，其展示用各種調配物冷凍、解凍且與Raji細胞共培養之CAR NK細胞之解凍後細胞凋亡動力學。
圖19展示解凍後4小時，在含有不同濃度之PlasmaLyte、細胞外CPA (聚葡萄糖及人類白蛋白)；細胞內CPA (DMSO 5%相對於7.5%)+/-細胞介素(IL-2/IL-15)之冷凍培養基中冷凍之CAR NK細胞之細胞凋亡(藉由磷脂結合蛋白V染色)。
圖20說明在GMP級CAR NK細胞冷凍培養基中添加血小板溶解產物(PLT Lys)、PlasmaLyte及AB血清+不同細胞介素組合(IL-2/IL-15相對於IL-2/IL-21)之測試，且包括在15天相對於22天活體外擴增之後使用相同條件冷凍之CAR NK細胞之比較。
圖21說明在GMP級CAR NK細胞冷凍培養基中添加PLT Lys、PlasmaLyte及AB血清+不同細胞介素組合(IL-2/IL-15相對於IL-2/IL-21)之測試，包括在活體外擴增15天相對於22天且使用相同條件冷凍之CAR NK細胞之比較。
圖22展示在含有不同濃度之PLT Lys、PlasmaLyte及AB血清+不同細胞介素組合(IL-2/IL-15相對於IL-2/IL-21)之冷凍培養基中冷凍之CAR NK細胞上解凍後之CAR表現。
圖23展示在含有不同濃度之PLT Lys、PlasmaLyte及AB血清+不同細胞介素組合(IL-2/IL-15相對於IL-2/IL-21)之冷凍培養基中冷凍之CAR NK細胞上解凍後之CD16表現。
圖24展示在含有不同濃度之PLT Lys、PlasmaLyte及AB血清+不同細胞介素組合(IL-2/IL-15相對於IL-2/IL-21)之冷凍培養基中冷凍之CAR NK細胞上解凍後之CD56表現。
圖25展現第22天，由在含有PLT Lys、PlasmaLyte及AB血清+不同細胞介素組合(IL-2/IL-15相對於IL-2/IL-21)之冷凍培養基中冷凍之CAR NK細胞進行的K562及Raji殺滅之IncuCyte活體成像細胞毒性分析及動力學。
圖26提供IncuCyte活體成像，其展示擴增22天且用各種調配物冷凍、解凍且與Raji細胞共培養之CAR NK細胞之解凍後細胞凋亡動力學。
圖27展示用於滴定細胞外冷凍保護劑之組分以最小化冰再結晶之研究：PLT Lys (25%相對於50%)；聚葡萄糖(25%相對於50%；在NACL或右旋糖中)；人類白蛋白(20%相對於45%相對於70%)。所有條件用兩種細胞介素之組合(IL-2/IL-15)測試。
圖28展示CAR NK細胞冷凍於含有不同濃度之細胞外冷凍保護劑之培養基中以最小化冰再結晶之存活率結果：PLT Lys (25%相對於50%)；聚葡萄糖(25%相對於50%；在NACL或右旋糖中)；人類白蛋白(20%相對於45%相對於70%)。所有條件用兩種細胞介素之組合(IL-2/IL-15)測試。解凍後立即測試存活率。
圖29提供表現磷脂結合蛋白之NK細胞之百分比作為CAR NK細胞解凍後細胞凋亡之度量，該等CAR NK細胞用含有細胞外冷凍保護劑之不同組分之培養基冷凍以最小化冰再結晶：PLT Lys (25%相對於50%)；聚葡萄糖(25%相對於50%；在NACL或右旋糖中)；人類白蛋白(20%相對於45%相對於70%)。所有條件用兩種細胞介素之組合(IL-2/IL-15)測試。
圖30展現由在含有不同濃度之PLT Lys (25%相對於50%)；聚葡萄糖(25%相對於50%；在NACL或右旋糖中)及人類白蛋白(20%相對於45%相對於70%)之培養基中冷凍之CAR NK細胞進行的K562及Raji殺滅之IncuCyte活體成像細胞毒性分析及動力學。
圖31展示IncuCyte活體成像，其展示擴增22天且用各種調配物冷凍、解凍且與Raji細胞共培養之CAR NK細胞之解凍後細胞凋亡動力學。
圖32提供用於滴定細胞外冷凍保護劑之組分以最小化冰再結晶之研究：PLT Lys (25%相對於50%)；聚葡萄糖(25%相對於50%；在NACL或右旋糖中)；人類白蛋白(20%相對於45%相對於70%)。所有條件用兩種細胞介素之組合(IL-2/IL-15)測試。
圖33展示冷凍於含有PLT Lys (25%相對於50%)；聚葡萄糖(25%相對於50%；在NACL或右旋糖中)；人類白蛋白(20%相對於45%相對於70%)之冷凍保存培養基中之CAR NK細胞的存活率及回收率之測定值。所有條件用兩種細胞介素之組合(IL-2/IL-15)測試。
圖34提供在以下中冷凍之CAR NK細胞上的CAR表現之檢查：PLT Lys (25%相對於50%)；聚葡萄糖(25%相對於50%；在NACL或右旋糖中)；人類白蛋白(20%相對於45%相對於70%)。所有條件用兩種細胞介素之組合(IL-2/IL-15)測試。
圖35提供擴增15天且在含有以下之培養基中冷凍之CAR NK細胞的細胞毒性之檢查：PLT Lys (25%相對於50%)；聚葡萄糖(25%相對於50%；在NACL或右旋糖中)；人類白蛋白(20%相對於45%相對於70%)。所有條件用兩種細胞介素之組合(IL-12/IL-15)測試。在解凍後立即藉由51鉻釋放分析量測CAR NK細胞之細胞毒性。
圖36展示由擴增15天、冷凍保存且隨後在解凍後立即測試之CAR NK細胞進行的K562及Raji殺滅之IncuCyte活體成像細胞毒性分析及動力學。
圖37說明測試在含有PLT Lys、PlasmaLyte及AB血清+不同細胞介素組合(IL-2/IL-15相對於IL-2/IL-21)之培養基中冷凍之GMP級CAR NK細胞之活體內抗腫瘤活性，隨後比較擴增15天或22天且使用相同冷凍保存條件冷凍之細胞的計劃。
圖38說明滴定細胞外冷凍保護劑之組分以最小化冰再結晶。冷凍培養基包括：PLT Lys (25%相對於50%)；聚葡萄糖(25%相對於50%；在NACL或右旋糖中)；人類白蛋白(20%相對於45%相對於70%)。所有條件用兩種細胞介素之組合(IL-12/IL-15)測試。
圖39展示滴定細胞外冷凍保護劑之組分以最小化冰再結晶。冷凍培養基包括：PLT Lys (25%相對於50%)；聚葡萄糖(25%相對於50%；在NACL或右旋糖中)；人類白蛋白(20%相對於45%相對於70%)。所有條件在無細胞介素、僅具有一種細胞介素(IL-2或IL-15)或具有兩種細胞介素之組合(IL-12/IL-15)的情況下測試。
圖40展示測試在冷凍培養基中添加PLT Lys、PlasmaLyte及AB血清+不同細胞介素組合(IL-2/IL-15相對於IL-2/IL-21)之計劃。GMP級CAR NK細胞擴增15天相對於22天且使用不同冷凍培養基冷凍保存。
圖41提供具有用於冷凍保存GMP級CAR NK細胞之冷凍培養基之描述的表，該等細胞擴增22天且用於活體內小鼠研究。
圖42展示輸注Raji腫瘤細胞且用在各種冷凍培養基調配物中冷凍保存的CAR NK處理之小鼠之存活率。一組接受新鮮CD19 CAR NK細胞(陽性對照組)，11組接受冷凍CAR NK細胞，其在不同冷凍培養基中冷凍保存且在解凍後立即輸注。一組未接受CAR NK細胞(陰性對照組)。無關於用於冷凍保存CAR NK細胞之冷凍培養基，接受CAR NK細胞之小鼠相較於未處理的小鼠具有統計學上顯著之優良存活率，然而對於第6組、第8組及第11組，存活率明顯地不如接受新鮮CAR NK細胞之小鼠之存活率。第1組(HR=0.811，p=0.78)、第2組(HR=0.6，p=0.49)、第3組(HR=0.916，p=0.90)、第4組(HR=0.859，p=0.83)及第7組(HR=0.883，p=0.87)中經處理之小鼠具有優良存活率，但與用新鮮CAR NK細胞產物處理之小鼠相比，其在統計學上不顯著。
圖43展現如藉由BLI評估，Raji小鼠模型中相比於新鮮CAR NK細胞的冷凍CAR NK細胞之抗腫瘤活性。
圖44-45展示與分別作為陽性及陰性對照組之用新鮮CAR NK細胞處理或無處理小鼠相比，使用圖41中所列之不同條件冷凍之CAR NK細胞處理之小鼠的平均輻射量。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002

Claims (93)

  1. 一種冷凍保存培養基組合物，其包含至少一種冷凍保護劑、至少一種血清或血清之非血清替代物，及至少一種細胞介素及/或至少一種生長因子。
  2. 如請求項1之組合物，其中該冷凍保護劑為二甲亞碸(DMSO)、丙三醇、甘油、羥乙基澱粉(hydroxyethyl starch)或其組合。
  3. 如請求項1或2之組合物，其中該非血清替代物包含血小板溶解產物及/或血液產物溶解產物或人類或動物血清白蛋白。
  4. 如請求項1至3中任一項之組合物，其中該至少一種細胞介素係天然蛋白質、重組蛋白質、合成蛋白質或其混合物。
  5. 如請求項1至4中任一項之組合物，其中該至少一種細胞介素為美國食品藥物管理局(FDA)批准之細胞介素。
  6. 如請求項1至5中任一項之組合物，其中該組合物包含兩種或更多種細胞介素。
  7. 如請求項1至6中任一項之組合物，其中該至少一種細胞介素為IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-22、干擾素、腫瘤壞死因子、幹細胞因子、FLT3-配位體、APRIL、血小板生成素、紅血球生成素，或其組合。
  8. 如請求項1至7中任一項之組合物，其中該血清為動物來源之血清。
  9. 如請求項8之組合物，其中該動物來源之血清為人類血清或牛血清。
  10. 如請求項9之組合物，其中該人類血清係人類AB血清。
  11. 如請求項2至10中任一項之組合物，其中該冷凍保護劑包含該組合物之4%至6%。
  12. 如請求項2至10中任一項之組合物，其中該冷凍保護劑包含該組合物之5%至10%。
  13. 如請求項1至12中任一項之組合物，其中該血清包含該組合物之5%至99%。
  14. 如請求項1至13中任一項之組合物，其中該血清包含該組合物之95%。
  15. 如請求項3至14中任一項之組合物，其中該血小板溶解產物包含該組合物之5%至99%。
  16. 如請求項3至15中任一項之組合物，其中該血小板溶解產物包含該組合物之95%。
  17. 如請求項7至16中任一項之組合物，其中該IL-2以1至5000 U/mL之濃度存在。
  18. 如請求項7至16中任一項之組合物，其中該IL-2以400 U/mL之濃度存在。
  19. 如請求項7至18中任一項之組合物，其中該IL-21以10至3000 ng/mL之濃度存在。
  20. 如請求項7至19中任一項之組合物，其中該IL-21以20 ng/mL之濃度存在。
  21. 如請求項7至19中任一項之組合物，其中該IL-15以10至2000 ng/mL之濃度存在。
  22. 如請求項1至21中任一項之組合物，其中該組合物包含： (a)血小板溶解產物、PlasmaLyte及洛斯維·帕克紀念研究所(Roswell Park Memorial Institute，RPMI)培養基中之一或多者； (b) 聚葡萄糖、白蛋白及DMSO中之一或多者；及 (c) IL-2、IL-15及IL-21中之一或多者。
  23. 如請求項22之組合物，其中該血小板溶解產物係在該組合物之50%與90%之間。
  24. 如請求項22或23之組合物，其中該血小板溶解產物為該組合物之約50%。
  25. 如請求項22或23之組合物，其中該血小板溶解產物為該組合物之約90%。
  26. 如請求項22至25中任一項之組合物，其中該PlasmaLyte係在該組合物之約32.5%與70%之間。
  27. 如請求項22至26中任一項之組合物，其中該PlasmaLyte為該組合物之約32.5%。
  28. 如請求項22至26中任一項之組合物，其中該PlasmaLyte為該組合物之約35%。
  29. 如請求項22至26中任一項之組合物，其中該PlasmaLyte為該組合物之約50%。
  30. 如請求項22至26中任一項之組合物，其中該PlasmaLyte為該組合物之約70%。
  31. 如請求項22至30中任一項之組合物，其中該RPMI係在該組合物之32.5%與50%之間。
  32. 如請求項22至31中任一項之組合物，其中該RPMI為該組合物之約32.5%。
  33. 如請求項22至31中任一項之組合物，其中該RPMI為該組合物之約35%。
  34. 如請求項22至31中任一項之組合物，其中該RPMI為該組合物之約50%。
  35. 如請求項22至34中任一項之組合物，其中該聚葡萄糖為該組合物之約25%至40%。
  36. 如請求項22至34中任一項之組合物，其中該聚葡萄糖為該組合物之約25%。
  37. 如請求項22至34中任一項之組合物，其中該聚葡萄糖為該組合物之約40%。
  38. 如請求項22至37中任一項之組合物，其中該白蛋白為該組合物之約1%至99%。
  39. 如請求項22至38中任一項之組合物，其中該白蛋白為該組合物之約20%。
  40. 如請求項22至39中任一項之組合物，其中該DMSO為該組合物之約5%至7.5%。
  41. 如請求項22至40中任一項之組合物，其中該DMSO為該組合物之5%。
  42. 如請求項22至40中任一項之組合物，其中該DMSO為該組合物之7.5%。
  43. 如請求項1至42中任一項之組合物，其中該組合物包含以下中之一者： 50% RPMI；25%聚葡萄糖；20%人類白蛋白，5% DMSO    50% RPMI；25%聚葡萄糖；20%人類白蛋白，5% DMSO + IL-2/IL-15    35% RPMI；40%聚葡萄糖；20%人類白蛋白，5% DMSO    35% RPMI；40%聚葡萄糖；20%人類白蛋白，5% DMSO + IL-2/IL-15    32.5% RPMI；40%聚葡萄糖；20%人類白蛋白，7.5% DMSO    32.5% RPMI；40%聚葡萄糖；20%人類白蛋白，7.5% DMSO + IL-2/IL-15    50% PlasmaLyte；25%聚葡萄糖；20%人類白蛋白，5% DMSO    50% PlasmaLyte；25%聚葡萄糖；20%人類白蛋白，5% DMSO + IL-2/IL-15    35% PlasmaLyte；40%聚葡萄糖；20%人類白蛋白，5% DMSO    35% PlasmaLyte；40%聚葡萄糖；20%人類白蛋白，5% DMSO + IL-2/IL-15    32.5% PlasmaLyte；40%聚葡萄糖；20%人類白蛋白，7.5% DMSO    32.5% PlasmaLyte；40%聚葡萄糖；20%人類白蛋白，7.5% DMSO + IL-2/IL-15    70% PlasmaLyte；25%聚葡萄糖；5% DMSO + IL-2/IL-15    90%血小板溶解產物(PLT Lys)+ 10% DMSO + IL-2/IL-15    50% PLT lys + 25%聚葡萄糖+20%人類白蛋白+5% DMSO + IL-2/IL-15    50% AB血清+25%聚葡萄糖+20%人類白蛋白+5% DMSO + IL-2/IL-15    50% PLT lys + 25%聚葡萄糖+20%人類白蛋白+5% DMSO + IL-2/IL-21    50% RPMI + 25%聚葡萄糖+20%人類白蛋白+5% DMSO + IL-2/IL-21    50% PlasmaLyte + 25%聚葡萄糖+20%人類白蛋白+5% DMSO + IL-2/IL-21    50%AB血清+25%聚葡萄糖+20%人類白蛋白+5% DMSO + IL-2/IL-21    50% PLT Lys；25%聚葡萄糖於NACL中；20%人類白蛋白；5% DMSO+IL-2/IL-15    50% PLT Lys；25%聚葡萄糖於右旋糖中；20%人類白蛋白；5% DMSO+IL-2/IL-15    25% PLT Lys；50%聚葡萄糖於NACL中；20%人類白蛋白；5% DMSO+IL-2/IL-15    25% PLT Lys；50%聚葡萄糖於右旋糖中；20%人類白蛋白；5% DMSO+IL-2/IL-15    25%聚葡萄糖於NACL中；70%人類白蛋白；5% DMSO+IL-2/IL-15    25%聚葡萄糖於右旋糖中；70%人類白蛋白；5% DMSO+IL-2/IL-15    50%聚葡萄糖於NACL中；45%人類白蛋白；5% DMSO+IL-2/IL-15    50%聚葡萄糖於右旋糖中；45%人類白蛋白；5% DMSO+IL-2/IL-15    50% Plasmalyte；45%人類白蛋白；5% DMSO+IL-2/IL-15    25% Plasmalyte；70%人類白蛋白；5% DMSO+IL-2/IL-15 。
  44. 如請求項1至43中任一項之組合物，其中該組合物包含以下中之一者： 50%血小板溶解產物；25%聚葡萄糖於NACL中；20%人類白蛋白；5% DMSO；加200國際單位(iu)之介白素2及10 ng/ml之介白素15    50%血小板溶解產物；25%聚葡萄糖於右旋糖中；20%人類白蛋白；5% DMSO；加200 iu之介白素2及10 ng/ml之介白素15    25%血小板溶解產物；50%聚葡萄糖於NACL中；20%人類白蛋白；5% DMSO；加200 iu之介白素2及10 ng/ml之介白素15    25%血小板溶解產物；50%聚葡萄糖於右旋糖中；20%人類白蛋白；5% DMSO；加200 iu之介白素2及10 ng/ml之介白素15    25%聚葡萄糖於NACL中；70%人類白蛋白；5% DMSO；加200 iu之介白素2及10 ng/ml之介白素15    25%聚葡萄糖於右旋糖中；70%人類白蛋白；5% DMSO；加200 iu之介白素2及10 ng/ml之介白素15    50%聚葡萄糖於NACL中；45%人類白蛋白；5% DMSO；加200 iu之介白素2及10 ng/ml之介白素15    50%聚葡萄糖於右旋糖中；45%人類白蛋白；5% DMSO；加200 iu之介白素2及10 ng/ml之介白素15    50% Plasmalyte；45%人類白蛋白；5% DMSO；加200 iu之介白素2及10 ng/ml之介白素15    25% Plasmalyte；70%人類白蛋白；5% DMSO；加200 iu之介白素2及10 ng/ml之介白素15    90%血小板溶解產物，10% DMSO 。
  45. 如請求項1至44中任一項之組合物，其進一步包含複數個細胞。
  46. 如請求項44之組合物，其中該等細胞為NK細胞、T細胞、B細胞、iNKT細胞、γ-δT細胞、MSC、巨噬細胞、單核球、樹突狀細胞、衍生自成熟細胞之NKT細胞、腫瘤細胞、幹細胞、誘導性多能幹細胞、MSC，或其混合物。
  47. 如請求項46之組合物，其中該等NK細胞為經擴增之NK細胞。
  48. 一種醫藥組合物，其包含如請求項22至47中任一項之組合物及醫藥學上可接受之載劑。
  49. 一種產生如請求項22至47中任一項之組合物之方法，其包含使該等細胞經受有效量之該冷凍保存培養基組合物之步驟。
  50. 如請求項49之方法，其中該等細胞為免疫細胞或幹細胞。
  51. 如請求項49或50之方法，其中該等細胞為NK細胞、T細胞、NKT細胞、不變(invariant) NKT細胞、B細胞、MSC、單核球、巨噬細胞、衍生自成熟細胞之樹突狀細胞、腫瘤細胞、幹細胞、誘導性多能幹細胞，或造血幹細胞。
  52. 如請求項49至51中任一項之方法，其中該等細胞為經擴增之NK細胞。
  53. 一種細胞群體，其係如請求項49至53中任一項之方法產生。
  54. 如請求項53之群體，及醫藥學上可接受之載劑。
  55. 如請求項53或53之群體，其中該等細胞為免疫細胞或幹細胞。
  56. 如請求項53、54或55之群體，其中該等細胞為NK細胞、T細胞、NKT細胞、B細胞、衍生自成熟細胞之不變NKT細胞、腫瘤細胞、幹細胞、誘導性多能幹細胞，或MSC。
  57. 如請求項56之群體，其中該等NK細胞為經擴增之NK細胞。
  58. 一種治療個體之免疫相關病症的方法，其包含向該個體投與有效量解凍之如請求項53至57中任一項之群體。
  59. 如請求項58之方法，其中該免疫相關病症為癌症、自體免疫病症、移植物抗宿主疾病、同種異體移植排斥，或發炎病狀。
  60. 如請求項58或59之方法，其中該群體包含細胞，該等細胞為NK細胞、T細胞、不變NKT細胞、B細胞、NKT細胞、單核球、巨噬細胞、衍生自成熟細胞之樹突狀細胞、腫瘤細胞、幹細胞、誘導性多能幹細胞，或MSC。
  61. 如請求項58至60中任一項之方法，其中該免疫相關病症為癌症。
  62. 如請求項58至61中任一項之方法，其中該至少一種細胞介素以不提供該個體治療作用之量存在於該組合物中。
  63. 如請求項58至62中任一項之方法，其中在投與步驟之前洗該組合物中之細胞。
  64. 如請求項58至62中任一項之方法，其中在投與步驟之前不洗該組合物中之細胞。
  65. 一種保存對冷凍保存敏感之細胞的方法，其包含使對冷凍保存敏感之細胞經受有效量之如請求項1至47中任一項之冷凍保存培養基組合物的步驟。
  66. 如請求項65之方法，其中該等細胞為NK細胞、T細胞、NKT細胞、B細胞、不變NKT細胞、單核球、巨噬細胞、衍生自成熟細胞之樹突狀細胞、幹細胞、誘導性多能幹細胞，或MSC。
  67. 如請求項65或66之方法，其進一步包含獲得或提供欲經受該冷凍保存培養基組合物之細胞的步驟。
  68. 如請求項65至67中任一項之方法，其中在該等細胞冷凍保存及解凍後，將有效量之該等細胞遞送至有需要之個體。
  69. 如請求項68之方法，其中該等細胞對於該個體為同種異體或自體的。
  70. 如請求項68或69之方法，其中該個體患有癌症、自體免疫病症、移植物抗宿主疾病、同種異體移植排斥，或發炎病狀。
  71. 如請求項68至70中任一項之方法，其中該至少一種細胞介素以不提供該個體治療作用之量存在於該組合物中。
  72. 如請求項68至71中任一項之方法，其中在投與步驟之前洗該組合物中之細胞。
  73. 如請求項68至71中任一項之方法，其中在投與步驟之前不洗該組合物中之細胞。
  74. 一種在冷凍保存細胞群體之後維持該群體之存活率(viability)在至少50%以上之方法，其包含使該群體經受有效量之如請求項1至44中任一項之冷凍保存培養基組合物及解凍該群體之步驟，其中在解凍後，該群體之存活率大於至少50%。
  75. 如請求項74之方法，其中在該群體冷凍保存後，在解凍後該細胞群體之存活率超過至少55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%。
  76. 如請求項74至75中任一項之方法，其中該等細胞為NK細胞、T細胞、NKT細胞、B細胞、衍生自成熟細胞之不變NKT細胞、腫瘤細胞、幹細胞、誘導性多能幹細胞、單核球、巨噬細胞、樹突狀細胞，或MSC。
  77. 一種在冷凍保存細胞群體時延長該群體之存放期的方法，其包含使該群體經受有效量之如請求項1至44中任一項之冷凍保存培養基組合物的步驟。
  78. 如請求項77之方法，其中該等細胞為NK細胞、T細胞、NKT細胞、B細胞、衍生自成熟細胞之不變NKT細胞、腫瘤細胞、幹細胞、誘導性多能幹細胞、單核球、巨噬細胞、樹突狀細胞，或MSC。
  79. 如請求項77或78之方法，其進一步包含獲得該等細胞之步驟。
  80. 如請求項77至79中任一項之方法，其中在該等細胞冷凍保存及解凍後，將有效量之該等細胞遞送至有需要之個體。
  81. 如請求項80之方法，其中該等細胞對於該個體為同種異體或自體的。
  82. 如請求項80或81之方法，其中該個體患有癌症、自體免疫病症、移植物抗宿主疾病、同種異體移植排斥，細菌、病毒或真菌感染，或發炎病狀。
  83. 如請求項80至82中任一項之方法，其中該至少一種細胞介素以不提供該個體治療作用之量存在於該組合物中。
  84. 如請求項80至83中任一項之方法，其中在投與步驟之前洗該組合物中之細胞。
  85. 如請求項80至83中任一項之方法，其中在投與步驟之前不洗該組合物中之細胞。
  86. 一種解凍細胞群體之方法，該細胞群體已用如請求項1至44中任一項之冷凍保存培養基組合物冷凍保存，該方法包含以下步驟： 將該細胞群體暴露於有效量之該冷凍保存培養基組合物以產生冷凍保存群體；及 將該冷凍保存群體暴露於適合解凍條件。
  87. 一種遞送細胞至個體中之目標位點或組織之方法，其包含在解凍細胞之後實質上立即或直接將有效量之細胞輸注至該目標位點或組織之步驟，其中該等細胞冷凍保存在如請求項1至44中任一項之冷凍保存培養基組合物中。
  88. 如請求項87之方法，其中該目標位點或組織為癌。
  89. 如請求項87之方法，其中該目標位點或組織為實體腫瘤。
  90. 如請求項87至89中任一項之方法，其中至少一種細胞介素以不提供該個體治療作用之量存在於該組合物中。
  91. 如請求項87至90中任一項之方法，其中在投與步驟之前洗該組合物中之細胞。
  92. 一或多種免疫細胞，其包含於如請求項1至44中任一項之冷凍保存培養基中。
  93. 如請求項92之一或多種細胞，其中該一或多種細胞為NK細胞、T細胞、不變NKT細胞、B細胞、NKT細胞、單核球、巨噬細胞、衍生自成熟細胞之樹突狀細胞、幹細胞、誘導性多能幹細胞、MSC，或其混合物。
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