TW202104252A - 用於生產car-nk細胞之方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明提供擴增表現嵌合抗原受體及/或T細胞受體之NK細胞之方法。進一步提供藉由投與該等CAR NK細胞治療疾病之方法。

Description

用於生產CAR-NK細胞之方法及其用途

本發明大體上係關於免疫學及醫學領域。更特定言之，其涉及擴增自然殺手(NK)細胞之方法。

儘管於診斷及對診斷有癌症之患者可得之治療選項中之技術進步，預後仍經常保持差且許多患者不可被治癒。免疫療法預示提供對診斷有各種腫瘤之患者之強效，已靶向之治療，具有根除惡性腫瘤細胞而不影響正常組織之潛力。理論上，免疫系統之T細胞能識別特異性針對腫瘤細胞之蛋白質模式且通過各種效應機理介導其破壞。授受性T細胞療法為利用及放大患者之自身T細胞之腫瘤根除能力及然後將此等效應子以使得其有效消除殘留腫瘤但不影響健康組織之狀態返回至患者的嘗試。雖然此方法對腫瘤免疫學領域非新穎，但是臨床使用授受性T細胞療法之許多缺點損害此方法於癌症治療中之完全使用。例如，嵌合抗原受體T細胞(CAR T細胞)係患者特異性且不得不基於個別情況針對各患者生產。

另一方面，源自臍帶血(CB)之自然殺手(NK)細胞提供用於免疫療法之細胞之現成來源及因此利用NK細胞對抗許多腫瘤之固有細胞毒性。雖然已在源自外周血之CAR NK細胞上進行研究，但是此等細胞用於「現成」方法亦不理想。此係因為於各情況下供體已被識別用於NK細胞捐贈。

亦已研究經CAR工程改造之NK92細胞；然而，NK92為源自淋巴瘤患者之NK細胞系，該患者缺少對NK細胞毒性重要之許多NK細胞受體。此外，因為該細胞系係源自患有淋巴瘤之患者，必須在輸注之前將細胞照射。NK細胞受體之此種缺少及對照射之需要顯著損害細胞增殖及持久之能力，使其較表現NK細胞受體之全陣列之經CAR修飾之CB-NK細胞較不有效。因此，存在對產生用於臨床療法之具有高效率之CAR NK細胞之方法之未滿足的需要。

於一個實施例中，本發明提供與針對醫學病狀(諸如癌症)之療法相關之方法及組合物。於特定實施例中，該等方法及組合物涉及免疫療法及/或細胞療法。於具體實施例中，本發明涉及用於生產經工程改造以表現嵌合抗原受體(CAR)及/或T細胞受體(TCR)之自然殺手(NK)細胞之離體方法，其包括在人工呈遞細胞(APC)或其他飼養細胞及至少一種細胞激素之存在下培養NK細胞之起始群體；將CAR及/或TCR表現載體引入NK細胞；及在APC及至少一種細胞激素之存在下將NK細胞於氣體通透性生物反應器中擴增，從而獲得經工程改造之NK細胞之擴增群體。於一些態樣中，該氣體通透性生物反應器為G-Rex®100M。於某些態樣中，該方法不包括進行HLA匹配。於一些替代情況下，該方法之任何或所有步驟在氣體可在不存在滲透生物反應器下發生。

於一些態樣中，該等經工程改造之NK細胞表現CAR。於某些態樣中，該等經工程改造之NK細胞表現TCR。於特定態樣中，該等經工程改造之NK細胞表現CAR及TCR或多種抗原受體。於特定態樣中，該經工程改造之NK細胞之群體係遵從GMP。於特定態樣中，於小於2週，諸如8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天內進行完整方法。於其他態樣中，完整方法可花費3、4週或更多週。於一些態樣中，該等NK細胞相對於個體係異源。於其他態樣中，該等NK細胞相對於個體係自體同源。

於一些態樣中，該NK細胞之起始群體係獲自臍帶血、外周血、骨髓、CD34⁺ 細胞或iPSC。於特定態樣中，該NK細胞之起始群體係獲自臍帶血。於一些態樣中，該臍帶血先前已經冷凍。於某些態樣中，該NK細胞之起始群體係藉由使用ficoll-paque密度梯度分離單核細胞獲得。於一些態樣中，該方法進一步包括耗盡CD3、CD14及/或CD19細胞之單核細胞以獲得NK細胞之起始群體。於一些態樣中，該方法進一步包括耗盡CD3、CD14及CD19細胞之單核細胞以獲得NK細胞之起始群體。於特定態樣中，耗盡包括進行磁性分選。於其他態樣中，NK細胞可使用分選、磁珠選擇或其他方法陽性選擇以獲得NK細胞之起始群體。

於某些態樣中，該等APC為經γ照射之APC。於一些態樣中，該等APC為通用APC (uAPC)。於一些態樣中，該等uAPC經工程改造以表現(1) CD48及/或CS1 (CD319)，(2)膜結合之介白素-21 (mbIL-21)，及(3) 41BB配位體(41BBL)。於特定態樣中，該等NK細胞及APC係在1:1至1:100比率，諸如1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10比率下存在。於某些態樣中，該等NK細胞及APC係在1:2比率下存在。

於一些態樣中，至少一種細胞激素為IL-2、IL-21、IL-15或IL-18。於某些態樣中，NK細胞之培養及/或擴增係在2、3或4種細胞激素之存在下。於一些態樣中，該等細胞激素係選自由IL-2、IL-21、IL-15及IL-18組成之群。於一些態樣中，該至少一種細胞激素(諸如IL-2)係在100至300 U/mL，諸如100、125、150、175、200、225、250、275或300 U/mL之濃度下存在。於某些態樣中，該至少一種細胞激素係在200 U/mL之濃度下存在。

於某些態樣中，引入CAR及/或TCR包括轉導或電穿孔。於一些態樣中，該轉導為重組人纖維連接蛋白(retronectin)轉導。於特定態樣中，該轉導具有至少20%，諸如至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%或更高之效率。於一些態樣中，該CAR及/或TCR表現構築體為慢病毒載體或逆轉錄病毒載體。於某些態樣中，該方法導致至少1000倍擴增，諸如至少1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍或更高擴增。

於一些態樣中，該CAR及/或TCR具有針對以下之抗原特異性：CD19、CD319/CS1、BCMA、CD38、CLL1、CD70、ROR1、CD20、CD5、CD70、CD20、癌胚抗原、α胎蛋白、CA-125、MUC-1、上皮腫瘤抗原、黑色素瘤相關抗原、突變p53、突變ras、HER2/Neu、ERBB2、葉酸結合蛋白、HIV-1封膜醣蛋白gp120、HIV-1封膜醣蛋白gp41、GD2、CD123、CD23、CD30、CD56、c-Met、間皮素、GD3、HERV-K、IL-11Rα、κ鏈、λ鏈、CSPG4、ERBB2、WT-1、EGFRvIII、TRAIL/DR4及/或VEGFR2。於一些態樣中，該CAR及/或表現構築體進一步表現一種細胞激素或2、3或4種細胞激素。於某些態樣中，該細胞激素為IL-15、IL-21、IL-18或IL-2。

於另外態樣中，該方法進一步包括將該經工程改造之NK細胞之群體冷凍保存。於一些態樣中，該等經工程改造之NK細胞經冷凍保存。本文中進一步提供經冷凍保存之NK細胞之群體。

於另一實施例中，提供根據本實施例之方法生產之經工程改造之NK細胞的群體。本文中進一步提供醫藥組合物，其包含該等實施例之經工程改造之NK細胞之群體及醫藥上可接受之載劑。另一實施例提供包含有效量之該等實施例之經工程改造之NK細胞的組合物，其用於治療個體之疾病或病症。本文中亦提供包含有效量之該等實施例之經工程改造之NK細胞之組合物的用途，其用於治療個體之免疫相關病症。

另一實施例提供一種治療個體之免疫相關病症之方法，其包括向該個體投與有效量之該等實施例之經工程改造之NK細胞。於某些態樣中，該方法不包括進行HLA匹配。於特定態樣中，該等NK細胞為在個體與供體之間錯配之KIR配位體。於特定態樣中，該方法不包括進行HLA匹配。於特定態樣中，HLA匹配不存在不會導致移植物抗宿主疾病或毒性。

於一些態樣中，該免疫相關病症為癌症、自體免疫病症、移植物抗宿主疾病、同種異體移植排斥或發炎性病狀。於某些態樣中，該免疫相關病症為發炎性病狀且該等免疫細胞基本上不表現糖皮質激素受體。於一些態樣中，該個體已經或正在接受投與類固醇療法。於一些態樣中，該等NK細胞係自體同源。於某些態樣中，該等NK細胞係異源。

於特定態樣中，該免疫相關病症為癌症。於一些態樣中，該癌症為實體癌症或血液惡性病。

於另外態樣中，該方法進一步包括投與至少第二治療劑。於一些態樣中，該至少第二治療劑包括化療、免疫療法、手術、放射療法或生物療法。於特定態樣中，該等NK細胞及/或至少第二治療劑係經靜脈內、經腹膜內、經氣管內、經鞘內、經腫瘤內、經肌肉內、經內視鏡、經病灶內、經皮、經皮下、局部、或藉由直接注射或輸注投與。可依序或同時投與組合療法。

另一實施例提供一種治療個體之任何類型之感染的方法，其包括向該個體投與有效量之該等實施例之經工程改造之NK細胞。於某些態樣中，該方法不包括進行HLA匹配。於特定態樣中，該等NK細胞為在個體與供體之間錯配之KIR配位體。於特定態樣中，該方法不包括進行HLA匹配。於一些態樣中，該等NK細胞為在個體與供體之間錯配之KIR配位體。於特定態樣中，HLA匹配不存在不會導致移植物抗宿主疾病或毒性。於一些態樣中，該等NK細胞係自體同源。於某些態樣中，該等NK細胞係異源。

本發明之其他目標、特徵及優點將自下列實施方式變得顯然。然而，應瞭解，當指示本發明之較佳實施例時，詳細描述及特定實例僅經由說明提供，因為本發明之精神及範圍內之各種變化及修改將自此詳細描述變得對熟習此項技術者顯然。

本申請案主張2019年3月29日申請之美國臨時專利申請案序號62/826,856之優先權，其全文係以引用的方式併入本文中。

已利用經靶向CD19⁺ 淋巴癌之逆轉錄病毒載體轉導之源自人類臍帶血的自然殺手(CB-NK)細胞看見令人鼓舞的臨床結果。已產生靶向骨髓瘤、多發性骨髓瘤及實體腫瘤癌症抗原的許多另外CAR-NK細胞構築體。於一些實施例中，本發明提供NK細胞之穩健擴增之方法。該等細胞可係獲自經冷凍或解凍之CB單元及於含有與抗原呈遞細胞(APC)，諸如通用抗原呈遞細胞(uAPC)或其他飼養細胞及細胞激素，諸如介白素(IL)-2之共培養物之氣體通透性生物反應器中擴增。

使用CAR NK細胞用於臨床療法之一個限制係因為其小的數目及其於解凍後差的生存。本研究藉由使用用於CAR NK細胞之離體擴增之GMP遵從策略來解決此等限制中之兩者。本方法導致兩週內擴增中值2200倍，具有約66%之優異CAR轉導效率。使用此策略，針對患者之治療可產生至多400個劑量的1 x10⁶ 個CAR NK細胞/kg。

因此，本發明之某些實施例提供涉及意欲用於細胞及免疫療法之臨床級NK細胞之製造、擴增、品質控制及功能表徵的方法及組合物。用於輸注至患者之NK細胞之生長及建模臨床相關數目同時滿足時間限制甚至於最佳環境中極具挑戰性。所揭示方法及組合物詳述NK細胞製造之方法，可達成NK細胞擴增之細節及動力學，及證實成功細胞建模之分子表徵。

本方法提供具有CAR構築體之NK細胞之高且一致轉導水平及高強效CB-CAR-NK細胞之快速生產，該等細胞可經新鮮輸注或冷凍用於隨後輸注。本文中所提供之冷凍CAR-NK細胞產品為真正「現成」細胞療法，其可經解凍及輸注至患者而對生產無延遲需要。

此外，本研究已證實輸注NK細胞及CAR-NK細胞之安全性，該等細胞不與患者HLA匹配。因此，不再需要HLA匹配及解凍產品之穩健功效之組合導致使用CAR基療法之樣式變換，其中CAR-NK細胞現可經製備成「現成」產品，其可作為即時護理產品輸注。本策略亦可適用於來自任何來源，包括外周血、骨髓、造血幹細胞、誘導多能幹細胞或NK細胞系之NK細胞。

於特定態樣中，該等NK細胞可自與APC (諸如K-562基飼養細胞或其他飼養細胞(諸如淋巴母細胞系或珠))及一或多種細胞激素(包括IL-2、IL-15、IL-12、IL21或lL-18)共培養之健康供體之臍帶CB分離。然後可將該等NK細胞用逆轉錄病毒、慢病毒、腺病毒或腺相關病毒載體轉導，或用靶向血液癌及實體癌症之睡美人(sleeping beauty)或背馱式(piggy-back)構築體電穿孔。然後可將經轉導之細胞進一步於含有與APC或其他飼養細胞及IL-2或其他細胞激素之共培養物之氣體通透性生物反應器中擴增以獲得強效經CAR轉導之CB-NK細胞。彼等細胞可經新鮮輸注，或可經冷凍用於稍後日期解凍及輸注。

用於異源環境中之輸注之CAR-T細胞必須經HLA匹配或經遺傳操縱以移除T細胞受體以防止致死GVHD。先前研究已使用CB單元產生臨床NK細胞及CAR-NK細胞產品，出於安全性及符合對CB移植匹配之要求，該等產品在4/6 HLA抗原下匹配。然而，於本研究中，將2名患者用源自異源CB之NK細胞處理，該等細胞未在任何抗原下與患者經HLA匹配且無毒性。其經安全輸注，無GVHD或其他毒性及與4/6 HLA匹配之NK細胞相比於患者中可比較的持久性。此已建立使用CB單元產生NK及CAR-NK細胞產品之目前平臺，而不需要任何HLA匹配。自用於NK細胞生產之CB庫隨機選擇CB單元藉由消除對患者之HLA分型及然後與CB單元匹配之需要而顯著擴大可得CB單元之數目且改善療法之時程及邏輯。

於另外態樣中，本方法可包括識別及選擇用於CAR NK生產之CB單元，該等CB單元針對殺手免疫球蛋白受體(KIR)配位體經分型及與接受者錯配。自KIR-配位體錯配之所得同種異體反應性可藉由與CAR介導之腫瘤細胞之識別協同而進一步增強經CAR轉導之NK細胞之活性。的確，本研究已顯示使用HLA阻斷抗體來阻斷KIR-配位體相互作用可顯著增強CAR-NK介導之CLL靶之細胞毒性(圖8)。

本發明經CAR轉導之NK細胞可提供用於許多癌症(包括液體及實體腫瘤二者)之免疫療法之細胞之現成來源。源自CB之NK細胞之逆轉錄病毒轉導允許於許多癌症之免疫療法中使用且潛在用於治療感染(包括病毒、細菌及真菌)及藉由靶向自體反應性B或T細胞之自體免疫病症的經工程改造之細胞的更長持久性及提高之功效。I. 定義

如本文中所用，就指定組分而言，本文中使用「實質上無」意指指定組分中無一者經故意調配至組合物中及/或僅呈污染物或以痕量存在。因此，自組合物之任何非預期污染產生之指定組分之總量良好地在0.05%以下，較佳地在0.01%以下。最佳為其中不可利用標準分析方法檢測到指定組分之量之組合物。

如本文說明書中所用，「一(a/an)」可意指一或多個。如本文申請專利範圍中所用，當結合單詞「包含」使用時，單詞「一(a/an)」可意指一個或超過一個。

除非明確指定係指僅替代物或替代物係相互排斥，否則於申請專利範圍中使用術語「或」係用於意指「及/或」，雖然本發明支持係指僅替代物及「及/或」之定義。如本文中所用，「另一」可意指至少第二者或更多。

整篇本申請案，術語「約」係用於指示值，其包含為測定值該正在採用之裝置、方法之誤差之固有變化，或在研究個體中存在之變化。

「免疫病症」、「免疫相關病症」或「免疫介導之病症」係指其中免疫反應於疾病之發展或進展中起重要作用之病症。免疫介導之病症包括自體免疫病症、異種移植排斥、移植物抗宿主疾病及發炎性及過敏病狀。

「免疫反應」為免疫系統之細胞，諸如B細胞或T細胞或天生免疫細胞對刺激物之反應。於一個實施例中，該反應對特定抗原係特異性(「抗原特異性反應」)。

「自體免疫疾病」係指疾病，其中免疫系統對抗為正常宿主之一部分之抗原(即，自體抗原)產生免疫反應(例如，B-細胞或T-細胞反應)，隨之組織損傷。自體抗原可係源自宿主細胞或可係源自共生生物體，諸如正常定殖黏膜表面之微生物(稱作共生生物體)。

「治療」疾病或病狀或疾病或病狀之治療係指執行方案，其可包括向患者投與一或多種藥物，努力減輕疾病之徵兆或症狀。治療之所需效果包括減少疾病進展之速率、改善或減輕疾病狀態及緩解或改善之預後。減輕可在疾病或病狀出現之徵兆或症狀之前，以及於其出現之後發生。因此，「治療(treating/treatment)」可包括疾病或非所需病狀之「預防(preventing/prevention)」。此外，「治療(treating/treatment)」不需要徵兆或症狀之完全減輕，不需要治癒，及特定言之包括僅對患者具有邊緣效果之方案。

如整篇本申請案所用，術語「治療效益」或「治療上有效」係指促進或增強個體與此病狀之醫學治療相關之幸福感之任何事情。此包括(但不限於)疾病之徵兆或症狀之頻率或嚴重度之降低。例如，癌症之治療可涉及例如腫瘤大小之減少、腫瘤侵襲之減少、癌症之生長率之減少或轉移之預防。癌症之治療亦可係指延長患有癌症之個體之生存。

「個體」及「患者」係指人類或非人類，諸如靈長類動物、哺乳動物及脊椎動物。於特定實施例中，該個體為人類。

短語「醫藥或生理上可接受」係指當視情況向動物(諸如人類)投與時，不產生不利、過敏或其他非所需反應之分子實體及組合物。包含抗體或另外活性成分之醫藥組合物之製備將按照本發明為熟習此項技術者已知。此外，針對動物(例如，人類)投與，應瞭解，製備應滿足如由生物標準之FDA辦公室所要求之無菌、熱原性、一般安全性及純化標準。

如本文中所用，「醫藥上可接受之載劑」包括任何及所有水性溶劑(例如，水、醇/水溶液、鹽水溶液、非經腸媒劑，諸如氯化鈉、林格氏(Ringer's)右旋糖等)、非水性溶劑(例如，丙二醇、聚乙二醇、植物油及可注射有機酯，諸如油酸乙酯)、分散介質、塗料、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如，抗細菌劑或抗真菌劑、抗氧化劑、螯合劑及惰性氣體)、等滲劑、吸收延遲劑、鹽、藥物、藥物穩定劑、凝膠、黏合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、調味劑、染料、流體及營養補充劑、類似材料及其組合，如為一般技術者已知。根據熟知參數調整醫藥組合物中之各種組分之pH及精確濃度。

術語「單倍分型或組織分型」係指用於例如藉由測定哪些ΗLA基因座在特定個體之淋巴細胞上表現來識別個體之單倍型或組織類型之方法。ΗLA基因位於主要組織相容性複合體(MΗC)，染色體6之短臂上之區，且涉及細胞間相互作用、免疫反應、器官移植、癌症之發展及對疾病之易感性。存在於移植中重要的六種遺傳基因座，指定為HLA-A、HLA-B、HLA-C、及HLA-DR、HLA-DP及HLA-DQ。在各基因座處，可存在若干不同對偶基因中之任一者。

針對單倍分型廣泛使用之方法使用聚合酶鏈反應(PCR)比較個體的DNA與編碼MHC抗原之基因之已知片段。基因之此等區之可變性確定個體之組織類型或單倍型。血清學方法亦用於檢測細胞表面上之血清學限定之抗原。HLA-A、-B及-C決定子可藉由已知血清技術量測。簡言之，將來自個體(自新鮮外周血分離)之淋巴細胞與識別所有已知HLA抗原之抗血清培育。將細胞於具有含各種抗血清之顯微鏡孔之盤子中散佈。將該等細胞培育30分鐘，接著另外60分鐘補充培育。若淋巴細胞在其表面上具有藉由抗血清中之抗體識別之抗原，則將該等淋巴細胞溶解。可添加染料以顯示細胞膜之滲透性之變化及細胞死亡。藉由溶解破壞之細胞之模式指示組織不相容性之程度。例如，若來自針對HLA-A3測試之人之淋巴細胞於含有針對HLA-A3之抗血清之孔中被破壞，則該測試對此抗原組係陽性。

術語「抗原呈遞細胞(APC)」係指能呈遞可藉由免疫系統之特定效應細胞識別之肽-MHC複合體之形式之一或多種抗原，及從而誘導針對抗原或正在呈遞之抗原之有效細胞免疫反應的一類細胞。術語「APC」涵蓋完整全細胞，諸如巨噬細胞、B細胞、內皮細胞、經活化之T細胞及樹突狀細胞，或能呈遞抗原之天然產生或合成分子，諸如與ÿ2-微球蛋白複合之經純化之MHC I類分子。II. 經工程改造之 NK 細胞

於某些實施例中，本發明提供用於生產經工程改造之抗原受體(例如，CAR及/或TCR) NK細胞之方法，其包括用人工呈遞細胞(APC)及細胞激素培育細胞，將該等細胞用CAR構築體轉導，及在APC及細胞激素之存在下擴增該等細胞。該CAR及/或TCR構築體可為逆轉錄病毒或慢病毒載體或可經電穿孔。該方法可包括自臍帶血、外周血、骨髓、CD34⁺ 細胞或iPSC，特定言之自臍帶血獲得細胞之起始群體。然後可使起始細胞群體經受Ficoll-Paque密度梯度以獲得單核細胞(MNC)。然後可將該等MNC耗盡CD3、CD14及/或CD19細胞用於NK細胞之陰性選擇或可藉由CD56選擇陽性選擇。然後可將NK細胞用APC及細胞激素(諸如IL-2、IL-21及IL-18)培育，接著CAR轉導，諸如逆轉錄病毒轉導。可將該等經工程改造之NK細胞進一步在經照射之APC及細胞激素(諸如IL-2)之存在下擴增。

用於本方法之APC可為基於K-562之飼養細胞、淋巴母細胞細胞系或通用抗原呈遞細胞(uAPC)，或基於非細胞方法，例如使用珠、細胞粒子或胞外體。本文中「UAPC」係指針對免疫細胞，特定言之NK細胞之最佳擴增設計之抗原呈遞細胞。該等UAPC可藉由共刺激分子之獨特組合產生以克服抑制信號且誘導最佳及特異性NK細胞殺死功能。示例性APC藉由膜結合介白素21 (mbIL-21)及4-1BB配位體於NK細胞敏感性K562抗原呈遞細胞系(APC) 中之強迫表現產生(稱作純系46)。於另一實施例中，UAPC藉由mbIL-21、4-1BB配位體及CD48於K562細胞中之強迫表現產生(稱作通用APC (UAPC))。於另一實施例中，UAPC藉由mbIL-21、4-1BB配位體及CS1於K562細胞中之強迫表現產生(稱作UAPC2)。可產生UAPC以表現mbIL-21、41BBL及NK-細胞特異性抗原，諸如SLAM家族抗原。

在不存在完全HLA-匹配下，本發明之經工程改造及擴增之NK細胞較現成CAR T細胞較少可能引起移植物抗宿主疾病(GVHD)。此外，源自CB之經工程改造之NK細胞(諸如CAR NK或TCR NK細胞)可用於產生用於免疫療法之NK細胞之庫而不必募集用於NK細胞收集之供體。

於某些實施例中，NK細胞係藉由此項技術中熟知方法源自人類外周血單核細胞(PBMC)、未經刺激之白細胞去除術產品(PBSC)、人類胚胎幹細胞(hESC)、誘導多能幹細胞(iPSC)、骨髓或臍帶血。特定言之，NK細胞可自臍帶血(CB)、外周血(PB)、骨髓或幹細胞分離。於特定實施例中，該等免疫細胞係自彙集之CB分離。該等CB可自2、3、4、5、6、7、8、10個或更多個單元彙集。該等免疫細胞可係自體同源或異源。經分離之NK細胞可為針對待投與細胞療法之個體匹配之單倍型。NK細胞可藉由特定表面標記物，諸如人類中之CD16及CD56檢測。

於某些態樣中，NK細胞之起始群體係藉由使用ficoll密度梯度離心分離單核細胞獲得。細胞培養可耗盡表現CD3、CD14及/或CD19細胞之任何細胞且可經表徵以測定CD56⁺ /CD3^- 細胞或NK細胞之百分比。

在存在APC，特定言之經照射之APC，諸如UAPC下將細胞擴增。擴增可係持續約2至30天或更長，諸如3至20天，特定言之12至16天，諸如12、13、14、15、16、17、18或19天，特定言之約14天。NK細胞及APC可在約3:1至1:3，諸如2:1、1:1、1:2，特定言之約1:2之比率下存在。擴增培養物可進一步包含細胞激素以促進擴增，諸如IL-2、IL-21及/或IL-18。細胞激素可在約10至500 U/mL，諸如100至300 U/mL，特定言之約200 U/mL之濃度下存在。可於擴增培養物中補充細胞激素，諸如每2至3天。可至少第二次，諸如於CAR轉導後將APC添加至培養物中。

於擴增後，免疫細胞可立即輸注或可經儲存，諸如藉由冷凍保存。於某些態樣中，細胞可於約1、2、3、4、5天內離體作為混合群體繁殖幾天、幾週或幾個月。

於一個實施例中，細胞之起始群體為藉由ficoll密度梯度自單一CB單元分離之MNC。然後可將細胞洗滌及耗盡CD3、CD14及CD19陽性細胞，諸如藉由使用CliniMACS免疫磁珠(Miltenyi Biotec)。可收集未經標記之經濃化之CB-NK細胞，用CliniMACS緩衝液洗滌，計數及與經照射(例如，100 Gy)之APC，諸如以1:2比率組合。可將細胞培養物(例如，1 x 10⁶ 個細胞/mL)轉移至含有NK完全培養基(例如，90%幹細胞生長培養基，10% FBS，2 mM L-麩胺醯胺)及IL-2，諸如50至500，諸如100至300，諸如200 U/mL之細胞培養燒瓶中。可將細胞在37℃下於5% CO₂ 中培育。在第3天，培養基改變可藉由離心收集細胞及將其再懸浮於含IL-2，諸如50至500，諸如100至300，諸如200 U/mL之NK完全培養基(例如，1 x 10⁶ 個細胞/mL)中進行。可將細胞在37℃下於5% CO₂ 中培育。在第5天，用於重組人纖維連接蛋白轉導所需之孔之數目可藉由培養物中之CB-NK細胞之數目確定。可將重組人纖維連接蛋白溶液平板接種至24孔培養板之孔。可將該等板密封及儲存於4℃冰箱中。

在第6天，可進行如第0天所述之第二次NK選擇，然後CB-NK細胞之轉導。可將該等細胞用CliniMACS緩衝液洗滌，離心及再懸浮於具有IL-2，諸如100至1000，特定言之600 U/mL之0.5 x 10⁶ /mL之NK完全培養基中。然後可將重組人纖維連接蛋白板用NK完全培養基洗滌及在37℃下培育直至使用。可將各孔中之NK完全培養基用逆轉錄病毒上清液替換，接著在32℃下將板離心。然後可將逆轉錄病毒上清液抽吸及用新鮮逆轉錄病毒上清液替換。可將含有0.5 x 10⁶ 個細胞及600 U/mL IL-2之CB-NK細胞懸浮液添加至各孔，及可將板離心。然後可將板在37℃與5% CO₂ 下培育。在第9天，可將經CAR轉導之CB-NK細胞自轉導板移除，藉由離心收集及於具有200 U/mL IL-2之NK完全培養基中用經照射(例如，100 Gy)之aAPC，諸如以1:2之比率刺激。將細胞培養燒瓶在37℃與5% CO₂ 下培育。在第12天，可進行培養基改變。在第14天，可藉由離心收集細胞，可將上清液抽吸及可將細胞再懸浮於含200 U/mL IL-2之新鮮NK完全培養基中。將細胞培養燒瓶在37℃與5% CO₂ 下培育。若存在超過1 x 10⁵ 個CD3⁺ 細胞/kg，則可使用CliniCliniMACS CD3試劑進行CD3⁺ 細胞之磁性免疫耗盡。在第15天，收穫細胞及製備最終產品用於輸注或冷凍保存。

經擴增之NK細胞可分泌I型細胞激素，諸如干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α及粒細胞-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)，其活化先天及授受性免疫細胞二者以及其他細胞激素及趨化因子。此等細胞激素之量測可用於測定NK細胞之活化狀態。此外，此項技術中已知之用於測定NK細胞活化之其他方法可用於表徵本發明之NK細胞。B. 生物反應器

可將NK細胞於功能關閉系統，諸如生物反應器中擴增。擴增可於氣體通透性生物反應器，諸如G-Rex®細胞培養裝置中進行。生物反應器可支持平均450 mL體積中1x10⁹ 至3x10⁹ 個總細胞。

生物反應器可根據一般類別分組，其包括：靜態生物反應器、經攪拌之燒瓶生物反應器、旋轉壁容器生物反應器、中空纖維生物反應器及直接輸注生物反應器。於生物反應器內，細胞可係游離或經固定，接種在多孔3維支架(水凝膠)上。

中空纖維生物反應器可用於增強在培養期間之質量轉移。中空纖維生物反應器為基於中空纖維之3D細胞培養系統，其為於平行陣列中排列之小的可半滲透毛細管膜，具有10至30 kDa之典型分子量截止(MWCO)範圍。此等中空纖維膜經常經成束及安置於管狀聚碳酸酯殼內以創建中空纖維生物反應器筒。於該等筒中，亦安裝有入口及出口埠，為兩隔室：中空纖維內之毛細管間(IC)空間，及中空纖維周圍之毛細管外(EC)空間。

因此，針對本發明，生物反應器可為中空纖維生物反應器。中空纖維生物反應器可具有嵌入纖維之內腔內之細胞，其中介質灌注腔外空間，或可提供通過中空纖維之氣體及介質灌注，其中細胞生長於腔外空間內。

中空纖維應適用於遞送營養物及移除生物反應器中之廢物。中空纖維可係任何形狀，例如，其可係圓形及管形或呈同軸環之形式。中空纖維可由可再吸收或非可再吸收膜組成。例如，中空纖維之適宜組分包括聚二氧雜環己酮、聚丙交酯、聚半乳糖結合蛋白(polyglactin)、聚乙醇酸、聚乳酸、聚乙醇酸/三亞甲基碳酸酯、纖維素、甲基纖維素、纖維素聚合物、纖維素酯、再生纖維素、普朗尼克(pluronic)、膠原蛋白、彈性蛋白及其混合物。

生物反應器可在接種細胞之前起動注給。該起動注給可包括用緩衝液，諸如PBS沖刷。該啟動亦可包括將生物反應器用細胞外基質蛋白，諸如纖維連接蛋白塗覆。然後可將該生物反應器用培養基，諸如αMEM洗滌。

於特定實施例中，本方法使用G-Rex®生物反應器。G-Rex®燒瓶之基礎為細胞駐留其上之氣體通透性膜。因此，細胞係於高度氧化環境中，允許其生長至高密度。系統容易擴大規模及需要較少頻繁培養操作。G-Rex®燒瓶與標準組織培養培育器及細胞實驗室設備相容，從而降低開始ACT方案所需之專有設備及資本投資。

細胞可於生物反應器中在約100至1000個細胞/cm² ，諸如約150個細胞/cm² 、約200個細胞/cm² 、約250個細胞/cm² 、約300個細胞/cm² ，諸如約350個細胞/cm² ，諸如約400個細胞/cm² ，諸如約450個細胞/cm² ，諸如約500個細胞/cm² ，諸如約550個細胞/cm² ，諸如約600個細胞/cm² ，諸如約650個細胞/cm² ，諸如約700個細胞/cm² ，諸如約750個細胞/cm² ，諸如約800個細胞/cm² ，諸如約850個細胞/cm² ，諸如約900個細胞/cm² ，諸如約950個細胞/cm² ，或約1000個細胞/cm² 之密度下接種。特定言之，細胞可在約400至500個細胞/cm² ，諸如約450個細胞/cm² 之細胞密度下接種。

接種於生物反應器中之細胞之總數目可係約1.0x10⁶ 至約1.0x10⁸ 個細胞，諸如約1.0x10⁶ 至5.0x10⁶ 、5.0x10⁶ 至1.0x10⁷ 、1.0x10⁷ 至5.0x10⁷ 、5.0x10⁷ 至1.0x10⁸ 個細胞。於特定態樣中，接種於生物反應器中之細胞之總數目係約1.0x10⁷ 至約3.0x10⁷ ，諸如約2.0×10⁷ 個細胞。

細胞可接種於任何適宜細胞培養基中，其中之許多係可自市面上購得。示例性培養基包括DMEM、RPMI、MEM、培養基199、HAMS及類似者。於一個實施例中，該培養基為αMEM培養基，特定言之補充有L-麩胺醯胺之αMEM。該培養基可補充有下列中之一或多者：生長因子、細胞激素、激素、或B27、抗生素、維他命及/或小分子藥物。特定言之，該培養基可係無血清。

於一些實施例中，細胞可在室溫下培育。培育器可經加濕且具有約5% CO₂ 及約1% O₂ 之氛圍。於一些實施例中，CO₂ 濃度範圍可自約1至20%、2至10%、或3至5%。於一些實施例中，O₂ 濃度範圍可自約1至20%、2至10%、或3至5%。C. 經遺傳工程改造之抗原受體

本發明之NK細胞可經遺傳工程改造以表現抗原受體，諸如經工程改造之TCR及/或CAR。例如，該等NK細胞經修飾以表現具有針對癌症抗原之抗原特異性之TCR。可將諸如至不同抗原之多個CAR及/或TCR添加至NK細胞。

修飾之適宜方法係此項技術中已知。參見，例如，Sambrook及Ausubel，見上。例如，可使用Heemskerk等人，2008及Johnson等人，2009中所述之轉導技術將細胞轉導以表現具有針對癌症抗原之抗原特異性之TCR。

針對全長TCR α及β (或γ及δ)鏈之RNA編碼之電穿孔可用作替代方案以克服由逆轉錄病毒轉導及內源TCR鏈之配對引起之自體反應性之長期問題。即使此替代配對發生於暫態轉染策略中，可能產生之自體反應性T細胞將於一段時間後失去此自體反應性，因為僅短暫表現經引入之TCR α及β鏈。當經引入之TCR α及β鏈表現減少時，僅正常自體同源T細胞留下。此非當藉由穩定逆轉錄病毒轉導引入全長TCR鏈時之情況，其將從不失去經引入之TCR鏈，引起患者之恆定呈現自體反應性。

於一些實施例中，細胞包含經由遺傳工程改造引入之編碼一或多個抗原受體之一或多個核酸，及此等核酸之經遺傳工程改造之產物。於一些實施例中，核酸係異源，即，正常不存在於細胞或獲自該細胞之樣本中，諸如獲自另一生物體或細胞者，其例如一般未於經工程改造之細胞及/或衍生此細胞之生物體中發現。於一些實施例中，核酸非天然產生，諸如未於自然中發現之核酸(例如，嵌合)。

於一些實施例中，CAR含有特異性結合至抗原之細胞外抗原識別域。於一些實施例中，抗原為在細胞表面上表現之蛋白質。於一些實施例中，CAR為TCR樣CAR且抗原為經加工之肽抗原，諸如細胞內蛋白之肽抗原，其如TCR在主要組織相容性複合體(MHC)分子之背景下在細胞表面被識別。

包括CAR及重組TCR之示例性抗原受體，以及用於工程改造及引入受體至細胞之方法，包括例如國際專利申請公開案號WO200014257、WO2013126726、WO2012/129514、WO2014031687、WO2013/166321、WO2013/071154、WO2013/123061、美國專利申請公開案號US2002131960、US2013287748、US20130149337、美國專利案：第6,451,995號、第7,446,190號、第8,252,592號、第8,339,645號、第8,398,282號、第7,446,179號、第6,410,319號、第7,070,995號、第7,265,209號、第7,354,762號、第7,446,191號、第8,324,353號及第8,479,118號，及歐洲專利申請案號EP2537416中所述之彼等，及/或由Sadelain等人，2013；Davila等人，2013；Turtle等人，2012；Wu等人，2012所述之彼等。於一些態樣中，經遺傳工程改造之抗原受體包括如美國專利案第7,446,190號中所述之CAR，及國際專利申請公開案第WO/2014055668 Al號中所述之彼等。1. 嵌合抗原受體

於一些實施例中，CAR包含：a)細胞內信號傳導域，b)跨膜域，及c)包含抗原結合區之細胞外域。

於一些實施例中，經工程改造之抗原受體包括CAR，包括活化或刺激CAR、共刺激CAR (參見WO2014/055668)及/或抑制CAR (iCAR，參見Fedorov等人，2013)。CAR一般包含連接至一或多個細胞內信號傳導組分之細胞外抗原(或配位體)結合域，於一些態樣中經由連接子及/或跨膜域連接。此等分子通常模擬或靠近通過天然抗原受體之信號、通過此受體與共刺激受體之組合之信號及/或僅通過共刺激受體之信號。

本發明之某些實施例涉及核酸，包括編碼抗原特異性CAR多肽之核酸之用途，該抗原特異性CAR多肽包括經人源化以降低免疫原性之CAR (hCAR)，該CAR包含細胞內信號傳導域、跨膜域及包含一或多個信號傳導基序之細胞外域。於某些實施例中，該CAR可識別包含一或多個抗原之間之共用空間的抗原決定基。於某些實施例中，結合區可包括單株抗體之互補決定區、單株抗體之可變區及/或其抗原結合片段。於另一實施例中，該特異性係源自結合至受體之肽(例如，細胞激素)。

設想人類CAR核酸可為用於增強針對人類患者之細胞免疫療法之人類基因。於特定實施例中，本發明包含全長CAR cDNA或編碼區。該等抗原結合區或域可包含源自特定人類單株抗體之單鏈可變片段(scFv)之V_H 及V_L 鏈之片段，諸如美國專利案7,109,304中所述之彼等，其以引用的方式併入本文中。該片段亦可為任何數目之人類抗原特異性抗體之不同抗原結合域。於更特定實施例中，該片段為藉由經最佳化用於人類密碼子用途以於人類細胞中表現之序列編碼的抗原特異性scFv。

排列可係多聚，諸如二抗體或多聚體。多聚體最可能藉由輕鏈及重鏈之可變部分之交叉配對為二抗體形成。構築體之鉸鏈部分可具有多個替代，自完全缺失至具有維持之第一半胱胺酸，至脯胺酸而非絲胺酸取代，至截短至第一半胱胺酸。Fc部分可缺失。穩定及/或二聚之任何蛋白質可用於此目的。吾人可使用Fc域中之僅一者，例如，來自人類免疫球蛋白之CH2或CH3域。吾人亦可使用已經修飾以改善二聚之人類免疫球蛋白之鉸鏈、CH2及CH3區。吾人亦可僅使用人類免疫球蛋白之鉸鏈部分。吾人亦可使用CD8α之部分。

於一些實施例中，CAR核酸包含編碼其他共刺激受體，諸如跨膜域及經修飾之CD28細胞內信號域之序列。其他共刺激受體包括(但不限於) CD28、CD27、OX-40 (CD134)、DAP10、DAP12及4-1BB (CD137)中之一或多者。除了藉由CD3ζ啟動之初始信號外，藉由插入人類CAR之人類共刺激受體提供之另外信號對NK細胞之完全活化係重要的且可幫助改善授受性免疫療法之活體內持久性及治療成功。

於一些實施例中，構築CAR，其具有對特定抗原(或標記物或配位體)，諸如於待藉由授受性療法靶向之特定細胞類型中表現之抗原，例如，癌症標記物，及/或意欲誘導衰減反應之抗原，諸如在正常或非疾病細胞類型上表現之抗原之特異性。因此，該CAR通常包含一或多個抗原結合分子(諸如一或多個抗原結合片段、域或部分，或一或多個抗體可變域，及/或抗體分子)於其細胞外部分。於一些實施例中，該CAR包含抗體分子之抗原結合部分，諸如源自單株抗體(mAb)之可變重鏈(VH)及可變輕鏈(VL)之單鏈抗體片段(scFv)。

於嵌合抗原受體之某些實施例中，受體之抗原特異性部分(其可被稱作包含抗原結合區之細胞外域)包含腫瘤相關抗原或病原體特異性抗原結合域。抗原包括藉由模式-識別受體，諸如Dectin-1識別之糖類抗原。腫瘤相關抗原可為任何種類，只要其在腫瘤細胞之細胞表面上表現。腫瘤相關抗原之示例性實施例包括CD19、CD20、癌胚抗原、α胎蛋白、CA-125、MUC-1、CD56、EGFR、c-Met、AKT、Her2、Her3、上皮腫瘤抗原、黑色素瘤相關抗原、突變p53、突變ras等。於某些實施例中，當存在少量腫瘤相關抗原時，該CAR可與細胞激素共表現以改善持久性。例如，CAR可與IL-15共表現。

編碼嵌合受體之開放讀碼框之序列可獲自基因組DNA來源、cDNA來源，或可經合成(例如，經由PCR)，或其組合。取決於基因組DNA之大小及內含子之數目，可期望使用cDNA或其組合，因為發現內含子使mRNA穩定。同樣，可進一步有利使用內源或外源非編碼區以穩定mRNA。

設想可將嵌合構築體呈裸露DNA或於適宜載體中引入免疫細胞中。藉由電穿孔使用裸露DNA穩定轉染細胞之方法係此項技術中已知。參見，例如，美國專利案第6,410,319號。裸露DNA一般係指以適當表現取向編碼含於質粒表現載體中之嵌合受體之DNA。

或者，可使用病毒載體(例如，逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體或慢病毒載體)將嵌合構築體引入免疫細胞中。用於根據本發明之方法之適宜載體為於免疫細胞中非複製。基於病毒之大量載體係已知，其中維持於細胞中之病毒之複製數目係足夠低以維持細胞之活力，諸如，例如，基於HIV、SV40、EBV、HSV或BPV之載體。

於一些態樣中，抗原特異性結合或識別組分連接至一或多個跨膜域及細胞內信號域。於一些實施例中，該CAR包含融合至CAR之細胞外域之跨膜域。於一個實施例中，使用與CAR之域中之一者天然相關之跨膜域。於一些實例中，該跨膜域係經選擇或藉由胺基酸取代修飾以避免此等域結合至相同或不同表面膜蛋白之跨膜域以最小化與受體複合體之其他成員之相互作用。

於一些實施例中，跨膜域係源自天然或合成來源。在來源係天然之情況下，於一些態樣中，該域係源自任何膜結合蛋白或跨膜蛋白。跨膜區包含源自T細胞受體、CD28、CD3 ζ、CD3 ε、CD3 γ、CD3 δ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD 16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD 134、CD137、CD154、ICOS/CD278、GITR/CD357、NKG2D及DAP分子之α、β或ζ鏈之彼等(即，包含該鏈之至少跨膜區)。或者，於一些實施例中，跨膜域係合成。於一些態樣中，合成跨膜域主要包含疏水性殘基，諸如白胺酸及纈胺酸。於一些態樣中，苯丙胺酸、酪胺酸及纈胺酸之三聯物將在合成跨膜域之各端處發現。

於某些實施例中，本文中所揭示之遺傳修飾免疫細胞(諸如NK細胞)之平臺技術包括(i)使用電穿孔裝置(例如，核轉染器)之非病毒基因轉移，(ii)通過內域(例如，CD28/CD3-ζ、CD137/CD3-ζ、或其他組合)信號傳導之CAR，(iii)具有連接抗原識別域至細胞表面之可變長度之細胞外域之CAR，及於一些情況下，(iv)能穩健及數值上擴增CAR⁺ 免疫細胞之源自K562之人工抗原呈遞細胞(aAPC) (Singh等人，2008；Singh等人，2011)。2. T 細胞受體 (TCR)

於一些實施例中，經遺傳工程改造之抗原受體包含重組TCR及/或自天然產生之T細胞選殖之TCR。「T細胞受體」或「TCR」係指含有可變a及β鏈(亦各自稱作TCRα及TCRβ)或可變γ及δ鏈(亦各自稱作TCRγ及TCRδ)且能特異性結合至與MHC受體結合之抗原肽的分子。於一些實施例中，該TCR係呈αβ形式。

通常，以αβ及γδ形式存在之TCR一般係結構上相似，但是表現其之T細胞可具有不同解剖位置或功能。TCR可在細胞表面上或呈可溶形式發現。一般而言，TCR在T細胞(或T淋巴細胞)之表面上發現，其中其一般負責識別結合至主要組織相容性複合體(MHC)分子之抗原。於一些實施例中，TCR亦可含有恆定域、跨膜域及/或短胞質尾區(參見，例如，Janeway等人，1997)。例如，於一些態樣中，TCR之各鏈可具有一個N端免疫球蛋白可變域、一個免疫球蛋白恆定域、跨膜區及在C端處之短胞質尾區。於一些實施例中，TCR係與介導信號轉導中涉及之CD3複合體之不變蛋白相關。除非另有指定，否則應瞭解，術語「TCR」涵蓋其功能TCR片段。該術語亦涵蓋完整或全長TCR，包括呈αβ形式或γδ形式之TCR。

因此，出於本文中目的，提及TCR包含任何TCR或功能片段，諸如結合至MHC分子(即，MHC-肽複合體)中結合之特異性抗原肽之TCR的抗原結合部分。可交換使用之TCR之「抗原結合部分」或「抗原結合片段」係指含有TCR之結構域之部分，但是結合抗原(例如MHC-肽複合體)之分子，全TCR結合至該抗原。於一些情況下，抗原結合部分含有足以形成結合至特定MHC-肽複合體之結合位點之TCR之可變域，諸如TCR之可變a鏈及可變β鏈， 諸如一般而言其中各鏈含有三個互補決定區。

於一些實施例中，TCR鏈之可變域締合以形成環，或類似於免疫球蛋白之互補決定區(CDR)，其藉由形成TCR分子之結合位點及決定肽特異性來賦予抗原識別及決定肽特異性。通常，如免疫球蛋白，CDR藉由框架區(FR)分離(參見，例如，Jores等人，1990；Chothia等人，1988；Lefranc等人，2003)。於一些實施例中，CDR3為負責識別經加工之抗原之主要CDR，雖然亦已顯示α鏈之CDR1與抗原肽之N端部分相互作用，而β鏈之CDR1與肽之C端部分相互作用。認為CDR2識別MHC分子。於一些實施例中，β-鏈之可變區可含有另外高可變(HV4)區。

於一些實施例中，TCR鏈含有恆定域。例如，如免疫球蛋白，TCR鏈(例如，a-鏈、β-鏈)之細胞外部分可含有兩個免疫球蛋白域、N端之可變域(例如，V_a 或Vp；通常為胺基酸1至116，基於Kabat編號，Kabat等人，「Sequences of Proteins of Immunological Interest」, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991，第5版)、及鄰近細胞膜之一個恆定域(例如，a-鏈恆定域或C_a ，通常為胺基酸117至259，基於Kabat，β-鏈恆定域或Cp，通常為胺基酸117至295，基於Kabat)。例如，於一些情況下，由兩條鏈形成之TCR之細胞外部分含有兩個膜近端恆定域，及含有CDR之兩個膜遠端可變域。TCR域之恆定域含有短連接序列，其中半胱胺酸殘基形成二硫鍵，在兩條鏈之間產生連接。於一些實施例中，TCR可具有α及β鏈各者中之另外半胱胺酸殘基使得該TCR於恆定域中含有兩個二硫鍵。

於一些實施例中，TCR鏈可含有跨膜域。於一些實施例中，該跨膜域係帶正電。於一些情況下，TCR鏈含有胞質尾區。於一些情況下，該結構允許TCR與其他分子，如CD3締合。例如，含有恆定域與跨膜區之TCR可錨定細胞膜中之蛋白質及與CD3信號傳導裝置或複合體之不變亞單元締合。

一般而言，CD3為可具有哺乳動物中之三種不同鏈(γ、δ及ε)及ζ-鏈之多蛋白複合體。例如，於哺乳動物中，該複合體可含有CD3γ鏈、CD3δ鏈、兩個CD3ε鏈以及CD3ζ鏈之同型二聚體。CD3γ、CD3δ及CD3ε鏈為含有單一免疫球蛋白域之免疫球蛋白超家族之高度相關細胞表面蛋白。CD3γ、CD3δ及CD3ε鏈之跨膜區係帶負電，其特徵在於允許此等鏈與帶正電之T細胞受體鏈締合。CD3γ、CD3δ及CD3ε鏈之細胞內尾各含有稱作基於免疫受體酪胺酸之活化基序或ITAM之單一保守基序，而各CD3ζ鏈具有三個。一般而言，ITAM涉及TCR複合體之信號傳導能力。此等輔助分子具有帶負電之跨膜區及於將信號自TCR傳播至細胞中起作用。CD3-及ζ-鏈與TCR一起形成稱作T細胞受體複合體者。

於一些實施例中，該TCR可為兩條鏈α及β (或視情況γ及δ)之異二聚體或其可為單鏈TCR構築體。於一些實施例中，該TCR為含有兩條分開鏈 (α及β鏈或γ及δ鏈)之異二聚體，該等鏈諸如藉由二硫鍵連接。於一些實施例中，靶抗原(例如，癌症抗原)之TCR經識別及引入細胞中。於一些實施例中，編碼TCR之核酸可獲自各種來源，諸如藉由公共可得TCR DNA序列之聚合酶鏈反應(PCR)擴增。於一些實施例中，該TCR係獲自生物來源，諸如獲自細胞，諸如獲自T細胞(例如，細胞毒性T細胞)、T細胞雜交瘤或其他公共可得來源。於一些實施例中，該等T細胞可係獲自活體內經分離細胞。於一些實施例中，高親和力T細胞純系可自患者，及經分離之TCR。於一些實施例中，該等T細胞可為經培養之T細胞雜交瘤或純系。於一些實施例中，針對靶抗原之TCR純系已於經人類免疫系統基因(例如，人類白細胞抗原系統，或HLA)工程改造之轉殖基因小鼠中產生。參見，例如，腫瘤抗原(參見，例如，Parkhurst等人， 2009及Cohen等人，2005)。於一些實施例中，噬菌體展示係用於分離針對靶抗原之TCR (參見，例如，Varela-Rohena等人，2008及Li, 2005)。於一些實施例中，該TCR或其抗原結合部分可自TCR之序列之知識合成產生。D. 抗原呈遞細胞

包括巨噬細胞、B淋巴細胞及樹突狀細胞之抗原呈遞細胞藉由其特定MHC分子之表現加以區分。APC與其外細胞膜上之MHC分子一起使抗原內部化及重新表現該抗原之部分。MHC為具有多個基因座之大的遺傳複合體。該MHC基因座編碼兩種主要類別之MHC膜分子，稱作I類及II類MHC。T輔助淋巴細胞一般識別與MHC II類分子相關之抗原，及T細胞毒性淋巴細胞識別與MHC I類分子相關之抗原。於人類中，該MHC被稱作HLA複合體及於小鼠中被稱作H-2複合體。

於一些情況下，aAPC可用於製備實施例之治療組合物及細胞療法產品。關於抗原呈遞系統之製備及使用之一般指導，參見，例如，美國專利案第6,225,042號、第6,355,479號、第6,362,001號及第6,790,662號；美國專利申請公開案第2009/0017000號及第2009/0004142號；及國際公開案第WO2007/103009號。

aAPC系統可包含至少一個外源輔助分子。可採用輔助分子之任何適宜數目及組合。該輔助分子可係選自諸如共刺激分子及黏附分子之輔助分子。示例性共刺激分子包括CD86、CD64 (FcγRI)、41BB配位體及IL-21。黏附分子可包括糖類結合醣蛋白(諸如選擇素(selectin))、跨膜結合醣蛋白(諸如整聯蛋白(integrin))、鈣依賴性蛋白(諸如鈣黏蛋白(cadherin))及單通跨膜免疫球蛋白(Ig)超家族蛋白，諸如促進例如細胞間或細胞與基質接觸之細胞內黏附分子(ICAM)。示例性黏附分子包括LFA-3及ICAM，諸如ICAM-1。可用於示例性輔助分子(包括共刺激分子及黏附分子)之選擇、選殖、製備及表現之技術、方法及試劑例示於例如美國專利案第6,225,042號、第6,355,479號及第6,362,001號中。E. 抗原

藉由經遺傳工程改造之抗原受體靶向之抗原中為於待經由授受性細胞療法靶向之疾病、病狀或細胞類型之情況下表現之彼等。該等疾病及病狀為增殖性、贅生性及惡性疾病及病症，包括癌症及腫瘤，包括血液癌、免疫系統之癌症，諸如淋巴瘤、白血病及/或骨髓瘤，諸如B、T及骨髓性白血病、淋巴瘤及多發性骨髓瘤。於一些實施例中，抗原在疾病或病狀之細胞(例如，腫瘤或病原體細胞)上選擇性表現或過度表現，如與正常或非靶向細胞或組織相比。於其他實施例中，抗原在正常細胞上表現及/或在經工程改造之細胞上表現。

任何適宜抗原可用於本發明方法中。示例性抗原包括(但不限於)來自傳染媒介物之抗原分子、自體/自身抗原、腫瘤/癌症相關抗原及腫瘤新抗原(Linnemann等人，2015)。於特定態樣中，該等抗原包括NY-ESO、EGFRvIII、Muc-1、Her2、CA-125、WT-1、Mage-A3、Mage-A4、Mage-A10、TRAIL/DR4及CEA。於特定態樣中，針對兩種或更多種抗原受體之抗原包括(但不限於) CD19、EBNA、WT1、CD123、NY-ESO、EGFRvIII、MUC1、HER2、CA-125、WT1、Mage-A3、Mage-A4、Mage-A10、TRAIL/DR4及/或CEA。此等抗原之序列係此項技術中已知，例如，CD19 (寄存編號NG_007275.1)、EBNA (寄存編號NG_002392.2)、WT1 (寄存編號NG_009272.1)、CD123 (寄存編號NC_000023.11)、NY-ESO (寄存編號NC_000023.11)、EGFRvIII (寄存編號NG_007726.3)、MUC1 (寄存編號NG_029383.1)、HER2 (寄存編號NG_007503.1)、CA-125 (寄存編號NG_055257.1)、WT1 (寄存編號NG_009272.1)、Mage-A3 (寄存編號NG_013244.1)、Mage-A4 (寄存編號NG_013245.1)、Mage-A10 (寄存編號NC_000023.11)、TRAIL/DR4 (寄存編號NC_000003.12)、及/或CEA (寄存編號NC_000019.10)。

腫瘤相關抗原可係源自前列腺、乳房、結腸直腸、肺、胰臟、腎、間皮瘤、卵巢或黑色素瘤。示例性腫瘤相關抗原或源自腫瘤細胞之抗原包括MAGE 1、3及MAGE 4 (或其他MAGE抗原，諸如國際專利公開案第WO99/40188號中所揭示之彼等)；PRAME；BAGE；RAGE，Lage (亦稱作NY ESO 1)；SAGE；及HAGE或GAGE。腫瘤抗原之此等非限制性實例於廣泛範圍之腫瘤類型，諸如黑色素瘤、肺癌、肉瘤及膀胱癌中表現。參見，例如，美國專利案第6,544,518號。前列腺癌腫瘤相關抗原包括例如前列腺特異性膜抗原(PSMA)、前列腺特異性抗原(PSA)、前列腺酸磷酸鹽、NKX3.1及前列腺之六跨膜上皮抗原(STEAP)。

其他腫瘤相關抗原包括Plu-1、HASH-1、HasH-2、Cripto及Criptin。此外，腫瘤抗原可為可用於治療許多癌症之自身肽激素，諸如全長促性腺激素釋放激素(GnRH)，短10個胺基酸長的肽。

腫瘤抗原包括源自癌症之腫瘤抗原，其特徵在於腫瘤相關抗原表現，諸如HER-2/neu表現。所關注之腫瘤相關抗原包括譜系特異性腫瘤抗原，諸如黑素細胞-黑色素瘤譜系抗原MART-1/Melan-A、gp100、gp75、mda-7、酪胺酸酶及酪胺酸酶相關蛋白。說明性腫瘤相關抗原包括(但不限於)源自或包括下列中之任一者或多者之腫瘤抗原：p53、Ras、c-Myc、細胞質絲胺酸/蘇胺酸激酶(例如，A-Raf、B-Raf及C-Raf，週期蛋白依賴性激酶)、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、MART-1、BAGE、DAM-6、-10、GAGE-1、-2、-8、GAGE-3、-4、-5、-6、-7B、NA88-A、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、酪胺酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC2、磷脂醯肌醇3-激酶(PI3K)、TRK受體、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、威爾姆氏(Wilms')瘤抗原(WT1)、AFP、-連環蛋白(catenin)/m、半胱天冬酶-8/m、CEA、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白(Myosin)/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜聯蛋白(Annexin) II、CDC27/m、TPI/mbcr-abl、BCR-ABL、干擾素調節因子4 (IRF4)、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RAR、腫瘤相關鈣信號感測器1 (TACSTD1) TACSTD2、受體酪胺酸激酶(例如，表皮生長因子受體(EGFR) (特定言之，EGFRvIII)、血小板源生長因子受體(PDGFR)、血管內皮生長因子受體(VEGFR))、細胞質酪胺酸激酶(例如，src-家族、syk-ZAP70家族)、整合素連接激酶(ILK)、信號感測器及轉錄STAT3、STATS及STATE之啟動子、缺氧誘導因子(例如，HIF-1及HIF-2)、細胞核因子-κ B (NF-B)、Notch受體(例如，Notch1-4)、c-Met、雷帕黴素(rapamycin)之哺乳動物靶(mTOR)、WNT、細胞外信號調節激酶(ERK)及其調節亞單元、PMSA、PR-3、MDM2、間皮素(Mesothelin)、腎細胞癌-5T4、SM22-α、碳酸酐酶I (CAI)及IX (CAIX) (亦稱作G250)、STEAD、TEL/AML1、GD2、蛋白酶3、hTERT、肉瘤轉位中斷點、EphA2、ML-IAP、EpCAM、ERG (TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、ALK、雄性激素受體、細胞週期蛋白B1、聚唾液酸、MYCN、RhoC、GD3、岩藻糖基GM1、間皮蛋白(mesothelian)、PSCA、sLe、PLAC1、GM3、BORIS、Tn、GLoboH、NY-BR-1、RGsS、SART3、STn、PAX5、OY-TES1、精子蛋白17、LCK、HMWMAA、AKAP-4、SSX2、XAGE 1、B7H3、豆莢蛋白(legumain)、TIE2、Page4、MAD-CT-1、FAP、MAD-CT-2、fos相關抗原1、CBX2、 CLDN6、SPANX、TPTE、ACTL8、ANKRD30A、CDKN2A、MAD2L1、CTAG1B、SUNC1、LRRN1及個體遺傳型。

抗原可包含源自腫瘤細胞中突變之基因或源自腫瘤細胞與正常細胞相比在不同水平下轉錄之基因之抗原決定基區或抗原決定基肽，諸如端粒酶酵素、存活素、間皮素、突變ras、bcr/abl重排、Her2/neu、突變或野生型p53、細胞色素P450 1B1及異常表現之內含子序列，諸如N-乙醯基葡糖胺基轉移酶-V；於骨髓瘤及B細胞淋巴瘤中產生獨特個體遺傳型之免疫球蛋白基因之純系重排；包含源自癌病毒方法之抗原決定基區或抗原決定基肽之腫瘤抗原，諸如人類乳頭狀瘤病毒蛋白E6及E7；愛潑斯坦巴爾(Epstein bar)病毒蛋白LMP2；具有腫瘤選擇性表現之非突變之癌胎蛋白，諸如癌胚抗原及α-胎蛋白。

於其他實施例中，抗原係獲自或源自病原體微生物或源自機會性病原體微生物(本文中亦稱作感染性疾病微生物)，諸如病毒、真菌、寄生蟲及細菌。於某些實施例中，源自此等微生物之抗原包括全長蛋白質。

設想其抗原用於本文中所述方法之說明性病原體微生物包括人類免疫缺陷病毒(HIV)、單純皰疹病毒(HSV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、巨細胞病毒(CMV)、愛潑斯坦-巴爾二氏(Epstein-Barr)病毒(EBV)、A型、B型及C型流感、水皰性口炎病毒(VSV)、水皰性口炎病毒(VSV)、多瘤病毒(例如，BK病毒及JC病毒)、腺病毒、葡萄球菌物種，包括甲氧西林(Methicillin)耐藥性金黃色葡萄球菌(MRSA)及鏈球菌物種，包括肺炎鏈球菌。熟習者應瞭解，源自此等及其他病原體微生物之用作如本文中所述抗原之蛋白質及編碼該等蛋白質之核苷酸序列可於公開案及公共資料庫，諸如GENBANK®、SWISS-PROT®及TREMBL®中識別。

衍生自人類免疫缺陷病毒(HIV)之抗原包括HIV病毒子結構蛋白(例如，gp120、gp41、p17、p24)、蛋白酶、逆轉錄酶；或藉由tat、rev、nef、vif、vpr及vpu編碼之HIV蛋白中之任一者。

衍生自單純皰疹病毒(例如，HSV 1及HSV2)之抗原包括(但不限於)自HSV晚期基因表現之蛋白質。晚期基因組主要編碼形成病毒子粒子之蛋白質。此等蛋白質包括形成病毒衣殼之五種蛋白質(UL)：UL6、UL18、UL35、UL38及主要衣殼蛋白UL19、UL45及UL27，其各者可用作如本文中所述之抗原。本文中涵蓋用作抗原之其他說明性HSV蛋白包括ICP27 (H1, H2)、醣蛋白B (gB)及醣蛋白D (gD)蛋白。HSV基因組包含至少74種基因，各編碼可潛在用作抗原之蛋白質。

衍生自巨細胞病毒(CMV)之抗原包括CMV結構蛋白、在病毒複製之即刻早期及早期階段期間表現之病毒抗原、醣蛋白I及III、衣殼蛋白、外殼蛋白、低基質蛋白pp65 (ppUL83)、p52 (ppUL44)、IE1及1E2 (UL123及UL122)、來自UL128至UL150之基因簇之蛋白質產物 (Rykman等人，2006)、封膜醣蛋白B (gB)、gH、gN及pp150。熟習者應瞭解，用作本文中所述抗原之CMV蛋白可於公共資料庫，諸如GENBANK®、SWISS-PROT®及TREMBL® (參見例如，Bennekov等人，2004；Loewendorf等人，2010；Marschall等人，2009)中識別。

設想用於某些實施例之衍生自愛潑斯坦-班(Epstein-Ban)病毒(EBV)之抗原包括EBV裂解蛋白gp350及gp110、在潛伏週期感染期間產生之EBV蛋白，包括愛潑斯坦-班核抗原(EBNA)-1、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNA-前導蛋白(EBNA-LP)及潛伏膜蛋白(LMP)-1、LMP-2A及LMP-2B (參見，例如，Lockey等人，2008)。

設想用於本文中用途之衍生自呼吸道合胞病毒(RSV)之抗原包括藉由RSV基因組編碼之11種蛋白質中之任一者或其抗原片段：NS 1、NS2、N (核衣殼蛋白)、M (基質蛋白) SH、G及F (病毒外殼蛋白)、M2 (第二基質蛋白)、M2-1 (延長因子)、M2-2 (轉錄調節)、RNA聚合酶及磷蛋白P。

設想用於使用之衍生自水皰性口炎病毒(VSV)之抗原包括藉由VSV基因組編碼之五種主要蛋白質中之任一者，及其抗原片段：大蛋白(L)、醣蛋白(G)、核蛋白(N)、磷蛋白(P)及基質蛋白(M) (參見，例如，Rieder等人，1999)。

設想用於某些實施例之衍生自流感病毒之抗原包括血凝素(HA)、神經胺酸苷酶(NA)、核蛋白(NP)、基質蛋白M1及M2、NS1、NS2 (NEP)、PA、PB1、PB1-F2及PB2。

示例性病毒抗原亦包括(但不限於)腺病毒多肽、α病毒多肽、杯狀病毒多肽(例如，杯狀病毒衣殼抗原)、冠狀病毒多肽、犬瘟熱病毒多肽、埃博拉病毒多肽、腸道病毒多肽、黃熱病毒多肽、肝炎病毒(AE)多肽(B型肝炎核心或表面抗原，C型肝炎病毒E1或E2醣蛋白，核心或非結構蛋白)、皰疹病毒多肽(包括單純皰疹病毒或水痘-帶狀皰疹病毒醣蛋白)、感染性腹膜炎病毒多肽、白血病病毒多肽、馬堡(Marburg)病毒多肽、正黏病毒多肽、乳頭狀瘤病毒多肽、副流感病毒多肽(例如，血凝素及神經胺酸苷酶多肽)、副黏病毒多肽、細小病毒多肽、瘟病毒多肽、微小核糖核酸病毒科(picorna)病毒多肽(例如，脊髓灰質炎病毒衣殼多肽)、痘病毒多肽(例如，牛痘病毒多肽)、狂犬病病毒多肽(例如，狂犬病病毒醣蛋白G)、呼吸道腸道病毒多肽、逆轉錄病毒多肽及輪狀病毒多肽。

於某些實施例中，該抗原可為細菌抗原。於某些實施例中，所關注之細菌抗原可為經分泌之多肽。於其他某些實施例中，細菌抗原包括具有在細菌之外細胞表面上暴露之多肽之部分或多個部分的抗原。

設想使用之衍生自葡萄球菌物種(包括甲氧西林耐藥性金黃色葡萄球菌(MRSA))之抗原包括毒力調節劑，諸如Agr系統、Sar及Sae、Arl系統、Sar同源物(Rot、MgrA、SarS、SarR、SarT、SarU、SarV、SarX、SarZ及TcaR)、Srr系統及TRAP。可用作抗原之其他葡萄球菌蛋白包括Clp蛋白、HtrA、MsrR、順烏頭酸酶、CcpA、SvrA、Msa、CfvA及CfvB (參見，例如，Staphylococcus : Molecular Genetics, 2008 Caister Academic Press編輯，Jodi Lindsay)。金黃色葡萄球菌之兩個物種之基因組(N315及Mu50)已經定序及公共可得，例如在PATRIC (PATRIC: The VBI PathoSystems Resource Integration Center, Snyder等人，2007)下。熟習者應瞭解，用作抗原之葡萄球菌蛋白亦可於其他公共資料庫，諸如GenBank®、Swiss-Prot®及TrEMBL®中識別。

設想用於本文中所述之某些實施例之衍生自肺炎鏈球菌之抗原包括肺炎球菌溶血素(pneumolysin)、PspA、膽鹼結合蛋白A (CbpA)、NanA、NanB、SpnHL、PavA、LytA、Pht及菌毛蛋白(RrgA；RrgB；RrgC)。肺炎鏈球菌之抗原蛋白亦係此項技術中已知且可於一些實施例中用作抗原(參見，例如，Zysk等人，2000)。肺炎鏈球菌之劇毒株之完全基因組序列已經定序及如由熟習者所瞭解，本文中使用之肺炎鏈球菌蛋白亦可於其他公共資料庫，諸如GENBANK®、SWISS-PROT®及TREMBL®中識別。針對根據本發明之抗原特別受關注之蛋白質包括毒力因子及預測在肺炎球菌表面暴露之蛋白質(參見，例如，Frolet等人，2010)。

可用作抗原之細菌抗原之實例包括(但不限於)放線菌(Actinomyce )多肽、桿菌(Bacillus )多肽、擬桿菌(Bacteroides )多肽、博多特氏菌(Bordetella )多肽、巴爾通體菌(Bartonella )多肽、疏螺旋體菌(Borrelia )多肽(例如，伯氏疏螺旋體菌(B. burgdorferi ) OspA)、布魯氏菌(Brucella )多肽、彎曲桿菌(Campylobacter )多肽、噬二氧化碳菌(Capnocytophaga)多肽、衣原體(Chlamydia )多肽、棒狀桿菌(Corynebacterium )多肽、柯克斯體屬(Coxiella )多肽、嗜皮菌屬(Dermatophilus )多肽、腸球菌(Enterococcus )多肽、埃立克體(Ehrlichia )多肽、埃希氏菌(Escherichia )多肽、弗朗西絲菌(Francisella )多肽、 梭桿菌屬(Fusobacterium )多肽、血巴通氏體(Haemobartonella )多肽、嗜血桿菌(Haemophilus )多肽(例如，流感嗜血桿菌b型外膜蛋白)、螺桿菌(Helicobacter )多肽、克雷伯菌(Klebsiella )多肽、L型細菌多肽、鉤端螺旋體(Leptospira )多肽、李斯特菌(Listeria )多肽、分枝桿菌(Mycobacteria )多肽、支原體(Mycoplasma )多肽、奈瑟氏菌(Neisseria )多肽、新立克次氏體(Neorickettsia )多肽、諾卡氏菌(Nocardia )多肽、巴斯德氏菌(Pasteurella )多肽、消化球菌(Peptococcus )多肽、消化鏈球菌(Peptostreptococcus )多肽、肺炎球菌(Pneumococcus )多肽(即，肺炎鏈球菌(S. pneumonia )多肽) (參見本文中描述)、變形桿菌(Proteus )多肽、 假單孢菌(Pseudomonas )多肽、立克次氏體(Rickettsia )多肽、羅沙利馬體(Rochalimaea )多肽、沙門氏菌(Salmonella )多肽、志賀氏菌(Shigella )多肽、葡萄球菌多肽、組A鏈球菌多肽(例如，化膿性鏈球菌(S. pyogenes ) M蛋白)、組B鏈球菌(無乳鏈球菌(S. agalactiae ))多肽、密螺旋體(Treponema )多肽及耶爾森氏菌(Yersinia )多肽 (例如，鼠疫(Y pestis ) F1及V抗原)。

真菌抗原之實例包括(但不限於)犁頭黴屬(Absidia )多肽、支頂孢屬(Acremonium )多肽、交鏈孢黴(Alternaria )多肽、麯黴屬(Aspergillus )多肽、蛙糞黴菌屬(Basidiobolus )多肽、平臍蠕孢屬(Bipolaris )多肽、芽生菌(Blastomyces )多肽、念珠菌(Candida )多肽、球蟲(Coccidioides )多肽、分生孢子(Conidiobolus )多肽、隱球酵母(Cryptococcus )多肽、彎孢菌(Curvalaria )多肽、表皮癬菌(Epidermophyton )多肽、外瓶黴屬(Exophiala )多肽、地黴屬(Geotrichum )多肽、組織漿菌(Histoplasma )多肽、馬杜拉分支菌屬(Madurella )多肽、馬拉色菌屬(Malassezia )多肽、小孢子菌屬(Microsporum )多肽、叢梗孢屬(Moniliella )多肽、被孢黴屬(Mortierella )多肽、毛黴菌(Mucor )多肽、擬青黴屬(Paecilomyces )多肽、青黴菌(Penicillium )多肽、單胞瓶黴屬(Phialemonium )多肽、瓶黴屬(Phialophora )多肽、無綠藻屬(Prototheca )多肽、假埃希氏菌屬(Pseudallescheria )多肽、假小托菌屬(Pseudomicrodochium )多肽、腐黴屬(Pythium )多肽、鼻孢子蟲屬(Rhinosporidium )多肽、根酶屬(Rhizopus )多肽、線狀擔子菌屬(Scolecobasidium )多肽、孢子絲菌屬(Sporothrix )多肽、匍柄黴屬(Stemphylium )多肽、毛癬菌屬(Trichophyton )多肽、毛孢子菌屬(Trichosporon )多肽及木絲黴屬(Xylohypha )多肽。

原生動物寄生蟲抗原之實例包括(但不限於)巴貝蟲屬(Babesia )多肽、腸袋蟲屬(Balantidium )多肽、貝諾孢子蟲屬(Besnoitia )多肽、隱孢子蟲屬(Cryptosporidium )多肽、艾美耳屬(Eimeria )多肽、腦胞內原蟲屬(Encephalitozoon )多肽、內阿米巴屬(Entamoeba )多肽、梨形鞭毛蟲屬(Giardia )多肽、哈蒙德蟲屬(Hammondia )多肽、肝簇蟲屬(Hepatozoon )多肽、等孢子球蟲屬(Isospora )多肽、利什曼原蟲屬(Leishmania )多肽、微孢子蟲屬(Microsporidia )多肽、新孢子蟲屬(Neospora )多肽、微粒子蟲屬(Nosema )多肽、五鞭毛蟲屬(Pentatrichomonas )多肽、瘧原蟲屬(Plasmodium )多肽。腸蟲寄生蟲抗原之實例包括(但不限於)棘唇屬(Acanthocheilonema )多肽、貓圓線蟲屬(Aelurostrongylus )多肽、鉤蟲屬(Ancylostoma )多肽、管圓線蟲屬(Angiostrongylus )多肽、蛔蟲屬(Ascaris )多肽、布魯格氏絲蟲屬(Brugia )多肽、仰口線蟲屬(Bunostomum )多肽、毛細線蟲屬(Capillaria )多肽、夏氏線蟲屬(Chabertia )多肽、古柏線蟲屬(Cooperia )多肽、環體線蟲屬(Crenosoma )多肽、網尾線蟲屬(Dictyocaulus )多肽、潛根線蟲屬(Dioctophyme )多肽、棘唇線蟲屬(Dipetalonema )多肽、裂頭絛蟲屬(Diphyllobothrium )多肽、複孔絛蟲屬(Diplydium )多肽、惡絲蟲屬(Dirofilaria )多肽、龍線屬(Dracunculus )多肽、蟯蟲屬(Enterobius )多肽、類絲蟲屬(Filaroides )多肽、血矛線蟲屬(Haemonchus )多肽、兔唇蛔屬(Lagochilascaris )多肽、羅阿線蟲(Loa )多肽、曼森線蟲屬(Mansonella )多肽、繆勒線蟲屬(Mue llerius )多肽、侏形吸蟲屬(Nanophyetus )多肽、板口線蟲屬(Necator )多肽、細頸線蟲屬(Nematodirus )多肽、結節線蟲屬(Oesophagostomum )多肽、盤尾絲蟲屬(Onchocerca )多肽、後睾吸蟲屬(Opisthorchis )多肽、奧斯特線蟲屬(Ostertagia )多肽、副絲蟲屬(Parafilaria )多肽、並殖吸蟲屬(Paragonimus )多肽、副蛔蟲屬(Parascaris )多肽、泡翼線蟲屬(Physaloptera )多肽、原圓屬(Protostrongylus )多肽、腹腔絲蟲屬(Setaria )多肽、尾旋線蟲屬(Spirocerca )多肽、迭宮絛蟲屬(Spirometra )多肽、冠絲蟲屬(Stephanofilaria )多肽、類圓線蟲屬(Strongyloides )多肽、圓線蟲屬(Strongylus )多肽、眼線蟲(Thelazia )多肽、弓蛔線蟲屬(Toxascaris )多肽、弓蛔蟲屬(Toxocara )多肽、旋毛蟲屬(Trichinella )多肽、毛圓線蟲屬(Trichostrongylus )多肽、鞭蟲屬(Trichuris )多肽、鉤線蟲屬(Uncinaria )多肽、及吳策線蟲屬(Wuchereria )多肽。(例如，惡性瘧原蟲(P. falciparum )環子孢子(PfCSP))、子孢子表面蛋白2 (PfSSP2)、肝臟狀態抗原1之羧基端(PfLSA1 c-term)及輸出蛋白1 (PfExp-1)、肺囊蟲(Pneumocystis )多肽、肉胞子蟲(Sarcocystis )多肽、血吸蟲屬(Schistosoma )多肽、泰勒蟲屬(Theileria )多肽、弓形蟲屬(Toxoplasma )多肽及錐體蟲屬(Trypanosoma )多肽。

體外寄生蟲抗原之實例包括(但不限於)來自跳蚤；蜱蟲，包括硬蜱蟲及軟蜱蟲；蒼蠅，諸如蚊、蚊子、沙蠅、黑蠅、馬蠅、角蠅、鹿蠅、舌蠅、螫蠅、引起蠅蛆病之蒼蠅及咬人的蟲子；螞蟻；蜘蛛、蝨子；小蟲；及半翅目昆蟲，諸如臭蟲及接吻蟲之多肽(包括抗原以及過敏原)。F. 自殺基因

本發明之免疫細胞之CAR可包含一或多個自殺基因。如本文中所用，術語「自殺基因」經定義為基因，在投與前藥後，其實現基因產物轉變成殺死其宿主細胞之化合物。可使用自殺基因/前藥組合之實例為單純皰疹病毒-胸苷激酶(HSV-tk)及更昔洛韋(ganciclovir)、無環鳥苷(acyclovir)或FIAU；氧化還原酶及環己醯亞胺；胞核嘧啶脫胺酶及5-氟胞核嘧啶；胸苷激酶胸腺嘧啶激酶(Tdk::Tmk)及AZT；及去氧胞苷激酶及胞核嘧啶阿糖胞苷。於特定實施例中，該自殺基因為突變體TNF-α，其經膜結合且可藉由藥物或抗體靶向。

大腸桿菌(E.coli )嘌呤核苷磷酸化酶，所謂之自殺基因將前藥6-甲基嘌呤去氧核苷轉化成毒性嘌呤6-甲基嘌呤。併與前藥療法使用之自殺基因之其他實例為大腸桿菌胞核嘧啶脫胺酶基因及HSV胸苷激酶基因。

示例性自殺基因包括CD20、CD52、EGFRv3、突變體TNF-α (包括膜結合之TNF-α)或可誘導半胱天冬酶9。於一個實施例中，EGFR變異體III (EGFRv3)之截短形式可用作自殺抗原，其可藉由西妥昔單抗(Cetuximab)切除。可用於本發明中之此項技術中已知之另外自殺基因包括嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、細胞色素p450酵素(CYP)、羧肽酶(CP)、羧酸酯酶(CE)、硝基還原酶(NTR)、鳥嘌呤核糖體轉移酶(XGRTP)、糖苷酶酵素、甲硫胺酸-α,γ-裂解酶(MET)及胸苷磷酸化酶(TP)。 G.遞送方法

熟習此項技術者經精良裝備以通過標準重組技術(參見，例如，Sambrook等人，2001及Ausubel等人，1996，二者以引用的方式併入本文中)構築載體用於表現本發明之抗原受體。載體包括(但不限於)質粒、黏粒、病毒(噬菌體、動物病毒及植物病毒)、及人工染色體(例如，YAC)，諸如逆轉錄病毒載體(例如，衍生自莫洛尼(Moloney)鼠科白血病病毒載體(MoMLV)、MSCV、SFFV、MPSV、SNV等)、慢病毒載體(例如，衍生自HIV-1、HIV-2、SIV、BIV、FIV等)、腺病毒(Ad)載體(包括複製健全、複製缺陷及其無病毒基因形式)、腺相關病毒(AAV)載體、類人猿病毒40 (SV-40)載體、牛乳頭瘤病毒載體、愛潑斯坦-巴爾二氏病毒載體、皰疹病毒載體、牛痘病毒載體、哈威(Harvey)鼠科肉瘤病毒載體、鼠科乳房腫瘤病毒載體、勞斯氏(Rous)肉瘤病毒載體、細小病毒載體、脊髓灰質炎病毒載體、水皰性口炎病毒載體、馬拉巴(maraba)病毒載體及B組腺病毒enadenotucirev載體。 a. 病毒載體

編碼抗原受體之病毒載體可於本發明之某些態樣中提供。於產生重組病毒載體中，非必需基因通常經異源(或非天然)蛋白質之基因或編碼序列替換。病毒載體為一種表現構築體，其利用病毒序列將核酸及可能蛋白質引入細胞中。某些病毒經由受體介導之內噬感染細胞或進入細胞及整合至宿主細胞基因組及穩定且有效表現病毒基因之能力使其為將外來核酸轉移至細胞(例如，哺乳動物細胞)之有吸引力之候選。以下描述可用於遞送本發明之某些態樣之核酸之病毒載體的非限制性實例。

慢病毒為複合逆轉錄病毒，除了常見逆轉錄病毒基因gag 、 pol 及env 外，其含有具有調節或結構功能之其他基因。慢病毒載體係此項技術中熟知(參見，例如，美國專利案6,013,516及5,994,136)。

重組慢病毒載體能感染非分裂細胞且可用於活體內及離體基因轉移及核酸序列之表現二者。例如，能感染非分裂細胞之重組慢病毒(其中適宜宿主細胞經攜帶包裝功能之兩個或更多個載體，即，gag、pol及env，以及rev及tat轉染)述於美國專利5,994,136中，其以引用的方式併入本文中。 b.調節元件

包括於可用於本發明載體中之表現盒特定言之包含(以5'-至-3'方向)以操作方式連接至蛋白質編碼序列之真核轉錄啟動子、包括間插序列之剪接信號、及轉錄終止/聚腺苷酸化序列。在真核細胞中控制蛋白質編碼基因之轉錄的啟動子及增強子由多個遺傳元件組成。細胞機器能收集及整合由各元件傳達之調節資訊，允許不同基因演化出獨特且經常複雜的轉錄調節模式。本發明之上下文中使用之啟動子包括構成、可誘導及組織特異性啟動子。 (i) 啟動子/增強子

本文中所提供之表現構築體包含啟動子，以驅動抗原受體之表現。啟動子一般包含功能為定位RNA合成之起始位點之序列。此之最佳已知實例為TATA盒，但是有些缺少TATA盒之啟動子中，諸如，例如，哺乳動物末端去氧核苷酸基轉移酶基因之啟動子及SV40晚期基因之啟動子，與起始位點重疊之離散元件本身即有助於固定啟動位置。另有其他啟動子元件調節轉錄啟動之頻率。通常，此等係位於起始位點之上游的30110 bp區域，但許多啟動子已顯示亦含有起始位點下游之功能元件。為了使編碼序列「在啟動子之控制下」，將轉錄讀碼框之轉錄啟動位點的5'端定位在所選啟動子之「下游」(即，3')。「上游」啟動子刺激DNA之轉錄及促進所編碼RNA之表現。

啟動子元件之間之間隔經常係靈活的，使得當相對於彼此倒置或移動元件時，仍保留啟動子功能。於tk啟動子中，在活性開始下降之前，啟動子元件之間之間隔可增加至相距50 bp。取決於啟動子，似乎個別元件可協同或獨立地運作，以活化轉錄。啟動子可以聯合使用或可以不聯合使用「增強子」，該「增強子」係指涉及核酸序列之轉錄活化之順式作用調節序列。

啟動子可為與核酸序列天然相聯者，如可藉由分離位於編碼片段及/或外顯子之上游之5'非編碼序列獲得。此啟動子可稱作「內源性」。相似地，增強子可為與位於該序列之下游或上游之核酸序列天然相關者。或者，某些優點將藉由在重組或異源啟動子之控制下定位編碼核酸片段獲得，該重組或異源啟動子係指不與其自然環境中之核酸序列正常相關之啟動子。重組或異源增強子亦係指不與其自然環境中之核酸序列正常相關之增強子。此等啟動子或增強子可包括其他基因之啟動子或增強子，及自任何其他病毒或原核或真核細胞分離之啟動子或增強子，及非「天然產生」，即，含有不同轉錄調節區之不同元件及/或改變表現之突變的啟動子或增強子。例如，最常用於重組DNA構築體之啟動子包括β內醯胺酶(青黴素酶(penicillinase))、乳糖及色胺酸(trp‑)啟動子系統。除了合成產生啟動子及增強子之核酸序列外，可使用重組選殖及/或核酸擴增技術(包括PCR™)結合本文中所揭示之組合物產生序列。此外，設想亦可採用直接轉錄及/或表現非核細胞器，諸如粒線體、葉綠體及類似者內之序列之控制序列。

自然地，採用有效指導針對表現所選之細胞器、細胞類型、組織、器官或生物體中之DNA片段之表現的啟動子及/或增強子將係重要的。熟習分子生物學技術者一般瞭解，啟動子、增強子及細胞類型組合用於蛋白質表現之用途。(參見，例如Sambrook等人，1989，以引用的方式併入本文中)。所採用之啟動子可係構成、組織特異性、可誘導及/或可在適宜條件下用於指導引入之DNA片段之高水平表現，諸如於重組蛋白質及/或肽之大規模生產中係有利的。該啟動子可係異源或內源。

此外，任何啟動子/增強子組合(根據例如真核啟動子資料庫EPDB，通過萬維網網址epd.isb-sib.ch/)亦可用於驅動表現。使用T3、T7或SP6細胞質表現系統為另一可能實施例。若提供適宜細菌聚合酶作為遞送複合體之部分或作為另外遺傳表現構築體，則真核細胞可支持來自某些細菌啟動子之細胞質轉錄。

啟動子之非限制性實例包括早期或晚期病毒啟動子，諸如SV40早期或晚期啟動子、巨細胞病毒(CMV)立即早期啟動子、Rous肉瘤病毒(RSV)早期啟動子；真核細胞啟動子，諸如，例如，β肌動蛋白啟動子、GADPH啟動子、金屬硫蛋白啟動子；及級聯回應元件啟動子，諸如環狀AMP回應元件啟動子(cre)、血清回應元件啟動子(sre)、佛波酯啟動子(TPA)及最小TATA盒附近之回應元件啟動子(tre)。亦可使用人類生長激素啟動子序列(例如，在Genbank，寄存編號X05244，核苷酸283-341下所述之人類生長激素最小啟動子)或小鼠乳房腫瘤啟動子(可獲自ATCC，目錄號ATCC 45007)。於某些實施例中，該啟動子為CMV IE、dectin-1、dectin-2、人類CD11c、F4/80、SM22、RSV、SV40、Ad MLP、β-肌動蛋白、MHC I類或MHC II類啟動子，然而可用於驅動治療基因之表現之任何其他啟動子可適用於實踐本發明。

於某些態樣中，本發明之方法亦涉及增強子序列，即，增加啟動子之活性及具有順式作用潛力之核酸序列，及不管其方向，甚至在相對長距離上(遠離靶啟動子至多若干千鹼基對)。然而，增強子功能不一定限於此等長距離，因為其亦可以緊密鄰近給定啟動子起作用。 (ii)啟動信號及關聯表現

特定啟動信號亦可用於本發明中針對編碼序列之有效轉譯所提供之表現構築體中。此等信號包含ATG啟動密碼子或相鄰序列。可需要提供外源轉譯控制信號(包含ATG啟動密碼子)。一般技術者將容易能測定此及提供必需信號。熟知啟動密碼子必須於所需編碼序列之讀碼框之「框內」以確保整個插入物之轉譯。外源轉譯控制信號及啟動密碼子可係天然或合成。表現之效率可藉由納入適宜轉錄增強子元件增強。

於某些實施例中，內部核糖體進入位點(IRES)元件之使用係用於創建多基因或多順反子訊息。IRES元件能繞開5'甲基化Cap依賴性轉譯之核糖體掃描模式及在內部位點處開始轉譯。已描述來自小核糖核酸病毒家族之兩個成員(脊髓灰質炎及腦心肌炎病毒)之IRES元件以及來自哺乳動物訊息之IRES。可將IRES元件連接至異源開放讀碼框。多個開放讀碼框可在一起轉錄，各藉由IRES分離，創建多順反子訊息。憑藉IRES元件，各開放讀碼框可接近核糖體用於有效轉譯。多個基因可使用單啟動子/增強子有效表現以轉錄單一訊息。

此外，某些2A序列元件可用於創造本發明中所提供之構築體中之基因之相關表現或共表現。例如，裂解序列可用於藉由連接開放讀碼框以形成單順反子來共表現基因。示例性裂解序列為F2A (口蹄疫病毒2A)或「類2A」序列(例如，明脈扁刺蛾β四體(Thosea asigna )病毒2A；T2A)。 (iii)複製起源

為繁殖宿主細胞中之載體，其可含有複製位點之一或多個起源 (經常稱作「ori」)，例如，對應於如上所述之EBV之oriP之核酸序列或具有相似或提高之程式化功能之經遺傳工程改造之oriP之核酸序列，其為啟動複製所在之特異性核酸序列。或者可採用如上所述之其他染色體外複製病毒之複製起源或自主複製序列(ARS)。 c.選擇及可篩選標記物

於一些實施例中，含有本發明之構築體之細胞可藉由包含標記物於表現載體中於活體外或活體內經識別。此等標記物將賦予許可容易識別含有表現載體之細胞可識別的變化。一般而言，選擇標記物為賦予允許選擇之性質者。陽性選擇標記物為其中標記物之存在允許其選擇者，而陰性選擇標記物為其中其存在防止其選擇者。陽性選擇標記物之實例為耐藥性標記物。

通常藥物選擇標記物之納入有助於轉化株之選殖及識別，例如，賦予對新黴素(neomycin)、嘌呤黴素(puromycin)、潮黴素(hygromycin)、DHFR、GPT、博來黴素(zeocin)及組胺醇(histidinol)之抗性之基因為有用選擇標記物。除了賦予允許基於實施條件區別轉化株之表現型之標記物外，亦設想其他類型之標記物，包括可篩選標記物，諸如GFP，其基礎為比色分析。或者，可利用可篩選酵素，如陰性選擇標記物，諸如單純皰疹病毒胸苷激酶(tk )或氯黴素乙醯轉移酶(CAT)。熟習此項技術者亦應瞭解如何採用免疫標記物，可能結合FACS分析。認為所使用之標記物係不重要的，只要其能與編碼基因產品之核酸同時表現。選擇及可篩選標記物之另外實例為熟習此項技術者熟知。 d.核酸遞送之其他方法

除了病毒遞送編碼抗原受體之核酸外，下列為重組基因遞送至給定宿主細胞之另外方法及因此於本發明中考量。

引入核酸(諸如DNA或RNA)至本發明之免疫細胞可使用用於核酸遞送以轉化細胞之任何適宜方法，如本文中所述或為一般技術者已知。此等方法包括(但不限於)直接遞送DNA，諸如藉由離體轉染，藉由注射(包括顯微注射)；藉由電穿孔；藉由磷酸鈣沉澱；藉由使用DEAE-葡聚糖，接著聚乙二醇；藉由直接音波負載；藉由脂質體介導之轉染及受體介導之轉染；藉由顯微注射轟炸；藉由用碳化矽纖維攪動；藉由土壤桿菌介導之轉化；藉由乾燥/抑制介導之DNA吸收及此等方法之任何組合。通過應用諸如此等之技術，細胞器、細胞、組織或生物體可經穩定或短暫轉化。H. 基因表現之修飾

於一些實施例中，本發明之免疫細胞經修飾以具有某些基因，諸如糖皮質激素受體、TGFβ受體(例如，TGFβ-RII)及/或CISH之改變之表現。於一個實施例中，該等免疫細胞可經修飾以表現顯性陰性TGFβ受體II (TGFβRIIDN)，其可作為細胞激素貯庫起作用以耗盡內源TGFβ。

細胞激素信號傳導為造血細胞之正常功能係必需的。蛋白質之SOCS家族於細胞激素信號傳導之陰性調節中起著重要作用，充當固有刹車。CIS (藉由CISH基因編碼之蛋白質之SOCS家族之成員)已經識別為小鼠之NK細胞中之重要檢查點分子。因此，於一些實施例中，本發明涉及免疫細胞中之CISH之敲除以改善諸如NK細胞及CD8⁺ T細胞中之細胞毒性。此方法可單獨或與其他檢查點抑制劑組合使用以改善抗腫瘤活性。

於一些實施例中，經更改之基因表現藉由實現基因之破壞，諸如敲除、插入、錯義或框移突變(諸如雙對偶基因框移突變)，所有或部分基因(例如，一或多個外顯子或其部分)之缺失，及/或敲入進行。例如，該更改之基因表現可藉由序列特異性或靶向核酸酶，包括DNA結合靶向核酸酶(諸如鋅指核酸酶(ZFN)及類轉錄活化子效應子核酸酶(TALEN))，及專門設計以靶向基因或其部分之序列之RNA指導之核酸酶(諸如CRISPR相關核酸酶(Cas))實現。

於一些實施例中，基因之表現、活性及/或功能之更改係藉由破壞基因進行。於一些態樣中，基因經修飾使得其表現與基因修飾不存在或為實現修飾引入之組分不存在下之表現相比，減少至少或約20、30或40%，一般而言至少或約50、60、70、80、90或95%。

於一些實施例中，該更改係短暫或可逆，使得基因之表現在晚期恢復。於其他實施例中，該更改非可逆或短暫，例如，係永久。

於一些實施例中，基因更改藉由誘導基因之一或多個雙股破壞及/或一或多個單股破壞，通常以靶向方式進行。於一些實施例中，該等雙股或單股破壞由核酸酶，例如，核酸內切酶，諸如基因靶向核酸酶進行。於一些態樣中，於基因之編碼區中，例如，於外顯子中誘導該等破壞。例如，於一些實施例中，誘導在編碼區之N端部分附近，例如，於第一外顯子中，於第二外顯子中，或於隨後外顯子中發生。

於一些態樣中，雙股或單股破壞經由細胞修復過程，諸如藉由非同源末端接合(NHEJ)或同源導向修復(HDR)經歷修復。於一些態樣中，該修復過程係易錯且導致基因破壞，諸如框移突變，例如，雙對偶基因框移突變，其可導致基因之完全敲除。例如，於一些態樣中，該破壞包括誘導缺失、突變及/或插入。於一些實施例中，該破壞導致早期終止密碼子之存在。於一些態樣中，插入、缺失、轉位、框移突變及/或過早終止密碼子之存在導致基因之表現、活性及/或功能之破壞。

於一些實施例中，基因更改係使用反義技術，諸如藉由RNA干涉(RNAi)、短干涉RNA (siRNA)、短髮夾(shRNA)及/或用於選擇性抑制基因表現之核酶達成。siRNA技術為RNAi，其採用具有與自該基因轉錄之mRNA之核苷酸序列同源之序列及與該核苷酸序列互補之序列的雙股RNA分子。siRNA一般與自該基因轉錄之mRNA之一個區同源/互補，或可為包含與不同區同源/互補之複數個RNA分子之siRNA。於一些態樣中，該siRNA包含於多順反子構築體中。 2. ZFP及ZFN

於一些實施例中，DNA靶向分子包括DNA結合蛋白，諸如融合至效應蛋白(諸如核酸內切酶)之一或多個鋅指蛋白(ZFP)或類轉錄活化子蛋白(TAL)。實例包括ZFN、TALE及TALEN。

於一些實施例中，DNA靶向分子包括以序列特異性方式結合至DNA之一或多個鋅指蛋白(ZFP)或其域。ZFP或其域為蛋白質或較大蛋白質內之域，其通過一或多個鋅指(結合域內之胺基酸序列之區，該結合域之結構通過鋅離子之配位穩定)以序列特異性方式結合DNA。術語鋅指DNA結合蛋白經常被縮寫為鋅指蛋白或ZFP。ZFP為靶向特定DNA序列(通常9至18個核苷酸長，藉由個別指之組裝產生)之人工ZFP域。

ZFP包含其中單指域長度係約30個胺基酸且含有α螺旋之彼等，該α螺旋含有通過鋅與單β翻轉之兩個半胱胺酸配位之兩個不變組胺酸殘基，且具有2、3、4、5或6個指。一般而言，ZFP之序列特異性可藉由在鋅指識別螺旋之四個螺旋位置(-1、2、3及6)處進行胺基酸取代而更改。因此，於一些實施例中，ZFP或含ZFP之分子係非天然產生，例如，經工程改造以結合至選擇之靶位點。

於一些實施例中，該DNA靶向分子為或包含融合至DNA裂解域以形成鋅指核酸酶(ZFN)之鋅指DNA結合域。於一些實施例中，融合蛋白包含來自至少一個liS型限制酶之裂解域(或裂解半域)及可經工程改造或可不經工程改造之一或多個鋅指結合域。於一些實施例中，該裂解域係來自liS型限制核酸內切酶Fok I。Fok I一般催化DNA之雙股裂解，在一股上自其識別位點之9核苷酸處及在另一股上自其識別位點之13核苷酸處。

許多基因特異性經工程改造之鋅指係可自市面上購得。例如，Sangamo Biosciences (Richmond, CA, USA)與Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)合夥已開發用於鋅指構築之平臺(CompoZr)，允許研究者完全繞開鋅指構築及驗證，及提供針對上千種蛋白質之特異性靶向之鋅指(Gaj等人，Trends in Biotechnology , 2013, 31(7), 397-405)。於一些實施例中，使用可市面上購得之鋅指或經定製設計。(參見，例如，Sigma-Aldrich目錄編號CSTZFND、CSTZFN、Ctil-lKT及PZD0020)。 3. TAL、TALE及TALEN

於一些實施例中，該DNA靶向分子包含天然產生或經工程改造(非天然產生)之類轉錄活化子蛋白(TAL) DNA結合域，諸如於類轉錄活化子蛋白效應子(TALE)蛋白中，參見，例如，美國專利公開案第2011/0301073號，其全文係以引用的方式併入本文中。

TALE DNA結合域或TALE為包含一或多個TALE重複域/單元之多肽。該等重複域涉及TALE與其同源靶DNA序列之結合。單個「重複單元」(亦稱作「重複序列(repeat)」)通常為長度33至35個胺基酸且展示與天然產生之TALE蛋白質內之其他TALE重複序列至少一些序列同源性。各TALE重複單元包含1或2個DNA結合殘基，通常在該重複序列之位置12及/或13處組成重複序列可變二殘基(RVD)。已測定用於此等TALE之DNA識別之天然(正則)密碼，使得位置12及13處之HD序列導致結合至胞核嘧啶(C)，NG結合至T、NI至A、NN結合至G或A，及NO結合至T及非正則(非典型) RVD亦係已知。於一些實施例中，TALE可藉由設計具有對靶DNA序列特異性之TAL陣列靶向至任何基因。靶序列一般以胞苷開始。

於一些實施例中，該分子為DNA結合核酸內切酶，諸如TALE核酸酶(TALEN)。於一些態樣中，該TALEN為融合蛋白，其包含衍生自TALE之DNA結合域及裂解核酸靶序列之核酸酶催化域。

於一些實施例中，該TALEN識別及裂解基因之靶序列。於一些態樣中，DNA之裂解導致雙股斷裂。於一些態樣中，該等斷裂刺激同源重組或非同源末端接合(NHEJ)之速率。一般而言，NHEJ為不完美修復過程，其經常導致裂解位點處之DNA序列之變化。於一些態樣中，修復機理涉及保持兩個DNA末端通過直接再結合或經由所謂微觀同源性介導之末端接合再接合。於一些實施例中，經由NHEJ之修復導致小的插入或缺失且可用於破壞及從而抑制基因。於一些實施例中，該修飾可為至少一個核苷酸之取代、缺失或添加。於一些態樣中，其中裂解誘導之誘變事件，即，NHEJ事件後續之誘變事件發生之細胞可藉由此項技術中熟知方法識別及/或選擇。

於一些實施例中，TALE重複序列經組裝以特異性靶向基因。(Gaj等人，2013)。已構築靶向18,740種人類蛋白質編碼基因之TALEN庫(Kim等人，2013)。經定製設計之TALE陣列係可通過Cellectis Bioresearch (Paris, France)、Transposagen Biopharmaceuticals (Lexington, KY, USA)及Life Technologies (Grand Island, NY, USA)購得。具體而言，靶向CD38之TALEN係可購得(參見Gencopoeia，目錄號HTN222870-l、HTN222870-2及HTN222870-3)。示例性分子述於例如美國專利公開案第US 2014/0120622號及第2013/0315884號。

於一些實施例中，TALEN經引入作為藉由一或多個質粒載體編碼之反式基因。於一些態樣中，該質粒載體可含有選擇標記物，其提供接受該載體之細胞之識別及/或選擇。4. RGEN (CRISPR/Cas 系統 )

於一些實施例中，使用一或多個DNA結合核酸進行更改，諸如經由RNA指導之核酸內切酶(RGEN)更改。例如，可使用聚集之規則間隔之短迴文重複序列(CRISPR)及CRISPR相關(Cas)蛋白質進行更改。總之，「CRISPR系統」共同係指涉及CRISPR相關(「Cas」)基因之表現或指導該基因之活性之轉錄子及其他元件，包含編碼Cas基因之序列、tracr (反式活化CRISPR)序列(例如，tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr配對序列(在內源CRISPR系統之情況下，包含「直接重複序列」及經tracrRNA加工之部分直接重複序列)、指導序列(在內源CRISPR系統之情況下，亦稱作「間隔子」)及/或來自CRISPR基因座之其他序列及轉錄子。

CRISPR/Cas核酸酶或CRISPR/Cas核酸酶系統可包含非編碼RNA分子(導引) RNA，其序列特異性結合至DNA，及Cas蛋白(例如，Cas9)，具有核酸酶功能性(例如，兩個核酸酶域)。CRISPR系統之一或多個元件可源自I型、II型或III型CRISPR系統，例如，源自包含內源CRISPR系統之特定生物體，諸如化膿性鏈球菌。

於一些態樣中，將Cas核酸酶及gRNA (包含特異性針對靶序列之crRNA及經固定之tracrRNA之融合)引入細胞。一般而言，gRNA之5'端處之靶位點使用互補鹼基配對將Cas核酸酶靶向至靶位點，例如，基因。靶位點可基於原間隔基鄰近基序(PAM)序列，諸如通常NGG或NAG之其立即定位5'選擇。在此方面，gRNA藉由修飾導引RNA之前20、19、18、17、16、15、14、14、12、11或10個核苷酸以對應於靶DNA序列靶向至所需序列。一般而言，CRISPR系統藉由促進CRISPR複合體在靶序列之位點處形成之元件表徵。通常，「靶序列」一般係指序列，設計導引序列以具有與該序列之互補性，其中靶序列與導引序列之間之雜交促進CRISPR複合體之形成。不一定需要完全互補，只要存在足夠互補性以造成雜交及促進CRISPR複合體之形成。

CRISPR系統可誘導靶位點處之雙股斷裂(DSB)，接著如本文中所討論之破壞或更改。於其他實施例中，視作「切口酶」之Cas9變異體係用於在靶位點處將單股切口。可使用成對切口酶(例如)以提高特異性，各藉由一對不同gRNA靶向序列指導使得在引入切口時，同時引入5'突出物。於其他實施例中，催化失活Cas9經融合至異源效應域(諸如轉錄抑制子或活化子)以實現基因表現。

靶序列可包含任何多核苷酸，諸如DNA或RNA多核苷酸。靶序列可定位於細胞之細胞核或細胞質中，諸如於細胞之細胞器內。一般而言，可用於重組至包含靶序列之靶向基因座之序列或模板被稱作「編輯模板」或「編輯多核苷酸」或「編輯序列」。於一些態樣中，外源模板多核苷酸可被稱作編輯模板。於一些態樣中，該重組為同源重組。

通常，於內源CRISPR系統之情況下，CRISPR複合體(包含雜交至靶序列及與一或多個Cas蛋白質複合之導引序列)之形成導致靶序列內或附近(例如，於離靶序列1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或更多個鹼基對內)之一或兩個股之裂解。可包含野生型tracr序列之所有或部分(例如，野生型tracr序列之約或超過約20、26、32、45、48、54、63、67、85個或更多個核苷酸)或由之組成之tracr序列亦可形成CRISPR複合體之部分，諸如藉由沿著tracr序列之至少一部分雜交至以操作方式連接至導引序列之tracr配對序列之所有或部分。該tracr序列具有與tracr配對序列之足夠互補性以於CRISPR複合體之形成中雜交及沉澱，諸如當最佳比對時，沿著tracr配對序列之長度至少50%、60%、70%、80%、90%、95% 或99%之序列互補性。

可將驅動CRISPR系統之一或多個元件之表現之一或多個載體引入細胞中，使得CRISPR系統之元件之表現指導CRISPR複合體在一或多個靶位點處之形成。亦可將組分遞送至細胞中作為蛋白質及/或RNA。例如，Cas酵素(連接至tracr-配對序列之導引序列)及tracr序列可各以操作方式連接至分開載體之分開調節元件。或者，可將自相同或不同調節元件表現之元件中之兩者或更多者組合於單個載體中，其中一或多個另外載體提供不包含於第一載體中之CRISPR系統之任何組分。該載體可包含一或多個插入位點，諸如限制核酸內切酶識別序列(亦稱作「選殖位點」)。於一些實施例中，一或多個插入位點位於一或多個載體之一或多個序列元件之上游及/或下游。當使用多個不同導引序列時，單個表現構築體可用於靶向CRISPR活性至細胞內之多個不同對應靶序列。

載體可包含以操作方式連接至編碼CRISPR酵素之酵素編碼序列，諸如Cas蛋白之調節元件。Cas蛋白之非限制性實例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9 (亦稱作Csn1及Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4、其同源物、或其經修飾形式。此等酵素係已知；例如，化膿性鏈球菌Cas9蛋白之胺基酸序列可見於SwissProt資料庫寄存編號Q99ZW2。

該CRISPR酵素可為Cas9 (例如，來自化膿性鏈球菌或肺炎鏈球菌)。該CRISPR酵素可指導靶序列位置處(諸如靶序列內及/或靶序列之補體內)之一或兩個股之裂解。載體可編碼相對於對應野生型酵素突變之CRISPR酵素，使得經突變之CRISPR酵素缺少裂解含有靶序列之靶多核苷酸之一股或兩股的能力。例如，來自化膿性鏈球菌之Cas9之RuvC I催化域中之天冬胺酸至丙胺酸取代(D10A)將來自裂解兩股之核酸酶之Cas9轉化成切口酶(裂解單股)。於一些實施例中，Cas9切口酶可與導引序列，例如，各自靶向DNA靶之有義及反義股之兩個導引序列組合使用。此組合允許兩股經切口及用於誘導NHEJ或HDR。

於一些實施例中，編碼CRISPR酵素之酵素編碼序列經最佳化以於特定細胞(諸如真核細胞)中表現之密碼子。真核細胞可為特定生物體之彼等或源自特定生物體，諸如哺乳動物，包括(但不限於)人類、小鼠、大鼠、兔、狗或非人類靈長類動物。一般而言，密碼子最佳化係指藉由將初始序列之至少一個密碼子用更頻繁或最頻繁用於該宿主細胞之基因中之密碼子替換同時維持初始胺基酸序列來修飾核酸序列用於增強所關注之宿主細胞之表現的方法。各種物種展示特定胺基酸之某些密碼子之特定偏性。密碼子偏性(在生物體之間之密碼子用途差異)經常與信使RNA (mRNA)之轉譯效率相關，其繼而被認為尤其依賴於正在轉譯之密碼子之性質及特定轉移RNA (tRNA)分子之可利用性。所選tRNA於細胞中之主導作用一般為最頻繁用於肽合成中之密碼子之反映。因此，可基於密碼子最佳化定製基因於給定生物體中之最佳基因表現。

一般而言，導引序列為具有與靶多核苷酸之足夠互補性以與靶序列雜交及指導CRISPR複合體與靶序列之序列特異性結合的任何多核苷酸。於一些實施例中，當使用適宜比對演算法最佳比對時，導引序列與其對應靶序列之間之互補性之程度為約或超過約50%、60%、75%、80%、85%、90%、95%、97.5%、99%或更多。

NR3CS (糖皮質激素受體)之示例性gRNA序列包括Ex3 NR3C1 sG1 5-TGC TGT TGA GGA GCT GGA-3 (SEQ ID NO: 1)及Ex3 NR3C1 sG2 5-AGC ACA CCA GGC AGA GTT-3 (SEQ ID NO: 2)。TGF-β受體2之示例性gRNA序列包括EX3 TGFBR2 sG1 5-CGG CTG AGG AGC GGA AGA-3 (SEQ ID NO: 3)及EX3 TGFBR2 sG2 5-TGG-AGG-TGA-GCA-ATC-CCC-3 (SEQ ID NO: 4)。T7啟動子、靶序列及重疊序列可具有序列TTAATACGACTCACTATAGG (SEQ ID NO: 5) +靶序列+ gttttagagctagaaatagc (SEQ ID NO: 6)。

可使用用於比對序列之任何適宜演算法確定最佳比對，該演算法之非限制性實例包括Smith-Waterman演算法、Needleman-Wunsch演算法、基於Burrows-Wheeler轉化之演算法(例如，Burrows Wheeler Aligner)、Clustal W、Clustal X、BLAT、Novoalign (Novocraft Technologies)、ELAND (Illumina, San Diego, Calif.)、SOAP (在soap.genomics.org.cn可得)及Maq (在maq.sourceforge.net可得)。

該CRISPR酵素可為包含一或多個異源蛋白域之融合蛋白之部分。CRISPR酵素融合蛋白可包含任何另外蛋白質序列，及視情況在任何兩個域之間之連接子序列。可融合至CRISPR酵素之蛋白質域之實例包括(不限於)抗原決定基標籤、報告基因序列及具有下列活性中之一或多者之蛋白質域：甲基化酶活性、脫甲基酶活性、轉錄活化活性、轉錄抑制活性、轉錄釋放因子活性、組蛋白修飾活性、RNA裂解活性及核酸結合活性。抗原決定基標籤之非限制性實例包括組胺酸(His)標籤、V5標籤、FLAG標籤、流感血凝素(HA)標籤、Myc標籤、VSV-G標籤及硫氧還蛋白(Trx)標籤。報告基因之實例包括(但不限於)穀胱甘肽-5-轉移酶(GST)、山葵過氧化物酶(HRP)、氯黴素乙醯基轉移酶(CAT) β半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、螢光素酶、綠色螢光蛋白(GFP)、HcRed、DsRed、青色螢光蛋白(CFP)、黃色螢光蛋白(YFP)及自動螢光蛋白(包括藍色螢光蛋白(BFP))。CRISPR酵素可融合至編碼蛋白質之基因序列或結合DNA分子或結合其他細胞分子之蛋白質之片段，包括(但不限於)麥芽糖結合蛋白(MBP)、S-標籤、Lex A DNA結合域(DBD)融合物、GAL4A DNA結合域融合物、及單純皰疹病毒(HSV) BP16蛋白融合物。可形成包含CRISPR酵素之融合蛋白之一部分之另外域述於US 20110059502中，其以引用的方式併入本文中。 III.治療方法

於一些實施例中，本發明提供免疫治療之方法，其包括投與有效量之本發明NK細胞。於一個實施例中，醫學疾病或病症係藉由轉移引起免疫反應之NK細胞群體而治療。於本發明之某些實施例中，癌症或感染係藉由轉移引起免疫反應之NK細胞群體治療。本文中提供用於治療或延遲個體之癌症之進展的方法，其包括向該個體投與有效量之抗原特異性細胞療法。可應用本方法用於治療免疫病症，包括自體或同種免疫、實體癌症、血液癌及病毒感染。

本治療方法係可用之腫瘤包括任何惡性細胞類型，諸如於實體腫瘤或血液腫瘤中發現之彼等。示例性實體腫瘤可包括(但不限於)選自由以下組成之群之器官之腫瘤：胰臟、結腸、盲腸、胃、腦、頭、頸、卵巢、腎、喉、肉瘤、肺、膀胱、黑色素瘤、前列腺、及乳房。示例性血液腫瘤包括骨髓瘤、T或B細胞惡性病、白血病、淋巴瘤、母細胞瘤、骨髓瘤及類似者。可使用本文中所提供之方法治療之癌症之另外實例包括(但不限於)肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及肺鱗狀細胞癌)、腹膜癌、胃癌(包括胃腸癌及胃腸基質癌)、胰癌、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、各種類型之頭頸癌及黑色素瘤。

癌症可具體而言為下列組織學類型，儘管其不限於此等：惡性贅生物、癌、未分化之癌、巨大及梭形細胞癌、小細胞癌、乳頭狀癌、鱗狀細胞癌、淋巴上皮癌、基底細胞癌、毛髮基質癌、移行細胞癌、乳頭狀移行細胞癌、腺癌、惡性胃泌素瘤、膽管癌、肝細胞癌、組合之肝細胞癌及膽管癌、小梁腺癌、腺樣囊性癌、腺瘤性息肉之腺癌、家族性結腸息肉病腺癌、實體癌、惡性類癌腫瘤、分支肺泡腺癌、乳頭狀腺癌、難染癌、嗜酸細胞癌、嗜酸腺癌、嗜鹼細胞癌、透明細胞腺癌、粒細胞癌、濾泡狀腺癌、乳頭狀及濾泡狀腺癌、無被囊硬化癌、腎上腺皮質癌、子宮內膜癌、皮膚附屬器官癌、頂泌腺癌、脂肪腺癌、盯聹腺癌、黏樣表皮樣癌、囊腺癌、乳頭狀囊腺癌、乳頭狀漿液性囊腺癌、黏蛋白囊腺癌、黏蛋白腺癌、印戒細胞癌、浸潤導管癌、骨髓癌、小葉癌、發炎性癌、乳房佩吉特氏病(paget's disease)、腺泡細胞癌、腺鱗狀癌、腺癌w/鱗狀細胞化生、惡性胸腺瘤、惡性卵巢基質瘤、惡性卵泡膜瘤、惡性粒層細胞瘤、惡性雄激素母細胞瘤、塞爾托利(sertoli)細胞癌、惡性萊迪希(leydig)細胞瘤、惡性脂質細胞瘤、惡性副神經節瘤、惡性乳房外副神經節瘤、嗜鉻細胞瘤、血管球肉瘤、惡性黑色素瘤、無色素性黑色素瘤、表面傳播黑色素瘤、小痣惡性黑色素瘤、肢端豆狀黑色素瘤、結節性黑色素瘤、巨大色素痣中之惡性黑色素瘤、上皮樣細胞黑色素瘤、惡性藍痣、肉瘤、纖維肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、胚胎橫紋肌肉瘤、肺泡橫紋肌肉瘤、基質肉瘤、惡性混合腫瘤、苗勒氏(mullerian)混合腫瘤、腎母細胞瘤、肝母細胞瘤、癌肉瘤、惡性間質瘤、惡性勃勒納氏(brenner)瘤、惡性葉狀瘤、滑液肉瘤、惡性間皮瘤、無性細胞瘤、胚胎癌、惡性畸胎瘤、惡性卵巢甲狀腺腫、絨膜癌、惡性中腎瘤、血管肉瘤、惡性血管內皮瘤、卡波西氏(kaposi's)肉瘤、惡性血管外皮細胞瘤、淋巴管肉瘤、骨肉瘤、近皮質骨肉瘤、軟骨肉瘤、惡性軟骨肉瘤、間葉細胞軟骨肉瘤、骨巨細胞瘤、尤因氏(ewing's)肉瘤、惡性牙源性腫瘤、成釉細胞性牙源瘤、惡性成釉細胞瘤、成釉細胞性纖維肉瘤、惡性松果體瘤、脊索瘤、惡性神經膠質瘤、室管膜瘤、星形細胞瘤、原生質星形細胞瘤、纖維狀星形細胞瘤、星形母細胞瘤、膠質母細胞瘤、少突神經膠質瘤、少突神經膠質母細胞瘤、原始神經外胚層、小腦肉瘤、神經節母細胞瘤、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、嗅覺神經源性腫瘤、惡性腦膜瘤、神經纖維肉瘤、惡性神經鞘瘤、惡性粒細胞瘤、惡性淋巴瘤、霍奇金氏病(hodgkin's disease)、霍奇金氏、類肉芽腫、小淋巴細胞性惡性淋巴瘤、大細胞瀰漫性性惡性淋巴瘤、濾泡性惡性淋巴瘤、蕈樣肉芽腫、其他指定非霍奇金氏淋巴瘤、B-細胞淋巴瘤、低惡性度/濾泡性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴細胞性(SL) NHL、中惡性度/濾泡性NHL、中惡性度瀰漫性NHL、高惡性度免疫母細胞性NHL、高惡性度淋巴母細胞性NHL、高惡性度小非裂解細胞NHL、大病NHL、套細胞淋巴瘤、AIDS相關淋巴瘤、瓦爾登斯特龍氏(Waldenstrom's)巨球蛋白血症、惡性組織細胞增生、多發性骨髓瘤、肥大細胞肉瘤、免疫增殖性小腸疾病、白血病、淋巴性白血病、漿細胞白血病、紅白血病、淋巴肉瘤細胞白血病、骨髓性白血病、嗜鹼性白血球白血病、嗜酸性白血球白血病、單核細胞白血病、肥大細胞白血病、巨核母細胞性白血病、骨髓樣肉瘤、毛細胞白血病、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)及慢性骨髓母細胞性白血病。

特定實施例涉及治療白血病之方法。白血病為血液或骨髓之癌症且特徵在於血細胞，通常白血病(白血球)之異常增殖(藉由增殖產生)。其為稱作血液贅生物之疾病之廣群組的部分。白血病為覆蓋疾病譜系之廣泛術語。白血病經臨床及病理上分成其急性及慢性形式。

於本發明之某些實施例中，免疫細胞經遞送至有需要個體，諸如具有癌症或感染之個體。然後該等細胞增強個體之免疫系統以攻擊各自癌症或致病細胞。於一些情況下，向該個體提供一或多個劑量之免疫細胞。於向個體提供免疫細胞之兩個或更多個劑量之情況下，投與之間之持續時間應足以允許於個體中繁殖之時間，及於特定實施例中，劑量之間之持續時間為l、2、3、4、5、6、7或更多天。

本發明之某些實施例提供治療或預防免疫介導之病症之方法。於一個實施例中，該個體患有自體免疫疾病。自體免疫疾病之非限制性實例包括：斑禿、強直性脊柱炎、抗磷脂症候群、自體免疫阿狄森氏(Addison's)病、腎上腺之自體免疫病、自體免疫溶血性貧血、自體免疫肝炎、自體免疫卵巢炎及睾丸炎、自體免疫血小板減少症、白塞氏病(Behcet's disease)、大皰性類天皰瘡、心肌病、腹腔炎、慢性疲勞免疫功能障礙症候群(CFIDS)、慢性發炎性脫髓鞘性多發性神經病、許爾-史特勞斯二氏(Churg-Strauss)症候群、疤痕性類天皰瘡、CREST症候群、冷凝集素疾病、克羅恩氏病(Crohn's disease)、盤狀狼瘡、原發性混合型冷球蛋白血症、纖維肌痛-纖維肌炎、血管球性腎炎、格雷夫斯氏病(Graves' disease)、吉蘭-巴雷(Guillain-Barre)、橋本氏(Hashimoto's)甲狀腺炎、特發性肺纖維化、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、IgA神經病、幼年型關節炎、扁平苔蘚、紅斑狼瘡、美尼爾氏病(Meniere's disease)、混合結締組織病、多發性硬化、1型或免疫介導之糖尿病、重症肌無力、腎病症候群(諸如最小變化疾病、局灶性腎小球硬化症或膜性腎病)、尋常性天皰瘡、惡性貧血、結節性多動脈炎、多發性軟骨炎、多腺體症候群、風濕性多肌痛、多肌炎及皮肌炎、原發性無丙種球蛋白血症、原發性膽汁性肝硬化、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、雷諾氏(Raynaud's)現象、萊特氏(Reiter's)症候群、類風濕性關節炎、結節病、硬皮病、乾燥症候群(Sjogren's syndrome)、僵人症候群、全身性紅斑狼瘡、紅斑狼瘡、潰瘍性結腸炎、葡萄膜炎、血管炎(諸如結節性多動脈炎、大動脈炎、顳動脈炎/巨細胞動脈炎、或皮炎皰疹性血管炎)、白斑病、及韋格納氏(Wegener's)肉芽腫。因此，可使用本文中所揭示之方法治療之自體免疫疾病之一些實例包括(但不限於)多發性硬化、類風濕性關節炎、全身性紅斑狼瘡、I型糖尿病、克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、重症肌無力、血管球性腎炎、強直性脊柱炎、血管炎或牛皮癬。個體亦可患有過敏性病症，諸如哮喘。

於又一實施例中，該個體為移植器官或幹細胞之接受者且使用免疫細胞預防及/或治療排斥。於特定實施例中，該個體患有移植物抗宿主疾病或有發展該疾病之風險。GVHD為使用或含有來自相關或不相關供體之幹細胞之任何移植之可能併發症。存在兩種GVHD，急性及慢性。急性GVHD於移植後之前三個月內出現。急性GVHD之徵兆包括手及腳上之淡紅色皮疹，其可傳播及變得更嚴重，具有剝落或起水皰皮膚。急性GVHD亦可影響胃及腸，於該情況下存在抽筋、噁心及腹瀉。皮膚及眼睛之變黃(黃疸病)指示急性GVHD已影響肝臟。將慢性GVHD基於其嚴重度排序：階段/等級1係溫和；階段/等級4係嚴重。慢性GVHD於移植後三個月或更晚發展。慢性GVHD之症狀類似於急性GVHD之彼等，但是此外，慢性GVHD亦可影響眼中之黏液腺、口中之唾液腺、及潤滑胃內襯及腸之腺。可利用本文中所揭示之免疫細胞之群體中之任一者。移植器官之實例包括實體器官移植，諸如腎、肝、皮膚、胰、肺及/或心臟，或細胞移植，諸如小島、肝細胞、成肌細胞、骨髓、或造血細胞或其他幹細胞。移植可為綜合移植，諸如面部組織。免疫細胞可在移植之前、與移植同時或於移植後投與。於一些實施例中，在移植之前，諸如在移植之前至少1小時、至少12小時、至少1天、至少2天、至少3 天、至少4天、至少5天、至少6天、至少1週、至少2週、至少3週、至少4週或至少1個月投與免疫細胞。於一個特定非限制性實例中，治療上有效量之免疫細胞之投與在移植之前3至5天發生。

於一些實施例中，可在免疫細胞療法之前向個體投與非清髓性淋巴耗盡化學療法。非清髓性淋巴耗盡化學療法可為任何適宜此療法，其可藉由任何適宜途徑投與。非清髓性淋巴耗盡化學療法可包括例如投與環磷醯胺及氟達拉濱(fludarabine)，特定言之若癌症為黑色素瘤，該黑色素瘤可係轉移性。投與環磷醯胺及氟達拉濱之示例性途徑係經靜脈內。同樣，可投與環磷醯胺及氟達拉濱之任何適宜劑量。於特定態樣中，投與約60 mg/kg之環磷醯胺持續兩天，之後投與約25 mg/m² 之氟達拉濱持續五天。

於某些實施例中，與免疫細胞同時或免疫細胞之後向個體投與促進免疫細胞之生長及活化之生長因子。免疫細胞生長因子可為促進免疫細胞之生長及活化之任何適宜生長因子。適宜免疫細胞生長因子之實例包括介白素(IL)-2、IL-7、IL-15及IL-12，其可單獨或於各種組合中使用，諸如IL-2及IL-7、IL-2及IL-15、IL-7及IL-15、IL-2、IL-7及IL-15、IL-12及IL-7、IL-12及IL-15、或IL-12及IL2。

治療上有效量之免疫細胞可藉由許多途徑投與，包括非經腸投與，例如，靜脈內、腹膜內、肌肉內、胸骨內或關節內注射或輸注。

用於授受性細胞療法之免疫細胞之治療上有效量為達成正在治療之個體之所需效果的量。例如，此可為抑制進展，或引起自體免疫或同種免疫疾病之消退所需之免疫細胞的量，或其能緩解由自體免疫疾病引起之症狀，諸如疼痛及發炎。其可為緩解與發炎相關之症狀，諸如疼痛、浮腫及升高之體溫所需之量。其亦可為減少或防止移植器官之排斥所需之量。

免疫細胞群體可以符合疾病之治療方案投與，例如單一劑量或少量劑量歷時一至若干天以改善疾病狀態或在延長之時間內之週期劑量以抑制疾病進展及防止疾病復發。於調配物中採用之精確劑量亦將取決於投與途徑及疾病或病症之嚴重度，且應根據從業者之判斷及各患者之情況決定。免疫細胞之治療上有效量將取決於正在治療之個體、痛苦之嚴重度及類型及投與方式。於一些實施例中，可用於治療人類個體之劑量範圍為至少3.8×10⁴ 、至少3.8×10⁵ 、至少3.8×10⁶ 、至少3.8×10⁷ 、至少3.8×10⁸ 、至少3.8×10⁹ 或至少3.8×10¹⁰ 個免疫細胞/m² 。於某一實施例中，用於治療人類個體之劑量範圍為約3.8×10⁹ 至約3.8×10¹⁰ 個免疫細胞/m² 。於另外實施例中，免疫細胞之治療上有效量可自約5×10⁶ 個細胞/kg體重至約7.5×10⁸ 個細胞/kg體重，諸如約2×10⁷ 個細胞至約5×10⁸ 個細胞/kg體重，或約5×10⁷ 個細胞至約2×10⁸ 個細胞/kg體重變化。免疫細胞之精確量由熟習此項技術者基於個體之年齡、體重、性別及生理狀況容易確定。有效劑量可自源自活體外或動物模型測試系統之劑量-反應曲線推斷而來。

免疫細胞可與用於治療免疫介導之病症之一或多種其他治療劑組合投與。組合療法可包括(但不限於)一或多種抗微生物劑(例如，抗生素、抗病毒劑及抗真菌劑)、抗腫瘤劑(例如，氟尿嘧啶(fluorouracil)、胺甲喋呤(methotrexate)、紫杉醇(paclitaxel)、氟達拉濱、依託泊苷(etoposide)、多柔比星(doxorubicin)或長春新鹼(vincristine))、免疫耗盡劑(例如，氟達拉濱、依託泊苷、多柔比星或長春新鹼)、免疫抑制劑(例如，硫唑嘌呤(azathioprine)或糖皮質激素，諸如地塞米松(dexamethasone)或潑尼松(prednisone))、抗發炎劑(例如，糖皮質激素，諸如氫化可的松(hydrocortisone)、地塞米松或潑尼松，或非甾體抗發炎劑，諸如乙醯基水楊酸、布洛芬(ibuprofen)或萘普生(naproxen)鈉)、細胞激素(例如，介白素-10或轉化生長因子-β)、激素(例如，雌激素)或疫苗。此外，可投與包括(但不限於)鈣調磷酸酶(calcineurin)抑制劑(例如，環孢菌素(cyclosporin)及他克莫司(tacrolimus))；mTOR抑制劑(例如，雷帕黴素)；嗎替麥考酚酯(mycophenolate mofetil)抗體(例如，識別CD3、CD4、CD40、CD154、CD45、IVIG或B細胞)；化療劑(例如，胺甲喋呤、蘇消安(Treosulfan)、白消安(Busulfan))；照射；或趨化因子、介白素或其抑制劑(例如，BAFF、IL-2、抗IL-2R、IL-4、JAK激酶抑制劑)之免疫抑制或耐受原劑。此等另外醫藥劑可在投與免疫細胞之前、期間或之後投與，取決於所需效果。細胞及藥劑之此投與可藉由相同途徑或藉由不同途徑，及在相同位點或在不同位點處。 IV.醫藥組合物

本文中亦提供醫藥組合物及調配物，其包含免疫細胞(例如，T細胞或NK細胞)及醫藥上可接受之載劑。

如本文中所述之醫藥組合物及調配物可藉由將具有所需純度之活性成分(諸如抗體或多肽)與一或多種可選醫藥上可接受之載劑(Remington's Pharmaceutical Sciences，第22版，2012)混合來製備，呈凍乾調配物或水溶液形式。醫藥上可接受之載劑在所採用之劑量及濃度下一般對接受者無毒，且包括(但不限於)：緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八基二甲基苄基氯化銨；六甲氯銨；苯紮氯銨；苄索氯銨；苯酚、丁基醇或苄基醇；對羥基苯甲酸烷酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；雷鎖辛；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩胺醯胺、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他糖類，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽抗衡離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如，Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子表面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。本文中示例性醫藥上可接受之載劑進一步包括間質藥物分散劑，諸如可溶性中性活性透明質酸酶醣蛋白(sHASEGP)，例如，人類可溶性PH-20透明質酸酶醣蛋白，諸如rHuPH20 (HYLENEX^® ，Baxter International, Inc.)。某些示例性sHASEGP及使用方法(包括rHuPH20)述於美國專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號中。於一個態樣中，sHASEGP與一或多種另外糖胺聚糖酶(諸如軟骨素酶)組合。V. 組合療法

於某些實施例中，本實施例之組合物及方法涉及免疫細胞群體與至少一種另外療法組合。該另外療法可為放射療法、手術(例如，乳房腫瘤切除術及乳房切除術)、化療、基因療法、DNA療法、病毒療法、RNA療法、免疫療法、骨髓移植、奈米療法、單株抗體療法或上述之組合。該另外療法可呈輔助或新輔助療法之形式。

於一些實施例中，該另外療法為投與小分子酶促抑制劑或抗轉移劑。於一些實施例中，該另外療法為投與副作用限制劑(例如，意欲減少治療之副作用之出現及/或嚴重度之藥劑， 諸如抗噁心劑等)。於一些實施例中，該另外療法為放射療法。於一些實施例中，該另外療法為手術。於一些實施例中，該另外療法為放射療法與手術之組合。於一些實施例中，該另外療法為γ放射。於一些實施例中，該另外療法為靶向PBK/AKT/mTOR路徑之療法、HSP90抑制劑、微管蛋白(tubulin)抑制劑、細胞凋亡抑制劑及/或化學預防劑。該另外療法可為此項技術中已知之化學治療劑中之一或多者。

可在另外癌症療法(諸如免疫檢查點療法)之前、期間、之後或相對於另外癌症療法之各種組合中投與免疫細胞療法。投與可係以同時至數分鐘至數天至數週之範圍之間隔。於自另外治療劑分開向患者提供免疫細胞療法之實施例中，吾人一般將確保一大段時間在各遞送之時間之間不失效，使得兩種化合物仍能發揮對患者之有利組合效果。於此等實例中，設想吾人可於彼此之約12至24或72小時內，及更特定言之，於彼此之約6至12小時內提供給患者抗體療法及抗癌療法。於一些情況下，可期望顯著延長治療之時間段，其中各自投與之間經過若干天(2、3、4、5、6或7)至若干週(1、 2、3、4、5、6、7或8)。

可採用各種組合。針對以下實例，免疫細胞療法為「A」及抗癌療法為「B」： A/B/A   B/A/B   B/B/A  A/A/B  A/B/B  B/A/A   A/B/B/B   B/A/B/B B/B/B/A   B/B/A/B   A/A/B/B   A/B/A/B   A/B/B/A   B/B/A/A B/A/B/A   B/A/A/B   A/A/A/B   B/A/A/A   A/B/A/A   A/A/B/A

本實施例之任何化合物或療法向患者之投與將按照投與此等化合物之一般方案，考慮藥劑之毒性(若有的話)。因此，於一些實施例中，存在監測歸因於組合療法之毒性之步驟。1. 化療

根據本實施例可使用廣泛各種化療劑。術語「化療」係指使用藥物治療癌症。「化療劑」係用於暗示治療癌症所投與之化合物或組合物。此等藥劑或藥物藉由其於細胞內之活性模式分類，例如，其是否及在什麼階段影響細胞週期。或者，藥劑可基於其直接交聯DNA、插入DNA或藉由影響核酸合成來誘導染色體及有絲分裂畸變之能力來表徵。

化療劑之實例包括烷基化劑，諸如噻替派(thiotepa)及環磷醯胺；烷基磺酸酯，諸如白消安、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；環乙亞胺(aziridine)，諸如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多帕(meturedopa)及優多帕(uredopa)；伸乙基亞胺及甲基蜜胺，包括六甲蜜胺(altretamine)、三伸乙基蜜胺、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫代磷醯胺及三羥甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；多聚乙醯(acetogenin) (尤其布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone))；喜樹鹼(camptothecin) (包括合成類似物托泊替康(topotecan))；苔蘚蟲素(bryostatin)；凱利他汀(callystatin)；CC-1065 (包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)及比折來新(bizelesin)合成類似物)；念珠藻素(cryptophycin) (特定言之念珠藻素1及念珠藻素8)；朵拉司他汀(dolastatin)；杜卡黴素(duocarmycin) (包括合成類似物，KW-2189及CB1-TM1)；軟珊瑚醇(eleutherobin)；水鬼蕉鹼(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海綿抑制素(spongistatin)；氮芥(nitrogen mustard)，諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷醯胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、甲氮芥(mechlorethamine)、鹽酸甲氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)及尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亞硝基脲(nitrosurea)，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲黴素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，諸如烯二炔抗生素(例如，卡奇黴素(calicheamicin)，尤其卡奇黴素γlI及卡奇黴素ωI1)；達內黴素(dynemicin)，包括達內黴素A；雙膦酸鹽，諸如氯膦酸鹽(clodronate)；埃斯帕黴素(esperamicin)；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)發色團及相關色蛋白烯二炔抗生素發色團，阿克拉黴素(aclacinomysin)、放線菌素(actinomycin)、安麯黴素(authrarnycin)、重氮絲胺酸(azaserine)、博來黴素(bleomycin)、放線菌素C (cactinomycin)、卡拉比星(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycinis)、更生黴素(dactinomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮雜-5-側氧基-L-正白胺酸、多柔比星(doxorubicin) (包括嗎啉基-多柔比星、氰基嗎啉基-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星及去氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycin) (諸如絲裂黴素C)、麥考酚酸(mycophenolic acid)、諾加拉黴素(nogalarnycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、波菲黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、奎那黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑黴素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)及佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如胺甲喋呤及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、蝶羅呤(pteropterin)及曲麥克特(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)及硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二去氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)及氟尿苷(floxuridine)；雄激素，諸如卡魯睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)及睾內酯(testolactone)；抗腎上腺，諸如米托坦(mitotane)及曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如frolinic acid；乙葡醛內酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；胺基乙醯丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；貝曲布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate)；地磷醯胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依洛尼塞(elformithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；埃博黴素(epothilone)；乙環氧啶(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲(hydroxyurea)；香菇多醣(lentinan)；洛尼達寧(lonidainine)；美登醇(maytansinoid)，諸如美登素(maytansine)及安絲菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；噴司他汀(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基肼；丙卡巴嗪(procarbazine)；PSK多醣複合物；雷佐生(razoxane)；根瘤菌素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；螺旋鍺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯三乙胺；單端孢黴烯(trichothecene) (尤其T-2毒素、維拉庫林(verracurin) A、桿孢菌素(roridin) A及蛇形毒素(anguidine))；烏拉坦(urethane)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托肽(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside) (「Ara-C」)；環磷醯胺；紫杉烷(taxoid)，例如，特素(paclitaxel)及多西他奇(docetaxel)；吉西他濱(gemcitabine)；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；鉑配位複合物，諸如順鉑(cisplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)及卡鉑(carboplatin)；長春鹼(vinblastine)；鉑；依託泊苷(VP-16)；異環磷醯胺；米托蒽醌；長春新鹼；長春瑞濱(vinorelbine)；諾消靈(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依達曲沙(edatrexate)；道諾黴素(daunomycin)；胺基喋呤(aminopterin)；希羅達(xeloda)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；伊立替康(irinotecan) (例如，CPT-11)；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(difluorometlhylornithine) (DMFO)；類視色素(retinoid)，諸如視黃酸(retinoic acid)；卡培他濱(capecitabine)；卡鉑、丙卡巴嗪、普卡黴素(plicomycin)、吉西他濱(gemcitabien)、諾維本(navelbine)、法尼基(farnesyl)-蛋白質轉移酶抑制劑、反鉑(transplatinum)及以上任一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。2. 放射療法

造成DNA損傷及廣泛使用之其他因素包括通常稱作γ-射線、X-射線及/或直接遞送放射性同位素至腫瘤細胞者。亦設想DNA損傷因素之其他形式，諸如微波、質子束照射(美國專利5,760,395及4,870,287)及UV-照射。最可能為所有此等因素影響對DNA、對DNA之前驅體、對DNA之複製及修復，及對染色體之組裝及維持之廣泛損傷。X-射線之劑量範圍自50至200倫琴之每日劑量達延長時間段(3至4週)至2000至6000倫琴之單一劑量。放射性同位素之劑量範圍廣泛變化，且取決於同位素之半衰期、發射之輻射之強度及類型及贅生物細胞之吸收。 3.免疫療法

熟習技工應瞭解，另外免疫療法可與實施例之方法組合或聯合使用。於癌症治療之情況下，免疫治療一般而言依賴於免疫效應細胞及靶向且破壞癌細胞之分子之使用。利妥昔單抗(RITUXAN®)為此實例。免疫效應子可為例如特異性針對腫瘤細胞表面上之一些標記物之抗體。該抗體單獨可用作療法之效應子或其可募集其他細胞以實際上實現細胞殺死。抗體亦可結合至藥物或毒素(化療、放射核素、篦麻毒素(ricin) A鏈、霍亂毒素、百日咳毒素等)且用作靶向劑。或者，效應子可為攜帶與腫瘤細胞靶直接或間接相互作用之表面分子之淋巴細胞。各種效應細胞包括細胞毒性T細胞及NK細胞。

抗體-藥物結合物已出現作為開發癌症療法之突破方法。癌症為世界死亡之主要原因。抗體-藥物結合物(ADC)包含共價連接至殺死細胞藥物之單株抗體(MAb)。此方法將MAb針對其抗原靶之高特異性與高強效細胞毒性藥物組合，導致遞送載荷(藥物)至具有濃化水平之抗原之腫瘤細胞之「武裝」MAb。藥物之靶向遞送亦最小化其於正常組織中之暴露，導致降低之毒性及提高之治療指數。由FDA批准之兩種ADC藥物，ADCETRIS® (本妥昔單抗(brentuximab vedotin)) (於2011年)及KADCYLA® (曲妥珠單抗美坦新(trastuzumab emtansine)或T-DM1) (於2013年)驗證該方法。目前於用於癌症治療之臨床試驗之各種階段存在超過30種ADC藥物候選(Leal等人，2014)。因為抗體工程改造及連接體-載荷最佳化變得越來越成熟，新穎ADC之發現及開發越來越依賴於適用於此方法之新穎靶之識別及驗證及靶向MAb之產生。用於ADC靶之兩個標準為腫瘤細胞之上調/高水平表現及穩健內在化。

於免疫療法之一個態樣中，腫瘤細胞必須攜帶一些標記物，該標記物服從靶向，即，在大多數其他細胞上不存在。許多腫瘤標記物存在及於本實施例之情況下，此等中之任一者可適用於靶向。常見腫瘤標記物包括CD20、癌胚抗原、酪胺酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸基路易士(Sialyl Lewis)抗原、MucA、MucB、PLAP、層黏連蛋白(laminin)受體、erb B及p155。免疫療法之替代態樣為將抗癌效果與免疫刺激效果組合。免疫刺激分子亦存在，包括：細胞激素(諸如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN)、趨化因子(諸如MIP-1、MCP-1、IL-8)及生長因子(諸如FLT3配位體)。

目前在研究中或於使用中之免疫療法之實例為免疫佐劑，例如，牛型結核菌(Mycobacterium bovis)、鐮狀瘧原蟲(Plasmodium falciparum)、二硝基氯苯及芳族化合物(美國專利5,801,005及5,739,169；Hui及Hashimoto，1998；Christodoulides等人，1998)；細胞激素療法，例如，干擾素α、β及γ、IL-1、GM-CSF及TNF (Bukowski等人，1998；Davidson等人，1998；Hellstrand等人，1998)；基因療法，例如，TNF、IL-1、IL-2及p53 (Qin等人，1998；Austin-Ward及Villaseca，1998；美國專利5,830,880及5,846,945)；及單株抗體，例如，抗CD20、抗神經節苷脂GM2及抗p185 (Hollander, 2012；Hanibuchi等人，1998；美國專利5,824,311)。設想可採用一或多種抗癌療法與本文中所述之抗體療法。

於一些實施例中，該免疫療法可為免疫檢查點抑制劑。免疫檢查點打開信號(例如，共刺激分子)或關閉信號。可藉由免疫檢查點阻斷靶向之抑制性免疫檢查點包括腺苷A2A受體(A2AR)、B7-H3 (亦稱作CD276)、B及T淋巴細胞衰減器(BTLA)、細胞毒性T-淋巴細胞相關蛋白4 (CTLA-4，亦稱作CD152)、吲哚胺2,3-二氧酶(IDO)、殺手細胞免疫球蛋白(KIR)、淋巴細胞活化基因-3 (LAG3)、程式化死亡1 (PD-1)、T-細胞免疫球蛋白域及黏液素域3 (TIM-3)及T細胞活化之V-域Ig抑制劑(VISTA)。特定言之，免疫檢查點抑制劑靶向PD-1軸及/或CTLA-4。

免疫檢查點抑制劑可為藥物，諸如小分子，配位體或受體之重組形式，或特定言之，為抗體，諸如人類抗體(例如，國際專利公開案WO2015016718；Pardoll,Nat Rev Cancer, 12(4): 252-64, 2012；二者以引用的方式併入本文中)。可使用免疫檢查點蛋白質或其類似物之已知抑制劑，特定言之可使用抗體之嵌合、人源化或人類形式。熟習者應瞭解，替代及/或等效名稱可用於本發明中所提及之某些抗體。此等替代及/或等效名稱於本發明之上下文中係可交換。例如應瞭解蘭博利珠單抗(lambrolizumab)亦以替代及等效名稱MK-3475及派姆單抗(pembrolizumab)所知。

於一些實施例中，PD-1結合拮抗劑為抑制PD-1與其配位體結合搭檔結合之分子。於特定態樣中，PD-1配位體結合搭檔為PDL1及/或PDL2。於另一實施例中，PDL1結合拮抗劑為抑制PDL1與其結合搭檔結合之分子。於特定態樣中，PDL1結合搭檔為PD-1及/或B7-1。於另一實施例中，PDL2結合拮抗劑為抑制PDL2與其結合搭檔結合之分子。於特定態樣中，PDL2結合搭檔為PD-1。拮抗劑可為抗體、其抗原結合片段、免疫黏合素、融合蛋白或寡肽。示例性抗體述於美國專利案第US8735553號、第US8354509號及第US8008449號中，所有係以引用的方式併入本文中。用於本文中所提供之方法中之其他PD-1軸拮抗劑係此項技術中已知，諸如述於美國專利申請案第US20140294898號、第US2014022021號及第US20110008369號中，所有係以引用的方式併入本文中。

於一些實施例中，該PD-1結合拮抗劑為抗PD-1抗體(例如，人類抗體、人源化抗體或嵌合抗體)。於一些實施例中，該抗PD-1抗體係選自由納武單抗(nivolumab)、派姆單抗及CT-011組成之群。於一些實施例中，該PD-1結合拮抗劑為免疫黏合素(例如，包含融合至恆定區(例如，免疫球蛋白序列之Fc區)之PDL1或PDL2之細胞外或PD-1結合部分之免疫黏合素)。於一些實施例中，該PD-1結合拮抗劑為AMP- 224。納武單抗(亦稱作MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558及OPDIVO^® )為WO2006/121168中所述之抗PD-1抗體。派姆單抗(亦稱作MK-3475、Merck 3475、蘭博利珠單抗、KEYTRUDA^® 及SCH-900475)為WO2009/114335中所述之抗PD-1抗體。CT-011 (亦稱作hBAT或hBAT-1)為WO2009/101611中所述之抗PD-1抗體。AMP-224 (亦稱作B7-DCIg)為WO2010/027827及WO2011/066342中所述之PDL2-Fc融合可溶性受體。

可於本文中所提供之方法中靶向之另一免疫檢查點為細胞毒性T-淋巴細胞相關蛋白4 (CTLA-4)，亦稱作CD152。人類CTLA-4之完全cDNA序列具有Genbank寄存編號L15006。CTLA-4在T細胞之表面上發現且當結合至抗原呈遞細胞表面上之CD80或CD86時，充當「關閉(off)」開關。CTLA4為在輔助T細胞之表面上表現之免疫球蛋白超家族之成員且將抑制信號傳輸至T細胞。CTLA4係類似於T-細胞共刺激蛋白CD28，及兩種分子各自結合至抗原呈遞細胞上之CD80及CD86，亦稱作B7-1及B7-2。CTLA4將抑制信號傳輸至T細胞，然而CD28傳輸刺激信號。細胞內CTLA4亦於調節性T細胞中發現且對於其功能可係重要的。通過T細胞受體及CD28之T細胞活化導致CTLA-4 (B7分子之抑制受體)之增加的表現。

於一些實施例中，該免疫檢查點抑制劑為抗CTLA-4抗體(例如，人類抗體、人源化抗體或嵌合抗體)、其抗原結合片段、免疫黏合素、融合蛋白或寡肽。

可使用此項技術中熟知方法產生適用於本方法之抗人類CTLA-4抗體(或自其衍生之VH及/或VL域)。或者，可使用技術識別之抗CTLA-4抗體。例如，揭示於US 8,119,129、WO 01/14424、WO 98/42752；WO 00/37504 (CP675,206，亦稱作曲美木單抗(tremelimumab)；先前為替西木單抗(ticilimumab))，美國專利案第6,207,156號；Hurwitz等人(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95(17): 10067-10071；Camacho等人(2004)J Clin Oncology 22(145)：文摘編號2505 (抗體CP-675206)；及Mokyr等人(1998)Cancer Res 58:5301-5304中之抗CTLA-4抗體可用於本文中所揭示之方法中。上述公開案各者之教示係以引用的方式併入本文中。亦可使用與結合至CTLA-4之此等技術識別抗體中任一者競爭之抗體。例如，人源化CTLA-4抗體述於國際專利申請案第WO2001014424號、第WO2000037504號及美國專利案第8,017,114號中；所有以引用的方式併入本文中。

示例性抗CTLA-4抗體為易普利單抗(ipilimumab) (亦稱作10D1、MDX-010、MDX-101及Yervoy®)或其抗原結合片段及變異體(參見，例如，WO 01/14424)。於其他實施例中，抗體包含易普利單抗之重鏈及輕鏈CDR或VR。因此，於一個實施例中，抗體包含易普利單抗之VH區之CDR1、CDR2及CDR3域，及易普利單抗之VL區之CDR1、CDR2及CDR3域。於另一實施例中，抗體競爭結合及/或結合至與上述抗體相同之CTLA-4上之抗原決定基。於另一實施例中，抗體具有與上述抗體至少約90%可變區胺基酸序列同一性(例如，與易普利單抗至少約90%、95%或99%可變區同一性)。

用於調節CTLA-4之其他分子包括CTLA-4配位體及受體，諸如述於美國專利案第US5844905號、第US5885796號及國際專利申請案第WO1995001994號及第WO1998042752號中；所有以引用的方式併入本文中，及免疫黏合素，諸如述於美國專利案第US8329867號中，其以引用的方式併入本文中。 4.手術

約60%患有癌症的人將經歷一些類型之手術，其包括預防性、診斷性或分階段、治癒性及治標手術。治癒性手術包括切除術，其中癌組織之所有或部分經物理移除、切除及/或破壞且可結合其他療法，諸如本實施例之治療、化療、放射療法、激素療法、基因療法、免疫療法及/或替代療法使用。腫瘤切除術係指腫瘤之至少部分之物理移除。除了腫瘤切除術外，藉由手術之治療包括鐳射手術、冷凍手術、電手術及顯微鏡控制之手術(莫氏(Mohs’)手術)。

在切除癌細胞、組織或腫瘤之部分或所有後，可於體內形成腔。治療可藉由輸注、直接注射或另外抗癌療法之局部應用區域實現。可例如，每1、2、3、4、5、6或7天，或每1、2、3、4及5週或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月重複此治療。此等治療亦可為變化之劑量。5. 其他藥劑

設想其他藥劑可與本實施例之某些態樣組合使用以提高治療之治療功效。此等另外藥劑包括實現細胞表面受體及GAP接合之上調之藥劑、細胞抑制及分化劑、細胞黏附抑制劑、增加高增殖性細胞對細胞凋亡誘導劑之敏感性之藥劑或其他生物劑。藉由增加GAP接合之數目之細胞間信號傳導之增加將增加對相鄰高增殖性細胞群體之抗高增殖性效應。於其他實施例中，細胞抑制或分化劑可與本實施例之某些態樣組合使用以提高治療之抗高增殖性功效。設想細胞黏附抑制劑以提高本實施例之功效。細胞黏附抑制劑之實例為局灶性黏合激酶(FAK)抑制劑及洛伐他汀(Lovastatin)。進一步設想增加高增殖細胞對細胞凋亡之敏感性之其他藥劑(諸如抗體c225)可與本實施例之某些態樣組合使用以提高治療功效。 VI.製品或套組

本文中亦提供包含免疫細胞之製品或套組。製品或套組可進一步包含包裝插入物，該插入物包含使用免疫細胞治療或延遲個體之癌症之進展或增強患有癌症之個體之免疫功能之說明。本文中所述之抗原特異性免疫細胞中之任一者可包含於製品或套組中。適宜容器包括例如瓶、小瓶、袋及注射器。該容器可自各種材料，諸如玻璃、塑膠(諸如聚氯乙烯或聚烯烴)或金屬合金(諸如不銹鋼或哈斯特洛依合金(hastelloy))形成。於一些實施例中，該容器容納調配物及該容器上或與該容器相關之標籤可指示使用指導。製品或套組可進一步包含自商業及使用者立場所需之其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、填料、針、注射器及具有使用說明之包裝插入物。於一些實施例中，製品進一步包含另一藥劑中之一或多者(例如，化療劑及抗贅生物劑)。針對一或多種藥劑之適宜容器包括例如瓶、小瓶、袋及注射器。VII. 實例

包含下列實例以證實本發明之特定實施例。熟習此項技術者應瞭解，以下實例中所揭示之技術表示由發明者所發現之於實踐本發明之方法中良好起作用之技術，及因此可被認為構成其實務之特定模式。然而，熟習此項技術者根據本發明應瞭解，可在不背離本發明之標的之精神及範圍下於揭示之特定實施例中作出許多變化及仍獲得相似或類似結果。實例 1 —— CAR NK 細胞擴增

NK細胞係源自臍帶血及其特異性藉由將其遺傳工程改造以表現可增強其抗腫瘤活性而不增加移植物抗宿主疾病(GVHD)之風險之腫瘤特異性嵌合抗原受體(CAR)重定向，因此提供用於療法(諸如表現靶之任何癌症之免疫療法)之細胞之「現成」來源。

NK細胞係自健康供體之臍帶血(CB)分離及與抗原呈遞細胞(APC)及一或多種細胞激素，包括IL-2、IL-15、IL21或IL-18共培養。然後將NK細胞用針對CAR之逆轉錄病毒載體轉導。然後將經轉導之細胞進一步於具有APC及IL-2之共培養物中擴增以獲得經CAR轉導之CB-NK細胞。此等細胞可經新鮮輸注，或可於含有細胞激素之介質中冷凍用於後期解凍及輸注。圖1中概述用於產生CAR CB-NK細胞之程序。

具體而言，在第0天，將單核細胞自單一CB單元分離，洗滌及將CD3、CD14及CD19陽性細胞使用CliniMACS免疫磁性珠(Miltenyi Biotec)耗盡。收集未經標記之濃化之CB-NK細胞，用CliniMACS緩衝液洗滌，計數，及與經照射之(100 Gy) APC以1:2比率(1個NK細胞:2個APC)合併。將細胞混合物(1 x 10⁶ 個細胞/ml)轉移至含有NK細胞完全培養基(NKCCM) (90%幹細胞生長培養基，10% FBS，2 mM L-麩胺醯胺)及IL-2，200 U/mL之細胞培養燒瓶中。

將細胞在37℃下於5% CO₂ 中培育。在第3天，藉由離心收集細胞及將其再懸浮於含有IL-2，200 U/mL之NKCCM (1 x 10⁶ 個細胞/ml)中進行培養基改變。然後將細胞在37℃下於5% CO₂ 中培育。在第5天，藉由培養物中之CB-NK細胞之數目確定轉導所需之孔之數目。將重組人纖維連接蛋白溶液平板接種於24孔培養板中。將板密封及儲存於4℃冰箱中。

在第6天，如第0天所述進行第二次NK細胞選擇，之後轉導CB-NK細胞。將細胞用CliniMACS緩衝液洗滌，離心及在0.5 x 10⁶ /ml下再懸浮於含有600 U/ml IL-2之NKCCM中。然後將重組人纖維連接蛋白板用NKCCM洗滌，在37℃下培育直至使用。將各孔中之NKCCM用逆轉錄病毒上清液替換，接著在32℃下將板離心。然後將逆轉錄病毒上清液抽吸及用新鮮逆轉錄病毒上清液替換。將含有0.5 x 10⁶ 個細胞及600 U/mL IL-2之CB-NK細胞懸浮液添加至各孔，及將板離心。然後將板在37℃下用5% CO₂ 培育。

在第9天，將經CAR轉導之CB-NK細胞自轉導板移除，藉由離心收集及於遵從GMP之G-Rex®生物反應器中於含有200 U/ml IL-2 (最終濃度)之NKCCM中用放射(100 Gy) aAPC以1:2之比率(1個NK細胞:2個APC)刺激及在37℃下用5% CO₂ 培育。在第12天，添加IL-2。在第15天，收穫細胞及製備最終產品用於輸注或冷凍保存。

於轉導NK細胞後，使用G-Rex®生物反應器而非組織培養瓶持續整個培養週期增加CAR NK細胞擴增之穩健性及再現性，同時相較於燒瓶之更開放體系減少微生物污染之機會。此外，其亦明顯縮短技術專家時間，因為利用培養瓶體系，技術專家不得不每2至3天操作培養物。利用G-Rex®，如上所述餵養細胞一次及然後不受干擾直至第15天收穫。如圖3中所示，自含有28百萬個細胞之經轉導之CB細胞級分，於G-Rex®生物反應器中產生7.67 x 10⁹ 個CAR NK細胞之中值(p=0.014)，相比燒瓶中產生0.91 x 10⁹ 個CAR NK細胞。此表示於轉導後與燒瓶中之78倍擴增相比，於G-Rex®生物反應器中之中值274倍擴增(p=0.037) (自培養之第6天至第15天)。利用任一程序，轉導效率為約67%之優異中值(範圍48至87%)。因此，於NK細胞轉導步驟後使用G-Rex®生物反應器提供CAR NK細胞生產之優異策略。

將經擴增之CB CAR-NK細胞於具有5% DMSO之遵從GMP之NK細胞冷凍保存培養基混合物中冷凍，及使用速率控制方法於液氮中冷凍。活體外鉻釋放分析證實，利用新鮮相對冷凍CAR-NK細胞之Raji及K562細胞系二者之可比較的殺死。使用異種基因NSG小鼠模型之活體內殺死分析亦證實，冷凍相對新鮮NK細胞針對Raji腫瘤之可比較的抗腫瘤活性，如使用螢光素酶標記之Raji細胞之生物發光造影所評估。

圖4顯示用於活體內NSG研究之7種不同治療臂及相關對照之生存。經Raji腫瘤植入及經冷凍CAR-NK細胞處理之小鼠具有與接受新鮮CAR-NK細胞之動物可比擬之生存。圖5顯示此等動物之生存曲線及圖6顯示統計分析之細節。圖7顯示生物發光造影資料，其顯示經新鮮CAR-NK細胞或利用吾人新穎冷凍保存培養基混合物冷凍之CAR-NK細胞處理之荷Raji小鼠之最強效抗腫瘤活性。

使用此策略，超過100個劑量之1 x 10⁶ 個CAR NK細胞/Kg可自用於治療患者之各臍帶血單元產生。因此，源自經CAR轉導之臍帶血之NK細胞可提供NK細胞之現成來源，該等NK細胞可識別及攻擊許多癌症，包括液體及實體腫瘤。源自臍帶血之自然殺手細胞之逆轉錄病毒轉導允許用於許多癌症之免疫療法及潛在用於治療許多病毒感染之經工程改造之細胞的更長持久性及提高的功效。實例 2—— 經 CAR 轉導之自然殺手細胞於 CD19 陽性淋巴瘤中之使用

本實例涉及1及2期試驗之結果，其中向患有復發或難治性CD19陽性癌症(非霍奇金氏淋巴瘤或慢性淋巴細胞性白血病[CLL])之11名患者投與源自臍帶血之HLA錯配之抗CD19 CAR-NK細胞。將NK細胞用表現編碼抗CD19 CAR、介白素-15及作為安全開關之可誘導半胱天冬酶9之基因的逆轉錄病毒載體轉導。於淋巴耗盡化療後，將細胞離體擴增及在三個劑量(1×10⁵ 、1×10⁶ 或1×10⁷ 個CAR-NK細胞/kg體重)中之一者下以單一輸注投與。如本文中所述，CAR-NK細胞之投與係與細胞激素釋放症候群、神經毒性或移植物抗宿主疾病之發展不相關，及不存在發炎性細胞激素(包括介白素-6)之水平超過基線之增加。未達到最大耐受劑量。經治療之11名患者中，8名(73%)具有反應；此等患者中，7名(4名具有淋巴瘤及3名具有CLL)具有完全緩解，及1名具有里克特氏(Richter’s)轉化組分之緩解，但是具有持久之CLL。反應係快速的且於輸注後30天內在所有劑量程度下可見。經輸注之CAR-NK細胞在低水平下擴增及持久至少12個月。 研究設計及患者

本實例提供此研究中之前11名患者之資訊，資料截止為2019年4月。簡言之，患者經歷每日利用氟達拉濱(在30 mg/m² 之身體表面積之劑量下)及環磷醯胺(在300 mg/m² 之劑量下)持續3個連續日的淋巴耗盡化療，接著在1×10⁵ 個細胞、1×10⁶ 個細胞及1×10⁷ 個細胞/kg體重之漸增劑量下單一輸注試驗CAR-NK細胞。於第30天評估後，在治療醫師之裁量下許可緩解後療法。

前9名患者接受與接受者之HLA基因型部分匹配(HLA基因座A、B及DRβ1處之4/6匹配)之CAR-NK產品(圖9及圖22A及22B)。然後修改方案以許可不考慮HLA匹配之治療，其為患者10及11中所用之程序。當可能時，利用類殺手免疫球蛋白受體(KIR)配位體錯配(Mehta及Rezvani，2016)選擇臍帶血單元用於CAR-NK生產。(供體與接受者之間之KIR錯配可通過稱作缺失自我識別之過程增強NK細胞之內在[非CAR介導]之抗腫瘤活性。)對療法之臨床反應係基於國際工作組關於慢性淋巴細胞性白血病之2018標準(Hallek等人，2018)及針對非霍奇金氏淋巴瘤之2014 Lugano分類(Cheson等人，2014)。(實例3中提供進一步細節。) 製造來自臍帶血之CAR-NK細胞

於實例3之方法部分中提供關於CAR-NK細胞之製造之全部細節。簡言之，將臍帶血單元解凍及將NK細胞純化及在經工程改造之K562飼養細胞及介白素-2之存在下培養。在第6天，將細胞用編碼抗CD19 CAR、CD28.CD3ζ信號傳導內域、介白素-15及可誘導半胱天冬酶9之基因之逆轉錄病毒載體轉導(Hoyos等人，2010)。將細胞擴增及在第15天收穫用於新鮮輸注。輸注產品之最終CAR-NK轉導之效率為49.0% (範圍22.7至66.5)。於活體外測試CAR-NK細胞及以穿孔素依賴性方式殺死主要CLL靶(圖13)。輸注產品中之中值CD3陽性T-細胞含量為500個細胞/kg (範圍30至8000)，產品中具有0.01%中值 (範圍0.01至0.002)之污染CAR T細胞(圖23)。 統計分析

威克森(Wilcoxon)秩和測試係用於測試對療法之反應與CAR-NK細胞之含量之間之關聯。認為小於0.05之P值指示統計顯著。 患者之特徵

自2017年6月至2019年2月，根據方案募集15名連續患者。在此等患者中，4名在開始治療之前由於疾病進展、移植物抗宿主疾病之發展、可檢測疾病之不存在及產品之細菌污染退出(各1名患者)。因此，11名患者接受單一劑量之CAR-NK細胞(圖9及圖22A及22B)。患者之中值年齡為60歲(範圍47至70)。11名患者已接受中值4線療法(範圍3至11)。五名患者具有CLL (包括具有里克特氏轉化或加速CLL之2名)，及所有具有疾病進展史，同時接受依布替尼(ibrutinib)加最少3線其他療法；所有5名患者具有高風險遺傳特徵。六名患者患有淋巴瘤，包括2名患有瀰漫性大B細胞淋巴瘤及4名具有濾泡形式；此等患者中之3名經歷高惡性度淋巴瘤之轉化。在6名患有淋巴瘤之患者中，4名於自體造血幹細胞移植後經歷疾病進展及2名患有難治疾病。 安全性

於輸注CAR-NK細胞後，患者中無一者具有細胞激素釋放症候群、神經毒性或噬血細胞性淋巴組織細胞增多症之症狀。此外，未觀察到移植物抗宿主疾病之任何病例，儘管患者與其CAR-NK產品之間之HLA錯配。如所期望，所有患者具有短暫及可逆血液毒性事件，其主要與淋巴耗盡化療相關。不可確定CAR-NK細胞之輸注是否有助於血液毒性。不存在腫瘤溶解症候群或3或4級非血液毒性之情況。未達到CAR-NK細胞之最大耐受劑量。表2如圖10列出研究中觀察到之所有不良事件。不許可患者進入加護病房(ICU)以管理與CAR-NK細胞相關之不良事件。然而，許可患者2進入ICU以治療進展性淋巴瘤及隨後死亡。鑑於研究中不存在嚴重毒性，本發明者不活化半胱天冬酶9安全性開關(利用瑞米度西(rimiducid))以消除CAR-NK細胞。 治療反應

在13.8個月之中值追蹤期(範圍2.8至20.0)，8名患者(73%)具有客觀反應，包括7名具有完全反應之患者(3名患有CLL及4名患有淋巴瘤) (圖11)。患有CLL且里克特氏轉化之另一患者(患者5)具有高惡性度淋巴瘤之完全緩解，根據於CAR-NK輸注30天後進行之正電子發射斷層攝影術——電腦斷層攝影術(PET-CT)上不存在具有氟去氧葡萄糖攝入之病變，但是繼續具有血球減少，藉由CLL之骨髓浸潤(圖14)。雖然此患者最終具有完全反應，同時接受緩解後療法(見下)，本發明者不將此反應歸因於CAR-NK療法。於所有8名患者中，對治療之反應在輸注後之第一個月期間發生。在被治療之11名患者中，5名接受KIR配位體錯配之產品。 後緩解療法

具有對CAR-NK療法之反應之8名患者中，5名經歷後緩解療法(圖11)。患者3 (其患有CLL)於輸注9個月後具有隨後最小殘留疾病，如在外周血之流動式細胞測量術上所檢測及接受利妥昔單抗。患者7 (其亦患有CLL)具有臨床完全反應，但是具有持久最小殘留疾病及於輸注6週後開始接受來那度胺(lenalidomide)作為免疫調節劑。患者8 (其患有轉化之濾泡性淋巴瘤)及患者11 (其患有濾泡性淋巴瘤)於CAR-NK療法後經歷造血幹細胞移植，同時完全反應而無最小殘留疾病之證據。患者5 (其患有CLL且里克特氏轉化)具有高惡性度淋巴瘤之緩解，但是具有持久之CLL及接受維奈托克(venetoclax)。所有此等患者係活著且在最後評估之日完全緩解，雖然患者3、5及7繼續具有最小殘留疾病之陽性結果。 B細胞發育不全

因為B-細胞發育不全已用作抗CD19 CAR T-細胞活性之代理，於輸注CAR-NK細胞後於患者之外周血中量測CD19-陽性B細胞之頻率。除了患者1及5外之所有患者在募集時具有與先前B-細胞耗盡療法相關之B-細胞發育不全。於患者1中，B-細胞發育不良於CAR-NK療法及淋巴耗盡化療後發展。患者5具有外周血中之持久CLL，儘管相對於高惡性度轉化具有完全反應，直至其接受維奈托克。患者3具有與最小殘留疾病之復發陽性一致之B-細胞恢復之證據。剩餘患者中無一者在追蹤期期間具有正常B-細胞計數之恢復。 CAR-NK擴增、遷移及持久性

使用定量即時聚合酶鏈反應分析，根據載體轉殖基因副本數目/微克基因組DNA來量測CAR-NK細胞之活體內擴增。早在輸注3天後看到擴增，其中CAR-NK細胞堅持至少12個月(圖12A及圖24)。於輸注3至14天後量測峰值CAR-NK副本數目及係劑量依賴性。超過第14天，於外周血轉錄本之含量或在CAR-NK細胞之持久性方面未注意到劑量相關之差異。如用CAR-T細胞治療之患者中所報導(Turtle等人，2017；Neelapu等人，2017；Maude等人，2014)，具有對療法之反應之吾人研究中之患者較不具有反應之彼等具有顯著更高的CAR-NK細胞之早期擴增(圖12B)。根據與接受者HLA錯配之程度，未觀察到於CAR-NK細胞之持久性方面之差異(圖9中之表1及圖15)。此等結果藉助流動式細胞測量術證實(圖16) (Muftuoglu等人，2018)。

於具有可得淋巴結樣本之2名患者中，於淋巴結中較於骨髓或外周血中發現更多CAR-NK細胞(圖17及18)，發現結果支持CAR-NK細胞歸巢於疾病部位之觀念。於具有可得樣本之10名患者之骨髓及外周血中檢測到CAR-NK細胞之相似水平(圖19)。

產品中之污染CAR表現T細胞之最小數目於輸注後不導致可檢測之CAR T-細胞擴增，CD3+ T細胞不導致移植物抗宿主疾病之發展(圖20)。CAR-NK細胞在不具有反應或具有復發之患者中仍在低水平下可檢測，儘管腫瘤細胞中之CD19之表現，其於某些實施例中指示替代免疫逃避機制(諸如CAR-NK衰竭之誘導)之存在。尚未進行具有復發之患者中之殘留CAR-NK細胞的功能研究。持久CAR-NK細胞在復發時未於活體內擴增。 血清細胞激素之分析

針對發炎性細胞激素以及介白素-15量測來自連續外周血樣本之上清液，該介白素-15藉由用於生產CAR-NK細胞之逆轉錄病毒載體編碼。未觀察到發炎性細胞激素(例如，介白素-6及腫瘤壞死因子α)之水平相較於基線水平之增加，不存在介白素-15之全身水平超過處理前值之增加，其指示介白素-15於輸注後不藉由外周血中之CAR-NK細胞釋放至實質全身水平(圖21)。 針對供體之同種免疫抗體反應之誘導

所有患者接受HLA錯配之CAR-NK產品。患者1至9接受具有4/6 HLA分子之部分匹配之產品，然而患者10及11為非HLA匹配之CAR-NK細胞之接受者。因此，本發明者監測供體特異性HLA抗體之誘導。在進行測試時之所有時間點，未觀察到針對輸注產品之錯配之HLA對偶基因之抗體誘導(圖25)。未評估宿主細胞反應。實例 3 —— 補充材料 CAR-NK細胞製造

先前描述iC9/CAR19/IL15 CAR-NK細胞之臨床前開發(Hoyos等人，2010；Liu等人，2018)。CAR-NK細胞生產之臨床CB單元係獲自MD安德森癌症中心(MDACC) CB庫。於MDACC GMP設施中製造CAR-NK細胞。簡言之，將臍帶單元解凍及將NK細胞藉由CD3、CD19及CD14陰性選擇(Miltenyi珠)純化及在表現膜結合IL-21及4-1BB配位體之經工程改造之K562飼養細胞及外源IL-2 (200 U/ml)之存在下培養。在第6天，將細胞用攜帶針對CD19、CD28跨膜域及CD28.CD3ζ信號傳導內域之單鏈變異體片段(scFv)與人類IL15基因及可誘導半胱天冬酶-9自殺基因之組合之逆轉錄病毒載體轉導。將三種基因使用源自口蹄疫疾病病毒之2A序列肽連接在一起，及選殖至SFG逆轉錄病毒載體中以產生iC9/CAR.19/IL15逆轉錄病毒載體(Hoyos等人，2010；Liu等人，2018)。將細胞再擴增9天及在第15天收穫用於新鮮輸注。 研究設計

在本發明者之機構進行I至II期臨床試驗，及設計試驗，以判別最佳劑量及評估iC9/CAR19/IL15 CB-NK細胞之遞增劑量作為復發/難治CD19-陽性惡性疾病之治療的安全性及功效。使用逐次調適性I至II期EffTox基於權衡之設計，將劑量遞增(Thall及Cook, 2004；Thall等人，2006；Thall等人，2014)。將劑量限制性毒性定義為在細胞輸注2週內發生CRS，其需要轉移至加護病房或於輸注40天內發展出III至IV級急性GVHD或與NK-CAR細胞輸注相關之3至5級過敏反應。出於EffTox模型之目的，將功效定義為患者存活且在CAR-NK細胞輸注後第30天至少部分緩解。

收集及報告在輸注後起40天中之所有不良事件，不論其是否歸因於CAR-NK細胞療法。自治療後第40天直至12個月，收集及報告所有視為與CAR-NK細胞至少可能相關之不良事件。此外，所有患者均登記參與IRB批准之長期追蹤研究(持續15年)。EffTox劑量可接受性規則涵蓋0.50之劑量限制性毒性之概率之上限(基於CAR-T細胞經驗，吾人預料20%之患者將發展出劑量限制性CRS)及0.25之功效之概率之下限。用於計算權衡輪廓之三對等效權衡概率為(0.35, 0)、(0.55, 0.30)、(1, 0.075)。基於假設之先前平均值Prob(毒性|劑量) =0.35、0.40、0.45，及Prob(功效|劑量) = 0.15、0.20、0.25，各自計算先前之超參數，其中整體先前有效樣本大小= 1。吾人可在最低劑量程度(10⁵ 個細胞/kg)下開始處理樣本大小為12之至多3個群體中的最多36名患者；由EffTox方法選擇後續劑量，及當遞增時，不會略過未經試驗之劑量程度。使用MDACC生物統計臨床試驗部門執行網站(MDACC Department of biostatistics Clinical Trial Conduct  website) https://biostatistics.mdanderson.org/ClinicalTrialConduct/執行EffTox設計。 臨床試驗修訂及患者募集

在2017年6月與2019年2月之間，於方案中連續募集15名患者(4名篩選失敗，及11名接受療法)。患者依序參與從CAR NK輸注日至開始針對各群組內下一位患者之準備方案之14天交錯間隔，及將劑量遞增至下一個劑量程度之2-週間隔。於2019年3月，認為研究之尋找劑量部分已完成，並修訂方案，以允許在10⁷ 個細胞/kg劑量下重複進行CAR-NK細胞輸注。本發明之實例2及3報告在研究之劑量尋找部分中，接受單次輸注CAR-NK細胞治療之11名患者。此報告之數據截止日係2019年4月。臨床試驗之設計係追蹤患者12個月，之後依據針對接受基因改造之細胞產品治療之患者之IRB批准的長期追蹤研究追蹤患者。所有患者同意參與長期追蹤研究。 反應評估

於輸注4、8、12、16、26、48及52週後，及若臨床指示，則更頻繁地進行骨髓檢查及PET-CT造影。使用各自針對NHL及CLL患者之Lugano及iWCLL標準定義反應(Cheson等人，2014；Hallek等人，2008；Hallek等人，2018)。於MDACC CLIA認證之血液病理學實驗室中使用6色流動式細胞測量術以10-4個有核細胞或更好之敏感性評價所有骨髓樣本之MRD狀態。若患者具有至少兩個連續陰性評估，則認為其係MRD陰性。

用於霍奇金氏及非霍奇金氏淋巴瘤之反應評估之標準(Lugano標準) (Cheson等人，2014) 完全反應

	基於 PET-CT 之反應	基於 CT 之反應
淋巴結及淋巴外部位	完全代謝反應： 在5PS上評分1、2或3_具有或不具有殘留團塊†應知曉，於具有高生理攝入或具有脾或骨髓內之活化(例如，利用血療法或骨髓群落刺激因子)之魏氏(Waldeyer’s)環或結外部位中，攝入可較正常縱隔及/或肝更大。於此情況下，若初始牽連之部位處之攝入不大於周圍正常組織，則可推斷完全代謝反應，即使該組織具有高的生理攝入	完全放射反應(下列中之所有) 靶結節/結節團塊必須消退至LDi＜1.5 cm，無疾病之淋巴外部位
非量測之病變	不適用	不存在
器官增大	不適用	消退至正常
新病變	無	無
骨髓	無骨髓之FDG-avid疾病之證據	藉由形態學正常；若不確定，則IHC陰性

部分反應

	基於 PET-CT 之反應	基於 CT 之反應
淋巴結及淋巴外部位	部分代謝反應 評分4或5†與基線相比具有減少之攝入及任何大小之殘留團塊 在期中時，此等發現結果表明對應疾病    在治療結束時，此等發現結果只是殘留疾病	部分緩解(下列中之所有) 於至多6個靶可量測結節及結外部位之SPD減少＞50% 當病變太小而不能在CT上量測時，指定5 mm × 5 mm為缺省值 當不再可見時，0 × 0 mm 針對＞5 mm × 5 mm，但是小於正常之結節，使用實際測量值用於計算
非量測之病變	不適用	不存在/正常，消退，但是不增加
器官增大	不適用	脾必須在超出正常之長度上消退50%
新病變	無	無
骨髓	較正常骨髓之攝入更高，但是與基線相比減少之殘留攝入(允許與自化療之反應性變化相容之瀰漫性攝入)。若在結節反應之情況下於骨髓中存在持久病灶變化，則應考慮利用MRI或活組織檢查或間隔掃描之進一步評價	不適用

無反應或穩定疾病

	基於 PET-CT 之反應	基於 CT 之反應
靶結節/結節團塊，結外病變	無代謝反應 評分4或5在治療之期中或結束時不具有自基線之FDG攝入之顯著變化	穩定疾病 至多6個顯性可量測結節及結外部位之SPD自基線減少＜50%； 不滿足進展性疾病之標準
非量測之病變	不適用	無符合進展之增加
器官增大	不適用	無符合進展之增加
新病變	無	無
骨髓	自基線無變化	不適用

進展性疾病

	基於 PET-CT 之反應	基於 CT 之反應
個別靶結節/結節團塊 結外病變	進展性代謝疾病 評分4或5，具有攝入強度自基線增加及/或 在期中或治療結束評估時符合淋巴瘤之新的FDG-avid病灶	進展性疾病需要下列PPD進展中之至少一者： 個別結節/病變必須係異常，其中： LDi ＞1.5 cm及 自PPD天底點增加＞50%及LDi或SDi自天底點增加 針對病變＜2 cm，0.5 cm 針對病變＞2 cm，1.0 cm 於脾腫大之情況下，脾長度必須自其超過基線之先前增加，增加＞50%程度 (例如，15 cm脾必須增加至＞16 cm)。若無先前脾腫大，則必須自基線增加至少2 cm 新或復發脾腫大
非量測之病變	無	早已存在之非量測之病變之新或清晰進展
新病變	符合淋巴瘤而非另一種病因學(例如，感染、發炎)之新的FDG-avid病灶。若關於新病變之病因學不確定，則可考慮活組織檢查或間隔掃描	先前解決之病變之再生長。於任何軸中新結節＞1.5 cm 於任何軸中新結外部位＞1.0 cm；若於任何軸中＜1.0 cm，則其存在必須明確且必須歸因於淋巴瘤 任何大小之可評估疾病明確地歸因於淋巴瘤
骨髓	新發或復發FDG-avid病灶	新發或復發牽連

縮略語：5PS，5分量表；CT，電腦斷層攝影術；FDG，氟去氧葡萄糖；IHC，免疫組織化學；LDi，病變之最長橫向直徑；MRI，磁共振造影；PET，正電子發射斷層攝影術；PPD，LDi及垂直直徑之交叉乘積；SDi，垂直於LDi之最短軸；SPD，針對多個病變之垂直直徑之乘積的加總。*於許多患者中3分指示利用標準治療之良好預後，尤其若在期中掃描時。然而，於涉及PET之試驗中(其中研究遞減)，可較佳地認為3分為不足反應(為避免治療不足)。量測之顯性病變：最大顯性結節、結節團塊及結外病變中之至多六者被選擇以於兩個參數中明確可量測。結節應較佳地係來自身體之差別區且在可適用之情況下應包含縱隔及腹膜後區。非結節病變包括實體器官(例如，肝、脾、腎、肺)中之彼等、GI牽連、癌病變或觸診所指示之彼等。非量測之病變：應認為未選擇作為量測之顯性疾病之任何疾病及真正可評估疾病非量測。此等部位包括未選擇作為顯性或可量測或不滿足可量測要求但是仍認為異常之任何結節、結節團塊及結外部位以及真正可評估疾病，其為難以定量跟蹤量測之疑似疾病之任何部位，包括胸腔積液、腹水、骨病變、柔腦膜病、腹部腫塊及不可藉由造影證實及跟蹤之其他病變。於魏氏環或結外部位(例如，GI道、肝、骨髓)中，FDG攝入可較具有完全代謝反應之縱隔中更大，但是不應較周圍正常生理攝入更高(例如，由於化療或骨髓生長因子所致之髓活化)。†PET 5PS：1，無背景以上之攝入；2，攝入＜縱隔；3，攝入＞縱隔但是＜肝；4，攝入適度＞ 肝；5，攝入顯著高於肝及/或新病變；X，不可能與淋巴瘤相關之新攝入區域。 CLL之iwCLL反應標準(Hallek等人，2018) 完全緩解

CR需要下列標準中之所有：

1.外周血淋巴細胞(藉由血液及分化計數評價) ＜4 x10⁹ /L。

2.藉由身體檢查，不存在明顯淋巴結病變。於臨床試驗中，若先前異常，則頸、腹部、骨盆及胸部之CT掃描係所需。淋巴結之最長直徑應係＜1.5 cm。一旦確定此，不應需要進一步造影直至疾病進展為藉由臨床檢查或在血液測試時明顯。

3.藉由身體檢查，無脾腫大或肝腫大。於臨床試驗中，腹部之CT掃描應在反應評估下進行且應不顯示淋巴結病及脾腫大之證據。

4. 不存在疾病相關之全身症狀。

5.嗜中性白血球≥1.5x 10⁹ /L。

6.血小板≥100 x 10⁹ /L。

7.血紅蛋白≥11.0 g/dL (無紅血球輸血)。

一些患者滿足CR之所有標準，但是具有與CLL明顯不相關但是與藥物毒性相關之持久貧血症、血小板減少症或嗜中性白血球減少症。應認為此等患者為緩解之不同類別，具有不完全骨髓恢復之CR (CRi)。

部分緩解

為定義部分緩解，若先前異常，則組A之至少2個參數及組B之1個參數需要改善(下表)。若組A及B二者之僅1個參數在治療之前異常，則僅1個需要改善。

組A	組B
淋巴結	肝及/ 或 脾大小	全身 症狀	淋巴細胞 計數	血小板計數	血紅蛋白	骨髓
減少≥50% (自基線)	減少≥50% (自基線)	任何	減少≥50% (自基線)	≥100×109 /L或超過基線增加≥50%	≥11g/dL或超過基線增加≥50%	CLL細胞或B淋巴結之存在

進展性疾病

在療法期間或之後之進展性疾病的特徵在於下列中之至少1者(當與天底點比較時)：

1.任何新病變之出現，諸如增大之淋巴結(＞1.5 cm)、脾腫大、肝腫大或其他器官浸潤。

2.任何先前淋巴結之最大測定直徑(＞1.5 cm)增加＞ 50%。

3.脾大小增加≥50%或脾腫大之重新出現。於脾腫大之情況下，脾長度必須自其超過基線之先前增加，增加≥50%程度。若未在基線處觀察到先前脾腫大或若脾腫大經治療解決，則脾必須自基線增加至少2 cm。

4.肝大小之增加在藉由觸診定義之肋緣下肝之增大≥50%程度，或肝腫大之重新出現。

5.血液淋巴細胞之數目增加50%或更多，具有至少5x10⁹ 個/L B淋巴細胞。

6.轉化至更侵略性組織學(里克特氏症候群)

7.直接歸因於CLL及與自體免疫細胞減少不相關之細胞減少(嗜中性白血球減少症、貧血症或血小板減少症)之出現。

a. Hb含量減少≥2 g/dL或＜10 g/dL

b. 血小板計數減少≥50%或＜100x10⁹ /L

8. 於連續活組織檢查中骨髓中之CCL細胞增加≥50% 穩定疾病

認為尚未達成CR或部分緩解且尚未展示PD之患者具有穩定疾病。 復發

將復發定義為已先前達成以上CR標準或部分緩解持續≥6個月之患者之疾病進展的證據。 針對原發性CLL靶之CAR-NK細胞細胞毒性

將來自4名不同CLL患者之PBMC解凍及於加濕培育箱中在37℃/5% CO₂ 下於SCGM培養基中在2 x10⁶ 個PBMC/ml之濃度下用CD40L (2 ng/ml)預活化過夜。於v型底96孔板中進行4小時⁵¹ Cr-釋放分析。簡言之，於加濕培育箱中在37℃/5% CO₂ 下，將0.5 × 10⁶ 個CLL細胞再懸浮於1 ml SCGM中及用100微庫裡之⁵¹ Cr標記2小時。於標記後，將細胞用PBS洗滌兩次及再懸浮於SCGM中及然後用作分析之靶。將配對之未經轉導之(NT)及經CAR轉導之NK細胞(CAR-NK)用作在不同效應子-靶細胞比率(E:T)下之效應子。將特異性溶解百分比定義為[(測試孔之平均值)-(自發釋放孔之平均值)/(最大釋放孔之平均值)-(自發釋放孔之平均值)] × 100。使用Student配對t-檢定計算統計顯著性。 針對原發性CLL靶之穿孔素依賴性CAR-NK細胞細胞毒性之分析

使用卡那黴素(Concanamycin) A (CMA)防止穿孔素之成熟及耗盡活性穿孔素之NK細胞(Kataoka等人，1996)。簡言之，於加濕培育箱中在37℃/5% CO₂ 下，將2 x 10⁶ 個經CD19-CAR轉導之NK細胞用100 nM CMA (Fisher)或DMSO (Sigma)作為媒劑對照處理2小時。藉由流動式細胞測量術使用針對穿孔素之單株抗體(來自BioLegen之dG9純系)評估CAR-NK細胞中之穿孔素表現(Makedonas等人，2009)。穿孔素表現之變化藉由在CMA之存在或不存在下比較CD56+ CAR-NK細胞中之穿孔素MFI定義。使用如上所述之⁵¹ Cr釋放分析測定利用或不利用CMA預處理之CAR NK細胞針對原發性CLL靶之細胞毒性。使用Student氏t-檢定計算統計顯著性。 qPCR

使用QIAamp DNA Blood Mini套組(Qiagen)，按照製造商之建議提取基因組DNA。藉由定量PCR (qPCR)，使用Applied Biosystems 7500快速即時PCR系統測定每μg基因組DNA的載體轉殖基因副本數。使用TaqMan®通用PCR主混合液及基於DNA之定製設計之併入5'報告基因(FAM)及3'非螢光猝滅劑(NFQ)的Applied Biosystems™ TaqMan® MGB (小凹槽黏合劑)探針，即時檢測經擴增之靶，及使用標準曲線定量。將載體轉殖基因之定量副本/反應報告為副本/1 μg DNA。使用7500軟體v2.3分析螢光資料。

引子探針序列之實例：

正向引子GAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCA (SEQ ID NO: 7)

反向引子AGCGTATTACCCTGTTGGCAAA (SEQ ID NO: 8)

TaqMan FAM-MGB探針CCTGGAGCAAGAAG (SEQ ID NO: 9)

藉由Thermo Fisher Scientific定製設計及合成引子及探針。 合成血清細胞激素

使用來自Thermofisher (Vienna, Austria)之Procartaplex套組，按照製造商之說明，對來自在CAR-NK輸注之前及之後收集之連續外周血樣本之血清進行細胞激素量測。 CAR-NK細胞藉由多參數流動式細胞測量術之表現型及追蹤

為測定外周血中之源自CB之CAR-NK細胞之持久性及其至骨髓及淋巴結之運送，使用兩步策略。首先，本發明者利用患者與供體之間之現存HLA-錯配識別經輸注之源自臍帶血之NK細胞；接下來使用CAR特異性抗體識別供體NK細胞群體內之表現CAR的細胞。簡言之，使用針對錯配HLA對偶基因之螢光色素結合抗體開發流動嵌合特質分析。此外，將針對人類IgG鉸鏈之CH2-CH3域之抗CAR抗體(109606088/ Jackson Immuno Rsch)用於構築體中作為檢測CAR NK細胞之第二方法。將細胞在室溫下用含於1 ml PBS中之活/死染料(Tonbo BioScience: 13-0868-T100)染色20分鐘。然後將細胞藉由在室溫下在400 xg下離心5分鐘用含有PBS及1%熱失活FBS之流動緩衝液洗滌兩次。接下來，將細胞在4℃下用AF-647結合之抗CAR (109606088/ Jackson Immuno Rsch)抗體染色20分鐘。將細胞洗滌及在4℃下用相關抗HLA抗體染色10分鐘。然後將細胞在室溫下用含有CD19 PE-Cy5、CD20 FITC、CD3 APC-Cy7、CD14 BUV395、CD33 BUV395 (所有BD Biosciences)、CD45 BV510 (BeckMan Coulter)、CD56 PE-TX Red (BeckMan Coulter)及CD16 BV650 (Biolegend)之螢光標記之抗體之混合物培育15分鐘。然後將細胞藉由在400 x g下離心洗滌及用1%多聚甲醛固定。在BD LSRFortessa X-20儀器上進行流動式細胞測量術，及使用FlowJo軟體，版本10.0.8 (TreeStar)分析資料。用於檢測HLA-陽性CAR陽性NK細胞之閘控策略示於圖16中。 淋巴結樣本中之CAR-NK之檢測

於PBS中收集細針淋巴結活組織檢查樣本。藉由切碎兩個磨砂端載玻片之間之樣本來製備樣本之單細胞懸浮液。將細胞懸浮液通過50微米篩網過濾，旋轉下來，計數及將1 x 10⁶ 個細胞用含於PBS中之活死染料染色。於活力染色後，將細胞於含有1% FBS之PBS中洗滌一次，及用含於PBS-FBS緩衝液中之AF-647結合之抗CAR (109606088/ Jackson Immuno Rsch)抗體染色(4℃，20分鐘)。接下來，將細胞於PBS-FBS緩衝液中洗滌，及用HLA特異性抗體，接著針對CD19 PE-Cy5、CD20 FITC、CD3 APC-Cy7、CD14 BUV395、CD33 BUV395 (所有BD Biosciences)、CD45 BV510 (BeckMan Coulter)、CD56 PE-TX Red (BeckMan Coulter)及CD16 BV650 (Biolegend)之抗體之混合物依序染色(4℃，10分鐘)。將細胞於2%多聚甲醛中固定及在X20 Fortessa分析儀上分析。 供體特異性抗體(DSA)量測

針對供體特異性抗HLA抗體之存在，在CAR-NK輸注之前及於CAR-NK輸注後之多個時間點篩選11名患者中之10者。若篩選係陽性，則在Luminex®平臺上使用半定量固相抗體檢測測定抗體之特異性。實例 4—— 源自臍帶血之經 CAR 工程改造之 NK 細胞之劑量遞增研究 I/II 期結合患有復發 / 難治 B- 淋巴惡性病之患者之淋巴耗盡化療的實例

本實例涉及經CAR.CD19-CD28-ζ-2A-iCasp9-IL15轉導之CB-NK細胞於患有復發/難治CD19+ B淋巴惡性病之患者中之安全性及功效的測定。此實例允許評估總反應速率(完全及部分反應率)、經輸注之經異源供體CAR轉導之源自CB之NK細胞於接受者中之持久性的定量，及綜合免疫重建研究之性能。 背景

本實例描述用於研究新穎免疫治療策略，使用經工程改造之自然殺手(NK)細胞改善患有復發或難治CD19+ B-細胞惡性病之患者之無腫瘤生存期的臨床試驗。美國每年平均有69,740例非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)新病例，15,680例慢性淋巴細胞性白血病(CLL)新病例及6070例急性淋巴母細胞性白血病(ALL)新病例，估計年死亡率各自為19,020、4580及1,430 (http:/www.cancer.org)。總生存(OS)主要藉由在提交時之疾病階段及對化療之反應測定。針對於前線療法後復發之患者之標準療法為異源造血幹細胞移植(HSCT)。基於HSCT時之化療敏感性，第二次完全緩解之患者之期望OS為25%。因此，存在對開發針對患有晚期B系惡性病之患者之新穎療法之急迫且未滿足的需求，尤其因為於異源HSCT後之復發通常係致命的。

慢性淋巴細胞性白血病(CLL)為美國成人白血病之最常見形式，占所有白血病之25%。美國每年有超過15,000例CLL新病例及4,500例因CLL之死亡。該疾病之自然史係不同的。僅具有淋巴細胞增多之患者具有大於10年之中值生存，然而具有由貧血症或血小板減少症表現之骨髓衰竭之證據的彼等具有僅2至3年之中值生存。因為沒有顯示治療係治癒性的，亦不存在特定治療延長生存之客觀證據，所以治療延遲(Cheson及Cassileth, 1990)。經NCI贊助之CLL工作組提議開始治療之下列指示：1)在前6個月內體重損失大於10%；2)可歸因於進展性疾病之極端疲勞；3)發燒或盜汗而無感染之證據；4)惡化貧血症(Rai III期)或血小板減少症(Rai IV期)；5)大量淋巴結病(＞10 cm)或快速進展性淋巴細胞增多(淋巴細胞倍增時間＜6個月)；或6)前淋巴細胞或里克特氏轉化。新近診斷之CLL之目前治療包括單獨或組合之化療及抗體療法。正在開發各種新穎方法，諸如使用依布替尼治療CLL之靶向療法(Burger等人，2015；Byrd等人，2015)，但是該疾病尚不可治癒。此外，甚至於完全反應後，免疫異常及最小殘留疾病保留於大多數患者中。最終，導致感染性併發症之慢性免疫抑制發生於80%之CLL患者中且為死亡之主要原因。異源幹細胞移植於患有CLL之一些患者中可係治癒性，但是成功受限，主要由於與手術相關之死亡率及發病率之高發生率。非骨髓抑制異源移植方案有前景，但是患者資格受配對同科供體之可得性限制。

歷史上需要治療之患有CLL之患者之初始治療利用烷基化劑，特定言之苯丁酸氮芥(chlorambucil)，單獨或與皮質類固醇(corticosteroid)組合。總反應率為50至70%；然而，完全緩解率係低的(5至20%)。更新藥劑如嘌呤類似物，特定言之氟達拉濱作為初始治療具有更高反應率(Rai等人，2000)。將烷基化劑基療法與單藥劑氟達拉濱比較之隨機化試驗已顯示，利用核苷類似物之更高完全反應率及更長無疾病 (Rai等人，2000；Johnson等人，1996)生存期，但是不顯示生存優點。氟達拉濱係由美國食品及藥物管理局(U.S. Food and Drug Administration / FDA)批准用於治療患有B細胞CLL之患者，該等患者在用至少一種烷基化劑基方案治療期間無反應或進展。

已顯示組合方案(諸如環磷醯胺、氟達拉濱及利妥昔單抗)提高反應率(Keating等人，2005)，但是此等方案係高度免疫抑制，及尚未證實長期效益。依布替尼為布魯頓氏(Bruton's)酪胺酸激酶(BTK) (TEC酪胺酸激酶家族之成員及B細胞受體信號傳導路徑中之關鍵酵素)之共價抑制劑(Honigberg等人，2010)。依布替尼作為單藥療法，以及與免疫療法或化療組合為包括CLL之淋巴惡性病之極有效療法(Burger等人，2015；Byrd等人，2013)。然而，於依布替尼失效後之結果係令人沮喪的，於停藥後具有僅3.1個月生存(Jain等人，2015)。

急性淋巴母細胞性白血病。異源HCT為ALL患者之選定組之治癒方法。總生存(OS)範圍自30%至60%，取決於移植時患者疾病階段及風險特性(Fielding等人，2009；Golstone等人，2008)。越來越多地，最小殘留疾病(MRD)在HCT之前及之後均變成復發之重要預測因子(Gokbuget等人，2012)。在MD安德森癌症中心(Anderson Cancer Center)處於緩解之經移植之一系列149名ALL患者中，藉由多參數流動式細胞測量術之免疫表現型(FCI) (靈敏度為0.01%)量測之在HCT時呈現之MRD患者與MRD陰性之患者相比具有更短PFS，28%相對47%，p=.08 (4)。此外，在具有於HCT後量測之MRD之135名患者中，20名變得對MRD陽性，及此等患者中之18名於3.8個月之中值內發展明顯血液復發(Zhou等人，2014)。應注意，在於HCT後具有明顯復發之32名患者中，41%不具有上述MRD，此表明HCT後之陽性MRD基本上證實最終復發，但是高風險患者之HCT後之陰性MRD不排除復發(Leung等人，2012；Bar 等人，2014)。該等發現互相印證相似公開之研究。超出第二次緩解移植之患者常規具有顯著更低的PFS及OS率。於經白消安及氯法拉濱(clofarabine)化療調理接著匹配之同科(MSD)或匹配之不相關供體(MUD)移植治療之97名患者(CR1 51名，CR2 29名，其他17名)之研究中，CR1之患者與其他相比具有顯著更好無疾病生存(DFS)。針對CR1之患者，2-yr DFS率為61%，其中9/51患者在中值9個月復發，針對CR2，2-yr DFS率為40%，其中10/29在中值3個月復發，及針對具有更晚期疾病之患者，2-yr DFS率為33%，其中3/17在中值3個月進展。來自國際血液及骨髓移植研究中心(Center for International Blood and Marrow Transplant Research / CIBMTR)之資料證實該等發現。在1996年與2001年之間，於小於20歲之患者中，OS範圍自針對超過第一次緩解移植之患者之25%至針對第一次緩解中同科移植之50%。類似地，於大於20歲之成人患者中，於第一次緩解中進行之同科移植中注意到最佳結果，OS為60%，相比若超出CR1進行移植(CIBMTR登記)，則為35%。針對於HCT後復發之患者不存在有效治療選項。多個公開之系列報導此等患者之小於10%生存，不管所用之治療模式，中值生存為2至3個月(Fielding等人，2009；Poon等人，2013)。迄今為止，為降低於HCT後之復發率採用之最常見策略通常涉及免疫操縱之一些形式，範圍自供體淋巴細胞輸注(DLI)至第二次移植(Sullivan等人，1989；Poon等人，2013；Bader等人，2004)。然而，雖然已一貫顯示發展移植物抗宿主疾病(GVHD)之患有B-ALL之患者具有更少復發風險(Appelbaum, 1997)，DLI不顯示於此患者群組中之可預見的功效；緩解率係小於10%，且與GVHD之高發生率相關聯(Passweg等人，1998)。應注意，當預防投與DLI以防止復發時，於ALL中對DLI之最佳反應發生(Bader等人，2004)；此方法已於小兒科患者中證實但是於成人中尚未報導預防性DLI之資料。因此，存在對處在異源HCT後復發之高風險之ALL患者之有效療法之未滿足的需要，其中將高風險定義為陽性MRD及/或超出第一次完全緩解之疾病。

非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)。在美國，B細胞淋巴瘤表示所報導之病例之80至85%。在2013年，估計約69,740例NHL新病例及超過19,000例與疾病相關之死亡發生。非霍奇金氏淋巴瘤為最普遍血液惡性病及為男人及女人中之新發癌症之第七大部位及占所有新發癌症病例之4%及與癌症相關之死亡之3% (SEER 2014)。瀰漫性大B細胞淋巴瘤：瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)為NHL之最常見亞型，占NHL病例之約30%。美國每年有約22,000例DLBCL新診斷。DLBCL之第一線療法通常包含含蒽環類(anthracycline)之方案與利妥昔單抗(Coiffier等人，2002)。對R-CHOP (利妥昔單抗、環磷醯胺、多柔比星、長春新鹼及潑尼龍)之第一線客觀反應率及完全反應(CR)率各自為約80%及50%。然而，約1/3患者患有對初始療法之難治疾病或於R-CHOP後復發(Sehn等人，2005)。針對於對第一線療法反應後復發之彼等患者，約40至60%之患者可利用另外化療達成第二反應。針對年輕及健康患者，第二線療法之目標為達成使患者有資格進行自體幹細胞移植(ASCT)之反應。針對有資格移植之患者之第二線療法之護理標準包括利妥昔單抗及組合化療，諸如RICE (利妥昔單抗、異環磷醯胺、卡鉑、及依託泊苷)或RDHAP (利妥昔單抗、地塞米松、阿糖胞苷及順鉑)。於患有DLBCL之有資格移植之患者中之RICE相對RDHAP之大型隨機試驗(CORAL研究)中，63%之患者達成對任一方案之客觀反應，具有26% CR率。對第二線療法反應且認為足夠健康以移植之患者接受高劑量化療及ASCT之鞏固。此組合可治癒約50%移之植患者(Gisselbrecht等人，2010)。ASCT失敗之患者具有極差預後及無治癒選項。大多數第二線患者無資格進行ASCT，由於化療難治性疾病、年齡或共病，諸如心臟病、肺病、肝病或腎病。無移植資格之營救患者不具有對其可得之治癒選項。不存在復發/難治性DLBCL之標準定義。此試驗將募集患有化療難治性淋巴瘤之患者，如證實為無法達成對先前生物及組合化療之甚至短暫或部分反應或於ASCT後之早期復發。

經轉化之濾泡性淋巴瘤(TFL)。濾泡性淋巴瘤(FL)，B細胞淋巴瘤為NHL之最常見無痛(緩慢生長)形式，占所有NHL之約20%至30%。患有FL之一些患者將組織轉化(TFL)至DLBCL，其係更侵略性且與差的結果相關。至DLBCL之組織轉化在約3%之年速率下發生持續15年，其中轉化之風險於隨後幾年繼續下降。組織轉化之生物機制未知。TFL之初始治療受針對濾泡性淋巴瘤之先前療法影響，但是一般包括含蒽環類之方案與利妥昔單抗以消除疾病之侵略性組分(NCCN實務指導方針2014)。復發/難治性TFL之治療選項係類似於DLBCL中之彼等。鑑於此等疾病之低流行，尚未進行此等患者群組中之大的預期隨機研究。患有化療難治性疾病之患者具有與患有難治性DLBCL之彼等相似或更差預後。

套細胞淋巴瘤(MCL)，B-細胞淋巴瘤之不可治癒亞型占美國所有非霍奇金氏淋巴瘤病例之7% (Connors, 2013)。大多數MCL患者於前線療法後經歷疾病進展，於復發後具有約1至2年之中值總生存；因此，迫切需要MCL之新穎療法。依布替尼，布魯頓氏酪胺酸激酶(BTK)之第一類每日一次口服共價抑制劑最近由FDA批准以治療此疾病。雖然復發/難治性MCL之結果與其他標準療法相比係優越及前所未有的(Wang等人，2013)，但是大多數患者於單藥劑依布替尼後經歷疾病進展及於12個月內死亡(Wang等人，2015；Cheah等人，2015)。患有復發/難治性MCL之患者可達成長期緩解及利用基於免疫細胞之療法治癒(Hamadani等人，2013)，該等療法包括異源幹細胞移植(異源SCT)。此外，吾人已報導於接受自體SCT接著利妥昔單抗、BCNU、依託泊苷ara-C、美法侖(R-BEAM)療法之選定MCL患者中之有前景的結果(Tam等人，2009)。然而，於患有依布替尼抗藥疾病之MCL患者中，標準異源及自體移植之結果係次佳及明確需要更有效療法。總之，患有難治侵略性B淋巴惡性病之個體具有大的未滿足之醫療需求及於此等群體中保證新穎治療。

NK細胞：

自然殺手(NK)細胞為移植物抗白血病(GVL)反應之重要組分(Ruggeri等人，2002；Savani等人，2006)，其對於預防於HSCT後之復發係關鍵的。各成熟NK細胞表現寬範圍之活化及抑制類殺手免疫球蛋白受體(KIR)，該等受體係特異性針對不同HLA I類分子(Lanier, 2008；Yawata等人，2008；Caligiuri, 2008)。NK細胞識別及殺死惡性細胞之能力藉由自抑制性KIR與其同源HLA I類配位體之結合產生之抑制信號與來自活化受體之活化信號之間之複雜且不太瞭解的相互作用控制(Ruggeri等人，2002；Caligiuri, 2008；Ljunggren等人，1990)。NK細胞反應藉由兩種主要效應功能介導：靶細胞之直接細胞溶解及趨化因子及細胞激素之產生。通過後者機制(例如，干擾素-γ)，NK細胞參與授受性T細胞反應之成型，可能藉由初始T細胞與自發炎外周組織遷移至次級淋巴室之NK細胞之間的直接相互作用及藉由對樹突狀細胞(DC)之間接作用(Martin-Fontecha等人，2004；Krebs等人，2009)。

自臍帶血之GMP級NK細胞擴增。先前研究大量使用新鮮獲得之外周血NK細胞。循環外周血NK細胞之低數目嚴重限制其治療效用。本發明者已開發來自臍帶血(CB)之NK細胞之離體擴增之系統，其使用表現膜結合之IL-21、4-1BB配位體、CD64 (FcγRI)及CD86 (純系9.mbIL21)之GMP級K562基人工抗原呈遞細胞(aAPC)可靠地產生用於授受性免疫療法之GMP級CB-NK細胞之臨床相關劑量(Denman等人，2012)。臍帶血為用於細胞免疫療法之NK細胞之新穎吸引人之來源。已收集細胞，儲存及立即可用。可針對HLA類型、KIR基因表現及其他因素最佳選擇臍帶血供體。產生CB NK細胞之方法已由FDA批准。吾人目前方案平均產生3127倍之NK擴增(範圍1640至4931倍) (圖26A)，具有極少CD3+細胞(平均值4.50 x 10⁶ ) (圖26B)。

經離體擴增之CB-NK細胞之功能表現型及其針對骨髓性白血病靶之細胞毒性活性。經擴增之CB-NK細胞顯示全陣列之活化及抑制受體，繼續強烈表現脫中胚蛋白(eomesodermin) (Eomes)及T-bet (FIG. 26C-26D) (Gill等人，2012；Intlekofer等人，2005)，NK細胞成熟及活化所需之兩種因子，以劑量依賴性方式裂解骨髓靶細胞(圖26E)及在授受性轉移至非肥胖糖尿病嚴重合併免疫缺陷-γ無效(NSG)小鼠後，可歸巢到骨髓、肝、脾及多發性淋巴組織(圖27)。 源自CB之NK細胞之遺傳改性以增強其抗白血病之活性。

已廣泛使用嵌合抗原受體(CAR)以重引導T細胞針對白血病之特異性(Sadelain等人，2003；Rosenberg等人，2008；June等人，2009)，於患有急性淋巴母細胞性白血病(ALL)之患者中具有顯著臨床反應(Brentjens等人，2013；Kalos等人，2011；Maude等人，2015)。此等輸注主要受限於自體環境，因為來自異種基因來源之經活化之T細胞可能增加GVHD之風險。於本實例中，吾人可測試經工程改造之源自CB之NK細胞作為T細胞之替代用於B-淋巴惡性病之免疫療法的安全性及功效。源自CB之NK細胞具有超過T細胞之多個潛在優點：(i)異源NK細胞不應引起GVHD，如由小鼠模型以及患有白血病及實體惡性病之經單倍體同一或源自CB之NK細胞治療之患者中的觀察結果所預測(Olson等人，2010；Rubnitz等人，2010；Miller等人，2005)；(ii)成熟NK細胞具有幾週之有限壽命，允許抗腫瘤活性同時降低長期不良事件(諸如由對正常組織之命中目標/腫瘤外毒性引起之延長之血球減少)之概率，或惡性病轉化之風險；(iii)不像T-細胞，NK細胞亦具有通過其天然受體殺死抗原陰性靶細胞之活性，潛在防止免疫逃脫機制；(iv)針對各患者之自體同源T細胞產品之產生係邏輯上繁瑣及限制性(Ruggeri等人，2002；Rubnitz等人，2010)。使用儲存於大型全球臍帶血庫庫存中之冷凍現成CB單元來產生NK細胞具有廣泛可擴縮性之潛力，而利用源自自體同源外周血之T細胞或NK細胞產品，該潛力係不可能的。

因此，為改善經冷凍及離體擴增之CBNK細胞之持久性及抗白血病效力，本發明者將其用逆轉錄病毒載體iC9.CAR19-CD28-ζ-2A-IL15 (iC9/CAR.19/IL15)遺傳改性，該載體(i)併入CAR-CD19之基因以重引導向其對CD19之特異性；(ii)異位產生IL-15，對NK細胞生存及增殖關鍵之細胞激素(Hoyos等人，2010；Tagaya等人，1996)，及(iii)表現自殺基因，基於可誘導半胱天冬酶-9 (iC9) (Di等人，2011)，其可經藥理學活化以視需要消除轉殖基因細胞。初始資料顯示，CB-NK細胞可經穩定轉導以表現CAR分子(圖29A)。使用標準51Cr-釋放分析，吾人發現經iC9/CAR.19/IL15轉導之CB-NK細胞具有抗CD19+ Raji細胞及原發性CLL細胞之特異性細胞毒性活性(n=18；圖29B)。NK-CAR及未經轉導之NK細胞顯示抗K562細胞之相等效應功能，指示CB-NK細胞之遺傳改性不改變其針對NK敏感性靶之固有細胞毒性(圖29B)。

接下來使用NSG小鼠Raji異種移植物模型評價經iC9/CAR.19/IL15改性之CB-NK細胞於活體內之輸送及持久性。將NT及經iC9/CAR.19/IL15轉導之CB-NK細胞輸注於經Raji細胞植入之小鼠中。如圖30A中所示，iC9/CAR.19/IL15+ CBNK細胞歸巢到脾、肝臟及骨髓(腫瘤浸潤之部位)，而於構築體中無IL-15基因之CAR.CD19+ CB-NK細胞以及NT CB-NK細胞於腫瘤部位中幾乎不可檢測到。

經iC9/CAR.19/IL15轉導之CB-NK細胞發揮增強之活體內抗腫瘤活性。為研究經iC9/CAR.19/IL15轉導之CB-NK細胞之活體內抗腫瘤活性，吾人以2 × 10⁵ /小鼠對NSG小鼠注射經FFLuc標記之Raji細胞。在同一天，小鼠接受對照NT、CAR.19或經iC9/CAR.19/IL15轉導之CB-NK細胞之一次靜脈內輸注(10 x 10⁶ /小鼠)。藉由量測腫瘤生物發光隨時間之變化來監測腫瘤生長。如圖30B中所示，腫瘤生物發光於經Raji細胞植入及用對照NT CB-NK細胞處理之小鼠中快速增加。相比之下，CAR.19+或iC9/CAR.19/IL15+ CB-NK細胞之輸注導致生存相較於NT CB-NK細胞之效應的顯著延長(各自P=0.006及P=0.001)。應注意，iC9/CAR.19/IL15+ CB-NK細胞控制腫瘤擴增及延長生存(圖30C)較缺少IL-15基因之CAR.CD19構築體顯著更好，強調IL-15對增強之抗腫瘤活性之重要貢獻。

經iC9/CAR.19/IL15轉導之CB-NK細胞不顯示自發或失調生長之活體外或活體內徵兆。為研究載體中之IL-15基因可導致經轉導之CB-NK細胞之自發或失調生長之可能性，吾人將經iC9/CAR.19/IL15轉導之CB-NK細胞在不添加外源IL-2或純系9.mbIL21刺激下於完全無血清幹細胞生長培養基(SCGM)中培養42天(n=5)。對活細胞例舉及每三天藉由用新鮮完全SCGM替換培養基來傳代。如圖28A中所示，經iC9/CAR.19/IL15轉導之CB-NK細胞培養物歷時6週不顯示異常生長之任何徵兆，之後細胞停止擴增。在培養至多17週(n=7)之經iC9/CAR.19/IL15轉導之CB NK細胞上進行之核型分型無法檢測到任何染色體更改(資料未顯示)。本發明者亦在CAR轉導及離體擴增之前(在基線)及於CAR轉導及離體擴增後至多22週對成對CB-NK細胞(n=6)進行染色體及SNP微陣列分析，及未觀察到遺傳不穩定之任何證據。利用超過10個月之追蹤，吾人未觀察到用經iC9/CAR.19/IL15或CAR.19轉導之CB-NK細胞處理之小鼠中之自發生長或白血病轉化的任何證據。組織病理學檢查不揭示此等小鼠之任何組織中之任何淋巴細胞浸潤、增殖或淋巴瘤。於來自兩組動物之所有NSG小鼠中，脾及淋巴結之初級淋巴組織無淋巴細胞(圖28B)，此等小鼠之骨髓中不存在任何淋巴細胞浸潤或增殖。血液測試指示白細胞及淋巴細胞之正常數目，且於兩組小鼠中無淋巴細胞性白血病之證據。 由經CAR轉導之NK細胞產生IL-15

為驗證iC9/CAR.19/IL15+ CB-NK細胞可產生IL-15，在CD19+ CLL B細胞之存在或不存在下，將對照NT CB-NK及iC9/CAR.19/IL15+ CB-NK淋巴細胞一式三份培養及收集培養物上清液以於培養24、48及72小時後量測IL15釋放。如圖29中所示，IL15於自單獨或與CLL靶培養之未經轉導之CB-NK細胞收集之上清液中不可檢測到。相比之下，iC9/CAR.19/IL15+ CB-NK細胞在抗原刺激之不存在下產生少量IL15 [平均15.05 pg/mL/10⁶ 個細胞(範圍6.2至23.47 pg/mL)]，其隨著抗原刺激顯著增加[平均27.61 pg/mL/10⁶ 個細胞(範圍15.82至38.18 pg/mL)] (P=0.02)。檢查經iC9/CAR.19/IL15轉導之NK細胞於經Raji細胞植入之NSG小鼠中活體內產生IL-15之能力。NK細胞擴增高度(於擴增後2週)之IL-15水平之血清水平為40至50 pg/mL，及與經培養細胞之上清液中檢測到之水平相當。

已於臨床環境中使用外源重組人類IL-15 (RhIL-15)。於患有轉移性黑色素瘤或腎細胞癌之患者之最近1期研究中，向患有轉移性惡性黑色素瘤或轉移性腎細胞癌之患者投與3.0、1.0及0.3 μg/kg/天之IL-15之團式輸注持續12個連續日(Conlon等人，2015)。顯示RhIL-15活化NK細胞、單核細胞、γδ及CD8 T細胞。3.0-、1.0-及0.3-μg/kg/天劑量各自導致43,800 ± 18,300、15,900 ± 1,900及1,260 ± 350 pg/mL之最大血清濃度(Cmax)。於接受3.0及1.0 μg/kg/天之患者中觀察到之劑量限制性毒性為3級低血壓、血小板減少症、及ALT及AST之升高，導致測定之最大耐受劑量為0.3 μg/kg/天。於吾人臨床研究中未觀察到與藉由經iC9/CAR.19/IL15轉導之CB-NK細胞之IL-15釋放相關的毒性。此可能因為藉由經轉導之NK細胞產生之IL-15之水平低於外源IL-15處理之臨床試驗中達成的水平平均2至3對數。

於活化自殺基因後藉由暴露於小分子二聚體中消除iC9/CAR.19/IL15+ CB-NK細胞。為抵消藉由發炎性細胞激素由經轉導之CB-NK細胞之釋放或未控制之NK細胞生長介導之過量毒性的可能性，吾人將基於可誘導半胱天冬酶-9基因之自殺基因併入構築體中(Di等人，2011)。如圖30A中所示，添加少至10 nM之小分子二聚體至經iC9/CAR.19/IL15轉導之CB-NK細胞之培養物中於4小時內誘導60%之轉殖基因細胞之細胞凋亡/壞死，如由膜聯蛋白-V及7AAD染色所評估，但是對NT CB-NK細胞之活力無影響。自殺基因亦於活體內有效。將小鼠靜脈內植入Raji腫瘤細胞及用經iC9/CAR.19/IL15轉導之CB-NK細胞處理。於NK細胞局部化及稍後在不同腫瘤部位處擴增10至14天後，投與小分子二聚體AP1903 (50 μg，腹膜內，間隔2天) (圖30B，左圖)，導致經處理小鼠之血液及組織中之經iC9/CAR.19/IL15轉導之CB-NK細胞之顯著減少 (圖30B，右圖)，指示轉殖基因細胞之活體內消除。 評價經iC9/CAR.19/IL15轉導之CB-NK細胞於患有復發/難治性B-淋巴惡性病中之患者中之安全性及功效的臨床試驗。

此為評價經iC9/CAR.19/IL15轉導之CB-NK細胞於患有復發/難治性B-淋巴惡性病(ALL、CLL、NHL)之患者中之安全性及相對功效的I/II期劑量遞增試驗。此臨床研究將利用藉由CAR CB-NK細胞產生之協同抗腫瘤活性及藉由淋巴耗盡方案誘導之有利淋巴細胞減少環境(Dudley等人，2002；Dudley等人，2005)。因此，將患者用環磷醯胺在300 mg/m/天之劑量5下處理3天。在第0天，一次輸注經iC9/CAR.19/IL15轉導之CB-NK細胞之遞增劑量(10⁷ /kg至10 /kg)以確定經iC9/CAR.19/IL15轉導之CB-NK細胞可安全輸注至患有復發/難治性B-淋巴惡性病之患者中之最高劑量，如由標準NCI毒性標準所定義。在4/6、5/6或6/6 HLA I類(血清學)及II類(分子)抗原下與患者匹配之CB單元係用於CB-NK擴增及CAR轉導。該等CB單元可獲自MD安德森臍帶血庫。

為深入瞭解經授受性轉移之iC9/CAR.19/IL15轉導之CB-NK細胞之持久性、功能及抗白血病潛力，吾人可進行一系列表現型及功能分析。吾人可藉由Q-PCR，使用特異性擴增獨特CAR轉殖基因的引子對評價連續獲得之PB樣本中之經授受性輸注之遺傳改性之NK細胞之擴增量級及持久性之持續時間，靈敏性為檢測1/10,000 CAR+ NK細胞。若存在足夠數目之循環NK細胞，則吾人將藉由流動式細胞測量術使用特異性針對iC9/CAR.19/IL15之CH2-CH3區之mAb定量，靈敏性為檢測1/1,000 CAR+ NK細胞。將流動式細胞測量術量測值與細胞表面NK活化及抑制性受體表現之分析結合。吾人可使用⁵¹ Cr釋放分析、CD107a脫粒(Rubio等人，2003；Rezvani等人，2009)、細胞激素釋放(針對IFNγ及IL-2，藉由細胞內細胞激素分析測定)及趨化因子釋放(MIP1-α及MIP-1β)，針對表現CD19之細胞系及當可得時，在治療之前自接受者收集及儲存之原發性CD19+腫瘤細胞，評價CD19重引導效應功能之維持。

為抵消任何潛在併發症(Porter等人，2011；Grupp等人，2013)，吾人可將基於可誘導半胱天冬酶-9基因(例如)之自殺基因併入CAR19載體(Hoyos等人，2010)中。如圖30中所示，添加小分子二聚體AP1903誘導轉殖基因細胞之快速細胞凋亡，使得在延長之B淋巴細胞減少之情況下，可引入二聚體以誘導經CAR19轉導之CB-NK細胞之細胞凋亡，從而允許B細胞之正常恢復。若發現經轉導之NK細胞誘導GVHD，則此策略亦係有用的。 患者資格性之實例 納入標準：

1.患有CD19陽性B-淋巴惡性病(ALL、CLL、NHL)史之患者，其已接受至少2線標準化學免疫療法或靶向療法且患有持久疾病。

2.患有ALL、CLL、NHL且於標準療法或幹細胞移植後復發疾病之患者。

3.在開始淋巴耗盡化療時距最後一次細胞毒性化療至少3週之患者。患者可繼續酪胺酸激酶抑制劑或其他靶向療法直至在投與淋巴耗盡化療之前之至少兩週。

4. Karnofsky/Lansky性能量表＞ 70。

5. 適當器官功能：

a.腎：肌胺酸酐清除率(如由Cockcroft Gault所評估) ＞/= 60 cc/min。

b.肝：ALT/AST ＜/= 2.5 x ULN或＜/= 5 x ULN (若記錄在案之肝轉移)，總膽紅素＜/= 1.5 mg/dL，除了患有吉伯特氏(Gilbert’s)症候群之個體，其總膽紅素必須係＜/= 3.0 mg/dL。

c.心臟：心臟射血分數＞/= 50%，無心包積液之證據，如由ECHO或MUGA所測定，且無臨床顯著ECG發現。

d.肺：無臨床顯著胸腔積液，在室內空氣中基線氧飽和＞ 92%。

6. 能提供書面知情同意。

7. 7至80歲。

8.能有孩子之所有參與者必須在研究時實行有效節育。女性患者之節育之可接受形式包括：激素節育、子宮內裝置、具有殺精劑之膈膜、具有殺精劑之避孕套或禁欲，持續研究之長度。若參與者係女性且懷孕或疑似懷孕，其必須立即通知其醫生。若參與者在此研究期間懷孕，其將離開此研究。能有孩子之男性必須在研究時使用有效節育。若男性參與者在研究時成為孩子的父親或疑似其成為孩子的父親，則其必須立即通知其醫生。

9.簽署長期追蹤協定PA17-0483之同意書。 排除標準：

1.定義為非絕經後之育齡女性陽性β HCG持續24個月或無先前手術絕育或分泌乳汁女性。

2. HIV之已知陽性血清學。

3. 自先前治療3級或更大毒性之存在。

4.需要IV抗菌劑用於管理之真菌、細菌、病毒或其他感染之存在。註釋：若對主動治療反應，則許可簡單UTI及無併發症之細菌性咽炎。

5.活躍神經病症之存在。

6. 伴隨使用其他研究藥劑。 治療計畫之實例

淋巴耗盡化療(住院患者)：

在以下時或之前

D-15開始NK細胞生產

D-6接納/ IV水合

D-5氟達拉濱30 mg/m² IV /環磷醯胺300 mg/m² IV /

美司鈉(Mesna) 300 mg/m² IV

D-4氟達拉濱30 mg/m² IV /環磷醯胺300 mg/m² IV /

美司鈉300 mg/m² IV

D-3氟達拉濱30 mg/m² IV /環磷醯胺300 mg/m² IV /

美司鈉300 mg/m² IV

D-2休息

D-1休息

D0輸注經iC9/CAR.19/IL15轉導之CB-NK細胞(每劑量程度)

在D7輸注經iC9/CAR.19/IL15轉導之CB-NK細胞(每劑量程度)*

與D14之間

淋巴耗盡化療(門診患者)：

在以下時或之前

D-15開始NK細胞生產

D-5氟達拉濱30 mg/m² IV /環磷醯胺300 mg/m² IV /美司鈉300 mg/m² IV

D-4氟達拉濱30 mg/m² IV /環磷醯胺300 mg/m² IV /美司鈉300 mg/m² IV

D-3氟達拉濱30 mg/m² IV /環磷醯胺300 mg/m² IV /美司鈉300 mg/m² IV

D-2休息

D-1休息

D0輸注經iC9/CAR.19/IL15轉導之CB-NK細胞(每劑量程度)

在D7輸注經iC9/CAR.19/IL15轉導之CB-NK細胞(每劑量程度)* 與D14之間

*若在初始NK細胞輸注後之前7天期間未觀察到DLT，則可在第7天與第14天之間使用初始提供之相同NK細胞劑量向患者提供第2次NK細胞輸注。

可測試三種劑量程度：10E5、10E6及10E7/kg體重。針對稱重＞20%其理想體重以上之患者，按照調整之體重將CAR NK細胞輸注給藥。針對小於或等於其理想體重20%以上之患者，使用實際體重。

若患者於方案評估後復發或患有持久疾病，則可提供另外CAR NK輸注。若自其第一次生產有留下多餘細胞，則可使用其或可選擇新臍帶單元用於CAR NK產生。若於先前測試之45天內或在醫師裁量時，則不需要重複預篩選測試。

針對稱重＞20%其理想體重以上之患者，按照調整之體重將環磷醯胺給藥。針對小於或等於20%其理想體重以上之患者，使用實際體重。

在D0靜脈內投與NK細胞輸注。利用苯海拉明(Benadryl) 25 mg po 或IV及泰諾(Tylenol) 650 mg po術前用藥。除非需要生理替代，否則禁忌使用類固醇。

個體可為用於CAR NK輸注之住院患者或門診患者，取決於床可得性及/或患者之臨床情況。按照細胞療法之BMT護理標準在所有患者上獲得生命體徵 (體溫、心率、血壓及呼吸速率)。

•約每15分鐘開始CAR NK輸注x 4

•然後約每30分鐘x 2或直至於CAR NK輸注完成後1小時。

•然後約每小時，如由患者之病狀所指示。

可藉由下列方法獲得NK細胞：

可將冷凍臍帶血單元解凍及可將單核細胞藉由Ficoll密度梯度離心分離。NK細胞將經CAR轉導及於使用APC飼養細胞之液體培養物中產生14至22天，如化學、製造及控制(Chemistry, Manufacturing and Controls/CMC)中詳細所述。

NK產品釋放標準

針對用於再輸注之經擴增NK細胞之釋放可需要下列最低標準：

Stat Gram染色：「未看到生物體」。

CAR+ NK細胞： ＞ 15%

CD3+數目：＜ 2 e5 CD3+細胞/kg。

CD32+細胞數目(aAPV)：＜ 5%

NK細胞(CD16+/56+)：＞80%

可視檢查：「無污染之證據」 (混濁；培養基顏色之變化)。

內毒素分析：＜ 5EU/Kg。

活力：≥70%。

可監測之其他參數包括細菌及真菌之無菌培養。若存在超過2 x 10⁵ 個CD3+細胞/kg，可進行CD3耗盡之第二循環。可降低輸注之細胞劑量，使得經輸注之CD3+細胞係＜2 x10⁵ / kg。若不產生足夠CAR+ NK細胞劑量，則將輸注所有可得細胞。若此針對此研究之MTD發現階段中之患者發生，則其不計數於任何群組中。若產生超過所需NK劑量，則另外NK細胞可經冷凍保存用於未來輸注或可用於研究。若由於微生物污染不可釋放CAR NK細胞，則將選擇另一臍帶血單元及生產將重新開始。若患者已完成淋巴耗盡化療，則其可在CAR NK輸注之前需要第二劑量之淋巴耗盡化療。

冷凍細胞：可將在D-15之前開始生產之CAR NK細胞冷凍保存及於滿足釋放標準後釋放用於輸注。可在D0按照GMP標準操作程序，將經冷凍保存之細胞解凍用於輸注。因為已顯示經新鮮輸注之CAR NK細胞於前9名患者中之安全性、功效及活體內擴增及持久性，吾人可使用冷凍及現成CAR NK產品及在1 x10⁷ /kg之最高劑量下用經冷凍CAR NK產品治療另外3名患者。將使用effTox方法評估此方法之安全性及功效。吾人可在輸注後約第+1、+3及+7天尋找活NK細胞之存在。若含量比得上吾人利用新鮮CAR NK細胞所見之彼等，則吾人將使用經冷凍CAR NK細胞進行研究之II期部分。 針對細胞激素釋放症候群(CRS)、神經毒性或GVHD之二聚體AP1903之投與

可採取步驟以解決CRS、神經毒性及GVHD。針對對標準支持措施無反應之2級CRS或2級神經毒性，吾人可視需要投與托西珠單抗(Tocilizumab) 8 mg/kg IV q 6小時持續至多3個劑量/ 24小時。針對3級CRS及3級神經毒性，除了托西珠單抗外，可投與單一劑量之AP1903 (0.4 mg/kg以靜脈內輸注歷時約2小時)。AP1903劑量係基於公開之Pk資料，其顯示隨著0.01 mg/kg至1.0 mg/kg劑量範圍之10至1275 ng/mL之血漿濃度，其中於給藥後0.5小時及2小時時血漿含量降至最大值之18%及7%。二聚體亦可用於治療I至IV級GVHD。於接受半胱胺酸天冬胺酸蛋白酶(Capsase)-9+ T細胞及然後AP1903之患有GVHD之患者中之反應，反應於前24至48小時內發生。於12小時內不經歷降級或CRS或神經毒性至2級或更低之患者可接受第二劑量之AP1903，但是亦將接受高劑量類固醇。 評價：研究之前或期間之任何時間：HLA分型(高解析度A、B、DR)。

可於研究募集之30天內獲得下列評價：歷史及身體檢查；CBC w/diff及血小板、總膽紅素、SGPT、鹼性磷酸酶、LDH、白蛋白、總蛋白質、BUN、肌胺酸酐、葡萄糖、電解質、PT/PTT、類型及篩選、免疫球蛋白含量(IGG、IGM、IGA)及細胞激素研究小組3 (IL6、IFN γ、TNF α)；HIV血清學；ECHO或MUGA；若臨床指示，則肺功能測試；胸部x-射線；尿分析；腦CT；如臨床指示之PET/CT掃描；如臨床指示之骨髓抽吸；EKG。 於開始淋巴耗盡化療之7天內之評價：

包含體重及生命體徵之歷史及身體檢查。

實驗室檢查：CBC w/diff及血小板、總膽紅素、SGPT、鹼性磷酸酶、LDH、白蛋白、總蛋白質、BUN、肌胺酸酐、葡萄糖、電解質及細胞激素分析。若為育齡女性參與者，則進行血清妊娠測試。

可於CAR-NK輸注後第0天、第3天(+/- 1天)、第7天(+/- 2天)、第14天(+/- 2天)、及第21天 (+/- 3天)、第4週(+/-5天)、第8週(+/-5天)、第12週(+/-5天)、第16週(+/- 14天)、第6個月(+/- 28天)、第9個月(+/- 28天)及1年(+/- 28天)獲得下列評價：

僅在第7天(+/-2天)進行包含體重及生命體徵之身體檢查。

CBC w/diff及血小板、化學研究小組及細胞激素分析。

在所有時間點，除僅如臨床指示在第6個月(+/- 28天)、第9個月(+/- 28天)及第12個月(+/- 28天)外，細胞激素研究小組3 (IL6、IFN γ、TNF α)。

僅在第4週(+/- 5天)及12週(+/- 5天)之HLA抗體。

研究實驗室：CAR NK檢測、表現型及功能

可於CAR-NK輸注後之第4週(+/- 5天)、第8週(+/-5天)、第12週(+/-5天)、第16週(+/- 14天)、及6個月(+/- 28天)、第9個月(+/- 28天)及第12個月(+/- 28天)獲得下列評價：

如臨床指示之PET/CT掃描。

可於CAR-NK輸注後之第7天(+/- 2)、第4週(+/- 5天)、第8週(+/-5 天)、第12週(+/-5天)、第16週(+/- 14天)、第6個月(+/- 28天)、第9個月(+/- 28天)及1年(+/- 28天)獲得下列評價：

如臨床指示之骨髓抽吸及/或活組織檢查。

研究實驗室：5至10 mL骨髓抽吸物。

淋巴結活組織檢查

若患者具有診斷性淋巴結活組織檢查，若可得，則可分析樣本之一部分。

對NK CAR細胞之RCR測試

在第-4天藉由GMP實驗室進行針對NK培養細胞之RCR測試。若RCR結果回到陽性，則不可輸注NK CAR細胞。然後患者必須離開研究。若結果延遲，則NK培養可再繼續一週。

參見圖34中之評價表。於此情況中，時間框窗口：第3天(+/- 1 天)、第7天(+/- 2天)、第14天(+/- 2天)、及第21天(+/- 3天)、第4週(+/-5天)、第8週(+/-5天)、第12週(+/- 14天)、第16週(+/- 14天)、及第6個月(+/- 28天)、第9個月(+/- 28天)、及第12個月(+/- 28天)。1歷史及身體檢查，CBC，化學研究小組：於開始淋巴耗盡化療之30天及7天內。妊娠測試：於開始淋巴耗盡化療之7天內。2僅在第7天(+/- 2天)進行身體檢查。3如臨床指示。作為研究實驗室z代碼之部分繪製。將樣本分批及約每3個月運行得出結果。4細胞激素研究小組3：在CAR NK輸注之前第0天。5作為協定LAB00-099之部分繪製。6複製勝任逆轉錄病毒(RCR)：於NK細胞輸注後約1、3及6個月，及然後每6個月一次持續5年，及然後之後一年一次持續10年，按照長期追蹤研究PA17-0483。

可根據本發明在無不適當實驗下進行及執行本文中所揭示及主張之所有方法。雖然已根據較佳實施例描述本發明之組合物及方法，對熟習此項技術者顯而易見，可在不背離本發明之觀念、精神及範圍下將變化應用於方法及步驟中或本文中所述方法之步驟之順序中。更具體而言，顯然化學及生理上均相關之某些藥劑可替代本文中所述藥劑，同時將達成相同或相似結果。認為對熟習此項技術者顯然之所有此等相似替代及修改係於如由隨附申請專利範圍所定義之本發明之精神、範圍及觀念內。參考文獻 下列參考文獻係以引用的方式明確地併入本文中，併入程度為其提供補充本文中所述彼等的示例性程序或其他細節。 Appelbaum, Leukemia 1997;11增刊4:S15-S17。 Arora等人，Blood . 2012;119(1):296。 Austin-Ward及Villaseca,Revista Medica de Chile , 126(7):838-845, 1998。 Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology , Greene Publishing Associates及John Wiley & Sons, NY, 1994。 Bader等人，J.Clin.Oncol . 2004;22:1696-1705。 Bar等人，Leuk.Res.Treatment . 2014;2014:421723。 Bennekov等人，Mt. Sinai J. Med . 71 (2): 86-93, 2004。 Brentjens等人，Sci.Transl.Med. 2013;5:177ra38。 Bukowski等人，Clinical Cancer Res ., 4(10):2337-2347, 1998。 Burger等人，N.Engl.J.Med . 2015;373:2425-2437。 Byrd等人，N.Engl.J.Med . 2013;369:32-42。 Byrd等人，Blood 2015;125:2497-2506。 Caligiuri,Blood 2008;112:461-469。 Camacho等人，J Clin Oncology 22(145)：文摘編號2505 (抗體CP-675206), 2004。 Campbell,Curr. Top. Microbiol. Immunol., 298: 23-57, 2006。 Cheah等人，Ann.Oncol. 2015;26:1175-1179。 Cheson等人，J.Clin.Oncol . 1990;8:813-819。 Cheson等人，J Clin Oncol 2014; 32: 3059-68。 Chothia等人，EMBO J . 7:3745, 1988。 Christodoulides等人，Microbiology , 144(Pt 11):3027-3037, 1998。 Cohen等人，J Immunol . 175:5799-5808, 2005。 Coiffier.N.Engl.J.Med . 2002;346:235-242。 Conlon等人，J.Clin.Oncol . 2015;33:74-82。 Connors,Mod.Pathol . 2013;26增刊1:S111-S118。 Davidson等人，J. Immunother ., 21(5):389-398, 1998。 Davila等人，PLoS ONE 8(4): e61338, 2013。  Denman等人，PLoS.One . 2012;7:e30264。  Di等人，N.Engl.J.Med . 2011;365:1673-1683。  Doulatov等人，Cell Stem Cell . 10:120-36, 2012。 Dudley等人，Science 2002;298:850-854。 Dudley等人，J.Clin.Oncol. 2005;23:2346-2357。 歐洲專利申請案號EP2537416 Fedorov等人，Sci. Transl. Medicine , 5(215), 2013。 Fielding等人，Blood 2016-0641 pg. 68 2009;113:4489-4496。 Frolet等人，BMC Microbiol. 10:190 (2010)。 Gaj等人，Trends in Biotechnology 31(7), 397-405, 2013。 Gill等人，Blood . 2012 Jun 14;119(24):5758-68。 Gisselbrecht等人，J.Clin.Oncol. 2010;28:4184-4190。 Gokbuget等人，Blood 2012;120:1868-1876。 Goldstone等人，Blood 2008;111:1827-1833。 Gribben,Best.Pract.Res.Clin.Haematol . 2007;20:513-527。 Grupp等人，N.Engl.J.Med . 2013;368:1509-1518. Hallek等人，Blood 2008;111(12):5446-5456。 Hallek等人，Blood 2018; 131: 2745-60。 Hamadani等人，Biol.Blood Marrow Transplant . 2013;19:625-631。 Hanibuchi等人，Int. J. Cancer , 78(4):480-485, 1998。 Heemskerk等人，Hum Gene Ther. 19:496-510, 2008。 Hellstrand等人，Acta Oncologica , 37(4):347-353, 1998。 Hollander,Front. Immun. , 3:3, 2012。 Honigberg等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 2010;107:13075-13080。 Hoyos等人，Leukemia 2010; 24: 1160-70。 Hubert等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 14523-28, 1999。 Hui及Hashimoto,Infection Immun., 66(11):5329-5336, 1998。 Hurwitz等人，Proc Natl Acad Sci USA 95(17): 10067-10071, 1998。 Ibrahim等人，Bayesian Survival Analysis . Springer, NY, 2001. 2015。 國際專利公開案第WO 00/37504號 國際專利公開案第WO 01/14424號 國際專利公開案第WO 2007/069666號 國際專利公開案第WO 2007/069666號 國際專利公開案第WO 98/42752號 國際專利公開案第WO/2014055668號  國際專利公開案第WO1995001994號 國際專利公開案第WO1998042752號 國際專利公開案第WO2000037504號 國際專利公開案第WO200014257號  國際專利公開案第WO2001014424號 國際專利公開案第WO2006/121168號 國際專利公開案第WO2007/103009號 國際專利公開案第WO2009/101611號 國際專利公開案第WO2009/114335號 國際專利公開案第WO2010/027827號 國際專利公開案第WO2011/066342號 國際專利公開案第WO2012/129514號  國際專利公開案第WO2013/071154號  國際專利公開案第WO2013/123061號  國際專利公開案第WO2013/166321號  國際專利公開案第WO2013126726號  國際專利公開案第WO2014/055668號 國際專利公開案第WO2014031687號  國際專利公開案第WO2015016718號 國際專利公開案第WO99/40188號 Intlekofer等人，Nat.Immunol . 2005;6:1236-1244。 Iuliucci等人，Journal of Clinical Pharmacology 41, 870-879 (2001)。 Jain等人，Blood 2015;125:2062-2067。 Janeway等人，Immunobiology: The Immune System in Health and Disease，第3版， Current Biology Publications，第433頁，1997。 Johnson等人，Lancet 1996;347:1432-1438。 Johnson等人，Blood 114:535-46, 2009。 Jores等人，PNAS U.S.A . 87:9138, 1990。 June等人，Nat.Rev.Immunol . 2009;9:704-716。 Kalos等人，Sci.Transl.Med . 2011;3:95ra73。 Kaplan, EL及Meier, P,J. American Statistical Association 53:457-481, 1958. 2015。 Kataoka等人，J Immunol 1996;156(10):3678。 Keating等人，J.Clin.Oncol . 2005;23:4079-4088。 Kim等人，Nature Biotechnology 31, 251-258, 2013。 Kirchmaier及Sugden,J. Virol ., 72(6):4657-4666, 1998。 Krebs.Blood 2009;113:6593-6602。 Kuruvilla等人，Leuk.Lymphoma 2008;49:1329-1336。 Lanier LL.Nat.Immunol. 2016-0641 pg. 70, 2008;9:495-502。 Leal, M.,Ann N Y Acad Sci 1321, 41-54, 2014。 Lefranc等人，Dev. Comp. Immunol . 27:55, 2003。 Leung等人，Blood 2012;120:468-472。 Li等人，Nat Biotechnol . 23:349-354, 2005。 Li等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279, 1992。 Linnemann, C.等人，Nat Med 21, 81-85, 2015。 Liu等人，Leukemia 2018; 32(2):520-531。 Ljunggren等人，Immunol.Today 1990;11:237-244。 Lockey等人，Front. Biosci. 13:5916-27, 2008。 Loewendorf等人，J. Intern. Med . 267(5):483-501, 2010。 Ludwig等人，Nature Biotech ., (2):185-187, 2006a。 Ludwig等人，Nature Methods , 3(8):637-646, 2006b。 Marschall等人，Future Microbiol . 4:731-42, 2009。 Martin-Fontecha等人，Nat.Immunol . 2004;5:1260-1265。 Maude等人，N Engl J Med ; 371: 1507-17, 2014。 Maude等人，Blood 2015;125:4017-4023。 Mehta RS、Rezvani K.Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2016; 2016: 106-18。 Miller等人，Blood 2005;105:3051-3057。 Mokyr等人，Cancer Res 58:5301-5304, 1998。 Muftuoglu等人，N Engl J Med 2018; 379: 1443-51。 Neelapu等人，N Engl J Med 2017; 377: 2531-44。 Notta等人，Science , 218-221, 2011。 Olson等人，Blood 2010;115:4293-4301。 Pardoll,Nat Rev Cancer, 12(4): 252-64, 2012 Parkhurst等人，Clin Cancer Res . 15: 169-180, 2009。 Passweg等人，Bone Marrow Transplant . 2016-0641,pg. 69 1998;21:153-158。 Poon等人，Bone Marrow Transplant . 2013;48:666-670。 Poon等人，Biol.Blood Marrow Transplant . 2013;19:1059-1064。 Porter等人，N.Engl.J.Med . 2011;365:725-733。 Qin等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 95(24):14411-14416, 1998。 Rai等人，N.Engl.J.Med . 2000;343:1750-1757。 Rezvani等人，Blood 2009;113:2245-2255。 Rieder等人，J. Interferon Cytokine Res. (9):499-509, 2009。 Rosenberg等人，Nat.Rev.Cancer 2008;8:299-308。 Rubio等人，Nat.Med . 2003;9:1377-1382。 Rubnitz等人，J.Clin.Oncol . 2010;28:955-959。 Ruggeri等人，Science 2002;295:2097-2100。 Rykman等人，J. Virol. 80(2):710-22, 2006。 Sadelain等人，Nat.Rev.Cancer 2003;3:35-45。  Sadelain等人，Cancer Discov . 3(4): 388-398, 2013。  Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual ，第3版，Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 2001。 Savani等人，Blood 2006;107:1688-1695。 Sehn等人，J Clin Oncol . 2005 Aug 1;23(22):5027-33。 Shah等人，PLoS One . 2013 Oct 18;8(10):e76781。 Singh等人，Cancer Research , 68:2961-2971, 2008。 Singh等人，Cancer Research , 71:3516-3527, 2011。 Sullivan等人，N.Engl.J.Med. 1989;320:828-834。 Tagaya等人，Immunity . 1996;4:329-336。 Takahashi等人，Cell , 126(4):663-76, 2007。 Tam等人，Blood 2009;113:4144-4152。 Terakura等人，Blood . 1:72- 82, 2012。 Thall及Cook JD.Biometrics 2004;60(3):684-693。 Thall等人，J Biopharm Stat 2006;16(5):623-638。 Thall等人，Clin Trials 2014;11(6):657-666。 Turtle等人，Curr. Opin. Immunol ., 24(5): 633-39, 2012。  Turtle等人，J Clin Oncol 2017; 35: 3010-20。  美國專利案第4,870,287號 美國專利案第5,739,169號 美國專利案第5,760,395號 美國專利案第5,801,005號 美國專利案第5,824,311號 美國專利案第5,830,880號 美國專利案第5,844,905號 美國專利案第5,846,945號 美國專利案第5,885,796號 美國專利案第5,994,136號 美國專利案第6,013,516號 美國專利案第6,103,470號 美國專利案第6,207,156號 美國專利案第6,225,042號 美國專利案第6,355,479號 美國專利案第6,362,001號 美國專利案第6,410,319號 美國專利案第6,416,998號 美國專利案第6,544,518號 美國專利案第6,790,662號 美國專利案第7,109,304號 美國專利案第7,442,548號 美國專利案第7,446,190號  美國專利案第7,598,364號 美國專利案第7,989,425號 美國專利案第8,008,449號 美國專利案第8,017,114號 美國專利案第8,058,065號 美國專利案第8,071,369號 美國專利案第8,119,129號 美國專利案第8,129,187號 美國專利案第8,183,038號 美國專利案第8,268,620號 美國專利案第8,329,867號 美國專利案第8,354,509號 美國專利案第8,546,140號 美國專利案第8,691,574號 美國專利案第8,735,553號 美國專利案第8,741,648號 美國專利案第8,900,871號 美國專利案第9,175,268號 美國專利公開案第2010/0210014號 美國專利公開案第12/478,154號 美國專利公開案第2002131960號  美國專利公開案第2003/0211603號 美國專利公開案第2005/0260186號 美國專利公開案第2006/0104968號 美國專利公開案第2009/0004142號 美國專利公開案第2009/0017000號 美國專利公開案第2009/0246875號 美國專利公開案第2011/0104125號 美國專利公開案第2011/0301073號 美國專利公開案第20110008369號 美國專利公開案第2012/0276636號 美國專利公開案第2013/0315884號 美國專利公開案第20130149337號  美國專利公開案第2013287748號  美國專利公開案第2014/0120622號 美國專利公開案第2014022021號 美國專利公開案第20140294898號 Varela-Rohena等人，Nat Med . 14: 1390-1395, 2008。 Wang等人，J Immunother . 35(9):689-701, 2012。 Wang等人，N.Engl.J.Med. 2013;369:507-516。 Wang等人，Blood 2015;126:739-745。 Wu等人，Adv. Cancer Res., 90: 127-56, 2003。 Wu等人，Cancer , 18(2): 160-75, 2012。  Yamanaka等人，Cell, 131(5):861-72, 2007。 Yawata等人，Blood 2008;112:2369-2380。 Yu等人，Science , 318:1917-1920, 2007。 Zhou等人，Clin.Lymphoma Myeloma.Leuk . 2014;14:319-326。 Zysk等人，Infect. Immun . 68(6):3740-43, 2000。

下列圖示形成本說明書之一部分且被包含以進一步證實本發明之某些態樣。本發明可藉由參考此等圖示中之一或多者與本文中呈現之特定實施例之詳細描述組合更好理解。

圖 1 ：臨床GMP級CAR-NK轉導及擴增。

圖 2 ：於培養14天後自5種不同CB單元產生之GMP級經CAR轉導之CB-NK細胞的特徵。

圖 3 ：CAR NK細胞於燒瓶相對G-Rex®生物反應器中之擴增。

圖 4 ：經不同NK細胞製劑處理之組中之小鼠之平均生存(天)。

圖 5 ：經Raji腫瘤植入及經不同NK細胞製劑處理之小鼠之生存百分比。

圖 6 ： 經Raji腫瘤植入及經不同NK細胞製劑處理之小鼠之生存的比較。

圖 7 ： 經指定NK細胞製劑處理之小鼠之生物螢光造影。

圖 8 ：阻斷KIR-HLA相互作用對CAR NK細胞對抗腫瘤靶之活性之影響。

圖 9 ：表1. 基線患者之特徵。

圖 10 ：表2. 11名研究患者中之不良事件。

圖 11 ：對CAR-NK療法及緩解後治療之臨床反應。顯示 11名患者之臨床結果及後續療法，該等患者於研究中經抗CD19嵌合抗原受體(CAR)自然殺手(NK)細胞治療。根據國際研究會對慢性淋巴細胞性白血病之2018標準及針對非霍奇金氏(Hodgkin’s)淋巴瘤之2014 Lugano分類證實及評估反應。指示之反應包括部分反應(PR)及完全反應(CR)；MRD表示最小殘留疾病，如在多參數流動式細胞測量術上所評估，具有或不具有骨髓(BM)浸潤。患者3接受利妥昔單抗(rituximab)之4個劑量(×4)；針對患者5及7，虛白線指示緩解後療法之持續時間。HSCT表示造血幹細胞移植。

圖 12A 及 12B ：CAR-NK細胞於輸注後之持久性。圖12A顯示外周血樣本中之CAR-NK細胞之量測，如在定量聚合酶鏈反應分析上，根據由患者接受之CAR-NK細胞之劑量所評估。在3個副本/微克DNA下之水平灰線表示針對此分析之定量下限。實心水平條指示針對各劑量程度在各種時間點下之中間副本數目。於單次輸注CAR-NK細胞後，可於所有11名患者中檢測到CAR序列。該等值增加及保持於外周血中可檢測到長達輸注後1年，不管劑量程度。超過輸注後14天未觀察到所投與細胞劑量與CAR-NK副本數目之間的關係，其表明CAR-NK細胞之持久性藉由經輸注細胞之活體內增殖驅動。追蹤長度在患者中變化。圖12B顯示針對11名患者，於輸注後之第一個28天CAR-NK細胞之峰值副本數目，根據其對療法之反應。在第30天具有反應之患者於輸注後較不具有反應之彼等具有顯著更高的CAR-NK細胞之副本數峰值(中值，31,744相對903個副本/微克；P = 0.02)。黑色水平條指示中值。

圖 13A 至 13C ：GMP級CAR-NK細胞以穿孔素(perforin)依賴性方式殺死原發性CLL靶。圖13A顯示原發性CLL靶(n=4)藉由經GMP級iC9/CAR19/IL-15轉導之CB NK細胞(紅線)相較於成對經離體擴增之未經轉導之NK細胞(NT-NK細胞；黑線)之溶解。***表示p＜ 0.0001且**p＜ 0.01。圖13B表示於經8-去乙基-8-甲基伴刀豆球蛋白A (concanomycin A) (CMA)處理後穿孔素(紅圓)之平均螢光強度之倍數變化，如下計算：與CMA培養後之穿孔素MFI/與CMA培養後之穿孔素MFI。NK細胞表面上之CD56 (黑圓)及CAR (綠圓)之MFI水平經量測作為對照及經CMA (n=3)處理後保持不變。圖13C顯示在經CMA處理之前(實心圓)及之後(空心圓)原發性CLL靶(n=4)藉由經GMP級iC9/CAR19/IL-15轉導之CB NK細胞之溶解；**表示p＜ 0.01及*p＜0.05。

圖 14 ： 患者5之放射反應。來自患者5之FDG PET-CT掃描在研究募集時、在接受CAR-NK細胞輸注之前(上列)及於接受CAR-NK細胞輸注29天後(下列)進行。右上角投射影像顯示在膈膜以上及以下之結節中之FDG攝入。右上中間顯示於增大腸系膜結節(暗箭頭)中具有異常攝入之FDG PET-CT掃描。左上中間PET-CT掃描顯示增大腸系膜結節(亮箭頭)。左上「融合」PETCT掃描顯示局限於腸系膜腺病之FDG攝入。右下角投射影像顯示在膈膜以上及以下之結節中之FDG攝入的解析。右下中間顯示於增大腸系膜結節(暗箭頭)中不具有攝入之FDG PET-CT掃描。左下中間PET-CT掃描顯示穩定之增大腸系膜結節(亮箭頭)。左下「融合」PET-CT掃描顯示於腸系膜腺病中無FDG攝入(箭頭)。

圖 15 ：根據CB CAR-NK細胞與接受者之間之HLA錯配之程度，CAR-NK細胞於輸注後之持久性。於輸注後在多個時間點自患者收集之外周血樣本中之經iC9/CAR19/IL-15修飾之CB-NK細胞的持久性及擴增係藉由qPCR評估。綠點表示接受部分HLA匹配之CAR-NK產品(4/6 HLA匹配)之九名患者之外周血樣本中的CAR-NK副本數目。紅點表示接受非HLA匹配之產品(1/6或2/6 HLA匹配)之兩名患者之CAR-NK副本數目。虛黑線表示PCR分析之檢測水平。

圖 16A 至 16D ：CAR-NK細胞藉由多參數流動式細胞測量術之檢測。圖16A顯示針對代表性患者(患者6，於CAR-NK輸注後第+3天)之外周血中之供體CAR-NK細胞之檢測的流動式細胞測量術閘控策略。使用FSC-A及SSC-A選擇淋巴細胞(i)；使用SSCW相對SSC-H排除下個雙值(ii)；使用活/死染料識別活細胞(iii)；然後藉由在CD45+細胞上閘控來選擇活群體內之造血幹細胞(iv)；藉由在CD33陰性及CD14陰性細胞上閘控來排除骨髓細胞(v)；藉由在CD3-及CD56+細胞上閘控來識別NK細胞(vi)。於CD3-CD56+子集內，基於供體特異性HLA-抗原之表現識別源自臍帶血之NK細胞(vii)。進一步使用針對人類IgG鉸鏈之CH2-CH3域之抗體(109606088/ Jackson Immuno Rsch)測定供體NK細胞上CAR之表現(viii)。藉由CD19及/或CD20之表現藉由在CD45+CD33-CD14-淋巴細胞群體上閘控來識別B細胞(ix)。圖16B顯示使用上述閘控策略針對患者6在輸注後第8、14及21天之CAR-NK頻率。圖16C顯示針對患者8在輸注後第3、14及21天之CAR-NK頻率。圖16D顯示針對患者10在輸注後第3、7及14天之CAR-NK頻率。PBMC：外周血單核細胞，FSC-A：向前散射-面積，FSC-H：向前散射-高度，SSC-A：側面散射-面積，SSC-H：側面散射-高度。

圖 17 ：用於檢測代表性患者之淋巴結中之CAR-NK細胞的連續手動閘控策略。流動式細胞測量術資料顯示用於檢測患者6之淋巴結中之供體CAR NK細胞之閘控策略。於CAR-NK輸注105天後進行活組織檢查以研究單淋巴結中之殘留FDG活性。基於FSC-A及SSC-A選擇淋巴細胞群體(i)；使用SSC-W相對SSC-H排除下個雙值(ii)；使用活/死染料識別活細胞(iii)；然後藉由在CD45+細胞上閘控來選擇活群體內之造血幹細胞(iv)；藉由在CD33陰性及CD14陰性細胞上閘控來排除骨髓細胞(v)；藉由在CD3-及CD56+細胞上閘控來識別NK細胞(vi)。於CD3-CD56+子集內，基於供體特異性HLA-抗原之表現識別源自臍帶血之NK細胞(於此情況下，CAR NK細胞係HLAA3陽性及接受者係HLA-A3陰性) (vii)。PBMC：外周血單核細胞，FSC-A：向前散射-面積，FSC-H：向前散射-高度，SSC-A：側面散射-面積，SSC-H：側面散射-高度。

圖 18 ： 於代表性患者之外周血、骨髓及淋巴結中之CAR-NK副本數目。該圖顯示藉由qPCR在各種時間點於患者8之外周血(綠圓)、骨髓(紅圓)及淋巴結(黑圓)中量測之CAR-NK副本數目。於CAR-NK輸注後之第56天進行淋巴結活組織檢查以研究單淋巴結中之殘留FDG活性。活組織檢查顯示具有鈣化之壞死團塊且無淋巴瘤之證據。CAR-NK轉錄可藉由qPCR於淋巴結(118,897.4個副本/μg)中相較於在相同時間段期間收集之外周血及骨髓樣本在顯著更高水平下(＞25倍)檢測到。

圖 19 ：CAR-NK細胞於輸注後於外周血及骨髓樣本中之持久性。該圖顯示外周血及骨髓樣本中之CAR-NK細胞之量測，如藉由qPCR所評估。綠點及紅點各自表示外周血及骨髓樣本。綠色(外周血)及紅色(骨髓)實線表示在各種時間點之中值副本數目。CAR-NK轉錄係於外周血及骨髓中在相似水平下可檢測到。

圖 20 ：於CAR-NK輸注後檢測表現供體CAR之T細胞之閘控策略。用於檢測代表性患者(患者6，於CAR-NK輸注後，第+8天，小圖i至viii，及第+21天，小圖ix及x)之外周血中之供體T-細胞及源自供體之表現CAR之T-細胞的流動式細胞測量術閘控策略。使用FSC-A及SSC-A選擇淋巴細胞閘(i)；使用SSC-W相對SSC-H排除下個雙值(ii)；使用活/死染料識別活細胞(iii)；然後藉由在CD45+細胞上閘控來選擇活群體內之造血幹細胞(iv)；藉由在CD33陰性及CD14陰性細胞上閘控來排除骨髓細胞(v)；藉由在CD3+ CD56-細胞上閘控來識別T-細胞(vi)。於CD3+子集內，基於供體特異性HLA-抗原之表現識別源自臍帶血之T-細胞(vii)。進一步使用針對人類IgG鉸鏈之CH2-CH3域之抗體(109606088/ Jackson Immuno Rsch)測定供體T-細胞上CAR之表現。百分比指示表現CAR分子之CD3+ T細胞之頻率(viii)。該小圖顯示藉由於CAR NK輸注後第8天(vii及viii)及第+21天(ix及x)自患者收集之PBMC樣本中之CAR+供體T細胞的最小污染。於具有可得連續樣本之兩名另外患者中發現相似結果(資料未顯示)。PBMC：外周血單核細胞，FSC-A：向前散射-面積，FSC-H：向前散射-高度，SSC-A：側面散射-面積，SSC-H：側面散射-高度。

圖 21A 至 21R ：外周血中之發炎性細胞激素之含量。小圖顯示於CAR-NK輸注後外周血樣本中之發炎性細胞激素之時間過程。水平線表示中值。

圖 22A 至 22B ： 患者特徵。

圖 23 ：經輸注之CAR-NK細胞產品之特徵。

圖 24 ：在追蹤期間之CAR-NK細胞持久性。於外周血中使用qPCR量測CAR-NK持久性。

圖 25 ：於CAR-NK輸注後在多個時間點之患者樣本中之供體特異性抗體的量測。(-)指示結果係不可得。

圖 26A 至 26B .經CAR19-CD28-ζ-2A-IL15載體轉導之CB-NK細胞之抗白血病功能。(圖26A) CB NK細胞(下圖)相較於未經轉導之NK細胞(上圖)之轉導效率(85%)。轉導係穩定的。(圖26B) CAR-NK細胞在殺死CD19+ Raji腫瘤及原發性CLL方面相較於針對K562細胞具有相等效應功能之未經轉導(NT)之經離體擴增且活化的NK細胞更有效。P ＜ 0.001 (iC9/CAR.CD19/IL15 + Raji 相對NT-NK + Raji)；P ＜ 0.001 (iC9/CAR.CD19/IL15 + CLL相對NT-NK + CLL)；P=ns (iC9/CAR.CD19/IL15 + K562相對NT-NK + K562)。

圖 27A 至 27C ：經iC9/CAR.19/IL15轉導之CB NK細胞之活體內歸巢、增殖及抗腫瘤活性。(圖27A) 經C9/CAR.19/IL15轉導之經eGFP-FFLuc標記之CB-NK細胞較經CAR.19轉導之CB-NK細胞或NT-NK細胞更有效歸巢至疾病部位(肝、脾、骨髓[BM])。(圖27B)經iC9/CAR.19/IL15轉導之CB-NK細胞至經螢光素酶標記之Raji細胞植入之NSG小鼠之輸注導致腫瘤根除，如由活體內生物發光造影所證實。顏色指示發光強度(紅色，最高；藍色，最低)。(圖27C)。單一劑量之經iC9/CAR.19/IL15轉導之CB NK之活體內抗腫瘤活性較未經轉導或經缺少IL-15之CAR.CD19構築體轉導之CB-NK細胞之活體內抗腫瘤活性顯著更佳。P= 0.001 (iC9/CAR.CD19/IL15 + Raji相對NT-NK + Raji)；P= 0.044 (iC9/CAR.CD19/IL15 + Raji相對CAR.CD19 + Raji)；P= 0.006 (CAR.CD19 + Raji相對NT-NK + Raji)；P= 0.182 (NT-NK + Raji相對單獨Raji)。

圖 28A 至 28B ：經IL-15轉導之CB-NK細胞不顯示自發或失調生長之徵兆。(圖28A)經iC9/CAR.19/IL15轉導之CB NK細胞於活體外培養之6週內停止擴增，無自發生長之證據。(圖28B)腸系膜淋巴結之顯微攝影顯示，於任何實驗小鼠中無淋巴細胞之殘留淋巴組織，此為NSG小鼠之典型。脾之影像顯示，缺乏淋巴細胞(黑色箭頭)且由各種階段之紅血球系及骨髓系列細胞(包括巨核細胞及滿載血鐵黃素之巨噬細胞)組成之造血組織包圍之初步外周小動脈淋巴組織。骨髓含有正常造血細胞及無異常淋巴細胞。H&E染色，放大x200。來自用經iC9/CAR.19/IL15轉導之CB NK細胞處理之NSG小鼠之兩個代表組的載玻片。

圖 29 ： IL-15藉由經iC9.CAR.19.CD28.CD3ζ.IL15轉導之CB NK細胞產生；經iC9. CAR.19.CD28.CD3ζ.IL15轉導之CB NK細胞響應於活體外抗原刺激而產生IL-15。

圖 30A 至 30B ：可誘導半胱天冬酶-9自殺基因之活化消除iC9/CAR.19/IL15+ CB-NK細胞。(圖30A) 添加10 nM之AP1903至iC9-CAR-IL15+ CB-NK細胞之培養物於4小時內誘導轉殖基因細胞之細胞凋亡/壞死(右下圖)，如藉由膜聯蛋白(annexin)-V-7AAD染色所評估。NT，未經轉導之CB-NK細胞；CAR，經iC9/CAR.19/IL15轉導之NK細胞；(圖30B) 10至14天後將靜脈內植入Raji細胞且輸注iC9/CAR.19/IL15+ CB-NK細胞之NSG小鼠用兩個劑量之AP1903二聚體(50 μg)相距兩天腹膜內處理。表現iC9/CAR.19/IL15之NK細胞於3天後測試之所有器官中實質上減少。

Claims (66)

1. 一種生產經工程改造以表現一或多種嵌合抗原受體(CAR)及/或一或多種T細胞受體(TCR)之自然殺手(NK)細胞之離體方法，其包括： (a) 在人工呈遞細胞(APC)及至少一種細胞激素之存在下，培養NK細胞之起始群體； (b)將一或多種CAR及/或TCR表現載體引入該等NK細胞中；及 (c)在APC及至少一種細胞激素之存在下將該等NK細胞於氣體通透性生物反應器中擴增，從而獲得經工程改造之NK細胞之擴增群體。
2. 如請求項1之方法，其中該氣體通透性生物反應器為G-Rex100M。
3. 如請求項1或2之方法，其中該方法不包括在步驟(c)期間移除或添加任何培養基組分。
4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該方法不包括進行HLA匹配。
5. 如請求項1至5中任一項之方法，其中該等經工程改造之NK細胞表現CAR。
6. 如請求項1至5中任一項之方法，其中該等經工程改造之NK細胞表現TCR。
7. 如請求項1至5中任一項之方法，其中該等經工程改造之NK細胞表現CAR及TCR。
8. 如請求項1至7中任一項之方法，其中該NK細胞之起始群體係獲自臍帶血、外周血、骨髓、CD34⁺ 細胞、誘導多能幹細胞(iPSC)、或NK細胞系。
9. 如請求項1至8中任一項之方法，其中該NK細胞之起始群體係獲自臍帶血。
10. 如請求項9之方法，其中該臍帶血先前已經冷凍。
11. 如請求項9之方法，其中該臍帶血先前尚未經冷凍。
12. 如請求項9之方法，其中該臍帶血已獲自健康供體。
13. 如請求項9之方法，其中該NK細胞之起始群體係藉由使用ficoll-paque密度梯度分離單核細胞獲得。
14. 如請求項13之方法，其進一步包括耗盡該等CD3、CD14及/或CD19細胞之單核細胞以獲得該NK細胞之起始群體。
15. 如請求項13之方法，其進一步包括耗盡該等CD3、CD14及CD19細胞之單核細胞以獲得該NK細胞之起始群體。
16. 如請求項14或15之方法，其中該耗盡係包括進行磁性分選。
17. 如請求項1至16中任一項之方法，其中該等APC為經γ照射之APC。
18. 如請求項1至17中任一項之方法，其中該等APC為通用APC (uAPC)。
19. 如請求項18之方法，其中該等uAPC經工程改造以表現(1) CD48及/或CS1 (CD319)，(2)膜結合之介白素-21 (mbIL-21)，及(3) 41BB配位體(41BBL)。
20. 如請求項1至19中任一項之方法，其中該等NK細胞及APC係以1:1至1:10比率存在。
21. 如請求項1至19中任一項之方法，其中該等NK細胞及APC係以1:2比率存在。
22. 如請求項1至21中任一項之方法，其中該至少一種細胞激素為IL-2、IL-7、IL-12、IL-21、IL-15、或IL-18。
23. 如請求項1至21中任一項之方法，其中該至少一種細胞激素為IL-2。
24. 如請求項1至23中任一項之方法，其中該等NK細胞之培養及/或擴增係在2、3或4種細胞激素之存在下。
25. 如請求項24之方法，其中該等細胞激素係選自由IL-2、IL-7、IL-12、IL-21、IL-15及IL-18組成之群。
26. 如請求項1至24中任一項之方法，其中該至少一種細胞激素係在100至300 U/mL之濃度下存在。
27. 如請求項1至24中任一項之方法，其中該至少一種細胞激素係在200 U/mL之濃度下存在。
28. 如請求項1至27中任一項之方法，其中該引入係包括轉導或電穿孔。
29. 如請求項28之方法，其中該轉導為重組人纖維連接蛋白(retronectin)轉導。
30. 如請求項29之方法，其中該轉導具有至少20%之效率。
31. 如請求項1至30中任一項之方法，其中該CAR及/或TCR表現構築體為慢病毒載體或逆轉錄病毒載體。
32. 如請求項1至31中任一項之方法，其中該經工程改造之NK細胞之群體係遵從GMP。
33. 如請求項1至32中任一項之方法，其中該方法導致至少2000倍擴增。
34. 如請求項1至33中任一項之方法，其中步驟(a)至(c)係進行2週以下。
35. 如請求項1至34中任一項之方法，其中該等NK細胞係異源。
36. 如請求項1至35中任一項之方法，其中該等NK細胞係自體同源。
37. 如請求項1至36中任一項之方法，其中該CAR及/或TCR具有針對以下之抗原特異性：CD70、BCMA、CD5、CD33、CD47、CD99、CLL1、CD38、U5snRNP200、CD200、BAFF-R、CD19、CD319/CS1、ROR1、CD20、癌胚抗原、α胎蛋白、CA-125、MUC-1、上皮腫瘤抗原、黑色素瘤相關抗原、突變p53、突變ras、HER2/Neu、ERBB2、葉酸結合蛋白、HIV-1封膜醣蛋白gp120、HIV-1封膜醣蛋白gp41、GD2、CD123、CD23、CD30、CD56、c-Met、間皮素、GD3、HERV-K、IL-11Rα、κ鏈、λ鏈、CSPG4、ERBB2、WT-1、EGFRvIII、TRAIL/DR4、VEGFR2、或其組合。
38. 如請求項1至37中任一項之方法，其中該CAR及/或表現構築體進一步表現細胞激素。
39. 如請求項38之方法，其中該細胞激素為IL-15、IL-21或IL-2。
40. 如請求項1至39中任一項之方法，其進一步包括將該經工程改造之NK細胞之群體冷凍保存。
41. 一種根據如請求項1至40中任一項之方法生產之經擴增之NK細胞的群體。
42. 一種醫藥組合物，其包含如請求項41之經工程改造之NK細胞之群體及醫藥上可接受之載劑。
43. 一種包含有效量之如請求項42之經工程改造之NK細胞的組合物，其用於治療個體之疾病或病症。
44. 一種包含有效量之如請求項1至40中任一項之經工程改造之NK細胞之組合物的用途，其用於治療個體之免疫相關病症。
45. 一種治療個體之免疫相關病症之方法，其包括向該個體投與有效量之如請求項1至40中任一項之經工程改造的NK細胞。
46. 如請求項45之方法，其中該方法不包括在該個體與供體之間進行HLA匹配。
47. 如請求項45之方法，其中該等NK細胞為在該個體與供體之間錯配之KIR-配位體。
48. 如請求項45至47中任一項之方法，其中該HLA匹配不存在不會導致移植物抗宿主疾病或毒性。
49. 如請求項45至48中任一項之方法，其中該免疫相關病症為癌症、自體免疫病症、移植物抗宿主疾病、同種異體移植排斥、或發炎性病狀。
50. 如請求項45至48中任一項之方法，其中該免疫相關病症為發炎性病狀且該等免疫細胞基本上不表現糖皮質激素受體。
51. 如請求項50之方法，其中該個體已經或正在接受投與類固醇療法。
52. 如請求項45至51中任一項之方法，其中該等NK細胞係自體同源。
53. 如請求項45至51中任一項之方法，其中該等NK細胞係異源。
54. 如請求項45至53中任一項之方法，其中該免疫相關病症為癌症。
55. 如請求項54之方法，其中該癌症為實體癌症或血液惡性病。
56. 如請求項45至55中任一項之方法，其進一步包括投與至少一種第二治療劑。
57. 如請求項56之方法，其中該至少一種第二治療劑包括化療、免疫療法、手術、放射療法、或生物療法。
58. 如請求項56之方法，其中該等NK細胞及/或該至少一種第二治療劑係經靜脈內、經動脈內、經腹膜內、經氣管內、經腫瘤內、經肌肉內、經內視鏡、經病灶內、經頭顱內、經皮、經皮下、局部、藉由直接注射、藉由輸注或其組合投與。
59. 一種治療個體之感染之方法，其包括向該個體投與有效量之藉由如請求項1至40中任一項產生之經工程改造的NK細胞。
60. 如請求項59之方法，其中該方法不包括在該個體與供體之間進行HLA匹配。
61. 如請求項59之方法，其中該方法不包括在該個體與供體之間進行HLA匹配。
62. 如請求項59至61中任一項之方法，其中該HLA匹配不存在不會導致移植物抗宿主疾病或毒性。
63. 如請求項59至62中任一項之方法，其中該等NK細胞為在該個體與供體之間錯配之KIR-配位體。
64. 如請求項59至63中任一項之方法，其中該感染為病毒、細菌或真菌。
65. 如請求項59至64中任一項之方法，其中該等NK細胞相對於該個體係自體同源。
66. 如請求項59至64中任一項之方法，其中該等NK細胞相對於該個體係異源。

Images