CN116769722A - 功能增强型car-nk细胞、其制备方法及其在免疫疗法中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了功能增强型嵌合抗原受体‑自然杀伤细胞(CAR‑NK)、其制备方法及其在免疫疗法中的应用。所述CAR‑NK的制备方法包括：提供CAR‑NK细胞，以及从中富集表达CD70的CAR‑NK细胞，或处理或改造该CAR‑NK细胞使之表达CD70。所述CAR‑NK的靶细胞杀伤效率显著提高。

Description

功能增强型CAR-NK细胞、其制备方法及其在免疫疗法中的 应用
技术领域
本发明属于免疫学及生物技术领域，更具体地，本发明涉及功能增强型CAR-NK细胞、其制备方法及其在免疫疗法中的应用。
背景技术
免疫治疗和细胞治疗革新了恶性肿瘤的治疗模式，逐渐成为复发性或难治性恶性肿瘤治疗的中坚力量。其中以T细胞为主要载体的嵌合抗原受体(CAR-T)技术最为显著，在治疗多种血液系统恶性肿瘤如B细胞白血病、B细胞非霍奇金淋巴瘤和多发性骨髓瘤的临床试验中展现出优异的临床效果。但是，CAR-T细胞疗法带来显著疗效的同时，其毒性反应也不可忽视，严重者或处理不及时可严重制约治疗效果。其中，细胞因子风暴是最为显著的毒性反应。此外，目前的CAR-T疗法需要使用患者自体T细胞，起始质量及异质性差异显著，严重阻碍了CAR-T细胞疗法的药效和药代动力学表征评价。
自然杀伤细胞(NK)细胞在1970年代被发现，是除T细胞、B细胞以外的淋巴细胞亚群。NK细胞在肿瘤免疫监视过程中发挥重要作用。目前已有多个活跃的临床试验在探索NK细胞疗法治疗血液系统和实体瘤的适应症，其中也包括了CAR-NK细胞免疫疗法。CAR-NK细胞来源丰富，脐带血、健康人或者诱导性多能干细胞研究发现，CAR-NK疗法展现出与CAR-T相当的治疗效果，而且完全没有细胞因子风暴和神经毒性，也没有任何移植物抗宿主病的情况。可见，CAR-NK疗法可以补充和在某些情况下替代基于CAR-T细胞的免疫疗法，以最大程度地发挥抗肿瘤作用并降低治疗毒性。
目前CAR-NK疗法的临床试验结果正式通过文献披露的仅1项，入组的11例患者接受靶向CD19的CAR-NK细胞治疗，有7例患者可实现完全缓解。几例效果不佳的患者外周血和骨髓中检测到CAR-NK细胞的同时，还有表达CD19的肿瘤细胞，这表明肿瘤细胞对CAR-NK的耐药。本领域其它在研的CAR-NK疗法也遇到诸如杀伤作用低下等问题。
因此，进一步增强CAR-NK细胞的功能，改善其对肿瘤细胞的杀伤作用，有着重大的研究和临床转化价值。
发明内容
本发明的目的在于提供功能增强型CAR-NK细胞、其制备方法及其在免疫疗法中的应用。
在本发明的第一方面，提供一种提高嵌合抗原受体-NK细胞(CAR-NK)的靶细胞杀伤效率的方法，包括：(1)提供嵌合抗原受体-NK细胞(包括培养物或细胞群)；(2)从(1)的细胞中富集表达CD70的嵌合抗原受体-NK细胞；或，处理或改造(1)的嵌合抗原受体-NK细胞使之表达(包括“过表达”)CD70。
在一种或多种实施方式中，(1)中，所述的嵌合抗原受体-NK细胞通过在NK细胞上表达嵌合抗原受体获得。
在一种或多种实施方式中，所述NK细胞包括：(a)分离自外周血的NK细胞；(b)(a)细胞的经培养的细胞；或(c)(a)或(b)细胞的经传代的细胞。
在一种或多种实施方式中，所述NK细胞包括：天然的NK细胞，或经基因工程修饰或改造的NK细胞(如还引入有嵌合抗原受体编码基因以外的其它功能性组件的编码基因)。
在一种或多种实施方式中，所述经基因工程修饰或改造的NK细胞例如(但不限于)：还引入有嵌合抗原受体组件编码基因以外的其它功能性组件的编码基因的细胞。
在一种或多种实施方式中，所述的嵌合抗原受体靶向于所述靶细胞上的抗原，所述靶细胞包括异常增殖细胞。
在一种或多种实施方式中，所述异常增殖细胞包括肿瘤细胞，所述抗原为肿瘤相关抗原。
在一种或多种实施方式中，所述肿瘤相关抗原为肿瘤细胞特异性表达抗原；或为肿瘤细胞高表达、正常细胞低表达或不表达的抗原。
在一种或多种实施方式中，所述抗原包括(但不限于)：CLDN18.2、CD19，CD5、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、CD34、CD37、CD38、CD43、CD72a、CD78、CD79a、CD79b、CD86、CD134、CD137、CD138、CD319、GPC3、CD32b、CD171、CS-1、CLL-1、BCMA、GD2、GD3、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、IL-13Ra2、Mesothelin、Her2、MUC1、EGFR、CLDN6、DLL3、NY-ESO-1、WT1、Nectin-4、GPC3、PDL1、NKG2DL以及以上抗原的任意组合。
在一种或多种实施方式中，所述肿瘤包括实体瘤和非实体瘤；较佳地包括(但不限于)：非霍奇金氏淋巴瘤(如小B细胞非霍奇金淋巴瘤)、霍奇金氏淋巴瘤、骨髓瘤、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、肝癌、肺癌(包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、胃癌、食道癌、肠癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、脑胶质瘤、宫颈癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、肉瘤。
在一种或多种实施方式中，(1)中，所述嵌合抗原受体-NK细胞的制备方法包括：(i)培养NK细胞；(ii)在起始培养(第0天)的第3-7天(较佳地4-6天，如5天)转染编码CAR的多核苷酸；(iii)在起始培养的第5-15天(较佳地6-13天，如7、8、9、10、11、12天；更佳地8-12天)、且在步骤(ii)之后，进行步骤(2)。
在一种或多种实施方式中，在培养过程中进行1-5次(如2、3、4次，较佳地2-3次)的刺激；较佳地，在起始培养的第0.1-2天(较佳地在0.5-1天)进行刺激；在培养的第5-9天(较佳地第6-8天，如6.5、7、7.5天)再次进行刺激。
在一种或多种实施方式中，所述嵌合抗原受体-NK细胞对靶细胞杀伤效率的提高不依赖于CD70与CD27的结合。
在一种或多种实施方式中，所述嵌合抗原受体(CAR)包括顺序连接的：胞外结合区，跨膜区和胞内信号区。
在一种或多种实施方式中，所述胞外结合区包含特异性识别所述抗原的结合部分(抗体，优选单链抗体)。
在一种或多种实施方式中，所述跨膜区是包含CD8、CD28、NKG2D、2B4、DAP10、DAP12的铰链区或跨膜区的序列。
在一种或多种实施方式中，所述胞内信号区包括选自4-1BB，CD3zeta，FcεRIγ，CD27，CD28，CD134，ICOS，GITR、2B4、DAP10、DAP12、DNAM-1、NKp30、NKp44、NKp46的胞内信号区序列，或其组合。
在一种或多种实施方式中，所述NK细胞与滋养层细胞共同培养。
在一种或多种实施方式中，所述CAR-NK细胞靶向表达CD19抗原的肿瘤细胞。较佳地，CAR中，胞外结合区为结合CD19抗原的scFv，较佳地为FMC63单抗scFv序列。较佳地，CAR中，包括4-1BB共刺激因子和CD3zeta激活域。较佳地，CAR中，所述4-1BB共刺激因子和CD3zeta激活域与IL-15协同表达；较佳地，以Furin-T2A短肽连接以形成所述协同表达。较佳地，CAR的表达元件被克隆于慢病毒载体中，引入到NK细胞中，实现CAR的表达，获得CAR-NK细胞。
在一种或多种实施方式中，所述CAR-NK细胞靶向表达CLDN18.2抗原的肿瘤细胞；较佳地，CAR中，胞外结合区为结合CLDN18.2抗原的scFv，较佳地为IMAB362单抗scFv序列。较佳地，CAR中，包括CD28共刺激因子和CD3zeta激活域。较佳地，CAR中，所述CD28共刺激因子和CD3zeta激活域与IL-15协同表达；较佳地，以Furin-T2A短肽连接以形成所述协同表达。较佳地，CAR的表达元件被克隆于慢病毒载体中，引入到NK细胞中，实现CAR的表达，获得CAR-NK细胞。
在一种或多种实施方式中，(2)中，从(1)的细胞中富集(包括分选、分离或纯化)CD70高表达的嵌合抗原受体-NK细胞包括：对嵌合抗原受体-NK细胞进行分选、分离或纯化，从而富集CD70高表达的嵌合抗原受体-NK细胞。
在一种或多种实施方式中，利用特异性抗CD70的抗体进行所述的分选、分离或纯化。
在一种或多种实施方式中，利用包括(但不限于)以下方法进行所述的分选、分离或纯化：流式细胞法、固相载体分离法；较佳地，所述固相载体分离法包括但不限于：柱纯化/分选法，磁珠纯化/分选法。
在一种或多种实施方式中，(2)中，所述处理(1)的嵌合抗原受体-NK细胞使之表达CD70包括：以去甲基化药物处理所述嵌合抗原受体-NK细胞；较佳地，所述去甲基化药物包括：5-氮杂-2-脱氧胞苷(地西他滨)，5-阿扎胞苷。
在一种或多种实施方式中，所述去甲基化药物包括：5-氮杂-2-脱氧胞苷；所述5-氮杂-2-脱氧胞苷处理细胞的浓度为25nM～10uM；较佳地为50nM～5M(如，60nM、80nM、100nM、200nM、300nM、500nM、800nM、1uM、1.2uM、1.5uM、1.8uM、2uM、2.5uM、3uM、4uM等)。
在一种或多种实施方式中，(2)中，所述改造(1)的嵌合抗原受体-NK细胞使之表达CD70包括：将编码CD70的多核苷酸引入到嵌合抗原受体-NK细胞中，从而使之表达CD70(表达于细胞表面)；较佳地，所述编码CD70的多核苷酸被装载于表达盒中，所述表达盒包括操作性连接的：启动子、编码CD70的多核苷酸和终止子；较佳地，所述表达盒存在于表达构建体(表达载体)中。
在本发明的另一方面，提供一种靶细胞杀伤效率提高的嵌合抗原受体-NK细胞(包括培养物或细胞群)，其表达CD70。
在一种或多种实施方式中，所述细胞由前面任一所述的方法制备获得；较佳地，所述细胞具有选自下组的特征：IFN-gamma细胞因子水平显著提高，脱颗粒水平显著提高，炎症基因显著富集，活化型受体表达显著提高，线粒体数量增多，线粒体膜电位活跃。
在本发明的另一方面，提供前面任一所述的方法或所述的细胞在制备杀伤靶细胞的药物组合物中的应用；较佳地，所述靶细胞包括异常增殖细胞。
在一种或多种实施方式中，所述异常增殖细胞包括肿瘤细胞，所述抗原为肿瘤相关抗原。
在一种或多种实施方式中，所述肿瘤相关抗原为肿瘤细胞特异性表达抗原；或为肿瘤细胞高表达、正常细胞低表达或不表达的抗原。
在本发明的另一方面，提供一种药物组合物，其中包括：所述的靶细胞杀伤效率提高的嵌合抗原受体-NK细胞(包括培养物或细胞群)；以及，药学上可将接受的载体或赋形剂。
在本发明的另一方面，提供一种药盒或包装，其中包括所述的靶细胞杀伤效率提高的嵌合抗原受体-NK细胞(包括培养物或细胞群)。
在本发明的另一方面，提供一种药盒或包装，其中包括所述的药物组合物。
在本发明的另一方面，提供特异性识别或结合CD70的试剂(如抗体)的应用，用于富集靶细胞杀伤效率提高的、表达CD70的嵌合抗原受体-NK细胞。
在一种或多种实施方式中，所述特异性识别或结合CD70的试剂被与流式细胞法或固相载体分离法相结合，富集靶细胞杀伤效率提高的、表达CD70的嵌合抗原受体-NK细胞。较佳地，所述固相载体分离法包括但不限于：柱纯化/分选法，磁珠纯化/分选法。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、靶向CD19的CAR-NK慢病毒载体的一些主要元件的示意图。
图2、6位健康人样本的NK细胞CD70表达水平变化。
图3、通过免疫磁珠分选法，获得CD70+及CD70-的两群细胞亚群。
图4、实时细胞分析仪RTCA检测不同表达CD70的CAR-NK细胞靶向杀伤3T3-CD19能力。
图5、CD70不同表达的CAR-NK细胞杀伤肿瘤细胞的能力比较。
图6、CD70不同表达的CAR-NK细胞脱颗粒功能比较。
图7、CD27敲除的肿瘤细胞株Raji-CD27KO中，CD70不同表达的CAR-NK的杀伤功能比较。
图8、动物模型验证CD70+CAR-NK体内抗肿瘤效果的实验流程图。
图9、不同实验组小鼠活体成像评估肿瘤负荷。
图10、不同实验组小鼠体内肿瘤荧光值。
图11、不同实验组小鼠生存曲线结果。
图12、火山图对比CD70+及CD70-细胞两者基因表达水平上的差别。
图13、通过RNA测序分析，CD70高表达的CAR-NK亚群会显著富集表达炎性反应相关的基因。
图14、质谱流式法分析CD70高表达的CAR-NK亚群会对于NK细胞的活化型受体表达的调节作用。
图15、CD70不同表达分组的线粒体功能分析。
图16、去甲基化药物可显著提高CAR-NK细胞的CD70表达。
图17、靶向CLDN18.2的CAR-NK慢病毒载体及不同表达CD70 CAR-NK细胞靶向杀伤MKN45-CLDN18.2的能力比较。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，首次揭示一种提高嵌合抗原受体-自然杀伤细胞(CAR-NK)的靶细胞杀伤效率的方法，包括：提供CAR-NK细胞；以及，从中富集表达CD70的CAR-NK细胞，或处理或改造该CAR-NK细胞使之表达CD70。
如本发明所用，“嵌合抗原受体”或“CAR”指，包含能够结合抗原的胞外结构域(也称为“抗原结合结构域”)、跨膜结构域和至胞质信号传导结构域(也称为“胞内信号区”)的重组多肽构建体，其中所述胞内信号区包含源自刺激分子和/或共刺激分子的功能信号传导结构域。例如，刺激分子可以包括(但不仅限于)与免疫细胞(如NK细胞)受体复合物相关的ξ链，共刺激分子可以包括(但不仅限于)4-1BB(CD137)或CD18。所述的CAR可以包含一个或多个(包括两个)抗原结合结构域。
“胞外结构域”也称为“抗原结合结构域”，包括特异性地结合至抗原(并从而能够靶向含有抗原的细胞)的CAR的区域。本发明的CAR可以包含一个或多个抗原结合结构域。通常，CAR上的靶向区域是细胞外的。抗原结合结构域可以包含抗体或其片段。胞外结构域可以包含例如全长重链、Fab片段、单链Fv(scFv)片段、二价单链抗体或双抗体。特异性结合至给定抗原的任何分子，例如来自天然存在的受体的亲和体或配体结合结构域，可以用作抗原结合结构域。较佳地，胞外结构域可以是scFv。通常，在scFv中，免疫球蛋白重链和轻链的可变区通过柔性接头融合以形成scFv。这种接头可以是例如“(G4/S1)3-接头”。较佳地，胞外结构域可以包含人或人源化抗体或其片段。
“铰链区”或“间隔区”指位于胞外(结构)域和跨膜(结构)域之间的亲水区域。本发明的CAR可以包含细胞外间隔子结构域，但是也可以通过这样的间隔子。间隔子可以包括抗体或其片段的Fc片段、抗体或其片段的铰链区、抗体的CH2或CH3区、辅助蛋白、人工间隔子序列或其组合。间隔子的著名实例是CD8α铰链。
CAR的“跨膜结构域”可以衍生自例如CD8α或CD28。CAR可以具有两个(或更多个)跨膜结构域。
CAR的“胞内信号区”负责激活其中表达CAR的免疫细胞的至少一种正常效应功能。“效应功能”指细胞的专门功能。细胞内信号传导结构域是指转导效应功能信号并指导表达CAR的细胞以执行专门功能的蛋白质的部分。细胞内信号传导结构域可以包括足以转导启动或阻断免疫细胞效应功能的信号的给定蛋白的细胞内信号传导结构域的任何完整的、突变的或截短的部分。
如本发明所用，“单链抗体(scFv)片段”指的是抗体片段，其包含通过接头(linker)连接的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，接头使得这两个结构域相关联，以最终形成抗原结合位点。单链抗体优选是由一条核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。本发明使用的单链抗体可单独或联合使用本领域已知的常规技术，例如氨基酸缺失、插入、取代、增加、和/或重组以及/或其它修饰方法作进一步修饰。
如本发明所用，“胞内信号传导结构域”或“胞内信号区”或“胞内信号传导激活区域”指CAR分子的胞内部分。胞内信号传导结构域产生可以促进CAR免疫效应细胞(例如CAR-NK细胞)的免疫效应子功能的信号。免疫效应子功能的例子，例如在CAR-NK细胞中，包括细胞裂解活性和辅助活性，包括细胞因子分泌。
本发明的CAR可以是具有至少双特异性的CAR，其包含细胞外部分，至少一个细胞内信号传导结构域，和至少一个跨膜结构域，其中所述CAR的细胞外部分包含a)至少一个抗原结合结构域，和b)至少一个细胞因子受体激活或阻断结构域，其中所述至少一个抗原结合结构域对靶细胞的抗原是特异性的(第一特异性)，和其中所述至少一个细胞因子受体激活或阻断结构域对不是所述抗原的细胞因子受体是特异性的(第二特异性)。
如本发明所用，“靶细胞”指在其细胞表面上表达抗原的细胞，其应该被CAR的抗原结合结构域识别(结合)。
如本发明所用，术语“基因工程修饰的细胞”和“基因工程改造的细胞”可以互换使用。这些术语指含有和/或表达外源基因或核酸序列，其进而改变细胞或其后代的基因型或表型。本发明中，“CAR-NK”本身为一种“基因工程修饰的细胞”，NK细胞表达了CAR；而进一步的修饰也是可以的。
如本发明所用，“特异性识别”的意思是本发明的胞外结合区(如单链抗体)不与或基本上不与目标抗原以外的任意多肽交叉反应。其特异性的程度可以通过免疫学技术来判断，包括但不限于免疫印迹，免疫亲和层析，流式细胞分析等。在本发明中，特异性识别优选通过流式细胞技术来确定，而具体情况下特异性识别的标准可由本领域一般技术人员根据其掌握的本领域常识来判断。
如本发明所用，所述的“操作性连接”或“可操作性相连”是指两个或多个核酸/蛋白区域或核酸/蛋白序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。
如本发明所用，所述的“表达盒”是指包含有表达目的多肽(本发明中为胶原酶)所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括以下元件：启动子、编码多肽的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等；这些元件是操作性相连的。
如本发明所用，所述的“构建物(或称构建体)”指一种已经通过人为干预，使其含有按照自然界中不存在的序列所组合和排列的DNA片段的单链或者双链DNA分子。所述的“构建物”包括表达载体；或者，所述的“构建物”被包含在表达载体中、作为表达载体的一部分。
如本发明所用，所述的“免疫细胞”与“免疫效应细胞”可互换使用，本发明中优选地为NK细胞。
NK细胞是免疫细胞的一个亚群，在固有免疫反应中发挥核心作用，能够消除正常的应激细胞，例如病毒感染的细胞以及恶性转化的细胞。NK细胞活性由通过其表面表达的激活和抑制受体转导的信号的平衡来调节，与T细胞相比，NK的激活不需要事先的抗原启动。
NK细胞主要是溶细胞性的免疫细胞，其主要作用机制依赖于称为脱颗粒的过程。因此，NK细胞在其细胞质中含有预先形成的带有穿孔素和颗粒酶的细胞毒性颗粒，当靶细胞识别时，这些内容物就被释放到免疫突触中，导致靶细胞裂解，且不会影响免疫效应细胞。溶酶体相关膜蛋白-1(CD107a)是一种存在于溶酶体中的高度糖基化跨膜蛋白。在NK细胞和细胞毒性T细胞中，CD107a是溶细胞颗粒中最丰富的蛋白质之一，位于囊泡膜的内层，其高度糖基化的部分隐藏在腔侧，短尾暴露于细胞质。脱颗粒结束时，颗粒的外膜与NK细胞膜合并，导致CD107a分子暴露于表面，是保护效应细胞免受脱颗粒相关自杀的机制。CD107a在膜上的表达被认为是活化细胞毒性淋巴细胞的标志物，包括CD8+T细胞和NK细胞。通过流式细胞术分析评估CD107a的表达与NK细胞细胞毒活性和细胞因子分泌之间存在直接相关性，故CD107a成为评估针对各种刺激的免疫细胞细胞毒反应的可靠测定方法，也被提议作为一种诊断细胞毒性遗传疾病的方法，NK细胞脱颗粒缺陷是某些疾病预后不良因素。
本领域常规的核酸转导方法，包括非病毒和病毒的转导方法都可以用于本发明，来建立所述的CAR-NK细胞。基于非病毒的转导方法包括电穿孔法和转座子法。非病毒载体系统例如睡美人转座子(Sleeping Beauty system)或PiggyBac转座子等转座子系统，其转导效率较普通电穿孔有较大提高，将nucleofector转染仪与睡美人转座子系统联合应用已有报道[Davies JK.，et al.Cancer Res，2010，70(10):OF1-10]，该方法既具有较高的转导效率又能够实现目的基因的定点整合。此外，mRNA转染技术也是可被应用的。
多种用于病毒包装的载体可被应用于本发明中，例如包括慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等，也包括在这些病毒载体基础上进一步改造后形成的病毒载体。应理解，多种类型的载体都是可用的，只要最终能够获得有活性的CAR以及由其修饰的免疫效应细胞。
所述的免疫细胞还可以携带外源的细胞因子的编码序列；所述的细胞因子包括但不限于：IL-12，IL-15或IL-21等。这些细胞因子具有免疫调节或抗肿瘤的活性，能增强效应细胞或活化的NK细胞的功能，或直接发挥抗肿瘤作用。因此，本领域技术人员可以理解，这些细胞因子的运用有助于所述的免疫细胞更好地发挥作用。
本发明所述的免疫细胞还可以表达趋化因子受体；所述的趋化因子受体包括但不限于CCR2。本领域技术人员可以理解，所述的CCR2趋化因子受体可以使得体内的CCR2与之竞争性结合，对于阻断肿瘤的转移是有利的。
本发明所述的免疫细胞还可以表达能降低PD-1表达的siRNA或者阻断PD-L1的蛋白。本领域技术人员可以理解，竞争性阻断PD-L1与其受体PD-1的相互作用，有利于进一步抑制肿瘤生长。
本发明所述的免疫细胞还可以表达安全开关；较佳地，所述的安全开关包括：iCaspase-9，Truancated EGFR或RQR8。如前所述，目前CA疗法还受到其生产的复杂性和与细胞活性相关的不良事件的挑战，比如细胞因子风暴(CRS)等。因此，能有效调控CAR-T的药物或疗法，例如设置安全开关是更为优选的。
在得知了本发明的技术方案后，可以采用本领域技术人员已知的方法来富集表达CD70的CAR-NK细胞。较为经典的方法如流式细胞法(FACS)或磁性细胞分选法，也即利用抗CD70的抗体从总的细胞群中分离表达CD70的细胞群。优选的方法例如是FACS法。各种细胞都有相应的表面分子表达方式，通过免疫荧光标记技术将细胞表面分子同标记有特异染料或荧光的一种或以上特异性抗体结合后，在流式细胞仪同一激光光源激发下可产生一种或集中特异荧光色，由荧光检测器对每个细胞的体积、结构、荧光种类及性质等多种参数同时测定，从而可分析得到细胞群体的多种表面分子的表达情况，或分选出特定细胞。FACS法是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的细胞分析或分选技术，利用合适的细胞表面分子，通过FACS法来分析或分选细胞是本领域人员熟知的技术。
在本发明的具体实施例中，通过免疫磁珠分选法，获得CD70+及CD70-的两群细胞亚群；同时通过流式细胞术验证了分选效果能够达到预期。
本发明的具体实施例中，制备了靶向于表达CD19抗原的肿瘤细胞的CAR-NK细胞，其CAR中，胞外结合区为结合CD19抗原的scFv；包括4-1BB共刺激因子和CD3zeta激活域，所述4-1BB共刺激因子和CD3zeta激活域与IL-15协同表达。其呈现了良好的靶向抑制作用。IL-15促进免疫细胞增殖和抗凋亡蛋白的转录。CD8+记忆T细胞和NK细胞对IL-15的反应敏感，而Tregs对IL-15不反应。此外，应理解，基于本发明的新发现，本发明的技术方案所针对的抗原不限于CD19，与之协同表达的因子不限于IL-15。
通过实时细胞分析仪RTCA检测发现，CD70高表达的CAR-NK细胞靶向杀伤3T3-CD19能力显著强于CD70低表达的亚群，且该表型具有与传统的CD27-CD70 signaling不同的方式。通过构建CD27敲除的肿瘤细胞株Raji-CD27KO，CD70高表达的CAR-NK的杀伤功能要显著优于CD70低表达组，说明其机制不依赖CD70/CD27的结合。也即，所述CAR-NK细胞对靶细胞杀伤效率的提高不依赖于CD70与CD27的结合。
实施例中的分析也显示，CD70高表达的CAR-NK细胞杀伤肿瘤细胞，分泌IFN-gamma细胞因子显著增多。CD70高表达的CAR-NK细胞杀伤肿瘤细胞，脱颗粒功能显著增加。
通过RNA测序分析，CD70高表达的CAR-NK亚群会显著富集表达炎性反应相关的基因。通过质谱流式法进一步发现，CD70高表达的CAR-NK亚群会显著上调NK细胞的活化型受体表达。
线粒体功能分析显示，CD70高表达的CAR-NK细胞线粒体数量增多(左图)，TMRM染色检测线粒体膜电位处于活跃状态。说明CD70+CAR-NK细胞的线粒体功能及活性优于CD70-CAR-NK细胞。
在动物实验中也发现，CD70高表达的CAR-NK细胞显著减少肿瘤负担，并延长动物的生存期。
本发明的表达CD70的CAR-NK细胞可以应用于制备组合物，特别是药物组合物。所述的组合物除了包括有效量的所述免疫效应细胞，还可包含药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。
可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。
本发明的组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式例如可以采用注射或其它治疗方式。
本发明的免疫效应细胞或含有所述细胞的组合物还可被置于适当的药盒中，以便于临床医师的是用。较佳地，所述的药盒中还可含有说明本发明的组合物的使用方法的使用说明书。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、CAR-NK细胞培养平台构建
1、分离健康人外周血来源的NK细胞
本实施例中，从健康人外周血获得NK细胞，分离步骤如下：
(1)抽取健康人的外周血10-15mL，按每1mL外周血加入50uL NK细胞分离试剂盒(RosetteSepTM Human NK Cell Enrichment Cocktail,Cat:#15065)充分混匀后在室温下孵育20min；
(2)用含2％FBS的PBS对孵育完的外周血按体积进行1:1稀释；
(3)在离心管中加入外周血总体积的1/3-1/2的样本密度梯度分离液(Cat：#HY2015(LTS10770015))；
(4)沿壁缓缓加入稀释好的外周血，使外周血位于分离液层之上，用1200g，Acc:1，Dec:0的速度离心20min；
(5)吸取中间的白膜层于装有4-5毫升2％FBS PBS中，按400g，5min离心一次后收获沉淀物(主要为NK细胞)，重新溶于培养基中。
(6)计数后按E:T＝2:1加入滋养细胞(Cat：#ZY-NKZ-0104(购自中赢生物，表达膜IL-21和4-1BBL，主要用于体外扩增NK细胞))，混匀后进行培养，起始培养时记为Day0。
2、19CAR-IL15慢病毒的制备
本实施例中，制备19CAR-IL15慢病毒，步骤如下：
(1)基于靶向CD19的FMC63单抗scFv序列(Genebank：HM852952.1)，设计并构建使用4-1BB共刺激因子和CD3zeta激活域的CAR结构慢病毒载体，并用Furin-T2A短肽协同表达IL15；所形成的靶向CD19的CAR-NK慢病毒载体称为19CAR-IL15，其各元件及其排列如图1；
(2)293T细胞汇合度为80-90％时进行转染，转染前2小时更换包装病毒用培养基(10％FBS Opti-MEM+1X丙酮酸钠+1X谷氨酰胺+1X HEPES)；
(3)利用常规的四质粒包装系统制备慢病毒，包括三个辅助质粒及目的质粒19CAR-IL15，加入Lipo2000等转染试剂，准备转染质粒混合物；
(4)混匀后室温孵育15-25min，沿侧壁加入293T细胞中；
(5)48小时后收集病毒上清；
(6)将上清液过滤后使用4000g离心过夜的方法进行浓缩，用NK-92MI细胞株进行病毒滴度检测；测得功能滴度结果为在0.5-1E8 TU/mL范围内，可见获得可有效转染细胞的慢病毒。
3、CAR-NK细胞的制备
本实施例中，在前述“分离健康人外周血来源的NK细胞”的基础上，制备CAR-NK细胞，步骤如下：
(1)培养至第5天(Day5)的NK细胞，离心弃上清，计数；
(2)按以下公式计算加入病毒的量：
(细胞数*MOI)/病毒滴度；
(3)按总体积1:5000的比例加入助转剂鱼精蛋白(储存浓度：50mg/mL)；
(4)将NK细胞，前述制备的19CAR-IL15慢病毒和助转剂混匀后，按每孔0.1-0.3M/200uL的体系加入96孔平底板中，1200g，37℃离心90min；
(5)离心结束后放入培养箱中培养4-6min后给细胞换液，弃去病毒液，换新鲜的NK细胞培养基。
上述过程后，获得CAR-NK细胞。
4、NK细胞培养
(1)第0天及培养至第7天(Day7)的NK细胞，进行第一次和第二次加入滋养细胞刺激，第0天的NK细胞和滋养细胞的比例是2:1(E:T＝2:1)，第7天是1:3(E:T＝1:3)。
(2)继续培养至Day10-11或其它的时间点进行功能实验(包括分选CD70+CAR-NK细胞或CD70-CAR-NK细胞后进行实验)。
实施例2、CD70高表达的CAR-NK细胞靶向杀伤能力强
1、CD70的表达水平检测
(1)从6位健康人获取NK细胞，在NK细胞分别培养至Day0，Day5，Day10，Day15时，取活率良好的NK细胞进行流式染色；
(2)离心去上清后，用2％FBS PBS洗液洗涤两遍；
(3)抗体孵育：每个样本按50uL体系算，三个抗体FITC anti-human CD3antibody(Biolegend，Cat:#317306)，PEcy7 anti-human CD56 antibody(Biolegend，Cat:#362510)，PE anti-human CD70 antibody(Biolegend，Cat:#355104)按1:200比例加入体系中，4℃避光孵育20min；
(4)离心去上清后，用洗液洗涤两遍；
(5)每个样本用200uL洗液重悬，流式上机检测。
结果如图2，共检测6位健康人样本的NK细胞CD70表达水平，发现NK细胞在培养过程中，在受到刺激(加入滋养细胞刺激培养)后CD70表达水平呈增强(CD70在体外培养中会有波动，但维持在20％以上，第10天二次刺激时达到更高水平)。
2、分选出CD70+CAR-NK细胞或CD70-CAR-NK细胞
在前述表达水平检测中检测到CD70表达水平至最高点的时间节点上，将CD70+CAR-NK细胞或CD70-CAR-NK细胞分选出来，进行下一步功能实验验证两者的功能差异。可以选择流式细胞术分选或者磁珠分选。
A.流式细胞术分选
(1)按(1)中的方法培养CAR-NK细胞至Day10；
(2)收集Day10细胞，离心弃上清后计数，用FACS buffer洗涤一遍后，按10M/mL用FACS buffer重悬，按1:200比例加入PE anti-human CD70 antibody，轻轻混匀后4℃避光孵育20min；
(3)用FACS buffer洗涤3遍；
(4)按5-10M/mL的密度用FACS buffer重悬起来，将重悬好的细胞悬液用带细胞滤网的流式管过滤；
(5)转至带盖子的无菌流式管中进行流式分选，分选出CD70+及CD70-两群细胞；
(6)重悬后上机，流式分选仪(BD FACSAria Fusion Cell Sorter)进行无菌分选，15mL离心管作收集管，分别收集分选下来的CD70+及CD70-细胞；
(7)离心弃上清后，用培养基重悬继续培养。
B.磁珠分选
(1)将加入滋养细胞二次刺激之后，培养至Day10的CAR-NK细胞收集至离心管中；
(2)离心弃培养基上清后，用无菌的分选buffer(0.5％FBS+2mM EDTA+PBS)重悬起来，计数；
(3)离心300g,10min，用分选buffer洗涤两遍；
(4)按10M/mL密度将细胞重悬起来，按照1:200比例加入Biotin anti-human CD70antibody(Biolegend,Cat:#355114)4℃避光孵育20min；
(5)孵育完成后按步骤3)方法洗涤，重复3遍；
(6)孵育磁珠：按100M/mL的总体积计算，Anti-Biotin Microbeads(Miltenyi,Cat:#130-090-485)按1:5比例加入磁珠孵育，混匀后在4℃避光孵育15分钟；
(7)按步骤3)方法洗涤，重复3遍，最后用500uL buffer将细胞重悬起来(细胞数<1*10^8，更多的细胞应当按比例增加重悬体积)，准备磁珠分选；
(8)将LS柱(Miltenyi，Cat:#130-042-401)架在分选器上(Miltenyi,Cat:#130-042-302)，用3mL的分选buffer预先润洗柱子3遍；
(9)待液体流尽后，将细胞悬液加入柱子中，待液体流尽后用3mL的分选buffer洗涤3遍，将所有流下来的细胞悬液收集起来；
(10)为提高细胞纯度，将收集起来的细胞悬液再过一次柱子，重复步骤9)，获得的流下来的细胞悬液即为CD70-细胞群；
(11)准备干净的离心管，取下LS柱，加入5mL buffer，用配套的活塞推下吸附在柱子上的细胞，即为CD70+细胞群；
(12)离心后弃上清，用NK细胞培养基重悬细胞后继续培养；
(13)Day2取细胞流式染PE anti-human CD70 antibody，上机检测CD70的表达水平，确认磁珠分选的效果。
如图3所示，通过免疫磁珠分选法，获得CD70+及CD70-的两群细胞亚群；同时，通过流式细胞术验证了分选效果能够达到预期。
3、RTCA检测CD70+细胞亚群或CD70-细胞亚群的杀伤能力差别
利用小鼠成纤维细胞株3T3构建3T3-hCD19-GFP稳转株，利用此稳转株作为靶细胞，使得此杀伤功能实验不受到CD27-CD70 signaling机制的影响，验证CD70+CAR-NK细胞能够通过内源性机制呈现更强的杀伤能力。
3T3-hCD19-GFP稳转株的建立：构建共表达人CD19和GFP的慢病毒载体，感染3T3细胞后筛选出稳定表达的克隆株；
(1)取出E-plate 16板(Agilent,Cat:#5469830001)，每孔加入50uL 37℃温育的培养基，测定基线值，确定各孔的背景本底OD值一致；
(2)按每孔铺10000cells的数量计算出所需的细胞数，离心后用37℃温育的培养基重悬，计数后调整细胞密度至0.0667M/mL；
(3)在E-plate 16板中每孔加入150uL细胞悬液，将板子放置在室温静置30min；
(4)将E-plate 16板放入培养箱中的xCELLigence RTCA仪中，检测细胞OD值；实时无标记细胞分析(RTCA)是将微电子细胞传感器芯片整合到细胞检测板的底部，以构建实时、动态、定量跟踪细胞形态和增殖分化等改变的细胞阻抗检测传感系统。
(5)当OD值长到1.0左右时，将CD70+或CD70-CAR-NK细胞离心后用37℃温育的培养基重悬，计数后调整至0.01M/mL的密度；
(6)暂停RTCA实验，取出E-plate 16板，弃掉原有的培养基，按分组每孔加入200uL调整好密度的CD70+或CD70-CAR-NK细胞，注意留好阴性对照(仅有靶细胞)；
(7)将E-plate 16板放回RTCA仪器上，继续检测OD值，以评估CD70+或CD70-CAR-NK细胞对靶细胞的杀伤功能。
结果如图4所示，通过实时细胞分析仪RTCA检测发现，CD70高表达的CAR-NK细胞靶向杀伤3T3-CD19能力显著强于CD70低表达的亚群，且该表型具有与传统的CD27-CD70signaling不同的方式。
实施例3、IFN-gamma细胞因子分泌功能实验验证CD70+CAR-NK杀伤
本实施例中，进一步分析验证CD70高表达的CAR-NK细胞靶向杀伤能力。
(1)靶细胞铺板：收集对数生长期的肿瘤细胞(Raji-CBR-GFP；CBR为click beetlered luciferase，即一种甲虫荧光素酶，可以催化荧光素底物激发红色光谱；CBR与GFP被引入到Raji细胞中)，离心后计数，按1M/mL用NK培养基重悬起来，按每孔100uL加入96孔U底板中。
(2)调整CAR％：分别收集CD70+CAR-NK细胞及CD70-CAR-NK细胞，流式染CAR％，并吹匀计数。用没有转CAR的NK细胞将CD70+及CD70-两组CAR-NK细胞的CAR％比例调成一致。
(3)效应细胞铺板：将调完CAR％的CD70+CAR-NK细胞及CD70-CAR-NK细胞分别用培养基调整成1M/mL的密度，按100uL的体积加入到96孔U底板中，每组留无肿瘤的对照孔。
(4)每孔按总体积的1:1500加入Protein transport inhibitor(BD,Cat:#554724),混匀后放至培养箱中孵育4-6小时。
(5)按流式染色的方法用FACS buffer洗涤两遍，染色表面marker抗体，APC anti-FMC63(Bioswan),PE anti-human CD70,按100uL体系1:200加入抗体避光4℃染色20min。
(6)洗涤3遍后，每孔加入100uL 4％多聚甲醛室温处理15min，同时配置1XIntracellular staining wash buffer(10X Intracellular StainingPermeabilization Wash Buffer(Biolegend,Cat:#421002)+FACS buffer＝1:9)。
(7)离心弃掉上清，用1Xperm wash buffer洗涤两遍，重悬后放冰箱中4℃过夜。
(8)离心弃上清，用1X perm wash buffer配置胞内染色体系，按1:200加入PEcy7anti-human IFN-g(Biolegend,Cat:#502528)，室温避光染色20min。
(9)用1X perm wash buffer洗涤两遍后，用200uL 1X perm wash buffer重悬起来上机检测。
结果如图5所示，CD70高表达的CAR-NK细胞杀伤肿瘤细胞更为显著，分泌IFN-gamma细胞因子显著增多。
实施例4、CD107a脱颗粒实验验证
(1)靶细胞铺板：收集对数生长期的肿瘤细胞(Raji-CBR-GFP)，离心后计数，按1M/mL用NK培养基重悬起来，按每孔100uL加入96孔U底板中。
(2)调整CAR％：分别收集CD70+CAR-NK细胞及CD70-CAR-NK细胞，流式染CAR％，并吹匀计数。用没有转CAR的NK细胞将CD70+及CD70-两组CAR-NK细胞的CAR％比例调成一致。
(3)效应细胞铺板：将调完CAR％的CD70+CAR-NK细胞及CD70-CAR-NK细胞用培养基分别调整成1M/mL的密度，按100uL的体积加入到96孔U底板中，每组留无肿瘤的对照孔。
(4)每孔按总体积的1:1500加入Protein transport inhibitor(BD,Cat:#554724)，按总体积的1:200加入PEcy7 anti-human CD107a antibody(Biolegend,Cat:#328618)混匀后放至培养箱中孵育4-6小时。
(5)按流式染色的方法用FACS buffer洗涤两遍，染色表面marker抗体，APC anti-FMC63(Bioswan),PE anti-human CD70,按100uL体系1:200加入抗体避光4℃染色20min。
(6)用FACS buffer洗涤两遍后，用200uL FACS buffer重悬起来上机检测。
如图6所示，CD107a分子作为NK细胞脱颗粒的一种敏感标志，是NK细胞杀伤肿瘤的能力评价指标之一。
结果显示，CD70高表达的CAR-NK细胞杀伤肿瘤细胞，脱颗粒功能显著增加。
实施例5、CD27敲除的Raji细胞验证CD70高表达的CAR-NK细胞增强的肿瘤杀伤功能
(1)CD27敲除的肿瘤细胞株Raji-CD27KO的构建：收集对数生长期的肿瘤细胞(Raji-CBR-GFP)，离心后计数，使用电转仪Lonza 4D-Nucleofector转入重组S.pyogenesCRISPR-Cas9蛋白(Invitrogen，货号A36499)和gRNA(AGUAGCUGAGAGCCCCACCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUA AAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU UUU(SEQID NO:1))对CD27进行敲除。敲除后，挑取单克隆细胞建立稳定的细胞株，通过流式细胞术鉴定CD27的缺失表达。
(2)调整CAR％：分别收集CD70+CAR-NK细胞及CD70-CAR-NK细胞，流式染CAR％，并吹匀计数。用没有转CAR的NK细胞将CD70+及CD70-两组CAR-NK细胞的CAR％比例调成一致。
(3)效应细胞和Raji-CD27KO铺板：将调完CAR％的CD70+CAR-NK细胞及CD70-CAR-NK细胞分别用培养基调整成1M/mL的密度，按100uL的体积加入到96孔U底板中，每组按效靶比(1:8)的比例加入Raji-CD27KO，混匀后放至培养箱中孵育4-6小时。
(4)按流式染色的方法用FACS buffer洗涤两遍，用200uL FACS buffer重悬起来上机检测GFP的表达，通过统计GFP标记的Raji-CD27KO残留数量计算杀伤比例。
结果如图7所示，通过构建CD27敲除的肿瘤细胞株Raji-CD27KO，CD70高表达的CAR-NK的杀伤功能要显著优于CD70低表达组，说明其机制不依赖CD70/CD27的结合。
实施例6、动物模型验证CD70+CAR-NK体内抗肿瘤效果
(1)如图8所示的体内模型流程图，将带荧光底物的淋巴瘤细胞株JeKo-1-CBR-GFP(CBR与GFP被引入到JeKo-1细胞中)尾静脉注射至重度免疫缺陷小鼠(NSG)体内：
(a)收集对数生长期的JeKo-1-CBR-GFP离心去上清；
(b)用不带血清的生理盐水洗涤两遍，确保无血清残留；
(c)计数，用生理盐水将密度调至0.0333M/mL,准备注射；
(d)按每只小鼠300uL体积(即每只小鼠注射10000cells)尾静脉注射肿瘤细胞建模，留2只小鼠不作处理作为空白对照；
(2)48小时后进行小动物活体成像，根据成像结果评估成瘤情况并进行分组，具体分组如下：
(a)NT-NK组：注射未转CAR的普通NK细胞(3只动物)；
(b)19CAR-IL15 WT组：注射未经分选的CAR-NK细胞(5只动物)；
(c)19CAR-IL15 70+组：注射CD70+CAR-NK细胞(5只动物)；
(d)Blank组：未经任何处理；
以上分组中，注射的效应细胞量与靶细胞比值均为5:1；
(3)成瘤第3天注射NK细胞：
(a)收集生长对数期的NK细胞，流式染CAR％，将WT/CD70+CAR-NK细胞的CAR％均调成一致；
(b)用不带血清的生理盐水洗涤两遍，确保无血清残留；
(c)计数，用生理盐水将密度调至0.0333M/mL，准备注射；
(d)按照(2)中的分组，按每只小鼠300uL体积尾静脉注射对应的NT-NK/CAR-NK细胞；
(4)注射NK/CAR-NK细胞成瘤的第一周进行两次活体成像，评估肿瘤进展情况；以后每周一次成像，评估肿瘤进展情况；
(5)并且根据肿瘤负荷及小鼠生存情况统计生存曲线。
不同的荷瘤时间，小鼠活体成像评估肿瘤负荷如图9所示，可见随着荷瘤时间的增加，NT-NK组在较早的时间出现动物死亡(“X”表示死亡)；19CAR-IL15WT组有一定的抑瘤作用，但是动物也呈现逐渐死亡，至第88天全部死亡；而19CAR-IL15 70+组抑瘤作用最佳，动物可以维持较长时间的生存，至第88条出现一只动物的死亡。
检测小鼠体内肿瘤荧光值的结果如图10所示，可见随着荷瘤时间的增加，NT-NK组荧光值提升很快；19CAR-IL15 WT组其次；而19CAR-IL15 70+组抑瘤作用最佳，动物体内荧光值最低。
小鼠生存曲线结果如图11所示，NT-NK组存活率最低；19CAR-IL15 WT组其次；而19CAR-IL15 70+组存活率高。
因此，使用淋巴瘤细胞JeKo-1建立荷瘤小鼠模型，通过磁珠分选出CD70高表达CAR-NK细胞和未经分选的CAR-NK细胞进行分组治疗淋巴瘤荷瘤小鼠。相比较显示，CD70高表达的CAR-NK细胞显著减少肿瘤负担，并延长小鼠的生存期。
实施例7、RNA测序分析CD70+CAR-NK及CD70-CAR-NK细胞基因表达水平变化
本实施例中，通过RNA测序分析对比CD70+CAR-NK及CD70-CAR-NK细胞两者基因表达水平上的差别。
(1)三名健康人外周血抽血分离NK，按(1)中的方法培养CAR-NK细胞至Day10；
(2)收集Day10细胞，离心弃上清后计数，用FACS buffer洗涤一遍后，按10M/mL用FACS buffer重悬，按1:200比例加入PE anti-human CD70 antibody，轻轻混匀后4℃避光孵育20min；
(3)用FACS buffer洗涤3遍；
(4)按5-10M/mL的密度用FACS buffer重悬起来，将重悬好的细胞悬液用带细胞滤网的流式管过滤；
(5)转至带盖的无菌流式管中进行流式分选，分选出CD70+及CD70-两群细胞；
(6)将分选完收集管内的细胞液离心后，弃上清，加入1mL TRIzol混匀，将样本冻至-80℃后送样至杭州联川生物技术股份有限公司进行后续的测序分析。
夹山图对比CD70+及CD70-细胞两者基因表达水平上的差别如图12所示。通过夹山图呈现的分析结果，可见基因表达水平变化在整个信号通路上显示出的活化差别。如图13，通过RNA测序分析，CD70高表达的CAR-NK亚群会显著富集表达炎性反应相关的基因。
实施例8、质谱流式法分析CD70高表达的CAR-NK亚群会对于NK细胞的活化型受体表达的调节作用
(1)三名健康人外周血抽血分离NK，按(1)中的方法培养CAR-NK细胞至Day10；
(2)收集Day10细胞，离心后计数，取1.5M细胞用培养基重悬；
(3)设计的质谱流式抗体panel如表1，CD70+及CD70-根据流式染色结果进行圈门及分群分。
表1：质谱流式抗体panel信息
List Metal-Tag Marker Clone Source
1 89Y CD45 HI30 BioLegend
2 115In CD3 UCHT1 BioXcell
3 141Pr CD56 NCAM16.2 BD
4 142Nd CD159c(NKG2C) 134522 RD
5 143Nd CD336(NKp44) P44-8 BioLegend
6 144Nd CD134(OX4O) Ber-ACT35 BioLegend
7 145Nd CD158b1/b2/j(KIR2DL2/L3/S2) GL183 Beckman Coulter
8 146Nd CD226(DNAM1) DX11 BD
9 147Sm CD335(NKp46) 9E2 BioLegend
10 148Nd TIGIT(VSTM3) A15153G BioLegend
11 149Sm CD158E1(KIR3DL1/NKB1) DX9 BD
12 150Nd CD159a(NKG2A) 131411 RD
13 151Eu CD158I(KIR2DS4) 179315 RD
14 152Sm CD27 0323 Biolegend
15 153Eu CD337(NKp30) P30-15 BioLegend
16 154Sm CD70 113-16 BioLegend
17 155Gd KLRG1(MAFA) SA231A2 BioLegend
18 156Gd CD314(NKG2D) 1D11 BioLegend
19 157Gd CD71 CY1G4 BioLegend
20 158Gd CD244(2B4) C1.7 Biolegend
21 159Tb CD16 HP-3G10 BioLegend
22 160Gd CD186(CXCR6) 56811 RD
23 161Dy CX3CR1 K0124E1 BioLegend
24 162Dy CD158f(K1R2DL5) UP-R1 Novus Biologicals
25 163Dy CD137(4-1BB) 4B4-1 BioLegend
26 164Dy TCF1(TCF7) 7F11A10 BioLegend
27 165Ho CD161 4G7 BioLegend
28 166Er CD98 UM7F8 BD
29 167Er GlucoseTransporter GLUT1 EPR3915 Abcam
30 168Er T-bet 4B10 BioLegend
31 169Tm CD94 HP-3D9 BD
32 170Er CD57 HNK-1 BioLegend
33 171Yb EOMES 644730 RD
34 172Yb CD62L DREG-56 BioLegend
35 173Yb CD69 FN50 BioLegend
36 174Yb CD223(LAG-3) 874501 RD
37 175Lu Ki-67 SolA15 Thermo
38 176Yb HLA-DR L243 BioLegend
如图14，通过质谱流式法进一步发现，CD70高表达的CAR-NK亚群会显著上调NK细胞的活化型受体(2B4、4_1BB等为此类受体)表达。
实施例9、CD70+CAR-NK细胞及CD70-CAR-NK细胞的线粒体功能分析
1、MitoTracker探针染色
(1)收集培养至Day10，对数生长期的CAR-NK细胞；
(2)离心去除上清，计数后按0.25M/mL密度用培养基重悬；
(3)按10nM浓度加入MitoTracker Deep Red染料(Invitrogen,Cat:#M22426),轻轻混匀；
(4)37℃培养箱中避光孵育15min；
(5)用FACS buffer洗涤两遍后，按正常流式染色方法染PE-CD70 antibody后上机检测。
2、TMRM染色
MitoTracker染色当天同时进行TMRM染色：
(1)收集培养至Day10，对数生长期的CAR-NK细胞；
(2)离心去除上清，计数后按0.1M/mL密度用培养基重悬
(3)加入Image-iTTM TMRM试剂(invitrogen,Cat:#I34361)(1:1000加入培养基中:100nM)；
(4)37℃培养箱中避光孵育30min；
(5)用FACS buffer洗涤两遍后，按正常流式染色方法染PE-CD70 antibody后上机检测。
结果如图15所示，对两者的线粒体功能进行分析，CD70高表达的CAR-NK细胞线粒体数量增多(左图)，TMRM染色检测线粒体膜电位处于活跃状态(右图)。说明CD70+CAR-NK细胞的线粒体功能及活性优于CD70-CAR-NK细胞。
实施例10、去甲基化药物如地西他滨可以提高CAR-NK细胞的CD70表达
本实施例中，验证可以提高CAR-NK细胞的CD70表达的药物。
(1)三名健康人外周血抽血分离NK，按(1)中的方法培养CAR-NK细胞至Day10
(2)收集Day10细胞，按照(3)中的方法分选出CD70阴性的CAR-NK细胞
(3)分别加入1nM，10nM，100nM和1000nM的地西他滨(Sigma，货号A3656)至培养基中混匀后放至培养箱中孵育24小时
(4)之后，第1至6天按(2)中的方法检测CAR-NK细胞的CD70表达。
如图16所示，去甲基化药物可显著提高CAR-NK细胞的CD70表达。
实施例11、构建靶向胃癌抗原CLDN18.2的CAR-NK细胞，以及CD70+亚群和CD70-亚群的CAR-NK细胞靶向杀伤MKN45-CLDN18.2的能力比较
(1)基于靶向胃癌抗原CLDN18.2的IMAB362单抗scFv序列(专利US 2015/0157711A1)，设计并构建使用CD28共刺激因子和CD3zeta激活域的CAR结构慢病毒载体，并用Furin-T2A短肽协同表达IL15，其各元件及其排列如图17(上)；
(2)慢病毒载体以及CAR-NK细胞的制备同前；
(3)胃癌细胞系MKN45-CLDN18.2稳转株的建立：构建共表达人CLDN18.2的慢病毒载体，感染MKN45细胞后筛选出稳定表达的克隆株；
(4)通过流式细胞术分选出CD70+亚群和CD70-亚群的CAR-NK细胞，在xCELLigenceRTCA仪中，评估CD70+或CD70-CAR-NK细胞亚群对靶细胞MKN-45-CLDN18.2的杀伤功能。
结果如图17(下)所示，通过实时细胞分析仪RTCA检测发现，CD70高表达的CAR-NK细胞靶向杀伤MKN45-CLDN18.2能力显著强于CD70低表达的亚群。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。

Claims (15)

1.一种提高嵌合抗原受体-NK细胞的靶细胞杀伤效率的方法，包括：
(1)提供嵌合抗原受体-NK细胞；
(2)从(1)的细胞中富集表达CD70的嵌合抗原受体-NK细胞；或，处理或改造(1)的嵌合抗原受体-NK细胞使之表达CD70。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中，所述的嵌合抗原受体-NK细胞通过在NK细胞上表达嵌合抗原受体获得；
较佳地，所述NK细胞包括：(a)分离自外周血的NK细胞；(b)(a)细胞的经培养的细胞；或(c)(a)或(b)细胞的经传代的细胞；
较佳地，所述NK细胞包括：天然的NK细胞，或经基因工程修饰或改造的NK细胞。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的嵌合抗原受体靶向于所述靶细胞上的抗原，所述靶细胞包括异常增殖细胞；
较佳地，所述异常增殖细胞包括肿瘤细胞，所述抗原为肿瘤相关抗原；
较佳地，所述肿瘤相关抗原为肿瘤细胞特异性表达抗原；或为肿瘤细胞高表达、正常细胞低表达或不表达的抗原；
较佳地，所述抗原包括：CLDN18.2、CD19，CD5、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、CD34、CD37、CD38、CD43、CD72a、CD78、CD79a、CD79b、CD86、CD134、CD137、CD138、CD319、GPC3、CD32b、CD171、CS-1、CLL-1、BCMA、GD2、GD3、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、IL-13Ra2、Mesothelin、Her2、MUC1、EGFR、CLDN6、DLL3、NY-ESO-1、WT1、Nectin-4、GPC3、PDL1、NKG2DL以及以上抗原的任意组合；
较佳地，所述肿瘤包括实体瘤和非实体瘤；较佳地包括：非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、骨髓瘤、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、肝癌、肺癌、胃癌、食道癌、肠癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、脑胶质瘤、宫颈癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、肉瘤。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，(1)中，所述嵌合抗原受体-NK细胞的制备方法包括：
(i)培养NK细胞；
(ii)在起始培养的第3-7天转染编码CAR的多核苷酸；
(iii)在起始培养的第5-15天、且在步骤(ii)之后，进行步骤(2)；
较佳地，在培养过程中进行1-5次的刺激；较佳地，在起始培养的第0.1-2天进行刺激；在培养的第5-9天再次进行刺激。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述CAR-NK细胞靶向表达CD19抗原的肿瘤细胞；较佳地：
CAR中，胞外结合区为结合CD19抗原的scFv，较佳地为FMC63单抗scFv序列；和/或
CAR中，包括4-1BB共刺激因子和CD3zeta激活域；和/或
CAR中，所述4-1BB共刺激因子和CD3zeta激活域与IL-15协同表达；较佳地，以Furin-T2A短肽连接以形成所述协同表达；和/或
CAR的表达元件被克隆于慢病毒载体中，引入到NK细胞中，实现CAR的表达，获得CAR-NK细胞。
6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述CAR-NK细胞靶向表达CLDN18.2抗原的肿瘤细胞；较佳地：
CAR中，胞外结合区为结合CLDN18.2抗原的scFv，较佳地为IMAB362单抗scFv序列；和/或
CAR中，包括CD28共刺激因子和CD3zeta激活域；和/或
CAR中，所述CD28共刺激因子和CD3zeta激活域与IL-15协同表达；较佳地，以Furin-T2A短肽连接以形成所述协同表达；和/或
CAR的表达元件被克隆于慢病毒载体中，引入到NK细胞中，实现CAR的表达，获得CAR-NK细胞。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(2)中，从(1)的细胞中富集CD70高表达的嵌合抗原受体-NK细胞包括：对嵌合抗原受体-NK细胞进行分选、分离或纯化，从而富集CD70高表达的嵌合抗原受体-NK细胞；
较佳地，利用特异性抗CD70的抗体进行所述的分选、分离或纯化；
更佳地，利用包括以下方法进行所述的分选、分离或纯化：流式细胞法、固相载体分离法；较佳地，所述固相载体分离法包括但不限于：柱纯化/分选法，磁珠纯化/分选法。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(2)中，所述处理(1)的嵌合抗原受体-NK细胞使之表达CD70包括：以去甲基化药物处理所述嵌合抗原受体-NK细胞；较佳地，所述去甲基化药物包括：5-氮杂-2-脱氧胞苷，5-阿扎胞苷。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述去甲基化药物包括：5-氮杂-2-脱氧胞苷；所述5-氮杂-2-脱氧胞苷处理细胞的浓度为25nM～10uM；较佳地为50nM～5M。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(2)中，所述改造(1)的嵌合抗原受体-NK细胞使之表达CD70包括：将编码CD70的多核苷酸引入到嵌合抗原受体-NK细胞中，从而使之表达CD70；较佳地，所述编码CD70的多核苷酸被装载于表达盒中，所述表达盒包括操作性连接的：启动子、编码CD70的多核苷酸和终止子；较佳地，所述表达盒存在于表达构建体中。
11.一种靶细胞杀伤效率提高的嵌合抗原受体-NK细胞，其表达CD70；
较佳地，所述细胞由权利要求1～10任一所述的方法制备获得；
较佳地，所述细胞具有选自下组的特征：IFN-gamma细胞因子水平显著提高，脱颗粒水平显著提高，炎症基因显著富集，活化型受体表达显著提高，线粒体数量增多，线粒体膜电位活跃。
12.权利要求1～10任一所述的方法或权利要求11所述的细胞在制备杀伤靶细胞的药物组合物中的应用；较佳地，所述靶细胞包括异常增殖细胞；
较佳地，所述异常增殖细胞包括肿瘤细胞，所述抗原为肿瘤相关抗原；
较佳地，所述肿瘤相关抗原为肿瘤细胞特异性表达抗原；或为肿瘤细胞高表达、正常细胞低表达或不表达的抗原；
较佳地，所述抗原包括：CLDN18.2、CD19，CD5、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、CD34、CD37、CD38、CD43、CD72a、CD78、CD79a、CD79b、CD86、CD134、CD137、CD138、CD319、GPC3、CD32b、CD171、CS-1、CLL-1、BCMA、GD2、GD3、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、IL-13Ra2、Mesothelin、Her2、MUC1、EGFR、CLDN6、DLL3、NY-ESO-1、WT1、Nectin-4、GPC3、PDL1、NKG2DL以及以上抗原的任意组合；
较佳地，所述肿瘤包括实体瘤和非实体瘤；较佳地包括：非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、骨髓瘤、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、肝癌、肺癌、胃癌、食道癌、肠癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、脑胶质瘤、宫颈癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、肉瘤。
13.一种药物组合物，其中包括：
权利要求11所述的靶细胞杀伤效率提高的嵌合抗原受体-NK细胞；以及，
药学上可将接受的载体或赋形剂。
14.一种药盒或包装，其中包括：
权利要求11所述的靶细胞杀伤效率提高的嵌合抗原受体-NK细胞；或
权利要求13所述的药物组合物。
15.特异性识别或结合CD70的试剂的应用，用于富集靶细胞杀伤效率提高的、表达CD70的嵌合抗原受体-NK细胞。
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