CN115243728A - 工程化自然杀伤细胞以靶向cd70阳性肿瘤的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开内容的实施方案包括与用特异性工程化以结合CD70抗原的NK细胞靶向表达CD70的细胞相关的方法和组合物。在特定实施方案中，被操纵以表达靶向CD70的工程化受体(例如CAR)的NK细胞被用于靶向表达CD70的癌症。在某些实施方案中，表达靶向CD70的CAR的载体还表达特定的自杀基因和/或一种或多种特定的细胞因子。

Description

工程化自然杀伤细胞以靶向CD70阳性肿瘤的方法
本申请要求于2020年1月8日提交的美国临时专利申请序列号62/958563的优先权，该申请的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开内容的实施方案至少包括细胞生物学、分子生物学、免疫学和医学(包括癌症医学)领域。
背景技术
针对过继性癌症免疫疗法的自然杀伤(NK)细胞的基因重编程具有临床相关的应用和益处，例如1)先天性抗肿瘤监测而无需事先致敏；2)同种异体功效而无移植物抗宿主反应性；以及3)靶肿瘤的直接细胞介导的细胞毒性和细胞溶解。人类NK细胞发育和自身耐受性、同种异体反应性以及效应功能的获取是许可、校准和武装的适应性过程。在分子水平下，特异性活化和抑制性受体通过将胞外信号聚集、平衡并整合至不同效应功能内来指导NK细胞功能。NK细胞的功能活性和对外来刺激的反应性遵循持续教育的“变阻器”模型并因此可重编程。基因修饰NK细胞以重定向其效应功能是利用其细胞毒性能力杀伤肿瘤细胞的有效方法。
本公开内容涉及针对分化簇(CD70)阳性癌症的细胞疗法和过继细胞疗法的改善。
发明内容
本公开内容的实施方案包含与靶向CD70(也称为CD27配体，例如，CD27LG和TNFSF7)的工程化细胞受体相关的方法和组合物。在特定实施方案中，靶向CD70的工程化受体呈多核苷酸、多肽的形式，或包含在任何种类的细胞(包括免疫细胞)的表面上。在特定情况下，细胞是免疫细胞，以及在某些实施方案中，所述免疫细胞是NK细胞、NK T细胞、不变NKT细胞、γδT细胞、调节性T细胞、B细胞、巨噬细胞、间充质基质细胞(MSC)、树突状细胞，以及来自任何来源等等。在某些实施方案中，包含来自脐带血的重编程NK细胞(CB-NK)以靶向表达CD70分子的肿瘤。
使用CD70作为方法和组合物的靶抗原，因为其表达于许多癌症上，例如，包括急性髓性白血病(AML)、淋巴瘤、肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、胶质母细胞瘤、间皮瘤、头颈癌、肾癌、多发性骨髓瘤和胰腺肿瘤。CD70在正常组织中的表达仅限于T细胞和树突状细胞(DC)的亚集。
本公开内容的实施方案包含并入异源融合至一个或多个信号传导结构域(包括，例如，包含CD247(也称为CD3ζ)以及CD28、DAP10、DAP12和NKG2D中的一个或多个的细胞质部分的那些)的CD70 scFv的各种新颖、特异性CAR构建体。在一些情况下，该scFv可包含衍生自对人类CD70抗原具有特异性的鼠抗体的重链(VH)和轻链(VL)的可变片段的融合物。载体还可包含一种或多种细胞因子基因，包括产生人类白介素15(IL-15)、IL-2、IL-21、IL-12、IL-7和/或IL-18的基因，其有助于NK细胞的存活和维持。作为一个实例，如此经修饰的CB-NK细胞包含编码CAR中CD70 scFv的载体，其除作为与CAR分离的分子产生的IL15之外，还包括CD28和CD3z。
尽管在一些实施方案中，所述方法和组合物是用于治疗患有CD70阳性癌症的个体，但在其他情况下，所述方法和组合物是用于消融表达CD70的(非癌性)免疫调节细胞，例如调节性T细胞(Treg)作为检查点。在特定实施方案中，提供靶向个体中表达CD70的非癌性细胞的方法，所述方法包括向所述个体递送有效量的CD70 CAR-表达细胞。
本公开内容的特定实施方案允许使用现成免疫细胞，包括至少相对于接受者个体为同种异体、靶向任何种类的CD70阳性细胞，以及还可经转导或可未经转导以表达一种或多种细胞因子(例如IL15、IL-2、IL21、IL-12、IL-7和/或IL-18)的NK细胞。
在本公开内容的特定实施方案中，免疫细胞中一种或多种内源基因的表达已被修饰，例如在表达方面所述表达可被部分或完全降低。尽管该修饰可通过任何方式发生，但在特定实施方案中，所述一种或多种基因的表达已经被修饰，例如通过降低表达水平修饰，并且这可通过任何合适的方式(包括至少CRISPR)发生。仅作为实例，内源基因可选自NKG2A、SIGLEC-7、LAG3、TIM3、CISH、FOXO1、TGFBR2、TIGIT、CD96、ADORA2、NR3C1、PD1、PDL-1、PDL-2、CD47、SIRPA、SHIP1、ADAM17、RPS6、4EBP1、CD25、CD40、IL21R、ICAM1、CD95、CD80、CD86、IL10R、CD5、CD7、CTLA-4、TDAG8、CD38及其组合。
在一个实施方案中，提供了表达构建体，其包含编码CD70特异性工程化受体和编码以下中的一种或两种的序列：(a)自杀基因；和(b)细胞因子。在特定情况下，CD70特异性工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体。CD70特异性CAR可包含具有重链和轻链的scFv，并且其中编码所述CAR的序列中的重链在5′至3′方向上在所述轻链的上游。在其他情况下，CD70特异性CAR包含具有重链和轻链的scFv，并且其中编码所述CAR的序列中的重链在5′至3′方向上在所述轻链的下游。在本文的任何情况下，CD70特异性CAR包含或不包含密码子优化的scFv。在本文的任何情况下，CD70特异性CAR包含或不包含人源化scFv。在本文的任何情况下，CD70特异性CAR包含或不包含信号传导肽，例如来自CD8α、Ig重链或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体或衍生自一种或多种其他表面受体的信号肽。在特定实施方案中，CD70特异性CAR包含一个或多个共刺激结构域，例如选自以下的一个或多个共刺激结构域：CD28、CD27、OX-40(CD134)、DAP10、DAP12、4-1BB(CD137)、CD40L、2B4、DNAM、CS1、CD48、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80，或其组合。
任何CD70特异性CAR可包含或可不包含CD3ζ和/或在scFv和跨膜结构域之间的铰链。在特定情况下，铰链是CD8-α铰链，所述铰链包含含有Gly3的人工间隔子，或所述铰链包含IgG的CH1、CH2和/或CH3结构域。在特定实施方案中，细胞因子是IL-15、IL-12、IL-2、IL-18、IL-21、IL-7或其组合。在其中使用自杀基因的情况下，该自杀基因可以是突变体TNF-α(例如工程化不可分泌突变体)、诱导型胱天蛋白酶9、HSV-胸苷激酶、CD19、CD20、CD52或EGFRv3。
本公开内容的实施方案包括表达构建体，该表达构建体包含以下中的一个或多个：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13。
本公开内容的实施方案包括任何种类的免疫细胞，该免疫细胞包含本文包含的任何表达。在特定实施方案中，该免疫细胞是NK细胞、T细胞、γδT细胞、不变NKT(iNKT)细胞、B细胞、巨噬细胞、MSC或树突状细胞。在其中该免疫细胞是NK细胞的情况下，该NK细胞可衍生自脐带血、外周血、诱导多能干细胞、骨髓或来自细胞系。在特定方面，该NK细胞系是NK-92细胞系或衍生自肿瘤或来自健康NK细胞或祖细胞的另一种NK细胞系。
在特定实施方案中，免疫细胞是NK细胞，例如衍生自脐带血，例如来自脐带血单核细胞。在特定情况下，该NK细胞可以是CD56+NK细胞。该NK细胞可表达一种或多种外源提供的细胞因子，例如IL-15、IL-2、IL-12、IL-18、IL-21、IL-7或其组合。特定实施方案包括本公开内容的任何种类的免疫细胞的群体，并且该细胞可存在于合适的介质或任何种类的合适的承载体中。
在一个实施方案中，提供杀伤个体的CD70阳性细胞的方法，该方法包括向个体施用有效量的携带本公开内容包含的任何表达构建体的细胞的步骤。在特定实施方案中，所述细胞是NK细胞、T细胞、γδT细胞、不变NKT(iNKT)细胞、B细胞、巨噬细胞、γδT细胞或树突状细胞。NK细胞可衍生自脐带血、外周血、诱导多能干细胞、骨髓或来自细胞系。NK细胞可衍生自脐带血单核细胞。在一些情况下，CD70阳性细胞不是癌细胞，尽管在其他情况下，其是癌细胞。CD70阳性细胞可以是调节性T细胞。在特定实施方案中，所述个体患有急性髓性白血病、淋巴瘤、肺癌、肾癌、膀胱癌、黑色素瘤、胶质母细胞瘤、乳腺癌、头颈癌、间皮瘤，或其组合。所述细胞相对于所述个体(可以是人类或可以不是人类)可以是同种异体或自体的。所述细胞可通过注射，静脉内，动脉内，腹腔内，气管内，肿瘤内，肌肉内，内窥镜下，病灶内，颅内，经皮，皮下，局部，通过灌注，在肿瘤微环境中，或其组合施用至所述个体。
在方法的特定实施方案中，可向所述个体施用所述细胞一次或多于一次。向所述个体施用所述细胞之间的持续时间可以是1-24小时、1-7天、1-4周、1-12个月，或1年或多年。所述方法可进一步包括向所述个体提供有效量的另外的疗法(例如手术、放射、基因疗法、免疫疗法和/或激素疗法)的步骤。在一些情况下，所述另外的疗法可包含一种或多种抗体或基于抗体的药剂。在方法的一些方面，其可进一步包括鉴定所述个体的CD70阳性细胞的步骤。
在特定实施方案中，提供一种物质组合物，其包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQID NO:13的序列。
特别考虑关于本发明的一个实施方案讨论的任何限制可适用于本发明的任何其他实施方案。此外，本发明的任何组合物可用于本发明的任何方法中，并且本发明的任何方法可用于产生或利用本发明的任何组合物。实施例中阐述的实施方案的方面也是可在不同实施例的其他地方或申请的其他地方(例如在发明内容、发明详述、权利要求和附图简述)讨论的实施方案的上下文中实施的实施方案。
上文已相当广泛地概述了本公开内容的特征和技术优势使得可更好地了解以下发明详述。下文中将描述形成本文权利要求的主题的另外特征和优势。本领域技术人员应了解公开的概念和特定实施方案可容易用作修饰或设计进行本发明设计的相同目的的其他结构的基础。本领域技术人员还应了解此类等同构筑不背离如所附权利要求中阐述的精神和范围。当结合所附附图考虑时，从下列描述将更好地了解据信为本文公开的设计的特性的新特征(关于组织和操作方法)以及其他目标和优势。然而，应明确理解，提供每幅图仅出于阐述和描述的目的并且不旨在作为本公开内容的限制的定义。
附图简述
为了更完整地了解本公开内容，参考以下结合附图的描述。
图1显示以下密码子优化CD70 CAR载体的质粒图谱的实例：CO CAR.CD7042D12.VLVH.IgG1.CD28.CD3z-2A-IL15。
图2提供了CO CAR.CD70 42D12 VHVL.IgG1.CD28.CD3z-2A-IL15载体的质粒载体图谱的实例。
图3示出了CAR.CD70 42D12 VLVH.IgG1.CD28.CD3z-2A-IL15的质粒载体图谱。
图4提供了CAR.CD70 42D12 VHVL.IgG1.CD28.CD3z-2A-IL15的图谱。
图5A显示NK细胞中的高效转导CD70 CAR。y轴自顶部至底部读为105、104、103、0以及-103，x轴自左至右读为-103、0、103、104以及105。图5B显示CD70抗原在多种急性髓性白血病(AML)细胞系上的表达。
图6提供了证实经CAR.CD70/IL15转导的NK细胞的更优抗肿瘤效应功能的功能分析。NK细胞经扩增，未经转导(NT)或经CAR CD70/IL15转导并且针对两种AML细胞系(MOLM13和MOLM14)测试其体外活性。与NT NK细胞相比，经CAR CD70/IL15转导的NK细胞响应于靶标分泌更多IFN-g、TNFa以及CD107a脱颗粒。Y轴自顶部至底部读为105、104、103、0以及-103，x轴自左至右读为-103、0、103、104以及105。
图7显示如通过膜联蛋白V测定评估的CAR.CD70 NK细胞对AML靶标的更大杀伤。NK细胞经扩增，未经转导(NT)或经CAR CD70/IL15转导并且针对三种AML细胞系(THP-1、MOLM14和MOLM13)测试其体外杀伤活性。与NT NK细胞相比，如通过活/死和膜联蛋白V染色测量的，经CAR CD70/IL15转导的NK细胞杀伤更大比例的白血病靶标。Y轴自顶部至底部读为105、104、103、0和-103，x轴自左至右读为-103、0、103、104和105。
图8显示如通过铬释放测定评估的CAR.CD70 NK细胞对AML靶标的更大杀伤。NK细胞经扩增，未经转导(NT)或经CAR CD70/IL15转导并且针对两种AML细胞系(THP-1和MOLM13)测试其体外杀伤活性。与NT NK细胞相比，如通过51铬释放测定测量的，经CARCD70/IL15转导的NK细胞杀伤更大比例的白血病靶标。
图9显示各种肺癌细胞系上的CD70表达。X轴自左至右读为-103、0、103、104和105。
图10A-10B证实与未经转导(NT)和经IL15转导的NK细胞相比，CAR.70NK细胞针对肺癌发挥更大的细胞毒性。NK细胞经扩增，未经转导(NT)或经IL15(IL15)或经CAR CD70/IL15(CD70 CAR)转导并且针对不同的肺癌细胞系测试其体外活性。与经IL-15转导或NT NK细胞相比，经CAR CD70/IL15转导的NK细胞响应于靶标分泌更多IFN-g、TNFa以及CD107a脱颗粒。Y轴自顶部至底部读为105、104、103、0和-103，x轴自左至右读为-103、0、103、104和105。
图11显示如通过膜联蛋白V染色评估的，与未经转导(NT)和经IL15转导的NK细胞相比，CAR.70NK细胞针对肺癌发挥更大的细胞毒性。NK细胞经扩增，未经转导(NT)或经CARCD70/IL15转导并且针对肺癌细胞系测试其体外杀伤活性。如通过活/死和膜联蛋白V染色测量的，与NT NK细胞或IL15 NK细胞相比，经CAR CD70/IL15转导的NK细胞杀伤更大比例的肺癌靶标。Y轴自顶部至底部读为105、104、103、0和-103，x轴自左至右读为-103、0、103、104和105。
图12显示如通过胱天蛋白酶表达(彩色版本中的绿色)在肺癌细胞系球状体中评估的与未经转导(NT)和经IL15转导的NK细胞相比，CAR.70NK细胞针对肺癌细胞系发挥更大的细胞毒性。
图13证实了如通过使用
Figure BDA0003833433700000081
测定的绿色信号(胱天蛋白酶，彩色版本中的绿色)的测量评估的与未经转导(NT)和经IL15转导的NK细胞相比，CAR.70NK细胞针对肺癌细胞系发挥更大的细胞毒性。
图14提供了如通过使用
Figure BDA0003833433700000082
测定的绿色信号(胱天蛋白酶，以彩色版本)的测量评估的与未经转导(NT)和经IL15转导的NK细胞相比，CAR.70NK细胞针对肺癌发挥更大的细胞毒性。
图15显示关于CD70在肿瘤细胞上的表达的癌症基因组图谱(TCGA)资料。
图16A-16B显示CBNK细胞中的CD70 CAR转导效率和CD70在各种AML靶标中的表达。(图16A)当与未经转导的细胞相比时，CD70 CAR以98％的转导效率在CBNK细胞中成功转导。Y轴自顶部至底部读为105、104、103、0和-103，x轴自左至右读为-103、0、103、104和105。(图16B)CD70在各种AML靶标的表面表达。X轴自左至右读为-103、0、103、104和105。
图17显示当与Molm13和Molm14细胞共培养时，CBNK CD70CAR细胞中的胞内细胞因子和脱颗粒标志物表达。当与Molm13(左)和Molm14(右)共培养时，未经转导(NT)的细胞和经CD70 CAR转导的CBNK细胞关于干扰素γ和肿瘤坏死因子α分泌和脱颗粒标志物CD107a表达的比较。Y轴自顶部至底部读为105、104、103、0和-103，x轴自左至右读为-103、0、103、104和105。
图18显示膜联蛋白V染色以在与CBNK CD70 CAR细胞共培养后评估AML靶细胞的凋亡。膜联蛋白V-LIVE/DEADTM可固定Aqua染色测定显示THP-1、Molm13和Molm14细胞的未经转导(NT)的细胞和经CD70 CAR转导的CBNK细胞的比较。Y轴自顶部至底部读为105、104、103、0和-103，x轴自左至右读为-103、0、103、104和105。
图19显示铬释放测定以评估CBNK CD70 CAR针对AML靶细胞的细胞毒性活性。如通过铬释放测定显示，提供未经转导(NT)的细胞和经CD70 CAR转导的CBNK细胞关于THP-1(左)和Molm13(右)细胞的细胞毒性水平的比较。
图20A-20B显示当与CBNK CD70 CAR细胞共培养时，对THP-1和OCI-AML3细胞的
Figure BDA0003833433700000091
细胞毒性测定。如通过
Figure BDA0003833433700000092
测定显示，显示了未经转导(NT)的细胞和经CD70 CAR转导的CBNK细胞对THP-1(图20A)和OCI-AML3(图20B)细胞的细胞毒性的比较。经IL15构建体转导的CBNK细胞在该测定中也用作对照。
图21显示CD70在各种肺癌细胞系中的表达。使用流式细胞术检测CD70在各种肺癌细胞系中的表面表达。X轴自左至右读为-103、0、103、104和105。
图22显示当与各种肺癌细胞系共培养时，CBNK CD70 CAR细胞中的胞内细胞因子和脱颗粒标志物表达。当与各种肺癌细胞系共培养时，显示未经转导(NT)的细胞和经CD70CAR转导的CBNK细胞针对干扰素γ和肿瘤坏死因子α分泌和脱颗粒标志物CD107a表达水平的比较。Y轴自顶部至底部读为105、104、103、0和-103，x轴自左至右读为-103、0、103、104和105。
图23显示膜联蛋白V染色以在与CBNK CD70 CAR细胞共培养后评估肺癌细胞的凋亡。如由膜联蛋白V-LIVE/DEADTM可固定Aqua染色测定显示的，未经转导(NT)的细胞和经CD70 CAR转导的CBNK细胞的凋亡程度的比较。Y轴自顶部至底部读为105、104、103、0和-103，x轴自左至右读为-103、0、103、104和105。
图24显示当与CBNK CD70 CAR细胞共培养时，对ER1细胞的
Figure BDA0003833433700000093
细胞毒性测定。54小时的
Figure BDA0003833433700000094
细胞毒性测定的定量显示于左图中，和代表性图像显示于右图中。
图25显示当与CBNK CD70 CAR细胞共培养时，对ER3细胞的
Figure BDA0003833433700000095
细胞毒性测定。
图26显示铬释放测定以评估CBNK CD70 CAR针对具有变化CD70表达的乳腺癌细胞系的细胞毒性活性。(左)使用流式细胞术检测CD70在各种乳腺癌细胞系中的表面表达(当两个峰值时，IgG位于左侧)。(右)如通过铬释放测定显示，未经转导(NT)的细胞和经CD70CAR转导的CBNK细胞针对BT549和BCX010细胞的细胞毒性的比较。对NK细胞敏感的K562细胞用作阳性对照。n.s.非显著；***，P＜0.001。
图27A-27E显示当与各种乳腺癌细胞共培养时，CBNK CD70CAR细胞中的胞内细胞因子和脱颗粒标志物表达。(图27A)无细胞；(图27B)K562细胞；(图27C)MDA-MB-231细胞；(图27D)BT549；(图27E)BCX010细胞。n.s.非显著；*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001。自左至右，条形的三个分组为CBNK NT、CBNK IL15和CBNK CAR CD70。
图28A-28B显示铬释放测定以评估CBNK CD70 CAR针对多发性骨髓瘤的细胞毒性活性。(图28A)如通过使用流式细胞术检测，显示MM1s(多发性骨髓瘤细胞系)的CD70的表面表达。(图28B)如通过铬释放测定显示，未经转导(NT)的细胞和经CD70 CAR转导的CBNK细胞的细胞毒性的比较。
图29A-29B显示铬释放测定以评估CBNK CD70 CAR针对肾细胞癌的细胞毒性活性。(图29A)使用流式细胞术检测CD70在各种RCC和其他癌细胞系中的表面表达。A498、SN12C和786-O是具有高CD70表达的RCC细胞系。(图29B)如通过铬释放测定显示，比较未经转导(NT)的细胞和经CD70 CAR转导的CBNK细胞的细胞毒性水平。
图30显示当与RCC细胞共培养时，CBNK CD70 CAR细胞中的胞内细胞因子和脱颗粒标志物表达。**，p＜0.01。
图31显示如通过测量绿色(胱天蛋白酶3/7)信号评估，当与CBNK CD70 CAR细胞共培养时，对786-O RCC细胞的
Figure BDA0003833433700000101
细胞毒性测定。**，p＜0.01；***，p＜0.001。
图32A-32B显示当与胰腺癌细胞共培养时，CBNK CD70 CAR细胞中的胞内细胞因子表达。(图32A)使用流式细胞术测量各种胰腺癌细胞系中的CD70的表面表达。Y轴自顶部至底部读为250K、200K、150K、100K、50K和0，x轴自左至右读为0、103、104和105。(图32B)当与PANC-1细胞系或MIA-Paca2细胞系(低CD70表达)共培养时，未经转导(NT)的细胞和经CD70CAR转导的CBNK细胞的干扰素γ和肿瘤坏死因子α分泌的比较。MFI表示平均荧光强度(表示表达水平)。
图33显示当与CBNK CD70 CAR细胞共培养时，对GSC20胶质母细胞瘤细胞的
Figure BDA0003833433700000111
细胞毒性测定。(i)使用流式细胞术检测CD70在各种GBM细胞系中的表面表达并且GSC20细胞系显示最高CD70表面表达。如通过
Figure BDA0003833433700000112
测定显示，如通过测量绿色(胱天蛋白酶3/7)信号强度评估，与未经转导(NT)的细胞相比，经CD70 CAR转导的CBNK细胞显示GSC20细胞的细胞毒性增加，表明CBNK CD70 CAR细胞针对GBM细胞具有更大的杀伤活性。57小时的
Figure BDA0003833433700000113
细胞毒性测定的定量显示于ii中，长达23小时的代表性图像显示于iii中。
图34显示植入Raji WT或CD70 KO细胞并用CBNK CD70 CAR细胞处理的NOD重度联合免疫缺陷病γ小鼠(免疫缺陷的NSG小鼠)的存活曲线。*p＜0.05。
尽管本文已显示并描述各种本公开内容的实施方案，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，这些实施方案仅作为示例提供。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员可以想到许多变化、改变和替换。应当理解，可以采用本文所述的本公开内容的实施方案的各种替代方案。
发明详述
1.定义的实例
为与长期存在的专利法惯例保持一致，词语“一个”和”一种”当在本申请说明书(包括权利要求)中与词语包含一起使用时，表示“一个或多个/一种或多种”。本公开内容的一些实施方案可由本公开内容的一个或多个组件、方法步骤和/或方法组成或基本上由其组成。预期本文描述的任何方法或组合物可关于本文描述的任何其他方法或组合物实施并且可以组合不同的实施方案。
在整个本说明书中，除非上下文另有要求，否则应了解词语“包括”、“包含”和“含有”是指包括规定步骤或组件或步骤或组件的组但不排除任何其他步骤或组件或步骤或组件的组。“由...组成”是指包括(且限制于)词组“由...组成”后的任何内容。因此，该词组“由...组成”指示列举的组件是必需的或强制性的，并且可不存在其他组件。“基本上由...组成”是指包括该词组后列举的任何组件，并且限制于不干扰或有助于本公开内容中针对列举的组件指定的活动或动作的其他组件。因此，词组“基本上由...组成”指示列举的组件是必需的或强制性的，但没有其他组件是任选的并且取决于该其他组件是否影响列举的组件的活动或动作而可存在或可不存在。
在整个本说明书中提及“一个实施方案”、“实施方案”、“特定实施方案”、“相关实施方案”、“某些实施方案”、“另外的实施方案”或“进一步的实施方案”或其组合是指结合该实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，在整个本说明书中，各种地方出现前述词组未必均指相同的实施方案。此外，特定特征、结构或特性可以任何合适的方式组合于一个或多个实施方案中。
如本文使用的术语“或”和“和/或”用于描述组合或彼此排斥的多种组分。例如，“x、y和/或z”可指单独“x”、单独“y”、单独“z”、“x、y和z”、“(x和y)或z”、“x或(y和z)”或“x或y或z”。特别考虑x、y或z可从实施方案明确排除。
在整个本申请中，术语“约”根据其在细胞和分子生物学领域中的普通和一般含义使用以指示一个值包括用于测定该值的装置或方法的误差的标准偏差。
如本文使用的术语“工程化”是指由人工产生的实体，包括细胞、核酸、多肽、载体等。在至少一些情况下，工程化实体是合成的并且包含非天然存在或以本公开内容中利用其的方式装配的组件。
如本文使用的术语“分离的”是指基本上不含其他材料的分子或生物制剂或细胞材料。在一个方面，术语“分离的”是指分别从例如存在于天然来源的其他DNA或RNA，或蛋白质或多肽，或细胞或细胞器，或组织或器官分离的核酸(例如DNA或RNA)，或蛋白质或多肽，或细胞或细胞器，或组织或器官。术语“分离的”也指当通过重组DNA技术产生时，基本上不含细胞材料、病毒材料或培养基的核酸或肽，或当化学合成时，基本上不含化学前体或其他化学品的核酸或肽。此外，“分离的核酸”意在包括作为片段非天然存在的和在天然状态下无法发现的核酸片段。本文中也使用术语“分离的”指从其他细胞蛋白中分离的多肽并且意在包含经纯化和重组的多肽。本文中也使用术语“分离的”指从其他细胞或组织分离的细胞或组织并且意在包含经培养和工程化细胞或组织。
如本文使用的“预防”和类似词语例如“防止”、“阻止”等指示预防、抑制疾病或病况(例如，癌症)，或降低其发生或复发的可能性的方法。预防也指延迟疾病或病况的发作或复发或延迟疾病或病况的症状的发生或复发。如本文使用的“预防”和类似词语也包括在疾病或病况发作或复发前，降低疾病或病况的强度、影响、症状和/或负担。
如本文使用的术语“样品”一般是指生物样品。该样品可取自个体的组织或细胞。在一些实例中，该样品可包含或来源于组织活检、血液(例如，全血)、血浆、细胞外液、干燥血斑、培养的细胞、废弃的组织。在收集前，该样品可以已从来源分离。非限制性实例包括血液、脑脊髓液、胸膜液、羊水、淋巴液、唾液、尿液、粪便、眼泪、汗液或粘膜分泌物，以及在收集前从主要来源分离的其他体液。在一些实例中，该样品在样品制备期间从其主要来源(细胞、组织、体液(例如血液)、环境样品等)分离。该样品可经纯化或可未经纯化或以其他方式从其主要来源富集。在一些情况下，该主要来源在进一步处理前经均质化。该样品可经过滤或离心以去除血沉棕黄层、脂质或颗粒物质。该样品还可针对核酸经纯化或富集，或可用核糖核酸酶处理。该样品可含有完整、破碎或部分降解的组织或细胞。
如本文使用的术语“受试者”一般是指生物样品正经受处理或分析并且在特定情况下患有或疑似患有癌症的个体。该受试者可以是任何生物体或动物受试者，其是方法或材料的目标，包括哺乳动物，例如，人类、实验室动物(例如，灵长类动物、大鼠、小鼠、兔)、家畜(例如，奶牛、绵羊、山羊、猪、火鸡和鸡)、家养宠物(例如，狗、猫和啮齿类动物)、马、和转基因非人类动物。该受试者可以是患者，例如，患有或疑似患有疾病(其可称为医学病况)，例如良性或恶性肿瘤，或癌症。该受试者可正经受或已经受治疗。该受试者可以是无症状的。该受试者可以是健康个体，但其渴望预防癌症。在至少一些情况下，术语“个体”可互换使用。如本文使用的，“受试者”或“个体”可安置在或可不安置在医疗设施中并且可作为医疗设施的门诊患者治疗。该个体可通过互联网接受一种或多种医疗组合物。个体可包括任何年龄的人类或非人类动物且因此包括成人和青少年(即，儿童)和婴儿和包括子宫内个体。该术语无意暗示需要医疗，因此，无论临床或支持基础科学研究，个体均可自愿或非自愿参与实验。
如本文使用的“治疗”或“医治”包括对疾病或病理学病况的症状或病状的任何有利或所需效应，并且可包括治疗中的疾病或病况(例如，癌症)的一种或多种可测量标志物的甚至最小程度的减少。治疗可任选地涉及疾病或病况的症状的减少或改善，或延迟该疾病或病况的进展。“治疗”未必指示该疾病或病况，或与其相关联的症状的完全根除或治愈。
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本公开内容涉及关于基因工程化任何种类的哺乳动物免疫细胞(包括至少人类NK细胞)以靶向CD70阳性肿瘤的方法和组合物。本公开内容包含针对CD70(细胞因子受体CD27的配体)的任何种类的基因工程化受体(包括CAR)。CD70是具有吸引力的“泛癌症抗原”，因为除了在血液系统恶性肿瘤(例如急性髓性白血病(AML)和淋巴瘤)上表达外，其还在许多实体瘤和癌症包括肾癌、膀胱癌、肺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、胰腺癌和黑色素瘤上表达。其仅在经活化的T和B淋巴细胞和树突状细胞上短暂发现。CD70作为AML的免疫疗法的靶标是尤其有利的，因为不同于其他AML靶标，CD70在正常造血干细胞上不表达并且因此不太可能导致长时间的血细胞减少和接受者在CAR疗法后需要造血干细胞移植。在特定实施方案中，提供表达CAR中针对CD70的单链可变片段(scFv)以及还表达一种或多种细胞因子(例如IL-15)，以支持NK细胞存活和增殖的许多新型表达构建体，包括逆转录病毒构建体。在本文提供的一系列体外研究中，证实CAR70/IL-15转导的脐带血(CB)-NK细胞针对AML、肺癌靶标和胶质母细胞瘤的活性。
I.基因工程化受体
本公开内容的免疫细胞可经基因工程化以表达靶向CD70的抗原受体，例如工程化TCR或CAR。例如，该免疫细胞可以是经修饰以表达对CD70具有抗原特异性的CAR和/或TCR的NK细胞。其他CAR和/或TCR可由与表达CD70受体的细胞相同的细胞表达，并且其可针对不同的抗原。在一些方面，该免疫细胞经工程化以通过使用CRISPR敲入CAR或TCR来表达CD70特异性CAR或CD70特异性TCR。
合适的修饰方法是本领域已知的。参见例如Sambrook和Ausubel，同上。例如，细胞可使用Heemskerk等人，2008和Johnson等人，2009中描述的转导技术转导以表达对癌症抗原具有抗原特异性的TCR。
在一些实施方案中，细胞包含经由基因工程引入的编码一种或多种抗原受体(其中的至少一种针对CD70)的一种或多种核酸，和此类核酸的基因工程化产物。在一些实施方案中，该核酸是异源的，即，通常不存在于细胞或获自该细胞的样品中，例如获自另一生物体或细胞的核酸，例如，其通常无法在正经工程化的细胞和/或衍生此细胞的生物体中发现。在一些实施方案中，该核酸不是天然存在的核酸，例如在自然界中未发现的核酸(例如，嵌合的)。
示例性抗原受体(包括CAR和重组TCR)，以及用于工程化该受体并将其引入细胞内的方法包括描述于例如国际专利申请公开号WO200014257、WO2013126726、WO2012/129514、WO2014031687、WO2013/166321、WO2013/071154、WO2013/123061、美国专利申请公开号US2002131960、US2013287748、US20130149337、美国专利号6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353，和8,479,118，和欧洲专利申请号EP2537416中的那些，和/或由Sadelain等人，2013；Davila等人，2013；Turtle等人，2012；Wu等人，2012描述的那些。在一些方面，该基因工程化抗原受体包括如描述于美国专利号7,446,190中的CAR，以及描述于国际专利申请公开号WO/2014055668Al中的那些。
A.嵌合抗原受体
在一些实施方案中，CD70特异性CAR包含：a)一个或多个细胞内信号传导结构域，b)跨膜结构域，和c)包含靶向(包括特异性结合)CD70的抗原结合区的细胞外结构域。在特定实施方案中，该抗原结合区是抗体并且不为非抗体的蛋白质或蛋白质片段。
在一些实施方案中，工程化的抗原受体包括CAR，包括活化或刺激性CAR、共刺激性CAR(参见WO2014/055668)和/或抑制性CAR(iCAR，参见Fedorov等人，2013)。CAR通常包含与一种或多种细胞内信号转导组分连接(在一些方面通过接头和/或一个或多个跨膜结构域)的细胞外抗原(或配体)结合结构域。这样的分子通常模拟或近似通过天然抗原受体引起的信号、通过与共刺激受体组合的这样的受体引起的信号和/或仅通过共刺激受体引起的信号。
本公开内容的某些实施方案涉及使用核酸，包括编码CD70特异性CAR多肽(包括已被人源化以降低免疫原性的CAR(hCAR)，其包含至少一个细胞内信号传导结构域、跨膜结构域以及包含一个或多个信号转导基序的细胞外结构域)的核酸。在某些实施方案中，CD70特异性CAR可以识别包含在一种或多种抗原之间的共享空间的表位。在某些实施方案中，结合区可包含单克隆抗体的互补决定区、单克隆抗体的可变区和/或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，该特异性来源于与受体结合的肽(例如，细胞因子)。
预期人CD70 CAR核酸可以是用于增强人患者的细胞免疫疗法的人基因。在特定实施方案中，本公开内容包括全长CD70特异性CAR cDNA或编码区。抗原结合区或结构域可以包含来源于特定人单克隆抗体的单链可变片段(scFv)的VH和VL链的片段，例如在美国专利7,109,304中描述的那些，该文献以引用方式并入本文。该片段也可以是人抗原特异性抗体的任何数量的不同抗原结合结构域。在一个更具体的实施方案中，该片段是由针对用于在人细胞中表达的人密码子使用进行优化的序列编码的CD70特异性scFv。
布置可以是多聚体，例如双抗体或多聚体。多聚体最可能通过将轻链和重链的可变部分交叉配对成双抗体而形成。构建体的铰链部分可以具有多种替代选择，从完全缺失到维持第一半胱氨酸，到脯氨酸而不是丝氨酸取代、被截短至第一半胱氨酸。Fc部分可以被删除。任何稳定和/或二聚化的蛋白质都可以达到这个目的。可以仅使用一个Fc结构域，例如人免疫球蛋白的CH2或CH3结构域。还可以使用经过修饰以改善二聚化的人免疫球蛋白的铰链区、CH2区和CH3区。也可以只使用免疫球蛋白的铰链部分。也可以使用CD8α的一部分。
在一些实施方案中，CD70 CAR核酸包含编码其他共刺激受体(例如，跨膜结构域和经修饰的CD28细胞内信号传导结构域)的序列。其他共刺激受体包括但不限于CD28、CD27、OX-40(CD134)、DAP10、DAP12和4-1BB(CD137)中的一种或多种。除了由CD3ζ引发的主要信号外，由插入人CAR中的人共刺激受体提供的其他信号对于NK细胞的完全活化也很重要，并且可以帮助改善体内持久性和过继免疫疗法的治疗成功。
在一些实施方案中，以对CD70具有特异性的方式构建CD70特异性CAR，例如在正常或未患病细胞类型上或患病细胞类型上表达CD70。因此，CAR通常在其细胞外部分中包含一个或多个CD70结合分子，例如一个或多个抗原结合片段、结构域或部分，或一个或多个抗体可变结构域，和/或抗体分子。在一些实施方案中，CD70特异性CAR包含抗体分子的一个或多个抗原结合部分，例如来源于单克隆抗体(mAb)的可变重链(VH)和可变轻链(VL)的单链抗体片段(scFv)。
在某些实施方案中，当存在少量肿瘤相关抗原时，CD70特异性CAR可以与细胞因子共表达以提高持久性。例如，CAR可以与一种或多种细胞因子例如IL-7、IL-2、IL-15、IL-12、IL-18、IL-21、IL-7或其组合共表达。
编码嵌合受体的开放阅读框的序列可获自基因组DNA来源、cDNA来源或可被合成(例如，经由PCR)或其组合。取决于基因组DNA的大小和内含子的数目，可能期望使用cDNA或其组合，因为发现内含子使mRNA稳定。此外，使用内源或外源非编码区来稳定mRNA可能是进一步有利的。
预期可以将嵌合构建体作为裸露的DNA或在合适的载体中引入免疫细胞。使用裸露的DNA通过电穿孔稳定转染细胞的方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利号6,410,319。裸露的DNA通常是指以用于表达的合适取向包含在质粒表达载体中的编码嵌合受体的DNA。
可替代地，可以使用病毒载体(例如，逆转录病毒载体，腺病毒载体，腺相关病毒载体或慢病毒载体)将嵌合构建体引入免疫细胞。根据本公开内容的方法使用的合适的载体在免疫细胞中是非复制性的。已知许多基于病毒的载体，其中维持在细胞中的病毒的拷贝数足够低以维持细胞的活力，例如基于HIV、SV40、EBV、HSV或BPV的载体。
在一些方面，抗原特异性结合或识别组分连接至一个或多个跨膜和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包括与CAR的细胞外结构域融合的跨膜结构域。在一个实施方案中，使用与CAR中的结构域之一天然缔合的跨膜结构域。在一些情况下，跨膜结构域通过氨基酸取代来选择或修饰，以避免此类结构域与相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。
在一些实施方案中，跨膜结构域来源于天然来源或来源于合成来源。如果来源是天然的，则该结构域在某些方面来源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜区包括来源于以下(即至少包括其一个或多个跨膜区)的那些：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ζ，CD3ε，CD3γ，CD3δ，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD154，ICOS/CD278，GITR/CD357，NKG2D和DAP分子。可替代地，在一些实施方案中，跨膜结构域是合成的。在一些方面，合成的跨膜结构域主要包含疏水性残基，例如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，在合成的跨膜结构域的每个末端将发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。
在某些实施方案中，本文公开的用于遗传修饰免疫细胞(例如，NK细胞)的平台技术包括(i)使用电穿孔装置(例如，nucleofector)的非病毒基因转移，(ii)通过内结构域(例如，CD28/CD3-ζ，CD137/CD3-ζ或其他组合)发送信号的CAR，(iii)具有可变长度的将CD70识别结构域连接到细胞表面的细胞外结构域的CAR，和在某些情况下(iv)来源于K562以能够稳健地和数字地扩增CAR+免疫细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)(Singh等人,2008；Singh等人,2011)。
B.特定CAR实施方案的实例
在特定实施方案中，本文包含特定CD70 CAR分子，或编码包括CD70特异性CAR的多个分子的载体。在一些情况下，CAR的CD70结合结构域是scFv，并且本文可利用结合至CD70的任何scFv。scFv的可变重链和可变轻链可以以N末端至C末端方向的任何顺序。例如，该可变重链可在该可变轻链的N末端侧，或反之亦然。该scFv可经密码子优化或可未经密码子优化。该scFv可经人源化或可未经人源化。CD70 scFv的特定实例包括至少42D12、Ab7、27B3、9D1、57B6或任何其他。使用的scFv可与42D12、Ab7、27B3、9D1、57B6或任何其他具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性。
在特定实施方案中，载体编码CD70特异性CAR以及还编码一种或多种其他分子。例如，载体可编码可经密码子优化(CO)或可未经密码子优化的CD70特异性CAR，以及在特定情况下，抗CD70 scFv是可在可变重链的上游或下游具有可变轻链的42D12 scFv。在特定实施方案中，CAR包含CD28并且没有其他共刺激结构域，并且CAR还可包含CD3ζ。在一些情况下，该载体还编码一种或多种细胞因子和一种或多种自杀基因。
密码子优化(CO)CAR.CD70 42D12 VLVH scFv抗体序列的DNA序列和多肽序列如下：
DNA
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCTCTGCTCCTCCCTCTGGCCCTGCTGCTCCATGCCGCCAGACCCCAGGCAGTtGTGACCCAGGAGCCTTCCCTGACAGTGTCTCCAGGAGGGACGGTCACGCTCACCTGCGGCCTCAAATCTGGGTCTGTCACTTCCGATAACTTCCCCACTTGGTACCAGCAGACACCAGGCCAGGCTCCCCGATTGCTTATCTACAACACAAACACCCGTCACTCTGGCGTCCCCGACCGCTTCTCCGGATCCATCCTGGGCAACAAAGCCGCCCTCACCATCACGGGGGCCCAGGCCGACGACGAGGCCGAATATTTCTGTGCTCTGTTCATAAGTAATCCTAGTGTTGAGTTCGGCGGAGGGACCCAACTGACCGTCCTAGGTGGCAGCACCAGCGGCTCCGGCAAGCCTGGCTCTGGCGAGGGCAGCACAAAGGGAGAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGTCTACTACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTCGAGTGGGTCTCAGATATTAATAATGAAGGTGGTACTACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCTAAGAACAGCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGCGCCGAGGACACGGCCGTGTACTACTGCGCGAGAGATGCCGGATATAGCAACCATGTACCCATCTTTGATTCTTGGGGCCAGGGGACCCTGGTCACTGTCTCCTCA(SEQ ID NO:1)
蛋白质
MALPVTALLLPLALLLHAARPQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGLKSGSVTSDNFPTWYQQTPGQAPRLLIYNTNTRHSGVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDEAEYFCALFISNPSVEFGGGTQLTVLGGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYYMNWVRQAPGKGLEWVSDINNEGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDAGYSNHVPIFDSWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:2)
未经密码子优化的下列scFv抗体序列(CAR.CD70 42D12 VHVL序列)的DNA和蛋白质序列如下：
DNA
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCTCTGCTCCTCCCTCTGGCCCTGCTGCTCCATGCCGCCAGACCCGAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGTCTACTACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTCGAGTGGGTCTCAGATATTAATAATGAAGGTGGTACTACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCTAAGAACAGCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGCGCCGAGGACACGGCCGTGTACTACTGCGCGAGAGATGCCGGATATAGCAACCATGTACCCATCTTTGATTCTTGGGGCCAGGGGACCCTGGTCACTGTCTCCTCAGGCAGCACCAGCGGCTCCGGCAAGCCTGGCTCTGGCGAGGGCAGCACAAAGGGACAGGCAGTGGTGACCCAGGAGCCTTCCCTGACAGTGTCTCCAGGAGGGACGGTCACGCTCACCTGCGGCCTCAAATCTGGGTCTGTCACTTCCGATAACTTCCCCACTTGGTACCAGCAGACACCAGGCCAGGCTCCCCGATTGCTTATCTACAACACAAACACCCGTCACTCTGGCGTCCCCGACCGCTTCTCCGGATCCATCCTGGGCAACAAAGCCGCCCTCACCATCACGGGGGCCCAGGCCGACGACGAGGCCGAATATTTCTGTGCTCTGTTCATAAGTAATCCTAGTGTTGAGTTCGGCGGAGGGACCCAACTGACCGTCCTAGGT(SEQ ID NO:3)
蛋白质
MGMALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYYMNWVRQAPGKGLEWVSDINNEGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDAGYSNHVPIFDSWGQGTLVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGLKSGSVTSDNFPTWYQQTPGQAPRLLIYNTNTRHSGVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDEAEYFCALFISNPSVEFGGGTQLTVLG(SEQ ID NO:4)
下列scFv抗体序列CAR.CD70 42D12 VLVH的DNA和蛋白质序列如下：
DNA
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCTCTGCTCCTCCCTCTGGCCCTGCTGCTCCATGCCGCCAGACCCGAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGTCTACTACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTTGAGTGGGTCTCAGATATTAATAATGAAGGTGGTACTACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCTAAGAACAGCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGCGCCGAGGACACGGCCGTGTACTACTGCGCGAGAGATGCCGGATATAGCAACCATGTACCCATCTTTGATTCTTGGGGCCAGGGGACCCTGGTCACTGTCTCCTCAGGCAGCACCAGCGGCTCCGGCAAGCCTGGCTCTGGCGAGGGCAGCACAAAGGGACAGGCAGTGGTGACCCAGGAGCCTTCCCTGACAGTGTCTCCAGGAGGGACGGTCACGCTCACCTGCGGCCTCAAATCTGGGTCTGTCACTTCCGATAACTTCCCCACTTGGTACCAGCAGACACCAGGCCAGGCTCCCCGATTGCTTATCTACAACACAAACACCCGTCACTCTGGCGTCCCCGACCGCTTCTCCGGATCCATCCTGGGCAACAAAGCCGCCCTCACCATCACGGGGGCCCAGGCCGACGACGAGGCCGAATATTTCTGTGCTCTGTTCATAAGTAATCCTAGTGTTGAGTTCGGCGGAGGGACCCAACTGACCGTCCTAGGT(SEQ ID NO:5)
蛋白质
MGMALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYYMNWVRQAPGKGLEWVSDINNEGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDAGYSNHVPIFDSWGQGTLVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGLKSGSVTSDNFPTWYQQTPGQAPRLLIYNTNTRHSGVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDEAEYFCALFISNPSVEFGGGTQLTVLG(SEQ ID NO:6)
包括CAR和IL15的特定载体分子的实例至少包括以下：
CO CAR.CD70 42D12.VLVH.IgG1.CD28.CD3z-2A-IL15
CO CAR.CD70 42D12 VHVL.IgG1.CD28.CD3z-2A-IL15
CAR.CD70 42D12 VLVH.IgG1.CD28.CD3z-2A-IL15
CAR.CD70 42D12 VHVL.IgG1.CD28.CD3z-2A-IL15
示例性CO CAR.CD70 42D12.VLVH.IgG1.CD28.CD3z-2A-IL15载体的质粒图谱的实例在图1中。包含CO CAR.CD70 42D12.VLVH.IgG1.CD28.CD3z-2A-IL15的载体的完整DNA序列如下：
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCTCTGCTCCTCCCTCTGGCCCTGCTGCTCCATGCCGCCAGACCCCAGGCAGTtGTGACCCAGGAGCCTTCCCTGACAGTGTCTCCAGGAGGGACGGTCACGCTCACCTGCGGCCTCAAATCTGGGTCTGTCACTTCCGATAACTTCCCCACTTGGTACCAGCAGACACCAGGCCAGGCTCCCCGATTGCTTATCTACAACACAAACACCCGTCACTCTGGCGTCCCCGACCGCTTCTCCGGATCCATCCTGGGCAACAAAGCCGCCCTCACCATCACGGGGGCCCAGGCCGACGACGAGGCCGAATATTTCTGTGCTCTGTTCATAAGTAATCCTAGTGTTGAGTTCGGCGGAGGGACCCAACTGACCGTCCTAGGTGGCAGCACCAGCGGCTCCGGCAAGCCTGGCTCTGGCGAGGGCAGCACAAAGGGAGAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGTCTACTACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTCGAGTGGGTCTCAGATATTAATAATGAAGGTGGTACTACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCTAAGAACAGCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGCGCCGAGGACACGGCCGTGTACTACTGCGCGAGAGATGCCGGATATAGCAACCATGTACCCATCTTTGATTCTTGGGGCCAGGGGACCCTGGTCACTGTCTCCTCACGTACGGTCACTGTCTCTTCACAGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAAAGATCCCAAATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCACGCGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAAAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGACCGCAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAATCCCGGGCCCATGCGCATTAGCAAGCCCCACCTGCGGAGCATCAGCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACAGCCACTTCCTGACCGAGGCCGGCATCCACGTGTTCATCCTGGGCTGCTTCAGCGCCGGACTGCCCAAGACCGAGGCCAACTGGGTGAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAGGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGAGCAGCAACGGCAACGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCAGCTGA(SEQ ID NO:7)
在一些实施方案中，使用密码子优化CO CAR.CD70 42D12VHVL.IgG1.CD28.CD3z-2A-IL15载体。密码子优化CO CAR.CD7042D12 VHVL.IgG1.CD28.CD3z-2A-IL15载体的质粒图谱的实例在图2中。下列构建体CO CAR.CD70 42D12VHVL.IgG1.CD28.CD3z-2A-IL15的完整DNA序列如下：
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCTCTGCTCCTCCCTCTGGCCCTGCTGCTCCATGCCGCCAGACCCGAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGTCTACTACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTCGAGTGGGTCTCAGATATTAATAATGAAGGTGGTACTACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCTAAGAACAGCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGCGCCGAGGACACGGCCGTGTACTACTGCGCGAGAGATGCCGGATATAGCAACCATGTACCCATCTTTGATTCTTGGGGCCAGGGGACCCTGGTCACTGTCTCCTCAGGCAGCACCAGCGGCTCCGGCAAGCCTGGCTCTGGCGAGGGCAGCACAAAGGGACAGGCAGTGGTGACCCAGGAGCCTTCCCTGACAGTGTCTCCAGGAGGGACGGTCACGCTCACCTGCGGCCTCAAATCTGGGTCTGTCACTTCCGATAACTTCCCCACTTGGTACCAGCAGACACCAGGCCAGGCTCCCCGATTGCTTATCTACAACACAAACACCCGTCACTCTGGCGTCCCCGACCGCTTCTCCGGATCCATCCTGGGCAACAAAGCCGCCCTCACCATCACGGGGGCCCAGGCCGACGACGAGGCCGAATATTTCTGTGCTCTGTTCATAAGTAATCCTAGTGTTGAGTTCGGCGGAGGGACCCAACTGACCGTCCTAGGTCGTACGGTCACTGTCTCTTCACAGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAAAGATCCCAAATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCACGCGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAAAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGACCGCAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAATCCCGGGCCCATGCGCATTAGCAAGCCCCACCTGCGGAGCATCAGCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACAGCCACTTCCTGACCGAGGCCGGCATCCACGTGTTCATCCTGGGCTGCTTCAGCGCCGGACTGCCCAAGACCGAGGCCAACTGGGTGAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAGGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGAGCAGCAACGGCAACGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCAGCTGA(SEQ ID NO:8)
还可使用非密码子优化CAR，例如CAR.CD70 42D12 VLVH.IgG1.CD28.CD3z-2A-IL15载体，在下面提供序列：
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCTCTGCTCCTCCCTCTGGCCCTGCTGCTCCATGCCGCCAGACCCCAGGCAGTtGTGACCCAGGAGCCTTCCCTGACAGTGTCTCCAGGAGGGACGGTCACGCTCACCTGCGGCCTCAAATCTGGGTCTGTCACTTCCGATAACTTCCCCACTTGGTACCAGCAGACACCAGGCCAGGCTCCCCGATTGCTTATCTACAACACAAACACCCGTCACTCTGGCGTCCCCGACCGCTTCTCCGGATCCATCCTGGGCAACAAAGCCGCCCTCACCATCACGGGGGCCCAGGCCGACGACGAGGCCGAATATTTCTGTGCTCTGTTCATAAGTAATCCTAGTGTTGAGTTCGGCGGAGGGACCCAACTGACCGTCCTAGGTGGCAGCACCAGCGGCTCCGGCAAGCCTGGCTCTGGCGAGGGCAGCACAAAGGGAGAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGTCTACTACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTtGAGTGGGTCTCAGATATTAATAATGAAGGTGGTACTACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCTAAGAACAGCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGCGCCGAGGACACGGCCGTGTACTACTGCGCGAGAGATGCCGGATATAGCAACCATGTACCCATCTTTGATTCTTGGGGCCAGGGGACCCTGGTCACTGTCTCCTCACGTACGGTCACTGTCTCTTCACAGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAAAGATCCCAAATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCACGCGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAAAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGACCGCAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAATCCCGGGCCCATGCGCATTAGCAAGCCCCACCTGCGGAGCATCAGCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACAGCCACTTCCTGACCGAGGCCGGCATCCACGTGTTCATCCTGGGCTGCTTCAGCGCCGGACTGCCCAAGACCGAGGCCAACTGGGTGAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAGGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGAGCAGCAACGGCAACGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCAGCTGA(SEQ ID NO:9).
在一些情况下，使用具有CD8α信号肽(CD8SP)的特定抗体。CD8SP CD70 42D12VLVH序列的一个实例如下：
DNA
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCTCTGCTCCTCCCTCTGGCCCTGCTGCTCCATGCCGCCAGACCCCAGGCAGTGGTGACCCAGGAGCCTTCCCTGACAGTGTCTCCAGGAGGGACGGTCACGCTCACCTGCGGCCTCAAATCTGGGTCTGTCACTTCCGATAACTTCCCCACTTGGTACCAGCAGACACCAGGCCAGGCTCCCCGATTGCTTATCTACAACACAAACACCCGTCACTCTGGCGTCCCCGACCGCTTCTCCGGATCCATCCTGGGCAACAAAGCCGCCCTCACCATCACGGGGGCCCAGGCCGACGACGAGGCCGAATATTTCTGTGCTCTGTTCATAAGTAATCCTAGTGTTGAGTTCGGCGGAGGGACCCAACTGACCGTCCTAGGTGGCAGCACCAGCGGCTCCGGCAAGCCTGGCTCTGGCGAGGGCAGCACAAAGGGAGAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGTCTACTACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTCGAGTGGGTCTCAGATATTAATAATGAAGGTGGTACTACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCTAAGAACAGCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGCGCCGAGGACACGGCCGTGTACTACTGCGCGAGAGATGCCGGATATAGCAACCATGTACCCATCTTTGATTCTTGGGGCCAGGGGACCCTGGTCACTGTCTCCTCA(SEQ ID NO:10)
蛋白质
ARVATMGMALPVTALLLPLALLLHAARPQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGLKSGSVTSDNFPTWYQQTPGQAPRLLIYNTNTRHSGVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDEAEYFCALFISNPSVEFGGGTQLTVLGGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYYMNWVRQAPGKGLEWVSDINNEGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDAGYSNHVPIFDSWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:11)
CAR.CD70 42D12 VLVH.IgG1.CD28.CD3z-2A-IL15的实例CAR的质粒载体图谱提供于图3中。
CAR.CD70 42D12 VLVH.IgG1.CD28.CD3z-2A-IL15的完整DNA序列如下：
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCTCTGCTCCTCCCTCTGGCCCTGCTGCTCCATGCCGCCAGACCCCAGGCAGTtGTGACCCAGGAGCCTTCCCTGACAGTGTCTCCAGGAGGGACGGTCACGCTCACCTGCGGCCTCAAATCTGGGTCTGTCACTTCCGATAACTTCCCCACTTGGTACCAGCAGACACCAGGCCAGGCTCCCCGATTGCTTATCTACAACACAAACACCCGTCACTCTGGCGTCCCCGACCGCTTCTCCGGATCCATCCTGGGCAACAAAGCCGCCCTCACCATCACGGGGGCCCAGGCCGACGACGAGGCCGAATATTTCTGTGCTCTGTTCATAAGTAATCCTAGTGTTGAGTTCGGCGGAGGGACCCAACTGACCGTCCTAGGTGGCAGCACCAGCGGCTCCGGCAAGCCTGGCTCTGGCGAGGGCAGCACAAAGGGAGAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGTCTACTACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTtGAGTGGGTCTCAGATATTAATAATGAAGGTGGTACTACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCTAAGAACAGCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGCGCCGAGGACACGGCCGTGTACTACTGCGCGAGAGATGCCGGATATAGCAACCATGTACCCATCTTTGATTCTTGGGGCCAGGGGACCCTGGTCACTGTCTCCTCACGTACGGTCACTGTCTCTTCACAGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAAAGATCCCAAATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCACGCGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAAAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGACCGCAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAATCCCGGGCCCATGCGCATTAGCAAGCCCCACCTGCGGAGCATCAGCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACAGCCACTTCCTGACCGAGGCCGGCATCCACGTGTTCATCCTGGGCTGCTTCAGCGCCGGACTGCCCAAGACCGAGGCCAACTGGGTGAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAGGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGAGCAGCAACGGCAACGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCAGCTGA(SEQ ID NO:12)
CAR.CD70 42D12 VHVL.IgG1.CD28.CD3z-2A-IL15载体可用于本公开内容的方法和组合物中。CAR.CD70 42D12 VHVL.IgG1.CD28.CD3z-2A-IL15的质粒载体图谱阐述于图4中。CAR.CD70 42D12 VHVL.IgG1.CD28.CD3z-2A-IL15的完整DNA序列如下：
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCTCTGCTCCTCCCTCTGGCCCTGCTGCTCCATGCCGCCAGACCCGAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGTCTACTACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTTGAGTGGGTCTCAGATATTAATAATGAAGGTGGTACTACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCTAAGAACAGCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGCGCCGAGGACACGGCCGTGTACTACTGCGCGAGAGATGCCGGATATAGCAACCATGTACCCATCTTTGATTCTTGGGGCCAGGGGACCCTGGTCACTGTCTCCTCAGGCAGCACCAGCGGCTCCGGCAAGCCTGGCTCTGGCGAGGGCAGCACAAAGGGACAGGCAGTGGTGACCCAGGAGCCTTCCCTGACAGTGTCTCCAGGAGGGACGGTCACGCTCACCTGCGGCCTCAAATCTGGGTCTGTCACTTCCGATAACTTCCCCACTTGGTACCAGCAGACACCAGGCCAGGCTCCCCGATTGCTTATCTACAACACAAACACCCGTCACTCTGGCGTCCCCGACCGCTTCTCCGGATCCATCCTGGGCAACAAAGCCGCCCTCACCATCACGGGGGCCCAGGCCGACGACGAGGCCGAATATTTCTGTGCTCTGTTCATAAGTAATCCTAGTGTTGAGTTCGGCGGAGGGACCCAACTGACCGTCCTAGGTCGTACGGTCACTGTCTCTTCACAGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAAAGATCCCAAATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCACGCGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAAAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGACCGCAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAATCCCGGGCCCATGCGCATTAGCAAGCCCCACCTGCGGAGCATCAGCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACAGCCACTTCCTGACCGAGGCCGGCATCCACGTGTTCATCCTGGGCTGCTTCAGCGCCGGACTGCCCAAGACCGAGGCCAACTGGGTGAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAGGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGAGCAGCAACGGCAACGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCAGCTGA(SEQ ID NO:13)
C.T细胞受体(TCR)
在一些实施方案中，遗传工程化的抗原受体包括重组TCR和/或从天然存在的T细胞克隆的TCR。“T细胞受体”或“TCR”是指包含可变的a和β链(分别称为TCRα和TCRβ)或可变的γ和δ链(分别称为TCRγ和TCRδ)，并且能够特异性结合与MHC受体结合的抗原肽的分子。在一些实施方案中，TCR为αβ形式。
通常，以αβ和γδ形式存在的TCR通常在结构上相似，但是表达它们的T细胞可能具有不同的解剖学位置或功能。TCR可以发现在细胞表面上或以可溶形式存在。通常，TCR在T细胞(或T淋巴细胞)的表面上发现，通常负责识别与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的抗原。在一些实施方案中，TCR还可以包含恒定结构域、跨膜结构域和/或短胞质尾(参见，例如，Janeway等人,1997)。例如，在一些方面，TCR的每条链可具有一个N末端免疫球蛋白可变结构域、一个免疫球蛋白恒定结构域、跨膜区和在C末端的短胞质尾。在一些实施方案中，TCR与参与介导信号转导的CD3复合物的不变蛋白相关。除非另有说明，否则术语“TCR”应理解为涵盖其功能性TCR片段。该术语还涵盖完整的或全长的TCR，包括αβ形式或γδ形式的TCR。
因此，出于本文的目的，提及的TCR包括任何TCR或功能片段，例如与结合在MHC分子中的特定抗原肽(即MHC-肽复合物)结合的TCR的抗原结合部分。TCR的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”(其可以互换使用)是指包含TCR的结构性结构域的一部分但与全长TCR结合的抗原(例如，MHC-肽复合物)结合的分子。在一些情况下，抗原结合部分包含TCR的可变结构域，例如TCR的可变α链和可变β链，其足以形成与特定MHC-肽复合物结合的结合位点，例如通常每条链包含三个互补决定区。
在一些实施方案中，TCR链的可变结构域缔合以形成类似于免疫球蛋白的环或互补决定区(CDR)，其通过形成TCR分子的结合位点并确定肽特异性而赋予抗原识别并确定肽特异性。通常，像免疫球蛋白一样，CDR被框架区(FR)分开(参见，例如，Jores等人,1990；Chothia等人,1988；Lefranc等人,2003)。在一些实施方案中，CDR3是负责识别经加工的抗原的主要CDR，尽管也已显示α链的CDR1与抗原肽的N末端部分相互作用，而β链的CDR1与肽的C末端部分相互作用。CDR2被认为识别MHC分子。在一些实施方案中，β链的可变区可以包含附加的高变(HV4)区。
在一些实施方案中，TCR链包含恒定结构域。例如，像免疫球蛋白一样，TCR链的细胞外部分(例如，a链、β链)可以包含两个免疫球蛋白结构域，分别是N末端处的可变结构域(例如，Va或Vp；通常是基于Kabat编号的氨基酸1至116，Kabat等人,"Sequences ofProteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services,PublicHealth Service National Institutes of Health,1991,5th ed.)，和与细胞膜相邻的恒定结构域(例如，α链恒定结构域或Ca，通常是基于Kabat的氨基酸117至259，β链恒定结构域或Cp，通常是基于Kabat的氨基酸117至295)。例如，在一些情况下，由两条链形成的TCR的细胞外结构域包含两个膜近端恒定结构域和两个包含CDR的膜远端可变结构域。TCR结构域的恒定结构域包含短连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，从而在两条链之间形成连接。在一些实施方案中，TCR在α链和β链的每条链中可具有另外的半胱氨酸残基，使得TCR在恒定结构域中包含两个二硫键。
在一些实施方案中，TCR链可包含跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域带正电。在一些情况下，TCR链包含细胞质尾部。在一些情况下，该结构允许TCR与其他分子(例如，CD3)缔合。例如，具有跨膜区的含有恒定结构域的TCR可以将蛋白质锚定在细胞膜中，并与CD3信号转导装置或复合物的不变亚基缔合。
通常，CD3是一种多蛋白复合物，其在哺乳动物中可以具有三条不同的链(γ、δ和ε)以及ζ链。例如，在哺乳动物中，该复合物可含有CD3γ链、CD3δ链、两条CD3ε链和CD3ζ链的同二聚体。CD3γ、CD3δ和CD3ε链是包含单个免疫球蛋白结构域的免疫球蛋白超家族的高度相关的细胞表面蛋白。CD3γ、CD3δ和CD3ε链的跨膜区带负电荷，这是允许这些链与带正电荷的T细胞受体链缔合的特征。CD3γ、CD3δ和CD3ε链的细胞内尾部各自包含一个保守的基序，称为基于酪氨酸的免疫受体活化基序或ITAM，而每个CD3ζ链具有三个。通常，ITAM涉及TCR复合体的信号转导能力。这些辅助分子具有带负电的跨膜区，并在将信号从TCR传播到细胞中发挥作用。CD3-和ζ-链与TCR一起形成所谓的T细胞受体复合物。
在一些实施方案中，TCR可以是两条链α和β(或任选地γ和δ)的异二聚体，或者它可以是单链TCR构建体。在一些实施方案中，TCR是包含两条分开的链(α和β链或γ和δ链)的异二聚体，其例如通过一个或多个二硫键连接。在一些实施方案中，鉴定针对靶抗原(例如，癌症抗原)的TCR并将其引入细胞。在一些实施方案中，编码TCR的核酸可以从多种来源获得，例如通过可公开获得的TCR DNA序列的聚合酶链反应(PCR)扩增。在一些实施方案中，TCR获自生物学来源，诸如获自细胞，诸如获自T细胞(例如细胞毒性T细胞)、T细胞杂交瘤或其他可公开获得的来源。在一些实施方案中，T细胞可以获自体内分离的细胞。在一些实施方案中，可以从患者中分离出高亲和力的T细胞克隆，并分离出TCR。在一些实施方案中，T细胞可以是培养的T细胞杂交瘤或克隆。在一些实施方案中，已经在用人免疫系统基因(例如人白细胞抗原系统或HLA)工程化的转基因小鼠中产生了针对靶抗原的TCR克隆。参见，例如，肿瘤抗原(参见，例如，Parkhurst等人,2009和Cohen等人,2005)。在一些实施方案中，噬菌体展示用于分离针对靶抗原的TCR(参见，例如，Varela-Rohena等人,2008和Li,2005)。在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分可以根据TCR序列的知识合成产生。
II.细胞因子
一种或多种细胞因子可与一种或多种CD70靶向基因工程化受体(例如CD70特异性CAR)一起使用。在一些情况下，一种或多种细胞因子存在于与工程化受体相同的载体分子上，尽管在其他情况下，它们在分开的分子上。在特定实施方案中，一种或多种细胞因子从与工程化受体相同的载体共表达。一种或多种细胞因子可作为与CD70特异性受体分开的多肽产生。作为一个实例，利用白介素-15(IL-15)。可使用IL-15，因为例如其受组织限制并且其仅在病理条件下以任何水平在血清中或全身观察到。IL-15具有过继疗法所需的数种属性。IL-15是体内恒定细胞因子，其诱导自然杀伤细胞的发育和细胞增殖、经由缓解肿瘤驻留细胞的功能抑制来促进已形成肿瘤的根除，并抑制活化诱导的细胞死亡。除IL-15之外，还设想其他细胞因子。这些包括但不限于细胞因子、趋化因子和有助于用于人类应用的细胞的活化和增殖的其他分子。作为一个实例，细胞因子是IL-15、IL-12、IL-2、IL-18、IL-21、IL-7或其组合。可以利用表达IL-15的NK细胞，并且能够持续支持细胞因子信号传导，这有助于它们在输注后的存活。
在特定实施方案中，NK细胞表达一种或多种外源提供的细胞因子。可向该NK细胞外源提供细胞因子，因为该细胞因子是从细胞内的表达载体表达的。在替代情况下，内源细胞因子的表达一经调节，例如在该细胞因子的一个或多个启动子位点处基因重组，细胞中的内源细胞因子即上调。在其中在表达构建体上向细胞提供细胞因子的情况下，细胞因子可从与自杀基因相同的载体编码。细胞因子可作为与自杀基因分开的多肽分子和作为与细胞的工程化受体分开的多肽表达。在一些实施方案中，本公开内容涉及CAR和/或TCR载体与IL-15的共同利用，特别是在NK细胞中。
III.自杀基因
在特定实施方案中，自杀基因与任何种类的细胞疗法结合使用以控制其用途并允许在期望事件和/或时间下终止该细胞疗法。出于在需要时引发转导的细胞的死亡的目的而将自杀基因用于转导的细胞中。本公开内容包含的已经修饰以携带载体的本公开内容的CD70靶向细胞可包含一个或多个自杀基因。在一些实施方案中，如本文使用的术语“自杀基因”定义为在施用前药或其他药剂后使基因产物转变为杀伤其宿主细胞的化合物的基因。在其他实施方案中，自杀基因编码基因产物，在需要时，其被靶向自杀基因产物的药剂(例如抗体)靶向。
可使用的自杀基因/前药组合的实例是单纯疱疹病毒-胸苷激酶(HSV-tk)和更昔洛韦(ganciclovir)、阿昔洛韦(acyclovir)或FIAU；氧化还原酶和环己酰亚胺；胞嘧啶脱氨酶和5-氟胞嘧啶；胸苷激酶胸苷酸激酶(Tdk::Tmk)和AZT；以及脱氧胞苷激酶和阿糖胞苷。可使用大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶(将前药6-甲基嘌呤脱氧核苷转化为毒性嘌呤6-甲基嘌呤的所谓的自杀基因)。与前药疗法一起使用的自杀基因的其他实例是大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因和HSV胸苷激酶基因。
示例性自杀基因还包括CD20、CD52、EGFRv3或诱导型胱天蛋白酶9。在一个实施方案中，EGFR变体III(EGFRv3)的截断形式可用作可由西妥昔单抗(Cetuximab)消融的自杀抗原。本公开内容中可使用的现有技术中已知的其他自杀基因包括嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、细胞色素p450酶(CYP)、羧肽酶(CP)、羧酸酯酶(CE)、硝基还原酶(NTR)、鸟嘌呤核糖基转移酶(XGRTP)、糖苷酶、甲硫胺酸-α,γ-裂解酶(MET)和胸苷磷酸化酶(TP)。
在特定实施方案中，编码CD70靶向CAR的载体，或本文包含的NK细胞中的任何载体包括一个或多个自杀基因。该自杀基因可在与CD70靶向CAR相同的载体上或可不在与CD70靶向CAR相同的载体上。在其中自杀基因存在于与CD70靶向CAR相同的载体上的情况下，该自杀基因和该CAR可由例如IRES或2A元件分开。
在特定实施方案中，自杀基因是无法由天然裂解TNF的标准酶(例如TNF-α-转化酶(也称为TACE))裂解的肿瘤坏死因子(TNF)-α突变体。因此，在特定实施方案中，该TNF-α突变体是膜结合且不可分泌的。本公开内容中使用的TNF-α突变体可由结合突变体(包括至少一种抗体)的一种或多种药剂靶向，使得所述一种或多种药剂结合至细胞表面上的TNF-α突变体后，该细胞死亡。本公开内容的实施方案允许将该TNF-α突变体用作表达其的细胞的标志物。
表达无法裂解的TNF-α突变体的细胞可被靶向以选择性删除，包例如使用临床上目前使用的FDA批准的TNF-α抗体，例如依那西普(etanercept)、英夫利昔单抗(infliximab)或阿达木单抗(adalilumab)。突变的TNF-α多肽可在细胞中与一种或多种治疗性转基因(例如编码TCR或CAR的基因，包括CD70靶向TCR和/或CAR)共表达。另外，表达TNF-α突变体的细胞具有针对肿瘤靶标的极佳活性，该活性由膜结合的TNF-α蛋白的生物活性介导。
关于野生型，TNF-α具有26kD跨膜形式和17kD分泌组分。Perez等人，(1990)中描述的一些突变体可用于本公开内容中。在特定实施方案中，关于17kD TNF，本公开内容的TNF-α突变体的实例包括至少以下：(1)删除Val1和删除Prol12；(2)删除Val13；(3)删除Val1和删除Val13；(4)删除Val1至Prol12并且包括Prol12和删除Val13(删除13aa)；(5)删除Ala-3至Val 13并且包括Val 13(删除14aa)。在特定实施方案中，TNF-α突变体包含在位置-3、-2、-1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13，或其组合处的相应氨基酸的删除。特定组合包括以下位置处的删除：-3至13并且包括13；-3至12并且包括12；-3至11并且包括11；-3至10并且包括10；-3至9并且包括9；-3至8并且包括8；-3至7并且包括7；-3至6并且包括6；-3至5并且包括5；-3至4并且包括4；-3至3并且包括3；-3至2并且包括2；-3至1并且包括1；-3至-1并且包括-1；-3至-2并且包括-2；-2至13并且包括13；-2至12并且包括12；-2至11并且包括11；-2至10并且包括10；-2至9并且包括9；-2至8并且包括8；-2至7并且包括7；-2至6并且包括6；-2至5并且包括5；-2至4并且包括4；-2至3并且包括3；-2至2并且包括2；-2至1并且包括1；-2至-1并且包括-1；-1至13并且包括13；-1至12并且包括12；-1至11并且包括11；-1至10并且包括10；-1至9并且包括9；-1至8并且包括8；-1至7并且包括7；-1至6并且包括6；-1至5并且包括5；-1至4并且包括4；-1至3并且包括3；-1至2并且包括2；-1至1并且包括1；1至13并且包括13；1至12并且包括12；1至11并且包括11；1至10并且包括10；1至9并且包括9；1至8并且包括8；1至7并且包括7；1至6并且包括6；1至5并且包括5；1至4并且包括4；1至3并且包括3；1至2并且包括2；等等。
TNF-α突变体可通过任何合适的方法产生，但在特定实施方案中，它们等通过定点诱变产生。在一些情况下，所述TNF-α突变体可具有除使蛋白质无法裂解的突变之外的突变。在特定情况下，所述TNF-α突变体除Val1、Pro12和/或Val13或之间的区域处的删除之外可具有1、2、3或更多个突变。除了使该突变体不可分泌的那些突变之外的突变可以是氨基酸取代、删除、添加、倒位等中的一种或多种。在其中另外的突变是氨基酸取代的情况下，该取代可以是例如保守氨基酸取代或可以不是保守氨基酸取代。在一些情况下，1、2、3、4、5或更多个另外氨基酸可存在于蛋白质的N末端和/或C末端上。在一些情况下，TNF-α突变体具有(1)使所述突变体不可分泌的一个或多个突变；(2)阻止所述突变体由内而外信号传导的一个或多个突变；和/或(3)干扰所述突变体结合至TNF受体1和/或TNF受体2的一个或多个突变。
在特定实施方案中，在递送有效量的一种或多种药剂以结合至表达TNF-α突变体的CD70 CAR靶向细胞后，消除大多数表达TNF-α突变体的细胞。在特定实施方案中，在个体中消除大于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的表达TNF-α突变体的细胞。在认识到需要消除细胞后，可持续向该个体递送一种或多种药剂直至一种或多种症状不再存在或直至已消除足够数量的细胞。个体中的细胞数量可使用TNF-α突变体作为标志物进行监测。
本公开内容方法的实施方案可包括向有需要的个体提供有效量的CD70靶向免疫细胞疗法的第一步骤，其中该细胞包含一种或多种不可分泌的TNF-α突变体；以及使用一种或多种TNF-α突变体作为自杀基因消除细胞(通过任何机制直接或间接通过细胞死亡)的第二步骤。所述第二步骤可在个体发生至少一个不良事件时开始，并且该不良事件可通过任何方式识别，包括通过从开始细胞疗法时可持续或可不持续的常规监测。可以在检查和/或测试时检测一个或多个不良事件。在其中个体患有细胞因子释放综合征(其还可称为细胞因子风暴)的情况下，例如，该个体可具有升高的一种或多种炎性细胞因子(仅作为实例：干扰素-γ、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、IL-10、IL-6和TNF-α)；发烧；疲劳；低血压；缺氧、心跳过速；恶心；微血管渗漏；心脏/肾/肝功能障碍；或其组合。在其中个体具有神经毒性的情况下，个体可具有精神错乱、谵妄、发育不全和/或癫痫发作。在一些情况下，测试个体与细胞因子释放综合征的发作和/或严重性相关的标志物，例如C反应蛋白、IL-6、TNF-α和/或铁蛋白。
在另外的实施方案中，在细胞因子释放综合征或神经毒性期间施用结合不可分泌的TNF-α的一种或多种药剂例如具有中和高水平可溶性TNF-α的另外益处，高水平可溶性TNF-α会导致疗法的毒性。可溶性TNF-α在细胞因子释放综合征期间以高水平释放，并且是CAR T细胞疗法的毒性的中介物。在这样情况下，施用本文包含的TNF-α抗体具有双重有利效应，即选择性删除表达TNF-α突变体的细胞和中和可溶性TNF-α引起的毒性。因此，本公开内容的实施方案包含在接受或已接受其中细胞表达不可分泌的TNF-α突变体的过继细胞疗法的个体中消除或降低细胞因子释放综合征的严重性的方法，该方法包括提供有效量的结合不可分泌的TNF-α突变体的药剂的步骤，所述药剂在所述个体中引起(a)消除细胞疗法中的至少一些细胞；和(b)降低可溶性TNF-α的水平。
本公开内容的实施方案包括在已接受或接受使用表达不可分泌的TNF-α突变体的细胞的细胞疗法的个体中减少细胞因子释放综合征的效应的方法，该方法包括提供有效量的一种或多种结合该突变体的药剂的步骤，以在该个体中引起(a)消除细胞疗法中的至少一些细胞；和(b)降低可溶性TNF1-α的水平。
当需要利用TNF-α自杀基因时，向个体提供有效量的一种或多种可抑制(例如通过直接结合)细胞表面上的TNF-α突变体的抑制剂。在一些实施方案中，所述一种或多种抑制剂可向该个体全身和/或局部提供。所述抑制剂可以是多肽(例如抗体)、核酸、小分子(例如，黄嘌呤衍生物)、肽，或其组合。在特定实施方案中，抗体是经FDA批准的。当抑制剂是抗体时，在至少一些情况下，该抑制剂可以是单克隆抗体。当使用抗体的混合物时，该混合物中的一种或多种抗体可以是单克隆抗体。小分子TNF-α抑制剂的实例包括例如美国专利号5,118,500中描述的小分子，该专利通过引用整体并入本文。多肽TNF-α抑制剂的实例包括多肽，例如美国专利号6,143,866中描述的那些，该专利通过引用整体并入本文。
在特定实施方案中，利用至少一种抗体以靶向TNF-α突变体来触发其作为自杀基因的活性。抗体的实例包括例如至少阿达木单抗(Adalimumab)、阿达木单抗-atto(Adalimumab-atto)、赛妥珠单抗聚乙二醇(Certolizumab pegol)、依那西普、依那西普-szzs、戈利木单抗(Golimumab)、英夫利昔单抗、英夫利昔单抗-dyyb，或其混合物。
本公开内容的实施方案包括通过修饰细胞疗法的细胞以表达不可分泌的TNF-α突变体来降低细胞疗法对个体的毒性的风险的方法。在特定实施方案中，该细胞疗法用于癌症，并且其可包含靶向抗原(包括癌症抗原)的工程化受体。
在特定实施方案中，除本公开内容的发明性NK细胞疗法外，还可已向个体提供针对医学病况的另外的疗法、向个体提供和/或将向个体提供针对医学病况的另外的疗法。在其中该医学病况是癌症的情况下，可向该个体提供手术、放射、免疫疗法(除本公开内容的细胞疗法外)、激素疗法、基因疗法、化学疗法等等中的一个或多个。
IV.载体
CD70靶向CAR可通过任何合适的载体(包括通过病毒载体或通过非病毒载体)递送至接受者免疫细胞。病毒载体的实例包括至少逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒载体。非病毒载体的实例包括至少质粒、转座子、脂质、纳米颗粒等。
在其中免疫细胞用编码CD70靶向受体的载体转导并且还需要将另一个基因或多个基因(例如自杀基因和/或细胞因子和/或任选的治疗基因产物)转导至细胞内的情况下，CD70靶向受体、自杀基因、细胞因子和任选的治疗基因可包含或可不包含在相同载体上或可与相同载体一起包含或可不与相同载体一起包含。在一些情况下，CD70靶向CAR、自杀基因、细胞因子和任选的治疗基因从相同载体分子(例如相同病毒载体分子)表达。在这样的情况下，CD70靶向CAR、自杀基因、细胞因子和任选的治疗基因的表达可由相同的一个或多个调控元件调节或可不由相同的一个或多个调控元件调节。当CD70靶向CAR、自杀基因、细胞因子和任选的治疗基因在相同载体上时，它们可表达为分开的多肽或可不表达为分开的多肽。在其中它们表达为分开的多肽的情况下，例如，它们可在载体上由2A元件或IRES元件分开(或两种类型可在相同载体上使用一次或多于一次)。
A.一般实施方案
本领域技术人员将完全有能力通过标准重组技术构建载体(参见例如Sambrook等人，2001和Ausubel等人，1996，两者均通过引用并入本文)来表达本公开内容的抗原受体。
1.调控元件
包含在本公开内容中有用的载体中的表达盒特别地包含(沿5’至3’方向)可操作地连接至蛋白质编码序列的真核转录启动子、包含间插序列的剪接信号和转录终止/聚腺苷酸化序列。控制真核细胞中蛋白质编码基因的转录的启动子和增强子由多种遗传元件组成。细胞机制能够收集和整合每个元件传达的调控信息，从而允许不同的基因进化出独特的、通常是复杂的转录调控模式。在本公开内容的上下文中使用的启动子包括例如组成型、诱导型和组织特异性启动子。在其中载体用于产生癌症疗法的情况下，启动子在缺氧之条件下可以是有效的。
2.启动子/增强子
本文提供的表达构建体包含驱动抗原受体和其他顺反子基因产物表达的启动子。启动子通常包含用于定位RNA合成的起始位点的序列。对于此，最熟知的实例是TATA框，但在一些缺少TATA框的启动子中(例如，哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和SV40晚期基因的启动子)覆盖起始位点的离散元件本身帮助固定起始位置。另外的启动子元件调节转录起始的频率。通常，这些启动子位于起始位点上游的区域，尽管已显示许多启动子也含有起始位点下游的功能元件。为了使编码序列处于启动子的“控制之下”，将转录阅读框的转录起始位点的5’末端定位在所选择的启动子的“下游”(即3’)。“上游”的启动子刺激DNA的转录并促进编码的RNA的表达。
启动子元件之间的间隔通常是灵活的，使得当元件相对于彼此倒置或移动时，启动子功能得以保留。例如，在tk启动子中，在活性开始下降之前，启动子元件之间的间距可以增加到相距50bp。取决于启动子，似乎各个元件可以协同地或独立地起作用以激活转录。启动子可以或可以不与“增强子”结合使用，“增强子”是指与核酸序列的转录激活有关的顺式作用调节序列。
启动子可以是与核酸序列天然缔合的启动子，如可以通过分离位于编码片段和/或外显子上游的5’非编码序列而获得。这样的启动子可以称为“内源的”。类似地，增强子可以是与核酸序列天然缔合的增强子，位于该序列的下游或上游。可替代地，通过将编码核酸片段置于重组或异源启动子的控制下将获得某些优势，所述重组或异源启动子是指在其天然环境中通常不与核酸序列缔合的启动子。重组或异源增强子也指在其天然环境中通常不与核酸序列缔合的增强子。此类启动子或增强子可以包括其他基因的启动子或增强子，以及从任何其他病毒、原核或真核细胞中分离的启动子或增强子，以及非“天然存在”的启动子或增强子，即包含不同转录调控区的不同元件，和/或改变表达的突变。例如，最常用于重组DNA构建的启动子包括β内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖和色氨酸(trp-)启动子系统。除了合成地产生启动子和增强子的核酸序列以外，还可以结合本文公开的组合物使用重组克隆和/或核酸扩增技术(包括PCRTM)来产生序列。此外，预期还可以采用在非核细胞器(例如，线粒体、叶绿体等)内指导序列的转录和/或表达的控制序列。
自然地，重要的是使用有效地指导DNA区段在选择用于表达的细胞器、细胞类型、组织、器官或生物体中的表达的启动子和/或增强子。分子生物学领域的技术人员通常知道用于蛋白质表达的启动子、增强子和细胞类型组合的使用(参见，例如Sambrook等人,1989，通过引用并入本文)。所使用的启动子可以是组成型的、组织特异性的、可诱导的和/或在适当的条件下可用于指导引入的DNA区段的高水平表达，例如在重组蛋白和/或肽的大规模生产中是有利的。启动子可以是异源的或内源的。
另外，任何启动子/增强子组合(例如，根据真核启动子数据库EPDB，通过网址epd.isb-sib.ch/访问)也可以用于驱动表达。T3、T7或SP6细胞质表达系统的使用是另一个可能的实施方案。如果提供适当的细菌聚合酶(无论是作为递送复合物的一部分还是作为额外的基因表达构建体)，则真核细胞可以支持某些细菌启动子的胞质转录。
启动子的非限制性实例包括早期或晚期病毒启动子，例如SV40早期或晚期启动子，巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子，劳斯氏肉瘤病毒(RSV)早期启动子；真核细胞启动子，例如β肌动蛋白启动子，GADPH启动子，金属硫蛋白启动子；以及串联反应元件启动子，例如环AMP反应元件启动子(cre)、血清反应元件启动子(sre)、佛波酯启动子(TPA)和最小TATA框附近的反应元件启动子(tre)。还可以使用人生长激素启动子序列(例如，在
Figure BDA0003833433700000481
登录号X05244，核苷酸283-341中描述的人生长激素最小启动子)或小鼠乳腺肿瘤启动子(可从ATCC目录号ATCC 45007获得)。在某些实施方案中，启动子是CMV IE、dectin-1、dectin-2、人CD11c、F4/80、SM22、RSV、SV40、Ad MLP、β-肌动蛋白、I类MHC或II类MHC启动子，但是可用于驱动治疗性基因的表达的任何其他启动子适用于本公开内容的实践。
在某些方面，本公开内容的方法还涉及增强子序列，即，增加启动子的活性并具有顺式地而无论其取向地起作用的潜力(即使在相对长的距离(多至距离靶启动子数千碱基)也如此)的核酸序列。然而，增强子功能不一定限于这样长的距离，因为它们也可以在非常接近给定启动子的情况下起作用。
3.起始信号和连锁表达
特定起始信号也可以用于本公开内容中提供的表达构建体中以用于编码序列的有效翻译。这些信号包括ATG起始密码子或相邻序列。可能需要提供外源翻译控制信号，包括ATG起始密码子。本领域普通技术人员将能够容易地确定这一点并提供必要的信号。众所周知，起始密码子必须与所需编码序列的阅读框“在读框内”，以确保整个插入序列的翻译。外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或合成的。通过包含适当的转录增强子元件可以提高表达效率。
在某些实施方案中，使用内部核糖体进入位点(IRES)元件来产生多基因或多顺反子信使。IRES元件能够绕过5’甲基化的Cap依赖性翻译的核糖体扫描模型，并在内部位点开始翻译。已经描述了来自微小核糖核酸病毒家族的两个成员(脊髓灰质炎和脑心肌炎)的IRES元件，以及来自哺乳动物信使的IRES。IRES元件可以连接到异源开放阅读框。可以将多个开放阅读框一起转录，各自通过IRES隔开，从而产生多顺反子信使。借助于IRES元件，核糖体可接近每个开放阅读框以进行有效翻译。使用单个启动子/增强子来转录单个信使可以有效表达多个基因。
如本文在其他地方所描述的，某些2A序列元件可用于在本公开内容提供的构建体中产生基因的连锁表达或共表达。例如，通过连接开放阅读框以形成单个顺反子，切割序列可用于共表达基因。示例性的切割序列是马鼻炎A病毒(E2A)或F2A(口蹄疫病毒2A)或“2A样”序列(例如，Thosea asigna病毒2A；T2A)或猪捷申病毒-1(P2A)。在特定实施方案中，在单一载体中，多个2A序列是不相同的，然而在替代实施方案中，相同载体利用两个或更多个相同的2A序列。2A序列的实例提供在US 2011/0065779中，其通过引用整体并入本文。
4.复制起点
为了使载体在宿主细胞中繁殖，它可以包含一个或多个复制起始位点(通常称为“ori”)，例如，对应于如上文所述的EBV的oriP或在编程中具有相似或增强的功能的遗传工程化的oriP的核酸序列，复制起始位点是在其上起始复制的特定核酸序列。可替代地，可以使用如上文所述的其他染色体外复制病毒的复制起点或自主复制序列(ARS)。
5.选择性和可筛选标志物
在一些实施方案中，可以通过在表达载体中包含标志物来在体外或体内鉴定含有本公开内容的包含CD70靶向受体构建体的细胞。这样的标志物将赋予细胞可识别的改变，从而允许容易地鉴定含有表达载体的细胞。通常，选择标志物是赋予允许进行选择的属性的标志物。阳性选择标志物是其中标志物的存在允许其选择的标志物，而阴性选择标志物是其中标志物的存在阻止其选择的标志物。阳性选择标志物的一个实例是抗药性标志物。
通常药物选择标志物的包括有助于克隆和鉴定转化体，例如，赋予对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、博来霉素(zeocin)和组氨醇的抗性的基因是有用的选择标志物。除了赋予允许基于条件的实施来区分转化体的表型的标志物之外，还考虑了其他类型的标志物，包括可筛选标志物，例如以比色分析为基础的GFP。可替代地，可以使用可筛选的酶作为阴性选择标志物，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员还将知道如何使用免疫学标志物，可能结合FACS分析使用。所使用的标志物据信是不重要的，只要其能够与编码基因产物的核酸同时表达。选择性和可筛选的标志物的其他实例是本领域技术人员众所周知的。
B.多顺反子载体
在特定实施方案中，CD70靶向受体、任选的自杀基因、任选的细胞因子，和/或任选的治疗基因从多顺反子载体表达(如本文使用的术语“顺反子”是指从其可产生基因产物的核酸序列)。在特定实施方案中，多顺反子载体编码CD70靶向受体、自杀基因，和至少一种细胞因子，和/或工程化受体，例如T细胞受体和/或另外的非CD70靶向CAR。在一些情况下，多顺反子载体编码至少一种CD70靶向CAR、至少一种TNF-α突变体，和至少一种细胞因子。细胞因子可以是特定类型的细胞因子，例如人类或小鼠或任何物种。在特定情况下，细胞因子是IL15、IL12、IL2、IL18和/或IL21。
在某些实施方案中，本公开内容提供灵活的、模块化系统(如本文使用的术语“模块化”是指允许其互换性的顺反子或顺反子的组分，例如通过分别移除和置换整个顺反子或顺反子的组分，例如通过使用标准重组技术)，该模块化系统利用具有以基本相同的水平表达多个顺反子的能力的多顺反子载体。该系统可用于允许多种基因的组合表达(包括过表达)的细胞工程化。在特定实施方案中，由该载体表达的基因中的一个或多个包括一种、两种或更多种抗原受体。多种基因可包含但不限于CAR、TCR、细胞因子、趋化因子、归巢受体、CRISPR/Cas9介导的基因突变、诱饵受体、细胞因子受体、嵌合细胞因子受体等等。该载体可进一步包含：(1)一种或多种报告基因，例如荧光或酶报告基因，例如用于细胞测定和动物成像；(2)一种或多种细胞因子或其他信号传导分子；和/或(3)自杀基因。
在特定情况下，载体可包含至少4个由任何种类的裂解位点(例如2A裂解位点)分开的顺反子。载体可以是或可以不是基于莫洛尼氏鼠白血病病毒(MoMLV或MMLV)，包括在pUC19主链中具有psi包装序列的3’和5’LTR。载体可包含4个或更多个顺反子，该顺反子具有三个或更多个2A裂解位点和多个ORF用于基因交换。在一些实施方案中，系统允许组合过表达多种基因(7种或更多种)，所述基因侧接一个或多个限制性位点以通过亚克隆快速整合，并且该系统还包括至少三个2A自裂解位点。因此，所述系统允许表达多种CAR、TCR、信号传导分子、细胞因子、细胞因子受体和/或归巢受体。该系统还可应用于其他病毒和非病毒载体，包括但不限于慢病毒、腺病毒AAV和非病毒质粒。
系统的模块化性质还能够将基因高效亚克隆至多顺反子表达载体中的4个顺反子中的每一种中并进行基因交换，例如用于快速测试。策略性地位于多顺反子表达载体中的限制性位点允许高效交换基因。
本公开内容的实施方案包含利用多顺反子载体的系统，其中该载体中的至少一部分是模块化的，例如通过允许移除和置换一个或多个顺反子(或一个或多个顺反子的一个或多个组分)，例如通过利用一个或多个限制性内切酶位点，其同一性和位置经特定选择以促进该载体的模块化用途。该载体还具有实施方案，其中将多个顺反子翻译为单一多肽并处理成分开的多肽，由此赋予该载体以基本上等摩尔浓度表达不同的基因产物的优势。
本公开内容的载体被配置为模块化以能够改变该载体的一个或多个顺反子和/或改变一个或多个特定顺反子的一种或多种组分。该载体可经设计以利用一个或多个顺反子的末端侧接和/或特定顺反子的一种或多种组分的末端侧接的独特限制性内切酶位点。
本公开内容的实施方案包括多顺反子载体，其包含至少两个、至少三个或至少四个顺反子，每个顺反子侧接一个或多个限制性内切酶位点，其中至少一个顺反子编码至少一种抗原受体。在一些情况下，将两个、三个、四个或更多个顺反子翻译为单一多肽并裂解为分开的多肽，而在其他情况下，将多个顺反子翻译为单一多肽并裂解为分开的多肽。载体上的相邻顺反子可通过自裂解位点(例如2A自裂解位点)分开。在一些情况下，每个顺反子从载体表达分开的多肽。在特定情况下，载体上的相邻顺反子由IRES元件分开。
在某些实施方案中，本公开内容提供用于细胞工程化的系统，其允许组合表达(包括过表达)多个顺反子，所述顺反子可包括例如一种、两种或更多种抗原受体。在特定实施方案中，使用如本文描述的多顺反子载体允许该载体从同一mRNA产生等摩尔水平的多种基因产物。多种基因可包含但不限于CAR、TCR、细胞因子、趋化因子、归巢受体、CRISPR/Cas9介导的基因突变、诱饵受体、细胞因子受体、嵌合细胞因子受体等。载体可进一步包含一种或多种荧光或酶报告基因，例如用于细胞测定和动物成像。载体还可包含自杀基因产物，用于在不再需要携带该载体的细胞或对已提供该它们的宿主变得有害时，终止携带该载体的细胞。
在本公开内容的特定实施方案中，载体上的顺反子中的至少一种包含两种或更多种模块化组分，其中顺反子内的每个模块化组分侧接一个或多个限制性内切酶位点。一个顺反子可包含例如三种、四种或五种模块化组分。在至少一些情况下，一个顺反子编码一种抗原受体，其具有由相应模块化组分编码的该受体的不同部分。顺反子的第一模块化组分可编码该受体的抗原结合结构域。另外，顺反子的第二模块化组分可编码该受体的铰链区。另外，顺反子的第三模块化组分可编码该受体的跨膜结构域。另外，顺反子的第四模块化组分可编码第一共刺激结构域。另外，顺反子的第五模块化组分可编码第二共刺激结构域。另外，顺反子的第六模块化组分可编码信号传导结构域。
在本公开内容的特定方面，载体上的两个不同顺反子各自编码不同抗原受体。两种抗原受体均可由包含两种或更多种模块化组分的顺反子(包括包含两种或更多种模块化组分的不同顺反子)编码。该抗原受体可以是例如嵌合抗原受体(CAR)和/或T细胞受体(TCR)。
在特定实施方案中，载体是病毒载体(例如，逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体)或非病毒载体。载体可包含莫洛尼氏鼠白血病病毒(MMLV)5’LTR、3’LTR和/或psi包装元件。在特定情况下，将该psi包装并入5’LTR与抗原受体编码序列之间。该载体可包含或可不包含pUC19序列。在该载体的一些方面，至少一个顺反子编码细胞因子(例如，白介素15(IL-15)、IL-7、IL-21、IL-18、IL-12或IL-2)、趋化因子、细胞因子受体和/或归巢受体。
当载体中利用2A裂解位点时，该2A裂解位点可包含P2A、T2A、E2A和/或F2A位点。
除了一个编码CD70靶向CAR的顺反子外，载体的任何顺反子可包含自杀基因。载体的任何顺反子可编码报告基因。在特定实施方案中，第一顺反子编码自杀基因，第二顺反子编码CD70靶向CAR，第三顺反子编码报告基因，和第四顺反子编码细胞因子。在某些实施方案中，第一顺反子编码自杀基因，第二顺反子编码CD70靶向CAR，第三顺反子编码第二CAR或另一抗原受体，和第四顺反子编码细胞因子。在特定实施方案中，该CD70靶向CAR和/或另一受体的不同部分由相应模块化组分编码并且该第二顺反子的第一组分编码抗原结合结构域，第二组分编码铰链和/或跨膜结构域，第三组分编码共刺激结构域，和第四组分编码信号传导结构域。
在特定实施方案中，顺反子中的至少一种编码自杀基因。在一些实施方案中，顺反子中的至少一种编码细胞因子。在某些实施方案中，至少一个顺反子编码CD70靶向CAR。顺反子可编码或可不编码报告基因。在某些实施方案中，至少两个顺反子编码两种不同抗原受体(例如，CAR和/或TCR)。顺反子可编码或可不编码报告基因。
在感兴趣的基因货物(genetic cargo)的特定配置中，单一载体可包含编码CD70靶向CAR的顺反子和编码不同于该CD70靶向受体的第二抗原受体的顺反子。在特定实施方案中，第一抗原受体编码CD70靶向CAR和第二抗原受体编码TCR，或反之亦然。在特定实施方案中，包含分别编码CD70靶向CAR和第二抗原受体的分开的顺反子的载体还包含编码细胞因子或趋化因子的第三顺反子以及编码自杀基因的第四顺反子。然而，该自杀基因和/或该细胞因子(或趋化因子)可不存在于该载体上。
在特定实施方案中，至少一个顺反子包含模块化的多种组分本身。例如，一个顺反子可编码多组分基因产物，例如具有多个部分的抗原受体；在特定情况下，该抗原受体由单一顺反子编码，由此最终产生单一多肽。编码多种组分的顺反子可具有由1、2、3、4、5或更多个限制性内切酶消化位点(包括1、2、3、4、5或更多个包含该顺反子的载体特有的限制性内切酶消化位点)分开的多种组分(图1A和1B)。在特定实施方案中，具有多种组分的顺反子编码具有多个相应部分的抗原受体，各个相应部分赋予该受体独特的功能。在一个特定实施方案中，多组分顺反子的各组分或大多数组分由一个或多个该载体特有的限制性内切酶消化位点分开，允许视需要互换不同组分。
在特定实施方案中，多组分顺反子的各组分对应于经编码的抗原受体(例如CD70靶向CAR)的不同部分。在说明性实施方案中，组分1可编码该受体的CD70抗原-结合结构域；组分2可编码该受体的铰链结构域；组分3可编码该受体的跨膜结构域；组分4可编码该受体的共刺激结构域，以及组分5可编码该受体的信号传导结构域。在特定实施方案中，CD70靶向CAR可包含一个或多个共刺激结构域，各自由独特的限制性内切酶消化位点分开用于该受体内互换一个或多个共刺激结构域。
在特定实施方案中，存在具有四个分开的顺反子的多顺反子载体，其中相邻顺反子由2A裂解位点分开，然而在特定实施方案中，存在代替2A裂解位点的元件，该元件直接或间接引起从该顺反子产生分开的多肽(例如IRES序列)。例如，四个分开的顺反子可由三个2A肽裂解位点分开，并且各顺反子在该顺反子的每个末端侧接限制性位点(X1、X2等)以允许互换特定顺反子，例如与另一顺反子或其他类型的序列互换，并且依赖于使用标准重组技术。在特定实施方案中，每个顺反子的侧翼的一个或多个限制性内切酶位点为该载体特有的以允许易于进行重组，尽管在替代实施方案中，该限制性内切酶位点不是该载体特有的。
在特定实施方案中，载体通过允许在特定顺反子内，包括在特定顺反子的多种组分内互换而提供独特的、第二模块化水平。特定顺反子的多种组分可由一个或多个限制性内切酶位点(包括载体特有的限制性内切酶位点)分开，以允许在该顺反子内互换一种或多种组分。作为实例，顺反子2可包含五种分开的组分，尽管每个顺反子可存在2、3、4、5、6或更多种组分。作为实例，载体可包括具有五种组分的顺反子2，各组分由独特的酶限制性位点X9、X10、X11、X12、X13和X14分开，以允许标准重组来互换不同组分1、2、3、4和/或5。在一些情况下，不同组分间可存在多个限制性内切酶位点(其是独特的，尽管可替代地，一个或多个不是独特的)，并且多个限制性内切酶位点间可存在序列(尽管可替代地，可不存在)。在某些实施方案中，由顺反子编码的所有组分出于可互换的目的来进行设计。在特定情况下，顺反子的一种或多种组分被设计成可互换的，而该顺反子的一种或多种其他组分可不被设计成可互换的。
在特定实施方案中，顺反子编码具有多种组分的CD70靶向CAR分子。例如，顺反子2可包含编码具有由组分1、组分2、组分3等表示的分开的组分的CD70靶向CAR分子的序列。该CAR分子可包含2、3、4、5、6、7、8种或更多种可互换组分。在一个特定实例中，组分1编码CD70scFv；组分2编码铰链；组分3编码跨膜结构域；组分4编码共刺激结构域(尽管还可存在编码侧接限制性位点用于交换的第二个或更多个共刺激结构域的组分4′)；和组分5编码信号传导结构域。在一个特定实例中，组分1编码CD70 scFv；组分2编码IgG1铰链和/或跨膜结构域；组分3编码CD28；和组分4编码CD3ζ。
本领域技术人员知晓在载体的设计中，各种顺反子和组分必须经配置，使得它们在需要时保持在读框内。
在一个特定实例中，顺反子1编码自杀基因；顺反子2编码CD70靶向CAR；顺反子3编码报告基因；顺反子4编码细胞因子；顺反子2的组分1编码CD70 scFv；顺反子2的组分2编码IgG1铰链；顺反子2的组分3编码CD28；和组分4编码CD3ζ。
限制性内切酶位点可以是任何种类并且可以在其识别位点中包括任何数量的碱基，例如4至8个碱基；该识别位点中碱基的数量可以是至少4、5、6、7、8个或更多个。在切割时该位点可产生钝切口或黏性末端。该限制性内切酶可以是例如I型、II型、III型或IV型。限制性内切酶位点可从可用数据库例如整合相关酶数据库(Integrated relationalEnzyme database,IntEnz)或BRENDA(综合酶信息系统)获得。
示例性载体可以是圆形并且按照惯例，其中将位置1(圆形顶部的12点钟位置，以及序列的剩余部分以顺时针方向)设定为5’LTR的起点。
在其中利用自裂解2A肽的实施方案中，该2A肽可以是18至22个氨基酸(aa)长度的病毒寡肽，该病毒寡肽在真核细胞中翻译期间介导多肽的“裂解”。名称“2A”是指病毒基因组的特定区域并且不同病毒2A已一般以衍生其的病毒命名。最先发现的2A是F2A(口蹄疫病毒)，之后还鉴定了E2A(马鼻炎A病毒)、P2A(猪捷申病毒-1 2A)和T2A(thosea asigna病毒2A)。发现2A介导的“自裂解”机制为核醣体跳过在该2A的C末端的甘氨酰-脯氨酰肽键形成。
在特定情况下，载体可以是γ-逆转录病毒转移载体。该逆转录病毒转移载体可包含基于质粒例如pUC19质粒的主链(HindIII和EcoRI限制性内切酶位点之间的大片段(2.63kb))。该主链可携带来自莫洛尼氏鼠白血病病毒(MoMLV)的病毒组分，包括5’LTR、psi包装序列和3’LTR。LTR是在逆转录病毒原病毒两侧上发现的长末端重复序列，并且在转移载体的情况下，将感兴趣的基因货物(例如CD70靶向CAR和相关联的组分)包括在内。还将psi包装序列(其是核衣壳包装的靶位点)顺式掺入，夹在5’LTR和CAR编码序列之间。因此，转移载体的一个实例的基础结构可如此配置：pUC19序列-5’LTR-psi包装序列-感兴趣的基因货物-3’LTR-pUC19序列。该系统还可应用于其他病毒和非病毒载体，包括但不限于慢病毒、腺病毒AAV和非病毒质粒。
V.细胞
本公开内容包含携带至少一种编码CD70靶向受体并且还可编码至少一种细胞因子和/或至少一种自杀基因的载体的任何种类的免疫细胞或干细胞。在一些情况下，不同载体编码CAR相对于编码自杀基因和/或细胞因子。免疫细胞(包括NK细胞)可衍生自脐带血、外周血、诱导多能干细胞(iPSC)、造血干细胞(HSC)、骨髓或其混合物。例如，NK细胞可衍生自例如但不限于NK-92细胞的细胞系。NK细胞可以是脐带血单核细胞，例如CD56+NK细胞。
本公开内容包含任何种类的免疫或其他细胞，包括传统T细胞、γδT细胞、NKT和不变NK T细胞、调节性T细胞、巨噬细胞、B细胞、树突状细胞、间充质基质细胞(MSC)，或其混合物。
在一些情况下，细胞已在有效量的通用抗原呈递细胞(UAPC)的存在下，包括以任何合适的比率扩增。该细胞可与UAPC在例如10:1至1:10；9:1至1:9；8:1至1:8；7:1至1:7；6:1至1:6；5:1至1:5；4:1至1:4；3:1至1:3；2:1至1:2；或1:1的比率下(包括在1:2的比率下)培养。在一些情况下，NK细胞在IL-2的存在下，例如在10至500、10至400、10至300、10至200、10至100、10至50、100至500、100至400、100至300、100至200、200至500、200至400、200至300、300至500、300至400或400至500U/mL的浓度下扩增。
在用一种或多种载体进行基因修饰后，NK细胞可立即输注或可储存。在某些方面，在基因修饰后，该细胞可在基因转移至细胞后约1、2、3、4、5天或更多天内作为大量群体离体繁殖数天、数周或数月。在另一方面，将转染物克隆，并离体扩增证实存在单一整合或附加维持的表达盒或质粒以及CD70靶向CAR的表达的克隆。选择用于扩增的克隆证实特异性识别并裂解表达CD70的靶细胞的能力。重组免疫细胞可通过用IL-2，或结合共同γ链的其他细胞因子(例如，IL-7、IL-12、IL-15、IL-21等)刺激扩增。该重组免疫细胞可通过用人工抗原呈递细胞刺激扩增。在另一方面，基因修饰细胞可冷冻保存。
本公开内容的实施方案包含表达如本文包含的一种或多种CD70靶向CAR和一种或多种自杀基因的细胞。在特定实施方案中，NK细胞包含编码一种或多种CD70靶向CAR和一种或多种工程化不可分泌、膜结合的TNF-α突变体多肽的重组核酸。在特定实施方案中，除了表达一种或多种CD70靶向CAR和TNF-α突变体多肽外，细胞还包含编码一种或多种治疗基因产物的核酸。
细胞可直接获自个体或可获自贮藏室或其他储存设施。作为疗法的细胞相对于作为疗法提供该细胞的个体可以是自体或同种异体的。
细胞可来自需要针对医学病况的疗法的个体，以及在其操作以表达CD70靶向CAR、任选的自杀基因、任选的一种或多种细胞因子和任选的一种或多种治疗基因产物(例如，使用针对过继细胞疗法的转导和扩增的标准技术)后，可将它们提供回至它们原始来源的个体。在一些情况下，储存该细胞以稍后用于该个体或另一个体。
免疫细胞可包含在细胞的群体中，并且该群体的大多数可以用一种或多种CD70靶向受体和/或一种或多种自杀基因和/或一种或多种细胞因子转导。细胞群体可包含51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％经一种或多种CD70靶向受体和/或一种或多种自杀基因和/或一种或多种细胞因子转导的免疫细胞。所述一种或多种CD70靶向受体和/或一种或多种自杀基因和/或一种或多种细胞因子可以是分开的多肽。
为针对特定目的进行模块化，可用一种或多种CD70靶向受体和/或一种或多种自杀基因和/或一种或多种细胞因子产生免疫细胞。例如，细胞可经产生，包括用于商业分布，表达CD70靶向CAR和/或一种或多种自杀基因和/或一种或多种细胞因子(或与编码突变体的核酸一起分布用于后续转导)，并且使用者可根据其预期目的修饰该细胞以表达一种或多种感兴趣的其他基因(包括治疗基因)。例如，有兴趣治疗CD70阳性细胞(包括CD70阳性癌症)的个体可获得或产生自杀基因表达细胞(或异源细胞因子表达细胞)并修饰它们以表达包含CD70特异性scFv的受体，或反之亦然。
在特定实施方案中，利用NK细胞，并且可修饰表达一种或多种CD70靶向CAR和/或一种或多种自杀基因和/或一种或多种细胞因子的经转导的NK细胞的基因组。该基因组可以任何方式修饰，但在特定实施方案中，该基因组通过例如CRISPR基因编辑修饰。出于任何目的，细胞的基因组可经修饰以增强该细胞的有效性。
VI.CD70特异性CAR细胞的基因编辑
在特定实施方案中，包含至少一种CD70特异性工程化受体的细胞经基因编辑以修饰细胞中一种或多种内源基因的表达。在特定情况下，CD70特异性CAR细胞经修饰以具有表达水平降低的一种或多种内源基因，包括抑制一种或多种内源基因的表达(其可称为敲除)。这样的细胞可扩增或可不扩增。
在特定情况下，CD70特异性CAR细胞的一种或多种内源基因是经修饰的，例如表达中断，其中所述表达部分或完全降低。在特定情况下，使用本公开内容的方法敲低或敲除一种或多种基因。在特定情况下，敲低或敲除多个基因，并且这可以在或可以不在产生它们的过程中的相同步骤中发生。在CD70特异性CAR细胞中编辑的基因可以是任何种类的，但在特定实施方案中，作为一个实例，该基因是基因产物抑制该CD70特异性CAR细胞(包括CD70特异性CAR NK细胞，例如衍生自脐带血的那些)的活性和/或增殖的基因。在特定情况下，在CD70特异性CAR细胞中编辑的基因允许该CD70特异性CAR细胞在肿瘤微环境中更有效地发挥作用。在特定情况下，该基因是以下中的一个或多个：NKG2A、SIGLEC-7、LAG3、TIM3、CISH、FOXO1、TGFBR2、TIGIT、CD96、ADORA2、NR3C1、PD1、PDL-1、PDL-2、CD47、SIRPA、SHIP1、ADAM17、RPS6、4EBP1、CD25、CD40、IL21R、ICAM1、CD95、CD80、CD86、IL10R、CD5和CD7。在特定实施方案中，TGFBR2基因在CD70特异性CAR细胞中被敲除或敲减。
在一些实施方案中，使用一种或多种DNA结合核酸进行基因编辑，例如通过RNA指导的核酸内切酶(RGEN)进行改变。例如，可以使用规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关(Cas)蛋白进行改变；在一些实施方案中，使用CpF1代替Cas9。通常，“CRISPR系统”总体地指与CRISPR相关(“Cas”)基因的表达或指导CRISPR相关(“Cas”)基因的活性有关的转录物和其他元件，包括编码Cas基因的序列、tracr(反式激活CRISPR)序列(例如，tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr配对序列(在内源CRISPR系统的背景下包含“直接重复序列”和tracrRNA处理的部分直接重复序列)、指导序列(在内源CRISPR系统的背景下也称为“间隔序列”)和/或来自CRISPR基因座的其他序列和转录物。
CRISPR/Cas核酸酶或CRISPR/Cas核酸酶系统可包括非编码RNA分子(指导)RNA(其序列特异性结合DNA)和具有核酸酶功能(例如，两个核酸酶结构域)的Cas蛋白(例如，Cas9)。CRISPR系统的一个或多个元件可以来源于I型、II型或III型CRISPR系统，例如来源于包含内源性CRISPR系统的特定生物，例如化脓链球菌。
在一些方面，将Cas核酸酶和gRNA(包括对靶序列特异的crRNA和固定的tracrRNA的融合体)引入细胞中。通常，使用互补碱基配对，在gRNA的5’末端的靶位点将Cas核酸酶靶向至靶位点，例如基因。靶位点可以基于其紧邻前间区序列邻近基序(PAM)序列的5’的位置(例如，通常为NGG或NAG)进行选择。在这方面，通过修饰指导RNA的前20、19、18、17、16、15、14、14、12、11或10个核苷酸以对应于靶DNA序列来将gRNA靶向至所需序列。通常，CRISPR系统的特征在于促进靶序列位点处的CRISPR复合物形成的元件。通常，“靶序列”通常是指指导序列被设计成与其具有互补性的序列，其中靶序列和指导序列之间的杂交促进CRISPR复合物的形成。如果存在足够的互补性以引起杂交并促进CRISPR复合物的形成，则不一定需要完全互补。
CRISPR系统可以在靶位点诱导双链断裂(DSB)，随后引起如本文所讨论的破坏或改变。在其他实施方案中，被认为是“切口酶”的Cas9变体用于在靶位点处对单链切口。可以使用成对的切口酶，例如以改善特异性，其各自由不同gRNA靶向序列对指导，使得在同时引入切口时，引入5’突出端。在其他实施方案中，将无催化活性的Cas9融合至异源效应子结构域，例如转录阻遏物或激活子，以影响基因表达。
靶序列可以包含任何多核苷酸，例如DNA或RNA多核苷酸。靶序列可以位于细胞的细胞核或细胞质中，例如在细胞的细胞器内。通常，可用于重组为包含靶序列的靶基因座的序列或模板称为“编辑模板”或“编辑多核苷酸”或“编辑序列”。在一些方面，外源模板多核苷酸可以被称为编辑模板。在一些方面，重组是同源重组。
通常，在内源性CRISPR系统的情况下，CRISPR复合物(包含与靶序列杂交并与一种或多种Cas蛋白复合的指导序列)的形成导致在靶序列中或其附近(例如，在靶序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50个或更多个碱基对内)的一条或两条链的切割。tracr序列(其可以包含野生型tracr序列的全部或一部分或由其组成(例如，野生型tracr序列的约或大于约20、26、32、45、48、54、63、67、85个或更多个核苷酸))也可以形成CRISPR复合物的一部分，例如通过沿着tracr序列的至少一部分与可操作地连接至指导序列的tracr配对序列的全部或一部分杂交。tracr序列与tracr配对序列具有足够的互补性，以杂交并参与CRISPR复合物的形成，例如当最佳匹配时沿tracr配对序列的长度至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的序列互补性。
可以将驱动CRISPR系统的一种或多种元件的表达的一种或多种载体引入细胞，使得CRISPR系统的元件的表达指导在一个或多个靶位点形成CRISPR复合物。组分也可以作为蛋白质和/或RNA递送到细胞。例如，Cas酶、连接至tracr-配对序列的指导序列和tracr序列可各自可操作地连接至单独载体上的单独调控元件。可替代地，可以将从相同或不同调控元件表达的两个或更多个元件组合在单个载体中，而一个或多个附加载体提供不包含在第一载体中的CRISPR系统的任何组分。载体可以包含一个或多个插入位点，例如限制性核酸内切酶识别序列(也称为“克隆位点”)。在一些实施方案中，一个或多个插入位点位于一个或多个载体的一个或多个序列元件的上游和/或下游。当使用多个不同的指导序列时，单个表达构建体可以用于将CRISPR活性靶向至细胞内的多个不同的相应靶序列。
载体可以包含与编码CRISPR酶(例如Cas蛋白)的酶编码序列可操作地连接的调节元件。Cas蛋白的非限制性实例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4、其同源物或其修饰形式。这些酶是已知的；例如，化脓链球菌Cas9蛋白的氨基酸序列可以在SwissProt数据库中以登录号Q99ZW2找到。
CRISPR酶可以是Cas9(例如来自化脓链球菌或肺炎链球菌)。在一些情况下，可以使用CpF1代替Cas9蛋白用作核酸内切酶。在一些实施方案中，酶是高保真酶。CRISPR酶可以指导在靶序列位置处一条或两条链的切割，例如在靶序列内和/或在靶序列的互补序列内。载体可以编码相对于相应的野生型酶被突变的CRISPR酶，使得突变的CRISPR酶缺乏切割含有靶序列的靶多核苷酸的一条或两条链的能力。例如，来自化脓链球菌的Cas9的RuvC I催化结构域中的天冬氨酸至丙氨酸取代(D10A)将Cas9从切割两条链的核酸酶转化成切口酶(切割单链)。在一些实施方案中，Cas9切口酶可以与一个或多个指导序列例如两个指导序列(其分别靶向DNA靶标的有义链和反义链)组合使用。这种组合允许两条链都被切口并用于诱导NHEJ或HDR。
在一些实施方案中，对编码CRISPR酶的酶编码序列进行密码子优化以在特定细胞(例如真核细胞)中表达。真核细胞可以是特定生物(例如哺乳动物，包括但不限于人，小鼠，大鼠，兔，狗或非人灵长类)的真核细胞或来源于该特定生物的真核细胞。一般而言，密码子优化是指通过用在宿主细胞的基因中更频繁或最频繁使用的密码子替换天然序列的至少一个密码子同时保持天然氨基酸序列来修饰核酸序列以在感兴趣的宿主细胞中增强表达的过程。各种物种对特定氨基酸的某些密码子表现出特定的偏倚。密码子偏倚(生物之间密码子使用的差异)通常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，其进而被认为取决于(除其他以外)翻译的密码子的性质和特定转移RNA(tRNA)分子的可用性。所选tRNA在细胞中的优势通常反映了肽合成中最常使用的密码子。因此，可以基于密码子优化针对在给定生物中的最佳基因表达定制基因。
一般而言，指导序列是与靶多核苷酸序列具有足够互补性以与靶序列杂交并指导CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合的任何多核苷酸序列。在一些实施方案中，当使用合适的比对算法进行最佳比对时，指导序列与其相应的靶序列之间的互补程度为约或大于约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或更高。
可以使用任何合适的用于比对序列的算法来确定最佳比对，算法的非限制性实例包括Smith-Waterman算法，Needleman-Wunsch算法，基于Burrows-Wheeler变换的算法(例如Burrows Wheeler Aligner)，Clustal W，Clustal X，BLAT，Novoalign(NovocraftTechnologies,ELAND(Illumina,San Diego,Calif.)，SOAP(可在soap.genomics.org.cn上获得)和Maq(可在maq.sourceforge.net上获得)。
CRISPR酶可以是包含一个或多个异源蛋白结构域的融合蛋白的一部分。CRISPR酶融合蛋白可包含任何其他蛋白质序列，以及任选地任何两个结构域之间的接头序列。可以与CRISPR酶融合的蛋白质结构域的实例包括但不限于表位标签，报告基因序列和具有以下一种或多种活性的蛋白结构域：甲基化酶活性，脱甲基酶活性，转录激活活性，转录抑制活性，转录释放因子活性，组蛋白修饰活性，RNA切割活性和核酸结合活性。表位标签的非限制性实例包括组氨酸(His)标签，V5标签，FLAG标签，流感血凝素(HA)标签，Myc标签，VSV-G标签和硫氧还蛋白(Trx)标签。报告基因的实例包括但不限于谷胱甘肽-5-转移酶(GST)，辣根过氧化物酶(HRP)，氯霉素乙酰转移酶(CAT)，β半乳糖苷酶，β-葡糖醛酸糖苷酶，荧光素酶，绿色荧光蛋白(GFP)，HcRed，DsRed，青色荧光蛋白(CFP)，黄色荧光蛋白(YFP)和自发荧光蛋白包括蓝色荧光蛋白(BFP)。CRISPR酶可以与编码结合DNA分子或结合其他细胞分子的蛋白质或蛋白质片段的基因序列融合，包括但不限于麦芽糖结合蛋白(MBP)，S-标签，Lex A DNA结合结构域(DBD)融合体，GAL4A DNA结合结构域融合体和单纯疱疹病毒(HSV)BP16蛋白融合体。可以形成包含CRISPR酶的融合蛋白的一部分的其他结构域在US 20110059502中描述，其通过引用并入本文。
VII.治疗方法
在各种实施方案中，出于在患有医学病况的个体中改善该医学病况的目的或出于在个体中降低该医学病况的风险或延迟其严重性和/或发作的目的，靶向在其表面上表达内源CD70的细胞。在特定情况下，出于杀伤癌细胞的目的，靶向表达内源CD70的癌细胞。在其他情况下，CD70作为CD70阳性细胞被靶向，但该CD70阳性细胞不是癌细胞。在这样的情况下，CD70阳性细胞可以是免疫调节细胞(例如调节性T细胞)。靶向并耗竭CD70+调节性T细胞可通过去除该细胞亚集的免疫抑制效应进一步增强癌症的免疫疗法。因此，在特定实施方案中，存在通过提供有效量的靶向CD70的细胞降低癌症疗法的免疫抑制的方法，如本文描述的。
如本文考虑的CD70靶向CAR构建体、核酸序列、载体、免疫细胞等，和/或包含其的药物组合物用于预防、治疗或改善癌性疾病(例如肿瘤性疾病)。在特定实施方案中，本公开内容的药物组合物可特别用于预防、改善和/或治疗癌症，例如，包括表达CD70并且可以是或可以不是实体瘤的癌症。
利用CD70靶向受体的免疫细胞可以是NK、T细胞、γδT细胞，或NKT或不变NKT(iNKT)，或在特定实施方案中为经工程化用于哺乳动物的细胞疗法的诱导NKT细胞。在该细胞为NK细胞的情况下，NK细胞疗法可以是任何种类的并且该NK细胞可以是任何种类的。在特定实施方案中，细胞是已经工程化以表达一种或多种CD70靶向CAR和/或一种或多种自杀基因和/或一种或多种细胞因子的NK细胞。在特定实施方案中，细胞是用CD70靶向CAR转导的NK细胞。
在特定实施方案中，本公开内容部分考虑可使用标准载体和/或基因递送系统单独施用或以任何组合施用的CD70 CAR-表达细胞、CD70靶向CAR构建体、CD70靶向CAR核酸分子和CD70靶向CAR载体，并且在至少一些方面，连同药学上可接受的承载体或赋形剂一起施用。在某些实施方案中，在施用后，可将该核酸分子或载体稳定整合至受试者的基因组内。
在特定实施方案中，可使用对某些细胞或组织具特异性且持续存在于NK细胞中的病毒载体。合适的药物承载体和赋形剂是本领域众所周知的。根据本公开内容制备的组合物可用于预防或治疗或延迟上文识别的疾病。
此外，本公开内容涉及用于预防、治疗或改善肿瘤性疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的表达如本文考虑和/或通过如本文考虑的方法产生的CD70靶向CAR、核酸序列、载体的细胞的步骤。
施用示例性CD70靶向CAR细胞的一种或多种组合物的可能适应症是癌性疾病，包括肿瘤性疾病，包括例如B细胞恶性肿瘤、多发性骨髓瘤、乳腺癌、胶质母细胞瘤、肾癌、胰腺癌或肺癌。施用CD70靶向CAR细胞的一种或多种组合物的示例性适应症是癌性疾病，包括表达CD70的任何恶性肿瘤。施用本公开内容的一种或多种组合物适用于所有阶段(I、II、III或IV)和类型的癌症，包括例如适用于微量残留病、早期癌症、晚期癌症，和/或转移性癌症和/或难治性癌症。
本公开内容进一步包含与其他化合物例如双特异性抗体构建体、靶向毒素或经由免疫细胞发挥作用的其他化合物共施用的方案。用于共施用本发明的一种或多种化合物的临床方案可包括在施用其他组分的同时、之前或之后共施用。特定组合疗法包括化学疗法、放射、手术、激素疗法，或其他类型的免疫疗法。
实施方案涉及包含如本文定义的CD70靶向CAR构建体、如本文定义的核酸序列、如本文定义的载体和/或如本文定义的宿主细胞(例如免疫细胞)的试剂盒。还考虑本公开内容的试剂盒包含如本文上文描述的药物组合物，单独或与待向需医疗或干预的个体施用的其他药物组合。
A.药物组合物
本文还提供包含经转导的NK细胞和医药上可接受的承载体的药物组合物和制剂。所述经转导的细胞可包含在适用于转移至个体的介质和/或适用于包括在转移至个体的前保存(例如冷冻保存)的介质中。
本文所述的药物组合物和制剂可通过将具有所需纯度的活性成分(例如细胞)与一种或多种任选的药学上可接受的承载体混合来制备(Remington's PharmaceuticalSciences第22版,2012)，其呈冻干制剂或水性溶液的形式。药学上可接受的承载体在所采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，例如钠；金属配合物(例如Zn-蛋白配合物)；和/或非离子表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药学上可接受的承载体还包括间质药物分散剂，例如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(
Figure BDA0003833433700000671
Baxter International,Inc.)。在美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中描述了某些示例性的sHASEGP和使用方法，其包括rHuPH20。在一个方面，将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺葡聚糖酶(例如软骨素酶)组合。
B.组合疗法
在某些实施方案中，本实施方案的组合物和方法涉及与至少一种另外的疗法组合的免疫细胞群体(包括NK细胞群体)。另外的疗法可以是放射疗法，手术(例如，肿块切除术和乳房切除术)，化学疗法，基因疗法，DNA疗法，病毒疗法，RNA疗法，免疫疗法，骨髓移植，纳米疗法，单克隆抗体疗法，激素疗法，溶瘤病毒或前述的组合。另外的疗法可以是辅助疗法或新辅助疗法的形式。
在一些实施方案中，另外的疗法是小分子酶抑制剂或抗转移剂的施用。在一些实施方案中，另外的疗法是副作用限制剂(例如，旨在减少治疗的副作用的发生和/或严重性的药剂，例如抗恶心剂等)的施用。在一些实施方案中，另外的疗法是放射疗法。在一些实施方案中，另外的疗法是手术。在一些实施方案中，另外的疗法是放射疗法和手术的组合。在一些实施方案中，另外的疗法是γ辐照。在一些实施方案中，另外的疗法是靶向PBK/AKT/mTOR途径疗法，HSP90抑制剂，微管蛋白抑制剂，细胞凋亡抑制剂和/或化学预防剂。另外的疗法可以是本领域已知的一种或多种化学治疗剂。
可以相对于另外的癌症疗法(例如免疫检查点疗法)在之前、期间、之后或以各种组合施用免疫细胞疗法。施用间隔可以从同时至数分钟至数天至数周。在其中免疫细胞疗法与另外的治疗剂分开地提供给患者的实施方案中，通常将确保在每次递送的时间之间没有显著的时间段到期，使得两种化合物将仍然能够发挥对患者有利的联合作用。在这样的情况下，预期可以在彼此约12至24或72小时内，更具体地在彼此约6-12小时内为患者提供抗体疗法和抗癌疗法。在某些情况下，可能期望将治疗时间显著延长，其中在各自施用之间流逝几天(2、3、4、5、6或7)至几周(1、2、3、4、5、6、7或8)。
可以采用各种组合。对于下面的实例，免疫细胞疗法为“A”，和抗癌疗法为“B”：
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
考虑到试剂的毒性(如果有的话)，本实施方案的任何化合物或细胞疗法向患者的施用将遵循用于施用此类化合物的一般方案。因此，在一些实施方案中，存在监测归因于组合疗法的毒性的步骤。
1.化学疗法
根据本发明的实施方案，可以使用多种化学治疗剂。术语“化学疗法”是指使用药物来治疗癌症。“化学治疗剂”用于表示在癌症的治疗中施用的化合物或组合物。这些药剂或药物根据它们在细胞内的活动方式(例如，它们是否影响细胞周期以及在什么阶段影响细胞周期)进行分类。可替代地，药剂可以基于其直接交联DNA、插入DNA或通过影响核酸合成来诱导染色体和有丝分裂畸变的能力来进行表征。
化学治疗剂的实例包括烷基化剂，例如噻替派(thiotepa)和环磷酰胺；烷基磺酸盐，诸如白消安，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，例如苯并多巴(benzodopa)，卡波醌(carboquone)，米特多巴(meturedopa)和尤利多巴(uredopa)；乙烯亚胺和甲基氨基吖啶(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)，三乙烯三聚氰胺(triethylenemelamine)，三乙烯磷酰胺(trietylenephosphoramide)，三乙烯硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三甲基三聚氰胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰(acetogenins)(特别是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成类似物拓朴替康(topotecan))；苔藓抑素；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)，卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；念珠藻素(cryptophycin)(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；海兔毒素(dolastatin)；多卡霉素(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；eleutherobin；水鬼蕉碱(pancratistatin)；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥，例如苯丁酸氮芥，萘氮芥(chlornaphazine)，氯磷酰胺(cholophosphamide)，雌氮芥(estramustine)，异环磷酰胺(ifosfamide)，甲氮芥(mechlorethamine)，盐酸甲氧氮芥(mechlorethamineoxidehydrochloride)，美法仑(melphalan)，新恩比兴(novembichin)，苯芥胆甾醇(phenesterine)，泼尼氮芥(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，和尿嘧啶氮芥；亚硝基尿素，诸如卡莫司汀(carmustine)，氯脲霉素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如，卡奇霉素(calicheamicin)，特别是卡奇霉素γII和卡奇霉素ωII)；达米辛(dynemicin)，包括达米辛A；双膦酸盐，例如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素生色团和相关的色蛋白烯二炔类抗生素生色团，aclacinomysin，放线菌素(actinomycin)，安曲霉素(authrarnycin)，重氮丝氨酸，博来霉素(bleomycins)，放线菌素C(cactinomycin)，卡拉比辛(carabicin)，洋红霉素(carminomycin)，嗜癌菌素(carzinophilin)，色霉素(chromomycinis)，放线菌素D(dactinomycin)，道诺霉素(daunorubicin)，地托比星(detorubicin)，6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸，多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉基-多柔比星，氰基吗啉基-多柔比星，2-吡咯啉基-多柔比星，和deoxydoxorubicin)，表柔比星(epirubicin)，伊达比星(esorubicin)，去甲氧正定霉素(idarubicin)，麻西罗霉素(marcellomycin)，丝裂霉素例如丝裂霉素C，霉酚酸，诺加霉素(nogalarnycin)，橄榄霉素(olivomycins)，培洛霉素(peplomycin)，紫菜霉素(potfiromycin)，嘌呤霉素，三铁阿霉素(quelamycin)，罗多比星(rodorubicin)，链黑菌素(streptonigrin)，链唑霉素(streptozocin)，杀结核菌素(tubercidin)，乌苯美司(ubenimex)，净司他丁(zinostatin)，和佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物例如二甲叶酸，蝶罗呤(pteropterin)，和三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物例如氟达拉滨(fludarabine)，6-巯嘌呤，硫咪嘌呤，和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物例如环胞苷，阿扎胞苷，6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷，二脱氧尿苷，去氧氟尿苷，依诺他滨(enocitabine)，和氟尿苷；雄激素，例如卡普睾酮(calusterone)，丙酸甲雄烷酮(dromostanolone propionate)，表硫雄醇(epitiostanol)，美雄烷(mepitiostane)，和睾内脂(testolactone)；抗肾上腺，例如米托坦(mitotane)和曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂例如亚叶酸；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比山群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；得弗伐胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵；埃博霉素(epothilone)；乙环氧啶(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；磨茹多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登醇(maytansinoids)，例如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；mopidanmol；nitraerine；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基肼类；甲基苄肼；PSK多糖复合物；丙亚胺(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细格孢氮杂酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌；2,2’,2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯族毒素类(特别是T-2毒素，黏液霉素A，杆孢菌素A和anguidine)；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；氮烯唑胺(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌血生(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；紫杉烷，例如紫杉醇和多西他赛吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；铂配位复合物例如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；能灭瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐；伊利替康(irinotecan)(例如CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇，例如视黄酸；卡培他滨(capecitabine)；卡铂，甲基苄肼(procarbazine)，plicomycin，吉西他滨，那韦尔滨(navelbine)，法呢基蛋白转移酶抑制剂，跨铂(transplatinum)和上述任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
2.放射疗法
引起DNA损伤并已被广泛使用的其他因素包括通常已知的γ射线、X射线和/或放射性同位素向肿瘤细胞的定向递送。也可以考虑其他形式的DNA损伤因素，例如微波、质子束辐照(美国专利5,760,395和4,870,287)和UV辐照。最有可能的是所有这些因素影响对DNA、DNA的前体、DNA的复制和修复以及染色体的装配和维持的广泛损害。X射线的剂量范围从长时间(3-4周)的50至200伦琴的每日剂量到2000至6000伦琴的单剂量。放射性同位素的剂量范围广泛变化，并且取决于同位素的半衰期、所发射的辐照的强度和类型以及肿瘤细胞的吸收。
3.免疫疗法
本领域技术人员将理解，其他免疫疗法可以与实施方案的方法组合或结合使用。在癌症治疗的背景下，免疫疗法通常依靠使用免疫效应细胞和分子来靶向和破坏癌细胞。利妥昔单抗
Figure BDA0003833433700000711
是这样的实例。免疫效应子可以是例如对肿瘤细胞表面上的某些标志物具有特异性的抗体。单独的抗体可以充当疗法的效应子，或者它可以募集其他细胞来实际影响细胞杀伤。抗体也可以与药物或毒素(化学治疗剂，放射性核素，蓖麻毒蛋白A链，霍乱毒素，百日咳毒素等)缀合，并用作靶向剂。可替代地，效应子可以是携带直接或间接与肿瘤细胞靶相互作用的表面分子的淋巴细胞。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
抗体-药物缀合物已成为研发癌症治疗剂的突破性方法。癌症是世界上主要的死亡原因之一。抗体-药物缀合物(ADC)包含共价连接至细胞杀伤药物的单克隆抗体(MAb)。这种方法将MAb针对其抗原靶标的高特异性与高效的细胞毒性药物结合在一起，从而产生了“经武装的”MAb，其将有效载荷(药物)递送至具有丰富抗原水平的肿瘤细胞。药物的靶向递送还使其在正常组织中的暴露降至最低，从而降低了毒性并改善了治疗指数。FDA批准的两种ADC药物(2011年批准的
Figure BDA0003833433700000721
(本妥昔单抗(brentuximab vedotin))以及2013年批准的
Figure BDA0003833433700000722
(恩美曲妥珠单抗(trastuzumab emtansine)或T-DM1))验证了该方法。目前在癌症治疗的临床试验的各种阶段中，存在超过30种ADC药物候选物(Leal等人，2014)。随着抗体工程化和接头-有效载荷优化变得越来越成熟，新型ADC的发现和研发越来越依赖于适用于此方法的新靶标的识别和验证以及靶向Mab的产生。ADC靶标的两个准则是在肿瘤细胞中表达的上调/高水平表达及稳健内化。
在免疫疗法的一方面，肿瘤细胞必须带有一些易于靶向的标志物，即其在大多数其他细胞上不存在。存在许多肿瘤标志物，并且在本发明的实施方案的背景下，这些肿瘤标志物中的任何一种都可能适于靶向。常见的肿瘤标志物包括CD20，癌胚抗原，酪氨酸酶(p97)，gp68，TAG-72，HMFG，唾液酸化的路易斯抗原，MucA，MucB，PLAP，层粘连蛋白受体，erbB和p155。免疫疗法的可选择的方面是将抗癌作用与免疫刺激作用相结合。还存在免疫刺激分子，包括：细胞因子，例如IL-2，IL-4，IL-12，GM-CSF，γ-IFN，趋化因子，例如MIP-1，MCP-1，IL-8和生长因子，例如FLT3配体。
目前正在研究或使用中的免疫疗法的实例是免疫佐剂，例如，牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、二硝基氯苯和芳族化合物(美国专利5,801,005和5,739,169；Hui和Hashimoto，1998；Christodoulides等人，1998)；细胞因子疗法，例如，干扰素α、β和γ、IL-1、GM-CSF和TNF(Bukowski等人，1998；Davidson等人，1998；Hellstrand等人，1998)；基因疗法，例如，TNF、IL-1、IL-2和p53(Qin等人，1998；Austin-Ward和Villaseca，1998；美国专利5,830,880和5,846,945)；和单克隆抗体，例如，抗CD20、抗神经节甘脂GM2以及抗p185(Hollander，2012；Hanibuchi等人，1998；美国专利5,824,311)。预期可以将一种或多种抗癌疗法与本文所述的抗体疗法一起使用。
在一些实施方案中，免疫疗法可以是免疫检查点抑制剂。免疫检查点调高信号(例如共刺激分子)或调低信号。可以被免疫检查点阻滞靶向的抑制性免疫检查点包括腺苷A2A受体(A2AR)，B7-H3(也称为CD276)，B和T淋巴细胞弱化剂(BTLA)，细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4，也称为CD152)，吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)，杀伤细胞免疫球蛋白(KIR)，淋巴细胞激活基因3(LAG3)，程序性死亡1(PD-1)，T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)和T细胞激活的V-结构域Ig抑制剂(VISTA)。特别地，免疫检查点抑制剂靶向PD-1轴和/或CTLA-4。
免疫检查点抑制剂可以是药物，例如小分子，配体或受体的重组形式，或者特别是抗体，例如人抗体(例如，国际专利公开WO2015016718；Pardoll，Nat Rev Cancer，12(4):252-64，2012；两者均通过引用并入本文)。可以使用免疫检查点蛋白或其类似物的已知抑制剂，特别是可以使用抗体的嵌合、人源化或人形式。如本领域技术人员将知道的，替代和/或等同名称可以用于本公开内容中提及的某些抗体。在本公开内容的上下文中，这样的替代和/或等同名称是可互换的。例如，已知兰博利珠单抗(lambrolizumab)也已知为替代和等同名称MK-3475和派姆单抗(pembrolizumab)。
在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1与其配体结合伴侣结合的分子。在特定方面，PD-1配体结合伴侣是PDL1和/或PDL2。在另一个实施方案中，PDL1结合拮抗剂是抑制PDL1与其结合伴侣结合的分子。在特定方面，PDL1结合伴侣是PD-1和/或B7-1。在另一个实施方案中，PDL2结合拮抗剂是抑制PDL2与其结合伴侣结合的分子。在特定方面，PDL2结合伴侣是PD-1。拮抗剂可以是抗体，其抗原结合片段，免疫粘附素，融合蛋白或寡肽。示例性抗体描述于美国专利号US8735553、US8354509和US8008449中，其均通过引用并入本文。用于本文提供的方法中的其他PD-1轴拮抗剂是是本领域已知的，例如描述于美国专利申请号US20140294898、US2014022021和US20110008369中，其均通过引用并入本文。
在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。在一些实施方案中，抗PD-1抗体选自纳武单抗、派姆单抗和CT-011。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是免疫粘附素(例如，包含与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)融合的PDL1或PDL2的细胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素)。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是AMP-224。纳武单抗(也称为MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558和
Figure BDA0003833433700000741
)是WO2006/121168中描述的抗PD-1抗体。派姆单抗(也称为MK-3475、Merck3475、兰博利珠单抗、
Figure BDA0003833433700000742
和SCH-900475)是WO2009/114335中描述的抗PD-1抗体。CT-011(也称为hBAT或hBAT-1)是WO2009/101611中描述的抗PD-1抗体。AMP-224(也称为B7-DCIg)是WO2010/027827和WO2011/066342中描述的PDL2-Fc融合可溶性受体。
可以在本文提供的方法中靶向的另一个免疫检查点是细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)，也称为CD152。人CTLA-4的完整cDNA序列的Genbank登录号为L15006。CTLA-4发现于T细胞的表面，并且当与抗原呈递细胞表面上的CD80或CD86结合时，充当“关闭”开关。CTLA4是免疫球蛋白超家族的成员，其在辅助T细胞的表面表达并向T细胞传递抑制信号。CTLA4与T细胞共刺激蛋白CD28相似，并且两种分子均与抗原呈递细胞上的CD80和CD86(分别也称为B7-1和B7-2)结合。CTLA4将抑制信号传递给T细胞，而CD28传递刺激信号。细胞内CTLA4也存在于调节性T细胞中，并且可能对它们的功能很重要。通过T细胞受体和CD28的T细胞活化导致CTLA-4(B7分子的抑制受体)的表达增加。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。
适用于本发明方法的抗人-CTLA-4抗体(或来源于其的VH和/或VL结构域)可以使用本领域众所周知的方法产生。可替代地，可使用本领域众所周知的抗CTLA-4抗体。例如，公开于以下中的抗CTLA-4抗体可用于本文公开的方法中：US 8,119,129、WO 01/14424、WO98/42752；WO 00/37504(CP675,206，也称为曲美莫单抗(tremelimumab)；原名地西林单抗(ticilimumab))、美国专利号6,207,156；Hurwitz等人，(1998)Proc Natl Acad Sci USA95(17):10067-10071；Camacho等人，(2004)J Clin Oncology 22(145):摘要号2505(抗体CP-675206)；以及Mokyr等人，(1998)Cancer Res 58:5301-5304。前述公开中的每一个的教导通过引用并入本文。也可使用与这些本领域公认的抗体中的任一个竞争结合至CTLA-4的抗体。例如，人源化CTLA-4抗体描述于国际专利申请号WO2001014424、WO2000037504，以及美国专利号8,017,114中；其均通过引用并入本文。
示例性抗CTLA-4抗体是伊匹单抗(也称为10D1，MDX-010，MDX-101和
Figure BDA0003833433700000751
)或其抗原结合片段和变体(参见，例如WO 01/14424)。在其他实施方案中，抗体包含伊匹单抗的重链和轻链CDR或VR。因此，在一个实施方案中，抗体包含伊匹单抗的VH区的CDR1，CDR2和CDR3结构域，以及伊匹单抗的VL区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一个实施方案中，该抗体竞争与CTLA-4上与上述抗体相同的表位的结合和/或与CTLA-4上与上述抗体相同的表位结合。在另一个实施方案中，该抗体与上述抗体具有至少约90％的可变区氨基酸序列同一性(例如，与伊匹单抗具有至少约90％，95％或99％的可变区同一性)。
调节CTLA-4的其他分子包括CTLA-4配体和受体，例如描述于美国专利号US5844905、US5885796以及国际专利申请号WO1995001994和WO1998042752中；其均通过引用并入本文，以及免疫粘附素，例如描述于美国专利号US8329867中，其通过引用并入本文。
4.手术
大约60％的癌症患者将接受某种类型的手术，包括预防性、诊断或分期性、治愈性和姑息手术。治愈性手术包括切除(其中全部或部分癌组织被物理移除、切除和/或破坏)，并且可以与其他疗法(例如本实施方案的治疗，化学疗法，放射疗法，激素疗法，基因疗法，免疫疗法和/或替代疗法)结合使用。肿瘤切除术是指肿瘤的至少一部分的物理切除。除肿瘤切除术外，手术治疗还包括激光手术、冷冻手术、电外科手术和显微控制手术(莫氏手术)。
在切除部分或全部癌细胞、组织或肿瘤后，可在体内形成空腔。可以通过使用其他抗癌疗法对该区域进行灌注、直接注射或局部应用来完成治疗。例如，可以每1、2、3、4、5、6或7天，或者每1、2、3、4和5周或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月重复这种治疗。这些治疗也可以具有不同的剂量。
5.其他药剂
预期可以将其他药剂与本发明的实施方案的某些方面组合使用以改善治疗的疗效。这些另外的药剂包括影响细胞表面受体的上调和GAP连接的药剂，细胞生长抑制剂和分化剂，细胞粘附抑制剂，增加过度增殖细胞对凋亡诱导剂的敏感性的药剂或其他生物药剂。通过增加GAP连接数增加细胞间信号转导将增加对邻近的过度增殖细胞群的抗过度增殖作用。在其他实施方案中，细胞生长抑制剂或分化剂可以与本发明的实施方案的某些方面结合使用以改善治疗的抗过度增殖功效。预期细胞粘附抑制剂可改善本发明实施方案的功效。细胞粘附抑制剂的实例是粘着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀。进一步考虑了增加过度增殖细胞对凋亡的敏感性的其他试剂(例如抗体c225)与本发明实施方案的某些方面组合使用以改善治疗功效。
VIII.本公开内容的试剂盒
本文描述的组合物中的任一种可包含在试剂盒中。在一个非限制性实例中，细胞、产生细胞的试剂、载体和产生载体和/或其组分的试剂可包含在试剂盒中。在某些实施方案中，NK细胞可包含在试剂盒中，并且它们还可以表达或可以不表达CD70靶向受体、任选的细胞因子或任选的自杀基因。这样的试剂盒可以具有或可以不具有一种或多种用于操作细胞的试剂。这样的试剂包括例如小分子、蛋白质、核酸、抗体、缓冲剂、引物、核苷酸、盐和/或其组合。编码一种或多种CD70靶向CAR、自杀基因产物和/或细胞因子的核苷酸可包括在试剂盒中。蛋白质例如细胞因子或抗体(包括单克隆抗体)可包括在试剂盒中。编码工程化CAR受体的组分的核苷酸(包括产生其的试剂)可包括在试剂盒中。
在特定方面，试剂盒包含本公开内容的NK细胞疗法以及另一癌症疗法。在一些情况下，除细胞疗法实施方案外，试剂盒还包括例如第二癌症疗法，例如化学疗法、激素疗法和/或免疫疗法。一种或多种试剂盒可针对个体的特定癌症调整并且包含针对该个体的相应第二癌症疗法。
试剂盒可包含本公开内容的适当等分的组合物。该试剂盒的组分可包装于水性介质中或以冻干形式包装。该试剂盒的容器工具将一般包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其他容器工具，其中可放置组分，并且优选地，该组分经适当等分。在试剂盒中存在多于一种组分的情况下，该试剂盒一般还可含有可分开放置另外组分的第二、第三或其他另外的容器。然而，组分的各种组合可包含于小瓶中。本发明的试剂盒通常还将包括用于密闭保存组合物和任何其他试剂容器以进行商业销售的工具。这样的容器可包括将所需小瓶保留于其中的射出或吹模成型的塑料容器。
IX.实施例
包括下列实施例以证实本公开内容的某些非限制性方面。本领域技术人员应知晓下列实施例中公开的技术表示由发明人发现在本文公开的主题的实践中充分发挥作用的技术。然而，鉴于本公开内容，本领域技术人员应知晓可在本文公开的特定实施方案中作出许多改变且仍获得相似或类似的结果，而不背离本文公开的主题的精神和范围。
实施例1
CAR.CD70 NK细胞靶向AML
在特定实施方案中，利用CD70特异性CAR NK细胞以靶向急性髓性白血病(AML)。图5A显示如与未经转导的细胞相比，CAR-CD70NK细胞的转导效率。图5B显示各种AML细胞系上的CD70表达。对于Molm13和Molm14 AML细胞系，图6显示相对于未经转导的细胞，表达CD70CAR/IL-15的NK细胞中CD70 CAR的活性的功能分析。与未经转导的细胞相比，膜联蛋白V测定证实增强的不同AML细胞系的杀伤(图7)。铬释放测定也证实使用还表达IL-15的表达CD70CAR的NK细胞更大程度地杀伤AML细胞系。
实施例2
CAR.CD70 NK细胞靶向肺癌
在一些实施方案中，利用试剂以靶向和杀伤表达CD70的肺癌(作为实体瘤的一个实施例)。图9显示各种肺癌细胞系上的CD70表达。当与未经转导的细胞和经IL-15转导的NK细胞相比时，使用表达CD70 CAR的NK细胞针对各种肺癌细胞系导致更大的毒性(图10A和10B)。如与未经转导的细胞和经IL-15转导的NK细胞相比，当比较表达CD70 CAR的NK细胞时，膜联蛋白染色证实在各种肺癌细胞系中更大的毒性(图11)。在图12中，如由肺癌细胞系球状体中胱天蛋白酶表达评估的，表达CD70 CAR的NK细胞显示比未经转导的NK细胞或经IL-15单独转导的NK细胞(无CAR)更大的毒性。使用
Figure BDA0003833433700000791
测定，与未经转导(NT)和经IL-15转导的NK细胞相比，表达CD70 CAR/IL-15的NK细胞针对ER1肺癌细胞系发挥更大的细胞毒性(图13)。使用
Figure BDA0003833433700000792
测定，与未经转导(NT)和经IL-15转导的NK细胞相比，表达CD70 CAR/IL-15的NK细胞针对ER3肺癌细胞系发挥更大的细胞毒性(图14)。
除肺癌以外的其他CD70阳性癌症可用本公开内容的方法和组合物治疗(例如，参见图15)。
实施例3
针对各种癌症的经CD70 CAR转导的脐带血衍生的自然杀伤(CBNK)细胞
急性髓性白血病(AML)
图16A至16B显示CBNK细胞中CD70 CAR转导效率和CD70在各种急性髓性白血病(AML)靶标中的表达。图16A显示当与未经转导的细胞相比时，CD70 CAR在CBNK细胞中以98％的转导效率成功转导。图16B显示CD70在各种AML靶标的表面中表达。
图17显示当与Molm13和Molm14细胞共培养时，CBNK CD70 CAR细胞中胞内细胞因子的表达和脱颗粒标志物表达。与未经转导(NT)的细胞相比，当与Molm13(左)和Molm14(右)共培养时，经CD70 CAR转导的CBNK细胞显示细胞因子(干扰素γ和肿瘤坏死因子α)分泌和脱颗粒标志物CD107a表达增加，表明针对表达CD70的AML细胞的增强的细胞毒性活性。
图18显示膜联蛋白V染色以在与CBNK CD70 CAR细胞共培养后评估AML靶细胞的凋亡。如由膜联蛋白V-LIVE/DEADTM可固定Aqua染色测定显示，与未经转导(NT)的细胞相比，经CD70 CAR转导的CBNK细胞显示THP-1、Molm13和Molm14细胞的凋亡增加，表明经CD70 CAR转导的CBNK细胞针对AML细胞的细胞毒性活性增强。
图19显示铬释放测定以评估CBNK CD70 CAR针对AML靶细胞的细胞毒性活性。如通过铬释放测定显示，与未经转导(NT)的细胞相比，经CD70 CAR转导的CBNK细胞显示THP-1(左)和Molm13(右)细胞的细胞毒性增加，表明CBNK CD70 CAR细胞针对AML细胞具有更大的杀伤活性。
图20A至20B显示当与CBNK CD70 CAR细胞共培养时，对THP-1和OCI-AML3细胞的
Figure BDA0003833433700000801
细胞毒性测定。如通过
Figure BDA0003833433700000802
测定显示，与未经转导(NT)的细胞相比，经CD70 CAR转导的CBNK细胞显示THP-1(图20A)和OCI-AML3(图20B)细胞的细胞毒性增加，表明CBNK CD70 CAR细胞针对AML细胞具有更大的杀伤活性。经IL15构建体转导的CBNK细胞在该测定中还用作对照，其显示与NT相比，细胞毒性活性增强，但不如CD70 CAR有效。
肺癌
图21显示CD70在各种肺癌细胞系中的表达。使用流式细胞术检测CD70在各种肺癌细胞系中的表面表达。
图22显示当共培养各种肺癌细胞系时，CBNK CD70 CAR细胞中的胞内细胞因子和脱颗粒标志物表达。当与各种肺癌细胞系共培养时，与未经转导(NT)的细胞相比，经CD70CAR转导的CBNK细胞显示细胞因子(干扰素γ和肿瘤坏死因子α)分泌和脱颗粒标志物CD107a表达增加，表明CBNK CD70 CAR针对肺癌的细胞毒性活性增强。
图23显示膜联蛋白V染色以在与CBNK CD70 CAR细胞共培养后评估肺癌细胞的凋亡。如由膜联蛋白V-LIVE/DEADTM可固定Aqua染色测定显示，与未经转导(NT)的细胞相比，经CD70 CAR转导的CBNK细胞显示各种肺癌细胞的凋亡增加，表明经CD70 CAR转导的CBNK细胞针对肺癌细胞的细胞毒性活性增强。
图24显示当与CBNK CD70 CAR细胞共培养时，对ER1细胞的
Figure BDA0003833433700000803
细胞毒性测定。如通过
Figure BDA0003833433700000804
测定显示，如通过测量绿色(胱天蛋白酶3/7)信号评估，与未经转导(NT)的细胞相比，经CD70 CAR转导的CBNK细胞显示ER1细胞的细胞毒性增加，表明CBNK CD70 CAR细胞针对肺癌细胞具有更大的杀伤活性。经CD19 CAR构建体转导的CBNK细胞在该测定中还用作对照，其与NT相比显示细胞毒性活性增强，但不如CD70 CAR有效。54小时的
Figure BDA0003833433700000811
细胞毒性测定的定量显示于左图中，以及代表性图像显示于右图中。
图25显示当与CBNK CD70 CAR细胞共培养时，对ER3细胞的
Figure BDA0003833433700000812
细胞毒性测定。如通过
Figure BDA0003833433700000813
测定显示，如通过测量绿色(胱天蛋白酶3/7)信号评估，与未经转导(NT)的细胞相比，经CD70 CAR转导的CBNK细胞显示ER3细胞的细胞毒性增加，表明CBNKCD70 CAR细胞针对肺癌细胞具有更大的杀伤活性。经CD19 CAR构建体转导的CBNK细胞在该测定中还用作对照，其与NT相比显示细胞毒性活性增强，但不如CD70 CAR有效。
乳腺癌
图26显示铬释放测定以评估CBNK CD70 CAR针对具有变化CD70表达的乳腺癌细胞系的细胞毒性活性。(左)使用流式细胞术检测CD70在各种乳腺癌细胞系中的表面表达。MBA-MB-231具有低/无CD70表达，而BT549和BCX010具有高CD70表达。(右)如通过铬释放测定显示，与未经转导(NT)的细胞相比，经CD70 CAR转导的CBNK细胞显示BT549和BCX010细胞的细胞毒性增加，表明CBNK CD70 CAR细胞针对具有高CD70表达的乳腺癌细胞具有更大的杀伤活性。对NK细胞敏感的K562细胞用作阳性对照。n.s.非显著；***，P＜0.001。
图27A至27E显示当与各种乳腺癌细胞共培养时，CBNK CD70 CAR细胞中的胞内细胞因子和脱颗粒标志物表达。当与具有高CD70表面表达的乳腺癌细胞系共培养时，与未经转导(NT)的细胞相比，经CD70 CAR转导的CBNK细胞显示细胞因子(干扰素γ和肿瘤坏死因子α)分泌和脱颗粒标志物CD107a表达增加，表明CBNK CD70 CAR针对乳腺癌的细胞毒性活性增强。n.s.非显著；*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001。
多发性骨髓瘤
图28A和28B提供铬释放测定以评估CBNK CD70 CAR针对多发性骨髓瘤的细胞毒性活性。(图28A)如通过使用流式细胞术检测，CD70在MM1(多发性骨髓瘤细胞系)中的表面表达高。(图28B)如通过铬释放测定显示，与未经转导(NT)的细胞相比，经CD70 CAR转导的CBNK细胞显示MM1细胞的细胞毒性增加，表明CBNK CD70 CAR细胞针对多发性骨髓瘤细胞具有更大的杀伤活性。
肾细胞癌(RCC)
图29A至29B显示铬释放测定以评估CBNK CD70 CAR针对RCC的细胞毒性活性。(图29A)使用流式细胞术检测CD70在各种RCC和其他癌细胞系中的表面表达。A498、SN12C和786-O是为数不多具有高CD70表达的RCC细胞系。(图29B)如通过铬释放测定显示，与未经转导(NT)的细胞相比，经CD70 CAR转导的CBNK细胞显示A498和SN12C细胞的细胞毒性增加，表明CBNK CD70 CAR细胞针对具有高CD70表达的RCC细胞具有更大的杀伤活性。
图30显示当与RCC细胞共培养时，在CBNK CD70 CAR细胞中胞内细胞因子的产生和脱颗粒标志物表达。当与具有高CD70表面表达的RCC细胞系786-O共培养时，与未经转导(NT)的细胞相比，经CD70 CAR转导的CBNK细胞显示细胞因子(干扰素γ和肿瘤坏死因子α)的分泌和脱颗粒标志物CD107a表达增加，表明CBNK CD70 CAR针对乳腺癌的细胞毒性活性增强。**，p＜0.01。
图31显示当与CBNK CD70 CAR细胞共培养时，对786-O RCC细胞的
Figure BDA0003833433700000821
细胞毒性测定。如通过
Figure BDA0003833433700000822
测定显示，如通过测量绿色(胱天蛋白酶3/7)信号评估，与未经转导(NT)的细胞相比，经CD70 CAR转导的CBNK细胞显示786-O细胞的细胞毒性增加，表明CBNK CD70 CAR细胞针对RCC具有更大的杀伤活性。**，p＜0.01；***，p＜0.001。
胰腺癌
图32A至32B显示当与胰腺癌细胞共培养时，在CBNK CD70 CAR细胞中胞内细胞因子的表达。(图32A)使用流式细胞术检测CD70在各种胰腺癌细胞系中的表面表达。MIA-Paca2具有低/无CD70表达，而PANC-1具有高CD70表达。(图32B)当与PANC-1细胞系(高CD70表达)但不与MIA-Paca2细胞系(低CD70表达)共培养时，与未经转导(NT)的细胞相比，经CD70 CAR转导的CBNK细胞显示细胞因子(干扰素γ和肿瘤坏死因子α)分泌增加，表明CBNKCD70 CAR针对具有高CD70表达的胰腺细胞的细胞毒性活性增强。
胶质母细胞瘤(GBM)
图33显示当与CBNK CD70 CAR细胞共培养时，对GSC20 GBM细胞的
Figure BDA0003833433700000831
细胞毒性测定。使用流式细胞术检测CD70在各种GBM细胞系中的表面表达，和GSC20细胞系显示最高CD70表面表达(图i)。如通过
Figure BDA0003833433700000832
测定显示，如通过测量绿色(胱天蛋白酶3/7)信号强度评估，与未经转导(NT)的细胞相比，经CD70 CAR转导的CBNK细胞显示GSC20细胞的细胞毒性增加，表明CBNK CD70 CAR细胞针对GBM细胞具有更大的杀伤活性。57小时的
Figure BDA0003833433700000833
细胞毒性测定的定量显示于图ii中，和长达23小时的代表性图像显示于图iii中。
植入Raji WT或CD70 KO细胞并用CBNK CD70 CAR细胞处理的NSG小鼠(免疫缺陷)的存活曲线提供于图34中。Kaplan Meier图证实当与未经转导的CBNK细胞相比时，经CD70CAR构建体转导的CBNK细胞显示植入Raji野生型(WT)肿瘤的小鼠中经改善的存活。在植入CD70敲除(KO)Raji细胞的小鼠中未见该经改善的存活，表明小鼠中经改善的存活对肿瘤细胞中存在的CD70抗原具有特异性。
尽管已详细描述本公开内容及其优点，但应了解本文可作出各种改变、取代和变更而不背离如由所附权利要求定义的设计的精神和范围。此外，本申请的范围无意限制于本说明书中描述的过程、机器、制造、物质组成、工具、方法和步骤的特定实施例。本领域技术人员将从本公开内容容易知晓，根据本公开内容可利用目前存在或稍后待研发的过程、机器、制造、物质组成、工具、方法或步骤，以进行与本文描述的相应实施方案基本上相同的功能或实现基本上相同的结果。因此，所附权利要求意欲将这样的过程、机器、制造、物质组成、工具、方法或步骤包括在其范围内。

Claims (51)

1.表达构建体，其包含编码CD70特异性工程化受体和编码以下中的一种或两种的序列：
(a)自杀基因；和
(b)细胞因子。
2.根据权利要求1所述的构建体，其中所述CD70特异性工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体。
3.根据权利要求2所述的表达构建体，其中所述CD70特异性CAR包含具有重链和轻链的scFv，并且其中编码所述CAR的序列中的重链在5′至3′方向上在所述轻链的上游。
4.根据权利要求2所述的表达构建体，其中所述CD70特异性CAR包含具有重链和轻链的scFv，并且其中编码所述CAR的序列中的重链在5′至3′方向上在所述轻链的下游。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的表达构建体，其中所述CD70特异性CAR包含密码子优化的scFv。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的表达构建体，其中所述CD70特异性CAR包含人源化scFv。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的表达构建体，其中所述CD70特异性CAR包含信号肽。
8.根据权利要求7所述的表达构建体，其中所述信号肽是来自CD8α、Ig重链或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体或衍生自一种或多种其他表面受体的信号肽。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的表达构建体，其中所述CD70特异性CAR包含一个或多个共刺激结构域。
10.根据权利要求9所述的表达构建体，其中所述共刺激结构域选自CD28、CD27、OX-40(CD134)、DAP10、DAP12、4-1BB(CD137)、CD40L、2B4、DNAM、CS1、CD48、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80及其组合。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的表达构建体，其中所述CD70特异性CAR包含CD3ζ。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的表达构建体，其中所述CD70特异性CAR包含在所述scFv和跨膜结构域之间的铰链。
13.根据权利要求12所述的表达构建体，其中铰链是CD8-α铰链，所述铰链包含含有Gly3的人工间隔子，或所述铰链包含IgG的CH1、CH2和/或CH3结构域。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的表达构建体，其中所述细胞因子是IL-15、IL-12、IL-2、IL-18、IL-21、IL-7或其组合。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的表达构建体，其中所述自杀基因是突变体TNF-α、诱导型胱天蛋白酶9、HSV-胸苷激酶、CD19、CD20、CD52或EGFRv3。
16.根据权利要求14所述的表达构建体，其中所述突变体TNF-α是工程化不可分泌突变体TNF-α。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的表达构建体，其中所述表达构建体包含以下中的任一种：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13。
18.免疫细胞，其包含权利要求1-17中任一项所述的表达构建体。
19.根据权利要求18所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞、T细胞、γδT细胞、不变NKT(iNKT)细胞、B细胞、巨噬细胞、MSC或树突状细胞。
20.根据权利要求18或19所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是NK细胞。
21.根据权利要求19或20所述的免疫细胞，其中所述NK细胞衍生自脐带血、外周血、诱导多能干细胞、骨髓或来自细胞系。
22.根据权利要求21所述的免疫细胞，其中所述NK细胞系是NK-92细胞系或衍生自肿瘤或来自健康NK细胞或祖细胞的另一种NK细胞系。
23.根据权利要求19-22中任一项所述的免疫细胞，其中所述NK细胞是脐带血单核细胞。
24.根据权利要求19-23中任一项所述的免疫细胞，其中所述NK细胞是CD56+NK细胞。
25.根据权利要求19-24中任一项所述的免疫细胞，其中所述NK细胞表达一种或多种外源提供的细胞因子。
26.根据权利要求25所述的免疫细胞，其中所述细胞因子是IL-15、IL-2、IL-12、IL-18、IL-21、IL-7或其组合。
27.根据权利要求18-26中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞中一种或多种内源基因的表达已被修饰。
28.根据权利要求27所述的免疫细胞，其中在表达方面所述表达已经被部分或完全降低。
29.根据权利要求27或28所述的免疫细胞，其中所述一种或多种基因的表达已经使用CRISPR进行修饰。
30.根据权利要求27-29中任一项所述的免疫细胞，其中所述基因选自NKG2A、SIGLEC-7、LAG3、TIM3、CISH、FOXO1、TGFBR2、TIGIT、CD96、ADORA2、NR3C1、PD1、PDL-1、PDL-2、CD47、SIRPA、SHIP1、ADAM17、RPS6、4EBP1、CD25、CD40、IL21R、ICAM1、CD95、CD80、CD86、IL10R、CD5、CD7、CTLA-4、TDAG8、CD38及其组合。
31.根据权利要求18-30中任一项所述的免疫细胞的群体，所述细胞存在于合适的介质中。
32.根据权利要求31所述的群体，其中所述免疫细胞是NK细胞。
33.一种杀伤个体的CD70阳性细胞的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的携带权利要求1-17中任一项所述的表达构建体的细胞的步骤。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述细胞是NK细胞、T细胞、γδT细胞、诱导NKT(iNKT)细胞、B细胞、巨噬细胞、γδT细胞或树突状细胞。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述NK细胞衍生自脐带血、外周血、诱导多能干细胞、骨髓或来自细胞系。
36.根据权利要求34-35中任一项所述的方法，其中所述NK细胞衍生自脐带血单核细胞。
37.根据权利要求33-36中任一项所述的方法，其中所述CD70阳性细胞不是癌细胞。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述CD70阳性细胞是调节性T细胞。
39.根据权利要求33-36中任一项所述的方法，其中所述个体患有急性髓性白血病、淋巴瘤、肺癌、肾癌、膀胱癌、黑色素瘤、胶质母细胞瘤、乳腺癌、头颈癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、胰腺癌或其组合。
40.根据权利要求33-39中任一项所述的方法，其中所述细胞相对于所述个体是同种异体的。
41.根据权利要求33-39中任一项所述的方法，其中所述细胞相对于所述个体是自体的。
42.根据权利要求33-41中任一项所述的方法，其中所述个体是人。
43.根据权利要求32-42中任一项所述的方法，其中向所述个体施用所述细胞一次或多于一次。
44.根据权利要求43所述的方法，其中向所述个体施用所述细胞之间的持续时间为1-24小时、1-7天、1-4周、1-12个月或一年或多年。
45.根据权利要求33-44中任一项所述的方法，其还包括向所述个体提供有效量的另外的疗法的步骤。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述另外的疗法包括手术、放射、基因疗法、免疫疗法或激素疗法。
47.根据权利要求45或46所述的方法，其中所述另外的疗法包括一种或多种抗体。
48.根据权利要求33-47中任一项所述的方法，其中所述细胞通过注射、静脉内、动脉内、腹腔内、气管内、肿瘤内、肌肉内、内窥镜下、病灶内、颅内、经皮、皮下、局部、通过灌注、在肿瘤微环境中或其组合施用至所述个体。
49.根据权利要求33-48中任一项所述的方法，进一步包括鉴定所述个体的CD70阳性细胞的步骤。
50.根据权利要求33-49中任一项所述的方法，进一步包括产生携带所述表达构建体的细胞的步骤。
51.一种物质组合物，所述物质为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13的序列。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116769722A (zh) * 2023-07-04 2023-09-19 杭州荣谷生物科技有限公司 功能增强型car-nk细胞、其制备方法及其在免疫疗法中的应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023100153A1 (en) * 2021-12-03 2023-06-08 Crispr Therapeutics Ag Use of anti-cd70 antibodies for identifying subjects susceptible for treatment with nk cell-based anti-cd70 therapy

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201206559D0 (en) * 2012-04-13 2012-05-30 Ucl Business Plc Polypeptide
JP6673838B2 (ja) * 2014-02-14 2020-04-01 セレクティスＣｅｌｌｅｃｔｉｓ 免疫細胞と病的細胞の両方に存在する抗原を標的とするように操作された、免疫療法のための細胞
US10689456B2 (en) * 2014-12-08 2020-06-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-CD70 chimeric antigen receptors
JP7328479B2 (ja) * 2016-03-23 2023-08-17 ソウル大学校産学協力団 重症熱性血小板減少症候群ウイルスの外膜糖タンパク質に結合する抗体及びその用途
US20190161542A1 (en) * 2016-08-01 2019-05-30 Novartis Ag Treatment of cancer using a chimeric antigen receptor in combination with an inhibitor of a pro-m2 macrophage molecule
WO2018195339A1 (en) * 2017-04-19 2018-10-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immune cells expressing engineered antigen receptors
CN113286879A (zh) * 2018-06-01 2021-08-20 南加利福尼亚大学 用于细胞疗法之多样化抗原结合域、新颖平台及其他增强子

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116769722A (zh) * 2023-07-04 2023-09-19 杭州荣谷生物科技有限公司 功能增强型car-nk细胞、其制备方法及其在免疫疗法中的应用

Also Published As

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