JP2023509766A - Ｃｄ７０陽性腫瘍を標的化するようにナチュラルキラー細胞を操作する方法 - Google Patents

Ｃｄ７０陽性腫瘍を標的化するようにナチュラルキラー細胞を操作する方法 Download PDF

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Abstract

Figure 2023509766000001
【課題】ＣＤ７０（例えば、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ２７ＬＧおよびＴＮＦＳＦ７としても知られる）を標的化する操作された細胞レセプターに関する方法および組成物を提供する。
【解決手段】本開示の実施形態は、ＣＤ７０抗原に結合するように特異的に操作されたＮＫ細胞によるＣＤ７０発現細胞の標的化に関連する方法及び組成物を含む。特定の実施形態では、ＣＡＲなどのＣＤ７０標的化工学的レセプターを発現するように操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ７０を発現するがんを標的化するために利用される。特定の実施形態において、ＣＤ７０標的化ＣＡＲを発現するベクターは、特定の自殺遺伝子及び／又は１つ以上の特定のサイトカインも発現する。
【選択図】図１

Description

本願は、２０２０年１月８日出願の米国仮特許出願第６２／９５８５６３号に対する優先権を主張する。この仮出願は、その全体が参照により本明細書中に援用される。
本開示の実施形態は、少なくとも細胞生物学、分子生物学、免疫学および医学（癌医学を含む）の分野を含む。
癌養子免疫療法に向けたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の遺伝子の初期化には、１）感作を事前に必要としない生得的な抗腫瘍監視；２）移植片対宿主反応性がない同種異系の有効性；および３）標的腫瘍の直接的な細胞媒介性細胞傷害および細胞溶解などの臨床的に妥当な用途および利点がある。ヒトＮＫ細胞の発生、ならびに自己寛容、アロ反応性およびエフェクター機能の獲得は、ライセンス化、精度管理（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）および武装化の適応的プロセスである。分子レベルでは、特定の活性化レセプターおよび阻害性レセプターが、細胞外シグナルを集約し、バランスをとり、独特なエフェクター機能に統合することによって、ＮＫ細胞の機能を指示している。ＮＫ細胞の機能活性および外部刺激に対する応答性は、継続的な教育という「レオスタット」モデルに従っているので、初期化が可能である。ＮＫ細胞の遺伝子改変によりエフェクター機能を再指示することは、それらの細胞傷害能力を利用して腫瘍細胞を殺滅する有効な方法である。
本開示は、表面抗原分類（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）（ＣＤ７０）陽性癌を標的とした細胞療法および養子細胞療法の改善に関する。
本開示の実施形態は、ＣＤ７０（例えば、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ２７ＬＧおよびＴＮＦＳＦ７としても知られる）を標的化する操作された細胞レセプターに関する方法および組成物を包含する。具体的な実施形態において、ＣＤ７０を標的化する操作されたレセプターは、ポリヌクレオチド、ポリペプチドの形態であるか、または免疫細胞をはじめとした任意の種類の細胞の表面上に含まれる。具体的な場合において、それらの細胞は、免疫細胞であり、ある特定の実施形態において、その免疫細胞は、任意の起源由来の、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、インバリアントＮＫＴ細胞、ガンマデルタＴ細胞、制御性Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）、樹状細胞などである。ある特定の実施形態において、臍帯血由来の初期化されたＮＫ細胞（ＣＢ－ＮＫ）が、ＣＤ７０分子を発現している腫瘍を標的化するために包含される。
ＣＤ７０は、例として急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、リンパ腫、肺癌、メラノーマ、乳癌、神経膠芽腫、中皮腫、頭頸部癌、腎癌、多発性骨髄腫および膵腫瘍をはじめとした多くの癌に発現されるので、方法および組成物に対する標的抗原として使用される。正常組織におけるＣＤ７０の発現は、Ｔ細胞および樹状細胞（ＤＣ）のサブセットに限定される。
本開示の実施形態は、１つ以上のシグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ２４７（ＣＤ３ζとしても知られる）の細胞質部分、ならびにＣＤ２８、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２およびＮＫＧ２Ｄのうちの１つ以上を含むシグナル伝達ドメインが挙げられる）に異種性に融合されたＣＤ７０ｓｃＦｖを組み込んでいる種々の新規の特異的なＣＡＲ構築物を包含する。そのｓｃＦｖは、いくつかの場合において、ヒトＣＤ７０抗原に対して特異性を有するマウス抗体の重（ＶＨ）鎖および軽（ＶＬ）鎖に由来する可変フラグメントの融合物を含み得る。そのベクターは、ＮＫ細胞の生存および維持を助けるヒトインターロイキン１５（ＩＬ－１５）、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＩＬ－１２、ＩＬ－７および／またはＩＬ－１８を産生する遺伝子を含む１つ以上のサイトカイン遺伝子も含み得る。一例として、このように改変されたＣＢ－ＮＫ細胞は、ＣＤ２８およびＣＤ３ｚを含むＣＡＲとは別個の分子として産生されるＩＬ１５に加えて、そのＣＡＲの中にＣＤ７０ｓｃＦｖをコードするベクターを含む。
いくつかの実施形態において、上記方法および組成物は、ＣＤ７０陽性癌を有する個体を処置するために使用されるが、他の場合において、それらの方法および組成物は、チェックポイントとしてのＣＤ７０発現（非癌性）免疫調節性細胞（例えば、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ））を取り除くために使用される。具体的な実施形態において、個体におけるＣＤ７０発現非癌性細胞を標的化する方法が存在し、その方法は、有効量のＣＤ７０ＣＡＲ発現細胞をその個体に送達する工程を含む。
本開示の特定の実施形態は、レシピエント個体に対して同種異系であり、任意の種類のＣＤ７０陽性細胞を標的化し、１つ以上のサイトカイン（例えば、ＩＬ１５、ＩＬ－２、ＩＬ２１、ＩＬ－１２、ＩＬ－７および／またはＩＬ－１８）を発現するように形質導入されていてもよいし、されていなくてもよい、既製の免疫細胞（少なくともＮＫ細胞を含む）の使用を可能にする。
本開示の具体的な実施形態において、免疫細胞における１つ以上の内在性遺伝子の発現が、改変されており、例えば、その発現は、部分的にまたは完全に低下している。その改変は、任意の手段によって行われ得るが、具体的な実施形態では、１つ以上の遺伝子の発現が、発現レベルを低下させるなどによって改変されており、これは、少なくともＣＲＩＳＰＲを含む任意の好適な手段によって行われ得る。単なる例として、内在性遺伝子は、ＮＫＧ２Ａ、ＳＩＧＬＥＣ－７、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＩＳＨ、ＦＯＸＯ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＡＤＯＲＡ２、ＮＲ３Ｃ１、ＰＤ１、ＰＤＬ－１、ＰＤＬ－２、ＣＤ４７、ＳＩＲＰＡ、ＳＨＩＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＲＰＳ６、４ＥＢＰ１、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＩＬ２１Ｒ、ＩＣＡＭ１、ＣＤ９５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ１０Ｒ、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＴＬＡ－４、ＴＤＡＧ８、ＣＤ３８およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
１つの実施形態において、ＣＤ７０に特異的な操作されたレセプターをコードし、以下：（ａ）自殺遺伝子；および（ｂ）サイトカインのうちの一方または両方をコードする、配列を含む発現構築物が存在する。具体的な場合において、ＣＤ７０に特異的な操作されたレセプターは、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）またはＴ細胞レセプターである。ＣＤ７０特異的ＣＡＲは、重鎖および軽鎖を有するｓｃＦｖを含み得、そのＣＡＲをコードする配列内の重鎖は、５’から３’の方向で軽鎖の上流に存在する。他の場合において、ＣＤ７０特異的ＣＡＲは、重鎖および軽鎖を有するｓｃＦｖを含み、そのＣＡＲをコードする配列内の重鎖は、５’から３’の方向で軽鎖の下流に存在する。本明細書中のいずれの場合においても、ＣＤ７０特異的ＣＡＲは、コドンが最適化されたｓｃＦｖを含むかまたは含まない。本明細書中のいずれの場合においても、ＣＤ７０特異的ＣＡＲは、ヒト化ｓｃＦｖを含むかまたは含まない。本明細書中のいずれの場合においても、ＣＤ７０特異的ＣＡＲは、シグナル伝達ペプチド（例えば、ＣＤ８アルファ、Ｉｇ重鎖または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子レセプター、または１つ以上の他の表面レセプターに由来するシグナルペプチドからの１つ）を含むかまたは含まない。特定の実施形態において、ＣＤ７０特異的ＣＡＲは、１つ以上の共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ－４０（ＣＤ１３４）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ４０Ｌ、２Ｂ４、ＤＮＡＭ、ＣＳ１、ＣＤ４８、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０またはそれらの組み合わせからなる群より選択される１つ以上の共刺激ドメインを含む。
いずれのＣＤ７０特異的ＣＡＲも、ＣＤ３ゼータ、および／またはｓｃＦｖと膜貫通ドメインとの間のヒンジを含んでもよいし、含まなくてもよい。具体的な場合において、ヒンジは、ＣＤ８－アルファヒンジであり、そのヒンジは、Ｇｌｙ３を含む人工スペーサーを含むか、またはそのヒンジは、ＩｇＧのＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを含む。具体的な実施形態において、サイトカインは、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－７またはそれらの組み合わせである。自殺遺伝子を使用する場合、その自殺遺伝子は、変異ＴＮＦ－アルファ（例えば、操作された非分泌性変異体）、誘導性カスパーゼ９、ＨＳＶ－チミジンキナーゼ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５２またはＥＧＦＲｖ３であり得る。
本開示の実施形態は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２または配列番号１３のうちのいずれか１つ以上を含む発現構築物を含む。
本開示の実施形態は、本明細書中に包含される任意の発現を含む任意の種類の免疫細胞を含む。具体的な実施形態において、免疫細胞は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、インバリアントＮＫＴ（ｉＮＫＴ）細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＭＳＣまたは樹状細胞である。免疫細胞がＮＫ細胞である場合、そのＮＫ細胞は、臍帯血、末梢血、人工多能性幹細胞、骨髄または細胞株に由来し得る。具体的な態様において、ＮＫ細胞株は、ＮＫ－９２細胞株、あるいは腫瘍または健康なＮＫ細胞もしくは前駆細胞に由来する別のＮＫ細胞株である。
具体的な実施形態において、免疫細胞は、ＮＫ細胞、例えば、臍帯血単核細胞に由来するものなど、臍帯血に由来するＮＫ細胞である。具体的な場合において、ＮＫ細胞は、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞であり得る。ＮＫ細胞は、１つ以上の外因的に提供されるサイトカイン（例えば、ＩＬ－１５、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－７またはそれらの組み合わせ）を発現し得る。特定の実施形態は、本開示の任意の種類の免疫細胞の集団を含み、それらの細胞は、好適な培地中または任意の種類の好適なキャリア中に存在し得る。
１つの実施形態において、個体におけるＣＤ７０陽性細胞を殺滅する方法が存在し、その方法は、本開示によって包含される任意の発現構築物を有する有効量の細胞を個体に投与する工程を含む。具体的な実施形態において、それらの細胞は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、インバリアントＮＫＴ（ｉＮＫＴ）細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ガンマデルタＴ細胞または樹状細胞である。ＮＫ細胞は、臍帯血、末梢血、人工多能性幹細胞、骨髄、または細胞株に由来し得る。ＮＫ細胞は、臍帯血単核細胞に由来し得る。いくつかの場合、ＣＤ７０陽性細胞は、癌細胞ではないが、他の場合では、癌細胞である。ＣＤ７０陽性細胞は、制御性Ｔ細胞であり得る。特定の実施形態において、個体は、急性骨髄性白血病、リンパ腫、肺癌、腎癌、膀胱癌、メラノーマ、神経膠芽腫、乳癌、頭頸部癌、中皮腫またはそれらの組み合わせを有する。上記細胞は、ヒトであってもよいし、ヒトでなくてもよい個体に対して同種異系または自己であり得る。上記細胞は、注射によって、静脈内に、動脈内に、腹腔内に、気管内に、腫瘍内に、筋肉内に、内視鏡的に、病巣内に、頭蓋内に、経皮的に、皮下に、領域性に、灌流によって、腫瘍微小環境に、またはそれらの組み合わせによって、個体に投与され得る。
上記方法の特定の実施形態において、上記細胞は、１回または１回より多く上記個体に投与され得る。個体への細胞の投与間の時間は、１～２４時間、１～７日間、１～４週間、１～１２ヶ月間または１年間またはそれより長いことがある。上記方法は、有効量のさらなる治療（例えば、手術、放射線照射、遺伝子療法、免疫療法および／またはホルモン療法）を個体に提供する工程をさらに含み得る。いくつかの場合において、さらなる治療は、１つ以上の抗体または抗体ベースの作用物質を含み得る。上記方法に対するいくつかの態様において、それらは、個体内のＣＤ７０陽性細胞を特定する工程をさらに含み得る。
具体的な実施形態において、配列番号１、配列番号２、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３の配列を含む合成物が存在する。
本発明の１つの実施形態に関して論じたいずれの限定も、本発明の他の任意の実施形態にも適用できることが明確に企図される。さらに、本発明の任意の組成物が、本発明の任意の方法において使用され得、本発明の任意の方法が、本発明の任意の組成物を生成するためまたは使用するために使用され得る。実施例に示される実施形態の態様は、異なる実施例または本願の他の箇所、例えば、簡単な要旨、詳細な説明、請求項、および図面の簡単な説明の中で論じられる実施形態の文脈で実行され得る実施形態でもある。
前述では、以下に続く詳細な説明をよりよく理解できるように、本開示の特徴および技術的利点をかなり広く概説した。本明細書の請求項の主題を成すさらなる特徴および利点を本明細書の以後で説明する。開示される概念および具体的な実施形態は、本構想の同じ目的を果たすために、他の構造を改変または設計するための基礎として容易に利用され得ることが当業者に認識されるだろう。そのような等価な構成は、添付の請求項に示されているような趣旨および範囲から逸脱しないことも、当業者に理解されるだろう。さらなる目的および利点とともに、構成と実施方法の両方に関して本明細書中に開示される構想に特有であると考えられる新規の特徴は、添付の図面と関連して考慮すると、以下の説明からよりよく理解されるだろう。しかしながら、それらの各図面は、例示目的および説明目的で提供されているに過ぎず、本開示の限度の定義として意図されていないことが明確に理解されるべきである。
本開示の理解をより完全なものにするために、添付の図面と併せて解釈される以下の説明について言及する。
図１は、以下のコドンが最適化されたＣＤ７０ＣＡＲベクター：ＣＯ ＣＡＲ．ＣＤ７０ ４２Ｄ１２．ＶＬＶＨ．ＩｇＧ１．ＣＤ２８．ＣＤ３ｚ－２Ａ－ＩＬ１５に対するプラスミドマップの例を示している。
図２は、ＣＯ ＣＡＲ．ＣＤ７０ ４２Ｄ１２ ＶＨＶＬ．ＩｇＧ１．ＣＤ２８．ＣＤ３ｚ－２Ａ－ＩＬ１５ベクターに対するプラスミドベクターマップの例を提供している。
図３は、ＣＡＲ．ＣＤ７０ ４２Ｄ１２ ＶＬＶＨ．ＩｇＧ１．ＣＤ２８．ＣＤ３ｚ－２Ａ－ＩＬ１５に対するプラスミドベクターマップを図示している。
図４は、ＣＡＲ．ＣＤ７０ ４２Ｄ１２ ＶＨＶＬ．ＩｇＧ１．ＣＤ２８．ＣＤ３ｚ－２Ａ－ＩＬ１５のマップを提供している。
図５Ａは、ＮＫ細胞におけるＣＤ７０ＣＡＲの効率的な形質導入を示している。ｙ軸には、上から下に向かって、１０５、１０４、１０３、０および－１０３と書かれており、ｘ軸には、左から右に向かって、－１０３、０、１０３、１０４および１０５と書かれている。 図５Ｂは、複数の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞株におけるＣＤ７０抗原の発現を示している。
図６は、ＣＡＲ．ＣＤ７０／ＩＬ１５を形質導入されたＮＫ細胞の優れた抗腫瘍エフェクター機能を実証している機能アッセイを提供している。ＮＫ細胞を拡大し、形質導入しなかったか（ＮＴ）、またはＣＡＲ ＣＤ７０／ＩＬ１５を形質導入し、２つのＡＭＬ細胞株（ＭＯＬＭ１３およびＭＯＬＭ１４）に対してインビトロ活性を試験した。ＣＡＲ ＣＤ７０／ＩＬ１５を形質導入されたＮＫ細胞は、標的に応答して、ＮＴ ＮＫ細胞よりも多くのＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦａおよびＣＤ１０７ａ脱顆粒を分泌する。ｙ軸には、上から下に向かって、１０５、１０４、１０３、０および－１０３と書かれており、ｘ軸には、左から右に向かって、－１０３、０、１０３、１０４および１０５と書かれている。
図７は、アネキシンＶアッセイによって評価された、ＣＡＲ．ＣＤ７０ＮＫ細胞によるＡＭＬ標的のより多くの殺滅を示している。ＮＫ細胞を拡大し、形質導入しなかったか（ＮＴ）、またはＣＡＲ ＣＤ７０／ＩＬ１５を形質導入し、３つのＡＭＬ細胞株（ＴＨＰ－１、ＭＯＬＭ１４およびＭＯＬＭ１３）に対してインビトロ殺滅活性を試験した。ＣＡＲ ＣＤ７０／ＩＬ１５を形質導入されたＮＫ細胞は、生死およびアネキシンＶ染色によって計測したとき、ＮＴ ＮＫ細胞よりも高い比率の白血病標的を殺滅した。ｙ軸には、上から下に向かって、１０５、１０４、１０３、０および－１０３と書かれており、ｘ軸には、左から右に向かって、－１０３、０、１０３、１０４および１０５と書かれている。
図８は、クロム放出アッセイによって評価された、ＣＡＲ．ＣＤ７０ＮＫ細胞によるＡＭＬ標的のより多くの殺滅を示している。ＮＫ細胞を拡大し、形質導入しなかったか（ＮＴ）、またはＣＡＲ ＣＤ７０／ＩＬ１５を形質導入し、２つのＡＭＬ細胞株（ＴＨＰ－１およびＭＯＬＭ１３）に対してインビトロ殺滅活性を試験した。ＣＡＲ ＣＤ７０／ＩＬ１５を形質導入されたＮＫ細胞は、５１クロム放出アッセイによって計測したとき、ＮＴ ＮＫ細胞よりも高い比率の白血病標的を殺滅した。
図９は、種々の肺癌細胞株におけるＣＤ７０の発現を示している。ｘ軸には、左から右に向かって、－１０３、０、１０３、１０４および１０５と書かれている。
図１０Ａ～図１０Ｂは、形質導入されなかったＮＫ細胞（ＮＴ）およびＩＬ１５を形質導入されたＮＫ細胞と比べて、ＣＡＲ．７０ＮＫ細胞が、肺癌に対してより高い細胞傷害性を発揮することを証明している。ＮＫ細胞を拡大し、形質導入しなかったか（ＮＴ）、またはＩＬ１５（ＩＬ１５）もしくはＣＡＲ ＣＤ７０／ＩＬ１５（ＣＤ７０ＣＡＲ）を形質導入し、種々の肺癌細胞株に対してインビトロ活性を試験した。ＣＡＲ ＣＤ７０／ＩＬ１５を形質導入されたＮＫ細胞は、標的に応答して、ＩＬ－１５を形質導入されたＮＫ細胞またはＮＴ ＮＫ細胞よりも多くのＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦａおよびＣＤ１０７ａ脱顆粒を分泌する。ｙ軸には、上から下に向かって、１０５、１０４、１０３、０および－１０３と書かれており、ｘ軸には、左から右に向かって、－１０３、０、１０３、１０４および１０５と書かれている。
図１１は、アネキシンＶ染色によって評価したとき、形質導入されなかったＮＫ細胞（ＮＴ）およびＩＬ１５を形質導入されたＮＫ細胞と比べて、ＣＡＲ．７０ＮＫ細胞が、肺癌に対してより高い細胞傷害性を発揮することを示している。ＮＫ細胞を拡大し、形質導入しなかったか（ＮＴ）、またはＣＡＲ ＣＤ７０／ＩＬ１５を形質導入し、肺癌細胞株に対してインビトロ殺滅活性を試験した。ＣＡＲ ＣＤ７０／ＩＬ１５を形質導入されたＮＫ細胞は、生死およびアネキシンＶ染色によって計測したとき、ＮＴ ＮＫ細胞またはＩＬ１５ ＮＫ細胞よりも高い比率の肺癌標的を殺滅した。ｙ軸には、上から下に向かって、１０５、１０４、１０３、０および－１０３と書かれており、ｘ軸には、左から右に向かって、－１０３、０、１０３、１０４および１０５と書かれている。
図１２は、肺癌細胞株スフェロイドにおけるカスパーゼ発現（カラーバージョンにおける緑色）によって評価したとき、形質導入されなかったＮＫ細胞（ＮＴ）およびＩＬ１５を形質導入されたＮＫ細胞と比べて、ＣＡＲ．７０ＮＫ細胞が、肺癌細胞株に対してより高い細胞傷害性を発揮することを実証している。
図１３は、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）アッセイを用いて緑色シグナルの測定値（カスパーゼ、カラーバージョンにおける緑色）によって評価したとき、形質導入されなかったＮＫ細胞（ＮＴ）およびＩＬ１５を形質導入されたＮＫ細胞と比べて、ＣＡＲ．７０ＮＫ細胞が、肺癌細胞株に対してより高い細胞傷害性を発揮することを証明している。
図１４は、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）アッセイを用いて緑色シグナルの測定値（カラーバージョンにおけるカスパーゼ）によって評価したとき、形質導入されなかったＮＫ細胞（ＮＴ）およびＩＬ１５を形質導入されたＮＫ細胞と比べて、ＣＡＲ．７０ＮＫ細胞が、肺癌に対してより高い細胞傷害性を発揮することを提供している。
図１５は、腫瘍細胞上のＣＤ７０の発現に関するＴｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）データを示している。
図１６Ａ～図１６Ｂは、ＣＢＮＫ細胞におけるＣＤ７０ＣＡＲの形質導入効率および様々なＡＭＬ標的におけるＣＤ７０の発現を示している。（図１６Ａ）ＣＤ７０ＣＡＲは、形質導入されなかった細胞と比べて、９８％の形質導入効率でＣＢＮＫ細胞への形質導入が成功した。ｙ軸には、上から下に向かって、１０５、１０４、１０３、０および－１０３と書かれており、ｘ軸には、左から右に向かって、－１０３、０、１０３、１０４および１０５と書かれている。（図１６Ｂ）ＣＤ７０は、様々なＡＭＬ標的の表面に発現された。ｘ軸には、左から右に向かって、－１０３、０、１０３、１０４および１０５と書かれている。
図１７は、Ｍｏｌｍ１３およびＭｏｌｍ１４細胞と共培養したときの、ＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲ細胞における細胞内サイトカインおよび脱顆粒マーカー発現を示している。Ｍｏｌｍ１３（左）およびＭｏｌｍ１４（右）と共培養したときの、インターフェロンガンマおよび腫瘍壊死因子アルファの分泌ならびに脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａの発現に関する、形質導入されなかった（ＮＴ）細胞と、ＣＤ７０ＣＡＲを形質導入されたＣＢＮＫ細胞との比較。ｙ軸には、上から下に向かって、１０５、１０４、１０３、０および－１０３と書かれており、ｘ軸には、左から右に向かって、－１０３、０、１０３、１０４および１０５と書かれている。
図１８は、ＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲ細胞と共培養した後のＡＭＬ標的細胞のアポトーシスを評価するアネキシンＶ染色を示している。アネキシンＶ－ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤＴＭＦｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ染色アッセイは、ＴＨＰ－１、Ｍｏｌｍ１３およびＭｏｌｍ１４細胞に対する、形質導入されなかった（ＮＴ）細胞と、ＣＤ７０ＣＡＲを形質導入されたＣＢＮＫ細胞との比較を示している。ｙ軸には、上から下に向かって、１０５、１０４、１０３、０および－１０３と書かれており、ｘ軸には、左から右に向かって、－１０３、０、１０３、１０４および１０５と書かれている。
図１９は、ＡＭＬ標的細胞に対するＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲの細胞傷害活性を評価するクロム放出アッセイを示している。クロム放出アッセイによって示された、ＴＨＰ－１（左）およびＭｏｌｍ１３（右）細胞に対する細胞傷害性レベルに関する、形質導入されなかった（ＮＴ）細胞と、ＣＤ７０ＣＡＲを形質導入されたＣＢＮＫ細胞との比較が提供されている。
図２０Ａ～図２０Ｂは、ＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲ細胞と共培養したときの、ＴＨＰ－１およびＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞に対するＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）細胞毒性アッセイを示している。ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）アッセイによって示されたＴＨＰ－１（図２０Ａ）およびＯＣＩ－ＡＭＬ３（図２０Ｂ）細胞に対する細胞傷害性についての、形質導入されなかった（ＮＴ）細胞と、ＣＤ７０ＣＡＲを形質導入されたＣＢＮＫ細胞との比較が示されている。ＩＬ１５構築物を形質導入されたＣＢＮＫ細胞も、このアッセイにおいてコントロールとして使用した。
図２１は、様々な肺癌細胞株におけるＣＤ７０の発現を示している。フローサイトメトリーを用いて、様々な肺癌細胞株におけるＣＤ７０の表面発現を検出した。ｘ軸には、左から右に向かって、－１０３、０、１０３、１０４および１０５と書かれている。
図２２は、様々な肺癌細胞株と共培養したときのＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲ細胞における細胞内サイトカインおよび脱顆粒マーカーの発現を示している。様々な肺癌細胞株と共培養したときの、インターフェロンガンマおよび腫瘍壊死因子アルファの分泌ならびに脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａの発現のレベルについての、形質導入されなかった（ＮＴ）細胞と、ＣＤ７０ＣＡＲを形質導入されたＣＢＮＫ細胞との比較が示されている。ｙ軸には、上から下に向かって、１０５、１０４、１０３、０および－１０３と書かれており、ｘ軸には、左から右に向かって、－１０３、０、１０３、１０４および１０５と書かれている。
図２３は、ＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲ細胞と共培養した後の肺癌細胞のアポトーシスを評価するアネキシンＶ染色を示している。アネキシンＶ－ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤＴＭＦｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ染色アッセイによって示されるような、形質導入されなかった（ＮＴ）細胞と、ＣＤ７０ＣＡＲを形質導入されたＣＢＮＫ細胞とのアポトーシスレベルの比較。ｙ軸には、上から下に向かって、１０５、１０４、１０３、０および－１０３と書かれており、ｘ軸には、左から右に向かって、－１０３、０、１０３、１０４および１０５と書かれている。
図２４は、ＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲ細胞と共培養したときのＥＲ１細胞におけるＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）細胞毒性アッセイを示している。５４時間にわたるＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）細胞毒性アッセイの定量が、左のパネルに示されており、代表的な画像が、右のパネルに示されている。
図２５は、ＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲ細胞と共培養したときのＥＲ３細胞におけるＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）細胞毒性アッセイを示している。
図２６は、様々なＣＤ７０発現を有する乳癌細胞株に対するＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲの細胞傷害活性を評価するクロム放出アッセイを示している。（左）ＣＤ７０の表面発現を、フローサイトメトリーを用いて様々な乳癌細胞株において検出した（２つのピークがあるとき、ＩｇＧが左側である）。（右）クロム放出アッセイによって示された、ＢＴ５４９およびＢＣＸ０１０細胞に対する、形質導入されなかった（ＮＴ）細胞、およびＣＤ７０ＣＡＲを形質導入されたＣＢＮＫ細胞の細胞傷害性の比較。ＮＫ細胞に感受性のＫ５６２細胞をポジティブコントロールとして使用している。ｎ．ｓ．有意でない；＊＊＊，Ｐ＜０．００１
図２７Ａ～図２７Ｅは、様々な乳癌細胞と共培養したときのＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲ細胞における細胞内サイトカインおよび脱顆粒マーカーの発現を示している。（図２７Ａ）細胞なし；（図２７Ｂ）Ｋ５６２細胞；（図２７Ｃ）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞；（図２７Ｄ）ＢＴ５４９；（図２７Ｅ）ＢＣＸ０１０細胞。ｎ．ｓ．有意でない；＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．０１；＊＊＊，ｐ＜０．００１。左から右に向かって、バーについての３つのグループ分けは、ＣＢＮＫ ＮＴ、ＣＢＮＫ ＩＬ１５およびＣＢＮＫ ＣＡＲ ＣＤ７０である。
図２８Ａ～図２８Ｂは、多発性骨髄腫に対するＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲの細胞傷害活性を評価するクロム放出アッセイを示している。（図２８Ａ）フローサイトメトリーを用いることによって検出された、多発性骨髄腫細胞株であるＭＭ１ｓに対するＣＤ７０の表面発現が示されている。（図２８Ｂ）クロム放出アッセイによって示されるような、形質導入されなかった（ＮＴ）細胞、およびＣＤ７０ＣＡＲを形質導入されたＣＢＮＫ細胞に対する細胞傷害性の比較。
図２９Ａ～図２９Ｂは、腎細胞癌に対するＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲの細胞傷害活性を評価するクロム放出アッセイを示している。（図２９Ａ）フローサイトメトリーを用いた、様々なＲＣＣおよび他の癌細胞株におけるＣＤ７０の表面発現の検出。Ａ４９８、ＳＮ１２Ｃおよび７８６－Ｏは、高いＣＤ７０発現を有するＲＣＣ細胞株である。（図２９Ｂ）クロム放出アッセイによって示された、形質導入されなかった（ＮＴ）細胞、およびＣＤ７０ＣＡＲを形質導入されたＣＢＮＫ細胞の細胞傷害性のレベルを比較している。
図３０は、ＲＣＣ細胞と共培養したときのＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲ細胞における細胞内サイトカインおよび脱顆粒マーカーの発現を示している。＊＊，ｐ＜０．０１
図３１は、緑色（カスパーゼ３／７）シグナルの測定値によって評価された、ＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲ細胞と共培養したときの７８６－Ｏ ＲＣＣ細胞におけるＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）細胞毒性アッセイを示している。＊＊，ｐ＜０．０１；＊＊＊，ｐ＜０．００１
図３２Ａ～図３２Ｂは、膵癌細胞と共培養したときのＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲ細胞における細胞内サイトカインの発現を示している。（図３２Ａ）ＣＤ７０の表面発現を、フローサイトメトリーを用いて様々な膵癌細胞株において計測した。ｙ軸には、上から下に向かって、２５０Ｋ、２００Ｋ、１５０Ｋ、１００Ｋ、５０Ｋおよび０と書かれており、ｘ軸には、左から右に向かって、０、１０３、１０４および１０５と書かれている。（図３２Ｂ）ＰＡＮＣ－１細胞株またはＭＩＡ－Ｐａｃａ２細胞株（低ＣＤ７０発現）と共培養したときの、形質導入されなかった（ＮＴ）細胞およびＣＤ７０ＣＡＲを形質導入されたＣＢＮＫ細胞のインターフェロンガンマおよび腫瘍壊死因子アルファの分泌の比較。ＭＦＩは、平均蛍光強度（発現レベルの代表）を表している。
図３３は、ＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲ細胞と共培養したときのＧＳＣ２０神経膠芽腫細胞におけるＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）細胞毒性アッセイを示している。（ｉ）ＣＤ７０の表面発現を、フローサイトメトリーを用いて様々なＧＢＭ細胞株において検出したところ、ＧＳＣ２０細胞株が、最も高いＣＤ７０表面発現を示した。形質導入されなかった（ＮＴ）細胞と比べて、ＣＤ７０ＣＡＲを形質導入されたＣＢＮＫ細胞は、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）アッセイによって示されたように、緑色（カスパーゼ３／７）シグナル強度の測定値によって評価したとき、ＧＳＣ２０細胞の高い細胞傷害性を示したことから、ＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲ細胞が、ＧＢＭ細胞に対してより高い殺滅活性を有することが示唆される。５７時間にわたるＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）細胞毒性アッセイの定量がｉｉに示されており、２３時間までの代表的な画像がｉｉｉに示されている。
図３４は、Ｒａｊｉ ＷＴまたはＣＤ７０ ＫＯ細胞を移植され、ＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲ細胞で処置された、ＮＯＤ ｓｃｉｄガンママウス（免疫不全のＮＳＧマウス）の生存曲線を示している。＊ｐ＜０．０５。
本開示の様々な実施形態を本明細書中に示し、説明してきたが、当業者には、そのような実施形態が単に例として提供されていることが明白だろう。当業者は、本発明から逸脱することのない数多くの変形、変更および置換に気づくだろう。本明細書中に記載される本開示の実施形態の様々な代替物が使用され得ることが理解されるべきである。
１．定義の例
長年の特許法の慣例に従い、特許請求の範囲を含め、本明細書でｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇという単語と一緒に使用される場合、単語「ａ」及び「ａｎ」は、「１つ又は複数」を表す。本開示のいくつかの実施形態は、本開示の１つ以上の要素、方法ステップ、及び／又は方法から構成されてもよいし、本質的に構成されてもよい。本明細書に記載される任意の方法又は組成物は、本明細書に記載される任意の他の方法又は組成物に関して実施することができ、異なる実施形態が組み合わされてもよいことが企図される。
本明細書を通じて、文脈上他に必要とされない限り、単語「含む」、「含む」及び「包含する」は、述べられたステップ又は要素又はステップ又は要素のグループを含むが、他のステップ又は要素又はステップ又は要素のグループを排除しないことを意味すると理解される。「からなる」は、フレーズ「からなる」の後に続くものを含み、およびそれに限定されることを意味する。したがって、「からなる」という表現は、列挙された要素が必要または必須であり、他の要素が存在し得ないことを示す。「から本質的になる」とは、フレーズの後に列挙された任意の要素を含み、列挙された要素について開示で指定された活性又は作用を妨げない又は寄与する他の要素に限定されることを意味する。 したがって、フレーズ「から本質的になる」は、リストされた要素が必要または必須であるが、他の要素は任意でなく、リストされた要素の活性または作用に影響するかどうかに応じて存在してもしなくてもよいことを示す。
本明細書を通じて、「一実施形態」、「実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある実施形態」、「追加の実施形態」、又は「さらなる実施形態」又はそれらの組み合わせへの言及は、実施形態と関連して説明される特定の特徴、構造又は特性が本発明の少なくとも一実施形態に含まれることを意味している。したがって、本明細書中の様々な場所における前述の語句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態に言及しているわけではない。さらに、特定の特徴、構造、又は特性は、１つ又は複数の実施形態において、任意の適切な方法で組み合わされ得る。
本明細書で使用される場合、用語「又は」及び「及び／又は」は、互いに組み合わせて又は排他的に複数の成分を記述するために利用される。例えば、”ｘ、ｙ、及び／又はｚ”は、”ｘ”単独、”ｙ”単独、”ｚ”単独、”ｘ、ｙ、及びｚ”、”（ｘ及びｙ）又はｚ”、”ｘ又は（ｙ及びｚ）”、又は”ｘ又はｙ又はｚ”を指すことが可能である。ｘ、ｙ、またはｚは、実施形態から具体的に除外され得ることが特に企図される。
本出願を通じて、用語「約」は、値を決定するために採用される装置又は方法についての誤差の標準偏差を含むことを示すために、細胞及び分子生物学の領域におけるその平易かつ通常の意味に従って使用される。
本明細書で使用する「操作された」という用語は、細胞、核酸、ポリペプチド、ベクターなどを含む、人の手によって生成される実体を指す。少なくともいくつかの場合において、操作された物は合成であり、天然には存在しないか、または本開示において利用される方法で構成される要素で構成される。
本明細書で使用する「単離された」という用語は、分子または生物学的物質または細胞物質が他の物質から実質的に遊離していることを指す。一態様において、用語「単離された」は、天然源に存在するような、それぞれ他のＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはタンパク質もしくはポリペプチド、または細胞もしくは細胞小器官、または組織もしくは器官から分離した、ＤＮＡもしくはＲＮＡなどの核酸、またはタンパク質もしくはポリペプチド、または細胞もしくは細胞小器官、または組織もしくは器官のことを指す。また、「単離された」という用語は、組換えＤＮＡ技術によって製造された場合には細胞材料、ウイルス材料、または培養液、あるいは化学的に合成された場合には化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない核酸またはペプチドを意味する。さらに、「単離された核酸」とは、断片として天然に存在せず、天然状態では見出されないような核酸断片を含むことを意味する。用語「単離された」はまた、本明細書において、他の細胞タンパク質から単離されたポリペプチドを指すために用いられ、精製ポリペプチドおよび組換えポリペプチドの両方を包含することが意図されている。用語「単離された」はまた、本明細書において、他の細胞または組織から単離された細胞または組織を指すために用いられ、培養された細胞または組織および操作された細胞または組織の両方を包含することを意図している。
本明細書で使用されるように、「予防する」、「予防された」及び「防止する」等の類似の語は、疾患又は状態、例えば癌の発生又は再発を予防、抑制、又はその可能性を低減するためのアプローチを示す。 また、疾患または状態の発症もしくは再発を遅延させること、または疾患または状態の症状の発生もしくは再発を遅延させることを意味する。本明細書で使用される場合、「予防」及び同様の言葉は、疾患又は状態の発症又は再発に先立って、疾患又は状態の強度、効果、症状及び／又は負担を低減させることも含む。
本明細書で使用される「試料」という用語は、一般に、生物学的試料を指す。 試料は、個体からの組織又は細胞から採取されてもよい。いくつかの例では、試料は、組織生検、血液（例えば、全血）、血漿、細胞外液、乾燥血液斑、培養細胞、廃棄された組織からなる、又はそれらに由来してもよい。試料は、採取前に供給源から分離されていてもよい。非限定的な例としては、血液、脳脊髄液、胸水、羊水、リンパ液、唾液、尿、便、涙、汗、又は粘膜排泄物、及び収集前に一次供給源から分離された他の体液が挙げられる。いくつかの例では、サンプルは、サンプル調製中にその一次ソース（細胞、組織、血液などの体液、環境サンプルなど）から単離される。 試料は、その一次産品から精製または濃縮されてもされなくてもよい。場合によっては、一次産品は、さらなる処理の前にホモジナイズされる。サンプルは、バフィーコート、脂質、または粒子状物質を除去するために、濾過または遠心分離される場合がある。サンプルはまた、核酸を精製または濃縮することもでき、ＲＮａｓｅで処理することもできる。サンプルは、無傷、断片化、または部分的に分解された組織または細胞を含むことができる。
本明細書で使用する「対象」という用語は、一般に、処理または分析を受ける生体試料を有する個体を指し、特定の場合には、癌を有するか、または癌を有する疑いがある個体を指す。対象は、哺乳類、例えば、ヒト、実験動物（例えば、霊長類、ラット、マウス、ウサギ）、家畜（例えば、牛、羊、ヤギ、豚、七面鳥、鶏）、家庭用ペット（例えば、犬、猫、齧歯類）、馬、及びトランスジェニック非ヒト動物などの方法又は材料の対象となる任意の生物又は動物の対象であり得る。対象は、例えば、良性もしくは悪性の新生物、または癌などの疾患（病状と呼ばれることもある）を有する、またはその疑いがある、患者であることができる。対象者は、治療中であってもよいし、治療を受けたことがあってもよい。被験者が無症状である。対象は、健康な個人であっても、癌の予防を希望している個人であってもよい。用語「個体」は、少なくともいくつかの場合において、互換的に使用することができる。 本明細書で使用される「対象」または「個体」は、医療施設に収容されていてもいなくてもよく、医療施設の外来患者として扱われていてもよい。個体は、インターネットを介して１つ又は複数の医療用組成物を受け取っていてもよい。個体は、ヒトまたは非ヒト動物の任意の年齢を含んでよく、したがって、成人および少年（すなわち、子供）および幼児の両方を含み、子宮内個体も含む。この用語が医学的治療の必要性を意味することは意図されておらず、したがって、個体は、臨床的であるか基礎科学研究の支援であるかにかかわらず、自発的または非自発的に実験の一部となることができる。
本明細書で使用される「治療」または「治療する」は、疾患または病的状態の症状または病理に対する任意の有益または望ましい効果を含み、治療される疾患または状態（例えば、癌）の１つまたは複数の測定可能マーカーにおける最小限の減少さえ含むことができる。治療は、任意に、疾患又は病態の症状の軽減又は改善、又は疾患又は病態の進行の遅延のいずれかを含むことができる。「治療」は、必ずしも疾患もしくは状態、またはそれらに関連する症状の完全な根絶もしくは治癒を示すものではない。
本開示は、ＣＤ７０陽性腫瘍を標的とする、任意の種類の遺伝子操作された哺乳類免疫細胞（少なくともヒトＮＫ細胞を含む）に向けられた方法及び組成物に関する。本開示は、サイトカインレセプターＣＤ２７のリガンドであるＣＤ７０に対して指向される、あらゆる種類の遺伝子操作されたレセプター（ＣＡＲを含む）を包含する。ＣＤ７０は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）およびリンパ腫などの血液悪性腫瘍に発現することに加えて、多くの固形腫瘍にも発現し、癌には腎臓、膀胱、肺、乳、グリオブラストーマ、膵臓、およびメラノーマが含まれるので、「全癌抗原」としては魅力的である。活性化されたＴリンパ球、Ｂリンパ球、樹状細胞には一過性にしか存在しない。ＣＤ７０は、他のＡＭＬ標的とは異なり、正常な造血幹細胞上に発現しないため、ＣＡＲ療法後に細胞減少が長引き、レシピエントの造血幹細胞移植の必要性が生じにくいことから、ＡＭＬの免疫療法の標的として特に有利である。特定の実施形態では、ＣＡＲにおいてＣＤ７０に対する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を発現し、さらにＮＫ細胞の生存及び増殖を支援するためにＩＬ１５などの１つ以上のサイトカインを発現する、レトロウイルス構築物を含む多数の新規発現構築物が提供される。本明細書で提供される一連のインビトロ研究において、ＡＭＬ、肺がん標的およびグリオブラストーマに対するＣＡＲ７０／ＩＬ－１５導入臍帯血（ＣＢ）－ＮＫ細胞の活性が実証される。
Ｉ．遺伝的に操作されたレセプター
本開示の免疫細胞は、工学的ＴＣＲまたはＣＡＲなど、ＣＤ７０を標的とする抗原レセプターを発現するように遺伝子工学的に改変することができる。例えば、免疫細胞は、ＣＤ７０に対する抗原特異性を有するＣＡＲ及び／又はＴＣＲを発現するように改変されたＮＫ細胞であってもよい。他のＣＡＲ及び／又はＴＣＲは、ＣＤ７０レセプター発現細胞と同じ細胞によって発現されてもよく、それらは異なる抗原に向けられることがある。いくつかの態様において、免疫細胞は、ＣＲＩＳＰＲを用いたＣＡＲまたはＴＣＲのノックインにより、ＣＤ７０特異的ＣＡＲまたはＣＤ７０特異的ＴＣＲを発現するように操作される。
好適な改変方法が当該分野で公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ，前出を参照のこと。例えば、それらの細胞は、Ｈｅｅｍｓｋｅｒｋ ｅｔ ａｌ．，２００８およびＪｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００９に記載されている形質導入法を用いて、癌抗原に対して抗原特異性を有するＴＣＲを発現するように形質導入され得る。
いくつかの実施形態において、それらの細胞は、１つ以上の抗原レセプター（少なくともそのうちの１つは、ＣＤ７０に対するものである）をコードする、遺伝子操作を介して導入された１つ以上の核酸、およびそのような核酸の遺伝的に操作された産物を含む。いくつかの実施形態において、それらの核酸は、異種であり、すなわち、ある細胞またはその細胞から得たサンプルには正常には存在せず、例えば、別の生物または細胞から得られたもの、例えば、操作された細胞および／またはそのような細胞が由来する生物には通常見られない核酸である。いくつかの実施形態において、それらの核酸は、天然に存在せず、例えば、自然界には見られない核酸（例えば、キメラ）である。
ＣＡＲおよび組換えＴＣＲをはじめとした例示的な抗原レセプター、ならびにそれらのレセプターを操作するための方法および細胞に導入するための方法には、例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ２０００１４２５７、ＷＯ２０１３１２６７２６、ＷＯ２０１２／１２９５１４、ＷＯ２０１４０３１６８７、ＷＯ２０１３／１６６３２１、ＷＯ２０１３／０７１１５４、ＷＯ２０１３／１２３０６１、米国特許出願公開番号ＵＳ２００２１３１９６０、ＵＳ２０１３２８７７４８、ＵＳ２０１３０１４９３３７、米国特許第６，４５１，９９５号、同第７，４４６，１９０号、同第８，２５２，５９２号、同第８，３３９，６４５号、同第８，３９８，２８２号、同第７，４４６，１７９号、同第６，４１０，３１９号、同第７，０７０，９９５号、同第７，２６５，２０９号、同第７，３５４，７６２号、同第７，４４６，１９１号、同第８，３２４，３５３号および同第８，４７９，１１８号、ならびに欧州特許出願番号ＥＰ２５３７４１６に記載されているもの、および／またはＳａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｄａｖｉｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｔｕｒｔｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，２０１２によって記載されたものが含まれる。いくつかの態様において、遺伝的に操作された抗原レセプターには、米国特許第７，４４６，１９０号に記載されているようなＣＡＲ、および国際特許出願公開番号ＷＯ／２０１４０５５６６８Ａｌに記載されているものが含まれる。
Ａ．キメラ抗原レセプター
いくつかの実施形態において、上記ＣＤ７０特異的ＣＡＲは、ａ）１つ以上の細胞内のシグナル伝達ドメイン、ｂ）膜貫通ドメイン、およびｃ）特異的に結合することを含む、ＣＤ７０を標的とする抗原結合領域１つ以上の抗原結合領域を含む細胞外のドメインを含む。特定の実施形態では、抗原結合領域は抗体であり、抗体ではないタンパク質またはタンパク質フラグメントではない。
いくつかの実施形態において、操作された抗原レセプターには、活性化型または刺激型のＣＡＲ、共刺激型のＣＡＲ（ＷＯ２０１４／０５５６６８を参照のこと）および／または阻害型のＣＡＲ（ｉＣＡＲ、Ｆｅｄｏｒｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１３を参照のこと）をはじめとしたＣＡＲが含まれる。それらのＣＡＲは、一般に、１つ以上の細胞内のシグナル伝達構成要素に、いくつかの態様ではリンカーおよび／または膜貫通ドメインを介して連結された、細胞外の抗原（またはリガンド）結合ドメインを含む。そのような分子は、通常、天然の抗原レセプターを介するシグナル、共刺激レセプターとともにそのようなレセプターを介するシグナル、および／または共刺激レセプターのみを介するシグナルを模倣するかまたはまねる。
本開示のある特定の実施形態は、細胞内のシグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、および１つ以上のシグナル伝達モチーフを含む細胞外のドメインを含む、ＣＤ７０特異的ＣＡＲポリペプチド（免疫原性を低減するためにヒト化されたＣＡＲ（ｈＣＡＲ）を含む）をコードする核酸を含む核酸の使用に関する。ある特定の実施形態において、そのＣＤ７０特異的ＣＡＲは、１つ以上の抗原の間で共有される空間を含むエピトープを認識し得る。ある特定の実施形態において、結合領域は、モノクローナル抗体の相補性決定領域、モノクローナル抗体の可変領域、および／またはそれらの抗原結合フラグメントを含み得る。別の実施形態において、その特異性は、レセプターに結合するペプチド（例えば、サイトカイン）に由来する。
ヒトＣＤ７０ＣＡＲ核酸は、ヒト患者に対する細胞免疫療法を増強するために使用されるヒト遺伝子であり得ると企図される。具体的な実施形態において、本開示は、ＣＤ７０特異的ＣＡＲの完全長ｃＤＮＡまたはコード領域を含む。その抗原結合領域またはドメインは、特定のヒトモノクローナル抗体に由来する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）のＶＨ鎖およびＶＬ鎖のフラグメント（例えば、参照により本明細書中に援用される米国特許第７，１０９，３０４号に記載されているもの）を含み得る。そのフラグメントは、ヒト抗原特異的抗体の任意の数の異なる抗原結合ドメインでもあり得る。より具体的な実施形態において、そのフラグメントは、ヒト細胞における発現のためにヒトのコドン使用頻度に最適化された配列によってコードされるＣＤ７０特異的ｓｃＦｖである。
配置は、多量体であり得る（例えば、ダイアボディまたは多量体）。その多量体は、軽鎖および重鎖の可変部分がダイアボディに交差対形成することによって形成される可能性が最も高い。その構築物のヒンジ部分には、完全欠失から、１つ目のシステインが維持されること、セリン置換ではなくプロリン置換であること、１つ目のシステインまで切断されることにまで及ぶ複数の選択肢があり得る。Ｆｃ部分を欠失させることができる。安定したかつ／または二量体化する任意のタンパク質が、この目的にかない得る。Ｆｃドメインのうちの１つだけ、例えば、ヒト免疫グロブリンのＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインを使用することができる。二量体化を改善するように改変されたヒト免疫グロブリンのヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域を使用することもできる。免疫グロブリンのヒンジ部分だけを使用することもできる。ＣＤ８アルファの部分を使用することもできる。
いくつかの実施形態において、上記ＣＤ７０ＣＡＲ核酸は、膜貫通ドメインおよび改変されたＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメインなどの、他の共刺激レセプターをコードする配列を含む。他の共刺激レセプターとしては、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ－４０（ＣＤ１３４）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、及び４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＤ３ζによって惹起される１次シグナルに加えて、ヒトＣＡＲに挿入されたヒト共刺激レセプターによって提供されるさらなるシグナルが、ＮＫ細胞の完全な活性化にとって重要であり、インビボでの持続性および養子免疫療法の治療の成功の改善を助け得る。
いくつかの実施形態において、ＣＤ７０特異的ＣＡＲは、養子療法によって標的化される特定の細胞型において発現されるＣＤ７０（例えば、正常細胞型上または非罹患細胞型上に発現される抗原）に対する特異性を有するように構築される。したがって、上記ＣＡＲは通常、その細胞外の部分に、１つ以上の抗原結合分子（例えば、１つ以上の抗原結合フラグメント、抗原結合ドメインもしくは抗原結合部分）または１つ以上の抗体可変ドメイン、および／または抗体分子を含む。いくつかの実施形態において、上記ＣＤ７０ＣＡＲは、抗体分子の抗原結合部分（例えば、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）に由来する一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ））を含む。
ある特定の実施形態において、ＣＤ７０ＣＡＲは、腫瘍関連抗原の量が少ないとき、持続性を改善するために１つ以上のサイトカインと同時発現され得る。例えば、ＣＡＲは、ＩＬ－７、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１またはそれらの組み合わせなどの１つ以上のサイトカインと同時発現され得る。
キメラレセプターをコードするオープンリーディングフレームの配列は、ゲノムＤＮＡ起源、ｃＤＮＡ起源から得ることができるか、または合成することができるか（例えば、ＰＣＲを介して）、またはそれらの組み合わせであり得る。イントロンはｍＲＮＡを安定化すると見出されているので、ゲノムＤＮＡのサイズおよびイントロンの数に応じて、ｃＤＮＡまたはそれらの組み合わせを使用することが望ましい場合がある。また、ｍＲＮＡを安定化するために内在性または外来性の非コード領域を使用することもさらに有益であり得る。
上記キメラ構築物は、裸のＤＮＡとしてまたは好適なベクターに入った状態で免疫細胞に導入され得ることが企図される。裸のＤＮＡを用いたエレクトロポレーションによって細胞を安定的にトランスフェクトする方法は、当該分野で公知である。例えば、米国特許第６，４１０，３１９号を参照のこと。裸のＤＮＡとは、一般に、発現にとって適切な向きでプラスミド発現ベクターに含められたキメラレセプターをコードするＤＮＡのことを指す。
あるいは、キメラ構築物を免疫細胞に導入するために、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター）を用いることができる。本開示の方法に従って使用するのに適したベクターは、免疫細胞において非複製性のベクターである。ウイルスに基づくベクターが多数知られており（例えば、ＨＩＶ、ＳＶ４０、ＥＢＶ、ＨＳＶまたはＢＰＶに基づくベクター）、細胞内に維持されるそのウイルスのコピー数は、その細胞の生存能を維持するほど十分低い。
いくつかの態様において、抗原に特異的に結合する構成要素または抗原特異的認識構成要素は、１つ以上の膜貫通ドメインおよび細胞内のシグナル伝達ドメインに連結される。いくつかの実施形態において、上記ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合された膜貫通ドメインを含む。１つの実施形態において、そのＣＡＲにおけるドメインの１つと天然に会合する膜貫通ドメインが使用される。いくつかの場合において、その膜貫通ドメインは、レセプター複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるためにそのようなドメインが同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに結合するのを回避するように、選択されるかまたはアミノ酸置換によって改変される。
膜貫通ドメインは、いくつかの実施形態において、天然起源または合成起源に由来する。起源が天然である場合、そのドメインは、いくつかの態様において、任意の膜結合型タンパク質または膜貫通タンパク質に由来する。膜貫通領域は、Ｔ細胞レセプターのアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＧＩＴＲ／ＣＤ３５７、ＮＫＧ２ＤおよびＤＡＰ分子に由来する（すなわち、それらの分子の膜貫通領域を少なくとも含む）膜貫通領域を含む。あるいは、膜貫通ドメインは、いくつかの実施形態において、合成の膜貫通ドメインである。いくつかの態様において、合成の膜貫通ドメインは、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主に含む。いくつかの態様では、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットが、合成の膜貫通ドメインの各末端に見られる。
ある特定の実施形態において、ＮＫ細胞などの免疫細胞を遺伝的に改変するための本明細書中に開示されるプラットフォーム技術としては、（ｉ）エレクトロポレーションデバイス（例えば、ヌクレオフェクター）を用いた非ウイルス遺伝子導入、（ｉｉ）エンドドメイン（例えば、ＣＤ２８／ＣＤ３－ζ、ＣＤ１３７／ＣＤ３－ζまたは他の組み合わせ）を介してシグナル伝達するＣＡＲ、（ｉｉｉ）長さが不定の細胞外ドメインであって抗原認識ドメインを細胞表面に接続する細胞外ドメインを有するＣＡＲ、およびいくつかの場合では、（ｉｖ）ＣＡＲ＋免疫細胞を頑強かつ数値的に拡大することができる、Ｋ５６２に由来する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，２０１１）が挙げられる。
Ｂ．特異的ＣＡＲ実施態様の例
特定の実施形態では、特定のＣＤ７０ＣＡＲ分子、又はＣＤ７０特異的ＣＡＲを含む複数の分子をコードするベクターが、本明細書に包含される。いくつかの態様において、ＣＡＲのＣＤ７０結合ドメインはｓｃＦｖであり、ＣＤ７０に結合する任意のｓｃＦｖが本明細書において利用され得る。ｓｃＦｖの可変重鎖及び可変軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端方向に任意の順序であってよい。例えば、可変重鎖は、可変軽鎖のＮ末端側にあってもよく、又はその逆であってもよい。ｓｃＦｖはコドン最適化されてもされなくてもよい。ｓｃＦｖはヒト化されてもされなくてもよい。ＣＤ７０ｓｃＦｖの具体例としては、少なくとも４２Ｄ１２、Ａｂ７、２７Ｂ３、９Ｄ１、５７Ｂ６、またはその他が挙げられる。利用されるｓｃＦｖは、４２Ｄ１２、Ａｂ７、２７Ｂ３、９Ｄ１、５７Ｂ６、またはその他と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であってもよい。
特定の実施形態では、ベクターは、ＣＤ７０特異的ＣＡＲをコードし、１つ又は複数の他の分子もコードする。例えば、ベクターは、コドン最適化（ＣＯ）されていてもいなくてもよいＣＤ７０特異的ＣＡＲをコードしてもよく、特定の態様において、抗ＣＤ７０ ｓｃＦｖは、可変重鎖の上流又は下流に可変軽鎖を有していてもよい４２Ｄ１２ ｓｃＦｖである。具体的な実施態様において、ＣＡＲは、ＣＤ２８を含み、他の共刺激ドメインを含まず、ＣＡＲは、ＣＤ３ζも含んでいてもよい。いくつかの場合において、ベクターは、１つ以上のサイトカイン及び１つ以上の自殺遺伝子もコードする。
コドン最適化（ＣＯ）ＣＡＲ．ＣＤ７０ ４２Ｄ１２ ＶＬＶＨ ｓｃＦｖ抗体配列のＤＮＡ配列およびポリペプチド配列は以下のとおりである：
ＤＮＡ
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCTCTGCTCCTCCCTCTGGCCCTGCTGCTCCATGCCGCCAGACCCCAGGCAGTtGTGACCCAGGAGCCTTCCCTGACAGTGTCTCCAGGAGGGACGGTCACGCTCACCTGCGGCCTCAAATCTGGGTCTGTCACTTCCGATAACTTCCCCACTTGGTACCAGCAGACACCAGGCCAGGCTCCCCGATTGCTTATCTACAACACAAACACCCGTCACTCTGGCGTCCCCGACCGCTTCTCCGGATCCATCCTGGGCAACAAAGCCGCCCTCACCATCACGGGGGCCCAGGCCGACGACGAGGCCGAATATTTCTGTGCTCTGTTCATAAGTAATCCTAGTGTTGAGTTCGGCGGAGGGACCCAACTGACCGTCCTAGGTGGCAGCACCAGCGGCTCCGGCAAGCCTGGCTCTGGCGAGGGCAGCACAAAGGGAGAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGTCTACTACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTCGAGTGGGTCTCAGATATTAATAATGAAGGTGGTACTACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCTAAGAACAGCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGCGCCGAGGACACGGCCGTGTACTACTGCGCGAGAGATGCCGGATATAGCAACCATGTACCCATCTTTGATTCTTGGGGCCAGGGGACCCTGGTCACTGTCTCCTCA （配列表の配列番号：１）
タンパク
MALPVTALLLPLALLLHAARPQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGLKSGSVTSDNFPTWYQQTPGQAPRLLIYNTNTRHSGVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDEAEYFCALFISNPSVEFGGGTQLTVLGGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYYMNWVRQAPGKGLEWVSDINNEGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDAGYSNHVPIFDSWGQGTLVTVSS （配列表の配列番号：２）
コドン最適化（ＣＯ）していないＣＡＲ．ＣＤ７０ ４２Ｄ１２ ＶＨＶＬ ｓｃＦｖ抗体配列のＤＮＡ配列およびタンパク質配列は以下のとおりである：
ＤＮＡ
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCTCTGCTCCTCCCTCTGGCCCTGCTGCTCCATGCCGCCAGACCCGAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGTCTACTACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTCGAGTGGGTCTCAGATATTAATAATGAAGGTGGTACTACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCTAAGAACAGCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGCGCCGAGGACACGGCCGTGTACTACTGCGCGAGAGATGCCGGATATAGCAACCATGTACCCATCTTTGATTCTTGGGGCCAGGGGACCCTGGTCACTGTCTCCTCAGGCAGCACCAGCGGCTCCGGCAAGCCTGGCTCTGGCGAGGGCAGCACAAAGGGACAGGCAGTGGTGACCCAGGAGCCTTCCCTGACAGTGTCTCCAGGAGGGACGGTCACGCTCACCTGCGGCCTCAAATCTGGGTCTGTCACTTCCGATAACTTCCCCACTTGGTACCAGCAGACACCAGGCCAGGCTCCCCGATTGCTTATCTACAACACAAACACCCGTCACTCTGGCGTCCCCGACCGCTTCTCCGGATCCATCCTGGGCAACAAAGCCGCCCTCACCATCACGGGGGCCCAGGCCGACGACGAGGCCGAATATTTCTGTGCTCTGTTCATAAGTAATCCTAGTGTTGAGTTCGGCGGAGGGACCCAACTGACCGTCCTAGGT（配列表の配列番号：３）
タンパク
MGMALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYYMNWVRQAPGKGLEWVSDINNEGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDAGYSNHVPIFDSWGQGTLVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGLKSGSVTSDNFPTWYQQTPGQAPRLLIYNTNTRHSGVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDEAEYFCALFISNPSVEFGGGTQLTVLG（配列表の配列番号：４）
ｓｃＦｖ抗体配列 ＣＡＲ．ＣＤ７０ ４２Ｄ１２ ＶＬＶＨのＤＮＡおよびタンパク質の配列は以下の通りである。：
ＤＮＡ
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCTCTGCTCCTCCCTCTGGCCCTGCTGCTCCATGCCGCCAGACCCGAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGTCTACTACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTTGAGTGGGTCTCAGATATTAATAATGAAGGTGGTACTACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCTAAGAACAGCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGCGCCGAGGACACGGCCGTGTACTACTGCGCGAGAGATGCCGGATATAGCAACCATGTACCCATCTTTGATTCTTGGGGCCAGGGGACCCTGGTCACTGTCTCCTCAGGCAGCACCAGCGGCTCCGGCAAGCCTGGCTCTGGCGAGGGCAGCACAAAGGGACAGGCAGTGGTGACCCAGGAGCCTTCCCTGACAGTGTCTCCAGGAGGGACGGTCACGCTCACCTGCGGCCTCAAATCTGGGTCTGTCACTTCCGATAACTTCCCCACTTGGTACCAGCAGACACCAGGCCAGGCTCCCCGATTGCTTATCTACAACACAAACACCCGTCACTCTGGCGTCCCCGACCGCTTCTCCGGATCCATCCTGGGCAACAAAGCCGCCCTCACCATCACGGGGGCCCAGGCCGACGACGAGGCCGAATATTTCTGTGCTCTGTTCATAAGTAATCCTAGTGTTGAGTTCGGCGGAGGGACCCAACTGACCGTCCTAGGT （配列表の配列番号：５）
タンパク
MGMALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYYMNWVRQAPGKGLEWVSDINNEGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDAGYSNHVPIFDSWGQGTLVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGLKSGSVTSDNFPTWYQQTPGQAPRLLIYNTNTRHSGVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDEAEYFCALFISNPSVEFGGGTQLTVLG （配列表の配列番号：６）
ＣＡＲおよびＩＬ１５を含む特定のベクター分子の例は、少なくとも以下を包含する。：
ＣＯ ＣＡＲ．ＣＤ７０ ４２Ｄ１２． ＶＬＶＨ．ＩｇＧ１．ＣＤ２８．ＣＤ３ｚ－２Ａ－ＩＬ１５
ＣＯ ＣＡＲ．ＣＤ７０ ４２Ｄ１２ ＶＨＶＬ．ＩｇＧ１．ＣＤ２８．ＣＤ３ｚ－２Ａ－ＩＬ１５
ＣＡＲ．ＣＤ７０ ４２Ｄ１２ ＶＬＶＨ．ＩｇＧ１．ＣＤ２８．ＣＤ３ｚ－２Ａ－ＩＬ１５
ＣＡＲ．ＣＤ７０ ４２Ｄ１２ ＶＨＶＬ．ＩｇＧ１．ＣＤ２８．ＣＤ３ｚ－２Ａ－ＩＬ１５
例示的なＣＯ ＣＡＲ．ＣＤ７０ ４２Ｄ１２ ＶＬＶＨ．ＩｇＧ１．ＣＤ２８．ＣＤ３ｚ－２Ａ－ＩＬ１５ベクターのプラスミドマップの一例は、図１である。ＣＯ ＣＡＲ．ＣＤ７０ ４２Ｄ１２ ＶＬＶＨ．ＩｇＧ１．ＣＤ２８．ＣＤ３ｚ－２Ａ－ＩＬ１５を構成するベクターの完全なＤＮＡ配列は、以下の通りである。：
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCTCTGCTCCTCCCTCTGGCCCTGCTGCTCCATGCCGCCAGACCCCAGGCAGTtGTGACCCAGGAGCCTTCCCTGACAGTGTCTCCAGGAGGGACGGTCACGCTCACCTGCGGCCTCAAATCTGGGTCTGTCACTTCCGATAACTTCCCCACTTGGTACCAGCAGACACCAGGCCAGGCTCCCCGATTGCTTATCTACAACACAAACACCCGTCACTCTGGCGTCCCCGACCGCTTCTCCGGATCCATCCTGGGCAACAAAGCCGCCCTCACCATCACGGGGGCCCAGGCCGACGACGAGGCCGAATATTTCTGTGCTCTGTTCATAAGTAATCCTAGTGTTGAGTTCGGCGGAGGGACCCAACTGACCGTCCTAGGTGGCAGCACCAGCGGCTCCGGCAAGCCTGGCTCTGGCGAGGGCAGCACAAAGGGAGAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGTCTACTACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTCGAGTGGGTCTCAGATATTAATAATGAAGGTGGTACTACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCTAAGAACAGCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGCGCCGAGGACACGGCCGTGTACTACTGCGCGAGAGATGCCGGATATAGCAACCATGTACCCATCTTTGATTCTTGGGGCCAGGGGACCCTGGTCACTGTCTCCTCACGTACGGTCACTGTCTCTTCACAGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAAAGATCCCAAATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCACGCGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAAAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGACCGCAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAATCCCGGGCCCATGCGCATTAGCAAGCCCCACCTGCGGAGCATCAGCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACAGCCACTTCCTGACCGAGGCCGGCATCCACGTGTTCATCCTGGGCTGCTTCAGCGCCGGACTGCCCAAGACCGAGGCCAACTGGGTGAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAGGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGAGCAGCAACGGCAACGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCAGCTGA （配列表の配列番号：７）
いくつかの実施形態では、コドン最適化ＣＯ ＣＡＲ．ＣＤ７０ ４２Ｄ１２ ＶＨＶＬ．ＩｇＧ１．ＣＤ２８．ＣＤ３ｚ－２Ａ－ＩＬ１５ ベクターが採用される。コドン最適化ＣＯ ＣＡＲ．ＣＤ７０ ４２Ｄ１２ ＶＨＶＬ．ＩｇＧ１．ＣＤ２８．ＣＤ３ｚ－２Ａ－ＩＬ１５ ベクターのプラスミドマップの一例は図２である。 以下のコンストラクトＣＯ ＣＡＲ．ＣＤ７０ ４２Ｄ１２ ＶＨＶＬ．ＩｇＧ１．ＣＤ２８．ＣＤ３ｚ－２Ａ－ＩＬ１５ の完全なＤＮＡ配列は以下のとおりである。：
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCTCTGCTCCTCCCTCTGGCCCTGCTGCTCCATGCCGCCAGACCCGAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGTCTACTACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTCGAGTGGGTCTCAGATATTAATAATGAAGGTGGTACTACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCTAAGAACAGCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGCGCCGAGGACACGGCCGTGTACTACTGCGCGAGAGATGCCGGATATAGCAACCATGTACCCATCTTTGATTCTTGGGGCCAGGGGACCCTGGTCACTGTCTCCTCAGGCAGCACCAGCGGCTCCGGCAAGCCTGGCTCTGGCGAGGGCAGCACAAAGGGACAGGCAGTGGTGACCCAGGAGCCTTCCCTGACAGTGTCTCCAGGAGGGACGGTCACGCTCACCTGCGGCCTCAAATCTGGGTCTGTCACTTCCGATAACTTCCCCACTTGGTACCAGCAGACACCAGGCCAGGCTCCCCGATTGCTTATCTACAACACAAACACCCGTCACTCTGGCGTCCCCGACCGCTTCTCCGGATCCATCCTGGGCAACAAAGCCGCCCTCACCATCACGGGGGCCCAGGCCGACGACGAGGCCGAATATTTCTGTGCTCTGTTCATAAGTAATCCTAGTGTTGAGTTCGGCGGAGGGACCCAACTGACCGTCCTAGGTCGTACGGTCACTGTCTCTTCACAGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAAAGATCCCAAATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCACGCGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAAAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGACCGCAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAATCCCGGGCCCATGCGCATTAGCAAGCCCCACCTGCGGAGCATCAGCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACAGCCACTTCCTGACCGAGGCCGGCATCCACGTGTTCATCCTGGGCTGCTTCAGCGCCGGACTGCCCAAGACCGAGGCCAACTGGGTGAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAGGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGAGCAGCAACGGCAACGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCAGCTGA （配列表の配列番号：８）
非コドン最適化ＣＡＲも採用することができ、例えばＣＡＲ．ＣＤ７０ ４２Ｄ１２ ＶＬＶＨ．ＩｇＧ１．ＣＤ２８．ＣＤ３ｚ－２Ａ－ＩＬ１５ベクターが例示され、配列は以下のように提供される。：
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCTCTGCTCCTCCCTCTGGCCCTGCTGCTCCATGCCGCCAGACCCCAGGCAGTtGTGACCCAGGAGCCTTCCCTGACAGTGTCTCCAGGAGGGACGGTCACGCTCACCTGCGGCCTCAAATCTGGGTCTGTCACTTCCGATAACTTCCCCACTTGGTACCAGCAGACACCAGGCCAGGCTCCCCGATTGCTTATCTACAACACAAACACCCGTCACTCTGGCGTCCCCGACCGCTTCTCCGGATCCATCCTGGGCAACAAAGCCGCCCTCACCATCACGGGGGCCCAGGCCGACGACGAGGCCGAATATTTCTGTGCTCTGTTCATAAGTAATCCTAGTGTTGAGTTCGGCGGAGGGACCCAACTGACCGTCCTAGGTGGCAGCACCAGCGGCTCCGGCAAGCCTGGCTCTGGCGAGGGCAGCACAAAGGGAGAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGTCTACTACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTtGAGTGGGTCTCAGATATTAATAATGAAGGTGGTACTACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCTAAGAACAGCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGCGCCGAGGACACGGCCGTGTACTACTGCGCGAGAGATGCCGGATATAGCAACCATGTACCCATCTTTGATTCTTGGGGCCAGGGGACCCTGGTCACTGTCTCCTCACGTACGGTCACTGTCTCTTCACAGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAAAGATCCCAAATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCACGCGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAAAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGACCGCAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAATCCCGGGCCCATGCGCATTAGCAAGCCCCACCTGCGGAGCATCAGCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACAGCCACTTCCTGACCGAGGCCGGCATCCACGTGTTCATCCTGGGCTGCTTCAGCGCCGGACTGCCCAAGACCGAGGCCAACTGGGTGAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAGGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGAGCAGCAACGGCAACGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCAGCTGA （配列表の配列番号：９）．
ある場合には、ＣＤ８αシグナルペプチド（ＣＤ８ＳＰ）を有する特定の抗体が利用される。ＣＤ８ＳＰ ＣＤ７０ ４２Ｄ１２ ＶＬＶＨ配列の一例は、以下の通りである。：
ＤＮＡ
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCTCTGCTCCTCCCTCTGGCCCTGCTGCTCCATGCCGCCAGACCCCAGGCAGTGGTGACCCAGGAGCCTTCCCTGACAGTGTCTCCAGGAGGGACGGTCACGCTCACCTGCGGCCTCAAATCTGGGTCTGTCACTTCCGATAACTTCCCCACTTGGTACCAGCAGACACCAGGCCAGGCTCCCCGATTGCTTATCTACAACACAAACACCCGTCACTCTGGCGTCCCCGACCGCTTCTCCGGATCCATCCTGGGCAACAAAGCCGCCCTCACCATCACGGGGGCCCAGGCCGACGACGAGGCCGAATATTTCTGTGCTCTGTTCATAAGTAATCCTAGTGTTGAGTTCGGCGGAGGGACCCAACTGACCGTCCTAGGTGGCAGCACCAGCGGCTCCGGCAAGCCTGGCTCTGGCGAGGGCAGCACAAAGGGAGAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGTCTACTACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTCGAGTGGGTCTCAGATATTAATAATGAAGGTGGTACTACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCTAAGAACAGCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGCGCCGAGGACACGGCCGTGTACTACTGCGCGAGAGATGCCGGATATAGCAACCATGTACCCATCTTTGATTCTTGGGGCCAGGGGACCCTGGTCACTGTCTCCTCA （配列表の配列番号：１０）
タンパク
ARVATMGMALPVTALLLPLALLLHAARPQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGLKSGSVTSDNFPTWYQQTPGQAPRLLIYNTNTRHSGVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDEAEYFCALFISNPSVEFGGGTQLTVLGGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYYMNWVRQAPGKGLEWVSDINNEGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDAGYSNHVPIFDSWGQGTLVTVSS （配列表の配列番号：１１）
ＣＡＲ．ＣＤ７０ ４２Ｄ１２ ＶＬＶＨ．ＩｇＧ１．ＣＤ２８．ＣＤ３ｚ－２Ａ－ＩＬ１５のＣＡＲの例のプラスミドベクターマップが図３に提供されている。
ＣＡＲ．ＣＤ７０ ４２Ｄ１２ ＶＬＶＨ．ＩｇＧ１．ＣＤ２８．ＣＤ３ｚ－２Ａ－ＩＬ１５の完全なＤＮＡ配列は以下のとおりである。
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCTCTGCTCCTCCCTCTGGCCCTGCTGCTCCATGCCGCCAGACCCCAGGCAGTtGTGACCCAGGAGCCTTCCCTGACAGTGTCTCCAGGAGGGACGGTCACGCTCACCTGCGGCCTCAAATCTGGGTCTGTCACTTCCGATAACTTCCCCACTTGGTACCAGCAGACACCAGGCCAGGCTCCCCGATTGCTTATCTACAACACAAACACCCGTCACTCTGGCGTCCCCGACCGCTTCTCCGGATCCATCCTGGGCAACAAAGCCGCCCTCACCATCACGGGGGCCCAGGCCGACGACGAGGCCGAATATTTCTGTGCTCTGTTCATAAGTAATCCTAGTGTTGAGTTCGGCGGAGGGACCCAACTGACCGTCCTAGGTGGCAGCACCAGCGGCTCCGGCAAGCCTGGCTCTGGCGAGGGCAGCACAAAGGGAGAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGTCTACTACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTtGAGTGGGTCTCAGATATTAATAATGAAGGTGGTACTACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCTAAGAACAGCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGCGCCGAGGACACGGCCGTGTACTACTGCGCGAGAGATGCCGGATATAGCAACCATGTACCCATCTTTGATTCTTGGGGCCAGGGGACCCTGGTCACTGTCTCCTCACGTACGGTCACTGTCTCTTCACAGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAAAGATCCCAAATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCACGCGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAAAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGACCGCAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAATCCCGGGCCCATGCGCATTAGCAAGCCCCACCTGCGGAGCATCAGCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACAGCCACTTCCTGACCGAGGCCGGCATCCACGTGTTCATCCTGGGCTGCTTCAGCGCCGGACTGCCCAAGACCGAGGCCAACTGGGTGAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAGGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGAGCAGCAACGGCAACGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCAGCTGA （配列表の配列番号：１２）
ＣＡＲ．ＣＤ７０ ４２Ｄ１２ ＶＨＶＬ．ＩｇＧ１．ＣＤ２８．ＣＤ３ｚ－２Ａ－ＩＬ１５ ベクターは、本開示の方法及び組成物において利用され得る。ＣＡＲ．ＣＤ７０ ４２Ｄ１２ ＶＨＶＬ．ＩｇＧ１．ＣＤ２８．ＣＤ３ｚ－２Ａ－ＩＬ１５のプラスミドベクター地図は、図４に示されている。ＣＡＲ．ＣＤ７０ ４２Ｄ１２ ＶＨＶＬ．ＩｇＧ１．ＣＤ２８．ＣＤ３ｚ－２Ａ－ＩＬ１５の完全なＤＮＡ配列は、以下の通りである。：
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCTCTGCTCCTCCCTCTGGCCCTGCTGCTCCATGCCGCCAGACCCGAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGTCTACTACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTTGAGTGGGTCTCAGATATTAATAATGAAGGTGGTACTACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCTAAGAACAGCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGCGCCGAGGACACGGCCGTGTACTACTGCGCGAGAGATGCCGGATATAGCAACCATGTACCCATCTTTGATTCTTGGGGCCAGGGGACCCTGGTCACTGTCTCCTCAGGCAGCACCAGCGGCTCCGGCAAGCCTGGCTCTGGCGAGGGCAGCACAAAGGGACAGGCAGTGGTGACCCAGGAGCCTTCCCTGACAGTGTCTCCAGGAGGGACGGTCACGCTCACCTGCGGCCTCAAATCTGGGTCTGTCACTTCCGATAACTTCCCCACTTGGTACCAGCAGACACCAGGCCAGGCTCCCCGATTGCTTATCTACAACACAAACACCCGTCACTCTGGCGTCCCCGACCGCTTCTCCGGATCCATCCTGGGCAACAAAGCCGCCCTCACCATCACGGGGGCCCAGGCCGACGACGAGGCCGAATATTTCTGTGCTCTGTTCATAAGTAATCCTAGTGTTGAGTTCGGCGGAGGGACCCAACTGACCGTCCTAGGTCGTACGGTCACTGTCTCTTCACAGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAAAGATCCCAAATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCACGCGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAAAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGACCGCAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAATCCCGGGCCCATGCGCATTAGCAAGCCCCACCTGCGGAGCATCAGCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACAGCCACTTCCTGACCGAGGCCGGCATCCACGTGTTCATCCTGGGCTGCTTCAGCGCCGGACTGCCCAAGACCGAGGCCAACTGGGTGAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAGGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGAGCAGCAACGGCAACGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCAGCTGA （配列表の配列番号：１３）
Ｃ．Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）
いくつかの実施形態において、遺伝的に操作された抗原レセプターには、組換えＴＣＲ、および／または天然に存在するＴ細胞からクローニングされたＴＣＲが含まれる。「Ｔ細胞レセプター」または「ＴＣＲ」とは、可変ａ鎖および可変β鎖（それぞれＴＣＲαおよびＴＣＲβとしても知られる）または可変γ鎖および可変δ鎖（それぞれＴＣＲγおよびＴＣＲδとしても知られる）を含む分子であって、ＭＨＣレセプターに結合した抗原ペプチドに特異的に結合することができる分子のことを指す。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、αβ型である。
通常、αβ型およびγδ型として存在するＴＣＲは、一般に構造が似ているが、それらを発現しているＴ細胞は、解剖学的位置または機能が異なり得る。ＴＣＲは、細胞表面上にまたは可溶型として見られ得る。一般に、ＴＣＲは、Ｔ細胞（またはＴリンパ球）の表面上に見られ、通常、その表面上で、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原の認識に関与する。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、定常ドメイン、膜貫通ドメイン、および／または短い細胞質テイルも含み得る（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ，１９９７を参照のこと）。例えば、いくつかの態様において、ＴＣＲの各鎖は、１つのＮ末端免疫グロブリン可変ドメイン、１つの免疫グロブリン定常ドメイン、膜貫通領域、およびＣ末端に短い細胞質テイルを有し得る。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、シグナル伝達の媒介に関わるＣＤ３複合体のインバリアントタンパク質と会合される。別段述べられない限り、用語「ＴＣＲ」は、その機能的ＴＣＲフラグメントを包含すると理解されるべきである。この用語は、αβ型またはγδ型のＴＣＲをはじめとしたインタクトなまたは完全長のＴＣＲも包含する。
したがって、本明細書中の目的では、ＴＣＲへの言及には、任意のＴＣＲまたは機能的フラグメント（例えば、ＭＨＣ分子において結合した特異的な抗原ペプチド、すなわち、ＭＨＣ－ペプチド複合体に結合するＴＣＲの抗原結合部分）が含まれる。交換可能に使用され得る、ＴＣＲの「抗原結合部分」または抗原結合フラグメントとは、ＴＣＲの構造ドメインの一部しか含まないが、完全なＴＣＲが結合する抗原（例えば、ＭＨＣ－ペプチド複合体）に結合する分子のことを指す。いくつかの場合において、抗原結合部分は、特異的なＭＨＣ－ペプチド複合体に結合するための結合部位を形成するのに十分なＴＣＲの可変ドメイン（例えば、ＴＣＲの可変ａ鎖および可変β鎖）を含み、例えば一般に、各鎖が３つの相補性決定領域を含む。
いくつかの実施形態において、ＴＣＲ鎖の可変ドメインは、会合してループ、または免疫グロブリンに類似の相補性決定領域（ＣＤＲ）を形成し、それにより、抗原認識がもたらされ、ＴＣＲ分子の結合部位を形成することによってペプチド特異性が決定され、ペプチド特異性が決定される。通常、免疫グロブリンと同様に、ＣＤＲは、フレームワーク領域（ＦＲ）によって隔てられる（例えば、Ｊｏｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，２００３を参照のこと）。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ３は、プロセシングされた抗原の認識に関与する主要なＣＤＲであるが、アルファ鎖のＣＤＲ１は、抗原ペプチドのＮ末端部と相互作用するとも示されているのに対して、ベータ鎖のＣＤＲ１は、そのペプチドのＣ末端部と相互作用する。ＣＤＲ２は、ＭＨＣ分子を認識すると考えられている。いくつかの実施形態において、β鎖の可変領域は、さらなる超可変性（ＨＶ４）領域を含み得る。
いくつかの実施形態において、ＴＣＲ鎖は、定常ドメインを含む。例えば、免疫グロブリンと同様に、ＴＣＲ鎖の細胞外の部分（例えば、ａ鎖、β鎖）は、２つの免疫グロブリンドメインである、Ｎ末端における可変ドメイン（例えば、ＶａまたはＶｐ；通常、ＫａｂａｔナンバリングであるＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ タンパクｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，１９９１，５ｔｈ ｅｄ．に基づくアミノ酸１～１１６）、および細胞膜に隣接した１つの定常ドメイン（例えば、ａ鎖定常ドメインまたはＣａ、通常、Ｋａｂａｔに基づくアミノ酸１１７～２５９、β鎖定常ドメインまたはＣｐ、通常、Ｋａｂａｔに基づくアミノ酸１１７～２９５）を含み得る。例えば、いくつかの場合、それらの２本の鎖によって形成されるＴＣＲの細胞外の部分は、２つの膜近位定常ドメイン、およびＣＤＲを含む２つの膜遠位可変ドメインを含む。ＴＣＲドメインの定常ドメインは、システイン残基がジスルフィド結合を形成する短い接続配列を含み、それにより、それらの２本の鎖の間に連結が形成される。いくつかの実施形態では、ＴＣＲが、定常ドメインに２つのジスルフィド結合を含むように、そのＴＣＲは、α鎖およびβ鎖の各々に追加のシステイン残基を有してもよい。
いくつかの実施形態において、ＴＣＲ鎖は、膜貫通ドメインを含み得る。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、正に帯電している。いくつかの場合において、ＴＣＲ鎖は、細胞質テイルを含む。いくつかの場合において、その構造のおかげで、ＴＣＲはＣＤ３のような他の分子と会合することができる。例えば、膜貫通領域とともに定常ドメインを含むＴＣＲは、そのタンパク質を細胞膜に固定し得、ＣＤ３シグナル伝達装置または複合体のインバリアントサブユニットと会合し得る。
一般に、ＣＤ３は、哺乳動物においては３つの異なる鎖（γ、δおよびε）およびζ鎖を有し得る多タンパク質複合体である。例えば、哺乳動物では、この複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、２つのＣＤ３ε鎖、およびホモ二量体のＣＤ３ζ鎖を含み得る。ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖およびＣＤ３ε鎖は、単一の免疫グロブリンドメインを含む免疫グロブリンスーパーファミリーの高度に関連した細胞表面タンパク質である。ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖およびＣＤ３ε鎖の膜貫通領域は、負に帯電しており、これは、これらの鎖が、正に帯電したＴ細胞レセプター鎖と会合できるようにする特性である。ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖およびＣＤ３ε鎖の各細胞内テイルは、免疫受容活性化チロシンモチーフまたはＩＴＡＭとして知られる保存された単一のモチーフを含むのに対して、各ＣＤ３ζ鎖は、３つ含む。一般に、ＩＴＡＭは、ＴＣＲ複合体のシグナル伝達能に関わる。これらのアクセサリー分子は、負に帯電した膜貫通領域を有し、ＴＣＲから細胞へのシグナルの伝播において役割を果たす。ＣＤ３鎖およびζ鎖は、ＴＣＲと一体となって、Ｔ細胞レセプター複合体として知られる複合体を形成する。
いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、２本の鎖αおよびβ（または必要に応じてγおよびδ）のヘテロ二量体であり得るか、または一本鎖ＴＣＲ構築物であり得る。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、ジスルフィド結合などによって連結された２本の別個の鎖（α鎖とβ鎖またはγ鎖とδ鎖）を含むヘテロ二量体である。いくつかの実施形態において、標的抗原（例えば、癌抗原）に対するＴＣＲが特定され、細胞に導入される。いくつかの実施形態において、ＴＣＲをコードする核酸は、公的に入手可能なＴＣＲ ＤＮＡ配列のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅などによって、種々の起源から得ることができる。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、生物学的起源、例えば、細胞、例えば、Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、Ｔ細胞ハイブリドーマまたは他の公的に入手可能な起源から得られる。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、インビボで単離された細胞から得ることができる。いくつかの実施形態において、高親和性Ｔ細胞クローンが、患者から単離され得、ＴＣＲが単離され得る。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、培養されたＴ細胞ハイブリドーマまたはクローンであり得る。いくつかの実施形態において、標的抗原に対するＴＣＲクローンは、ヒト免疫系遺伝子（例えば、ヒト白血球抗原系、すなわちＨＬＡ）で操作されたトランスジェニックマウスにおいて産生されたクローンである。例えば、腫瘍抗原（例えば、Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，２００９およびＣｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）を参照のこと。いくつかの実施形態では、ファージディスプレイを用いて、標的抗原に対するＴＣＲが単離される（例えば、Ｖａｒｅｌａ－Ｒｏｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．，２００８およびＬｉ，２００５を参照のこと）。いくつかの実施形態において、ＴＣＲまたはその抗原結合部分は、ＴＣＲの配列の知識によって合成的に作製され得る。
ＩＩ.サイトカイン
１つまたは複数のサイトカインを、ＣＤ７０特異的ＣＡＲなどの１つまたは複数のＣＤ７０標的遺伝子工学的レセプターとともに利用することができる。ある場合には、１つ又は複数のサイトカインは、遺伝子操作されたレセプターと同じベクター分子上に存在するが、他の場合には、それらは別々の分子上に存在する。特定の実施形態では、１つまたは複数のサイトカインは、設計されたレセプターと同じベクターから共発現される。１つ以上のサイトカインは、ＣＤ７０特異的レセプターとは別のポリペプチドとして産生されてもよい。一例として、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、が利用される。ＩＬ－１５は、例えば、組織に制限され、病理学的条件下でのみ、血清中、または全身に任意のレベルで観察されるため、採用され得る。ＩＬ－１５は、養子縁組療法に望ましいいくつかの特性を有している。ＩＬ－１５は、ナチュラルキラー細胞の発生と細胞増殖を誘導し、腫瘍常在細胞の機能抑制を緩和して確立した腫瘍の根絶を促進し、活性化誘導細胞死を阻害する恒常性サイトカインである。ＩＬ－１５に加え、他のサイトカインも想定される。これらには、サイトカイン、ケモカイン、およびヒトへの適用に用いられる細胞の活性化および増殖に寄与する他の分子が含まれるが、これらに限定されるものではない。一例として、サイトカインは、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－７、またはそれらの組合せである。ＩＬ－１５を発現するＮＫ細胞は利用されてもよく、支持的なサイトカインシグナル伝達を継続することができ、これは注入後の生存に有用である。
特定の実施形態において、ＮＫ細胞は、１つ以上の外因的に提供されたサイトカインを発現する。サイトカインは、細胞内の発現ベクターから発現されるため、ＮＫ細胞に外来的に提供され得る。別の態様では、細胞内の内因性サイトカインは、サイトカインのプロモーター部位（複数可）での遺伝子組み換えなどの内因性サイトカインの発現調節の操作によりアップレギュレートされる。サイトカインが発現構築物上で細胞に供給される場合、サイトカインは、自殺と同じベクターからコードされていてもよい。サイトカインは、自殺遺伝子とは別のポリペプチド分子として、また、細胞の操作されたレセプターとは別のポリペプチドとして発現されてもよい。いくつかの実施形態において、本開示は、ＣＡＲ及び／又はＴＣＲベクターとＩＬ－１５との共利用、特にＮＫ細胞における共利用に関する。
ＩＩＩ.自殺遺伝子
特定の実施形態において、細胞療法の使用を制御するため、ならびに所望の事象および／または時点において細胞療法を終結させるために、任意の種類の細胞療法とともに自殺遺伝子が使用される。自殺遺伝子は、必要なときに、形質導入された細胞に対して死を誘発する目的で、形質導入された細胞において使用される。本開示によって包含されるベクターを有するように改変された本開示のＣＤ７０標的化細胞は、１つ以上の自殺遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書中で使用される用語「自殺遺伝子」は、プロドラッグまたは他の作用物質が投与された際に、遺伝子産物が、宿主細胞を殺滅する化合物に変化する遺伝子と定義される。他の実施形態において、自殺遺伝子は、望まれるとき、自殺遺伝子産物を標的化する作用物質（例えば、抗体）によって標的化される、遺伝子産物をコードする。
使用され得る自殺遺伝子／プロドラッグの組み合わせの例は、単純ヘルペスウイルス－チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）と、ガンシクロビル、アシクロビルまたはＦＩＡＵ；オキシドレダクターゼとシクロヘキシミド；シトシンデアミナーゼと５－フルオロシトシン；チミジンキナーゼチミジル酸キナーゼ（Ｔｄｋ：：Ｔｍｋ）とＡＺＴ；およびデオキシシチジンキナーゼとシトシンアラビノシドである。プロドラッグである６－メチルプリンデオキシリボシドを毒性のプリンである６－メチルプリンに変換するいわゆる自殺遺伝子であるＥ．ｃｏｌｉのプリンヌクレオシドホスホリラーゼが使用され得る。プロドラッグ治療とともに用いられる自殺遺伝子の他の例は、Ｅ．ｃｏｌｉのシトシンデアミナーゼ遺伝子およびＨＳＶチミジンキナーゼ遺伝子である。
例示的な自殺遺伝子としては、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＥＧＦＲｖ３または誘導性カスパーゼ９も挙げられる。１つの実施形態では、切断バージョンのＥＧＦＲバリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖ３）が、セツキシマブによって切断され得る自殺抗原として使用され得る。本開示において使用され得る当該分野で公知のさらなる自殺遺伝子としては、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、シトクロムｐ４５０酵素（ＣＹＰ）、カルボキシペプチダーゼ（ＣＰ）、カルボキシルエステラーゼ（ＣＥ）、ニトロ還元酵素（ＮＴＲ）、グアニンリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＲＴＰ）、グリコシダーゼ酵素、メチオニン－α，γ－リアーゼ（ＭＥＴ）およびチミジンホスホリラーゼ（ＴＰ）が挙げられる。
特定の実施形態において、ＣＤ７０標的化ＣＡＲをコードするベクター、または本明細書中に包含されるＮＫ細胞における任意のベクターは、１つ以上の自殺遺伝子を含む。自殺遺伝子は、ＣＤ７０標的化ＣＡＲと同じベクター上に存在していてもよいし、しなくてもよい。自殺遺伝子がＣＤ７０標的化ＣＡＲと同じベクター上に存在する場合、その自殺遺伝子とＣＡＲとは、例えば、ＩＲＥＳまたは２Ａエレメントによって隔てられている場合がある。
具体的な実施形態において、自殺遺伝子は、ＴＮＦ－アルファ変換酵素（ＴＡＣＥとも称される）などの、自然界でＴＮＦを切断する標準的な酵素によって切断できない腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－アルファ変異体である。したがって、そのＴＮＦ－アルファ変異体は、特定の実施形態において、膜結合型であり、非分泌性である。本開示において使用されるＴＮＦ－アルファ変異体は、その変異体に結合する１つ以上の作用物質（少なくとも抗体を含む）によって標的化可能であり、その作用物質がその細胞の表面上のＴＮＦ－アルファ変異体に結合した後、その細胞は死滅する。本開示の実施形態は、ＴＮＦ－アルファ変異体が、それを発現する細胞に対するマーカーとして使用されるのを可能にする。
切断できないＴＮＦ－アルファ変異体を発現している細胞は、例えば、エタネルセプト、インフリキシマブまたはアダリルマブなどの、現在、臨床で用いられているＦＤＡが承認したＴＮＦ－α抗体を用いて、選択的な欠失について標的化され得る。変異したＴＮＦ－アルファポリペプチドは、その細胞において１つ以上の治療用の導入遺伝子（例えば、ＣＤ７０を標的化するＴＣＲおよび／またはＣＡＲを含む、ＴＣＲまたはＣＡＲをコードする遺伝子）と同時発現され得る。さらに、ＴＮＦ－アルファ変異体を発現している細胞は、膜結合型ＴＮＦ－アルファタンパク質の生物学的活性によって媒介される、優れた活性を腫瘍標的に対して有する。
野生型に関して、ＴＮＦ－アルファには、２６ｋＤの膜貫通型と、１７ｋＤの分泌成分とがある。Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ．（１９９０）に記載されているいくつかの変異体が、本開示において使用され得る。具体的な実施形態において、本開示のＴＮＦ－アルファ変異体の例としては、１７ｋＤのＴＮＦに関して少なくとも以下が挙げられる：（１）Ｖａｌ１の欠失およびＰｒｏｌ１２の欠失；（２）Ｖａｌ１３の欠失；（３）Ｖａｌ１の欠失およびＶａｌ１３の欠失；（４）Ｖａｌ１からＰｒｏｌ１２までの欠失およびＶａｌ１３の欠失（１３ａａの欠失）；（５）Ａｌａ－３からＶａｌ１３までの欠失（１４ａａの欠失）。具体的な実施形態において、ＴＮＦ－アルファ変異体は、－３、－２、－１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３位またはそれらの組み合わせにおけるそれぞれのアミノ酸の欠失を含む。具体的な組み合わせとしては、－３位から１３位まで；－３位から１２位まで；－３位から１１位まで；－３位から１０位まで；－３位から９位まで；－３位から８位まで；－３位から７位まで；－３位から６位まで；－３位から５位まで；－３位から４位まで；－３位から３位まで；－３位から２位まで；－３位から１位まで；－３位から－１位まで；－３位から－２位まで；－２位から１３位まで；－２位から１２位まで；－２位から１１位まで；－２位から１０位まで；－２位から９位まで；－２位から８位まで；－２位から７位まで；－２位から６位まで；－２位から５位まで；－２位から４位まで；－２位から３位まで；－２位から２位まで；－２位から１位まで；－２位から－１位まで；－１位から１３位まで；－１位から１２位まで；－１位から１１位まで；－１位から１０位まで；－１位から９位まで；－１位から８位まで；－１位から７位まで；－１位から６位まで；－１位から５位まで；－１位から４位まで；－１位から３位まで；－１位から２位まで；－１位から１位まで；１位から１３位まで；１位から１２位まで；１位から１１位まで；１位から１０位まで；１位から９位まで；１位から８位まで；１位から７位まで；１位から６位まで；１位から５位まで；１位から４位まで；１位から３位まで；１位から２位まで；などの欠失が挙げられる。
ＴＮＦ－アルファ変異体は、任意の好適な方法によって作製されてよいが、具体的な実施形態において、それらは、部位特異的突然変異誘発によって作製される。いくつかの場合において、ＴＮＦ－アルファ変異体は、そのタンパク質を切断できなくする変異以外の変異を有し得る。具体的な場合において、ＴＮＦ－アルファ変異体は、Ｖａｌ１、Ｐｒｏ１２および／もしくはＶａｌ１３またはそれらの間の領域に、欠失以外の１つ、２つ、３つまたはそれ以上の変異を有し得る。変異体を非分泌性にする変異以外の変異は、アミノ酸の置換、欠失、付加、逆位などのうちの１つ以上であり得る。さらなる変異がアミノ酸置換である場合、その置換は、例えば、保存的アミノ酸への置換であってもよいし、そうでなくてもよい。いくつかの場合において、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上のさらなるアミノ酸が、そのタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に存在し得る。いくつかの場合において、ＴＮＦ－アルファ変異体は、（１）変異体を非分泌性にする１つ以上の変異；（２）変異体に対するアウトサイドインシグナル伝達を妨げる１つ以上の変異；および／または（３）ＴＮＦレセプター１および／またはＴＮＦレセプター２への変異体の結合を干渉する１つ以上の変異を有する。
特定の実施形態において、ＴＮＦ－アルファ変異体を発現しているＣＤ７０ＣＡＲ標的化細胞に結合する有効量の１つ以上の作用物質を送達すると、ＴＮＦ－アルファ変異体発現細胞の大部分は除去される。具体的な実施形態において、ＴＮＦ－アルファ変異体を発現している細胞の５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％超が、個体において除去される。その細胞を除去する必要性を認識した後、１つ以上の症状がもはや存在しなくなるまで、または十分な数の細胞が除去されるまで、個体へのその作用物質の送達を継続することができる。個体における細胞数は、ＴＮＦ－アルファ変異体をマーカーとして用いてモニターされ得る。
本開示の方法の実施形態は、有効量のＣＤ７０標的化免疫細胞療法を、それを必要とする個体に提供する第１の工程であって、その細胞は、１つ以上の非分泌性ＴＮＦ－アルファ変異体を含む、工程；および自殺遺伝子としてＴＮＦ－アルファ変異体を使用して細胞を除去する（任意の機構による細胞死を通じて直接または間接的に除去する）第２の工程を含み得る。第２の工程は、その個体に対する少なくとも１つの有害事象の発生時に推進され得、その有害事象は、細胞療法の開始から継続的であってもよいし、そうでなくてもよい、通例のモニタリングをはじめとした任意の手段によって認識され得る。それらの有害事象は、検査および／または試験の際に検出され得る。個体が、サイトカイン放出症候群（サイトカインストームとも称されることがある）を有する場合、その個体は、例えば、高い炎症性サイトカイン（単なる例として：インターフェロン－ガンマ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ＩＬ－１０、ＩＬ－６およびＴＮＦ－アルファ）；発熱；疲労；低血圧；低酸素症、頻拍；悪心；毛細血管漏出；心臓／腎臓／肝臓の機能不全；またはそれらの組み合わせを有し得る。個体が神経毒性を有する場合、その個体は、錯乱、せん妄、形成不全および／または発作を有し得る。いくつかの場合、個体は、サイトカイン放出症候群の発生および／または重症度に関連するマーカー（例えば、Ｃ反応性タンパク質、ＩＬ－６、ＴＮＦ－アルファおよび／またはフェリチン）について試験される。
追加の実施形態において、サイトカイン放出症候群または神経毒性における、非分泌性ＴＮＦ－αに結合する１つ以上の作用物質の投与は、例えば、治療の毒性の一因となる高レベルの可溶性ＴＮＦ－アルファを中和するという追加の利点を有する。可溶性ＴＮＦ－アルファは、サイトカイン放出症候群において高レベルで放出され、ＣＡＲ Ｔ細胞療法による毒性のメディエーターである。そのような場合、本明細書中に包含されるＴＮＦ－アルファ抗体の投与には、有益な二重効果があり、すなわち、ＴＮＦ－アルファ変異体発現細胞の選択的な欠失、ならびに毒性を引き起こす可溶性ＴＮＦ－アルファの中和をもたらす。したがって、本開示の実施形態は、細胞が非分泌性ＴＮＦ－アルファ変異体を発現する養子細胞療法を受けているまたは受けたことがある個体におけるサイトカイン放出症候群を排除するかまたはその重症度を低下させる方法を包含し、その方法は、非分泌性ＴＮＦ－アルファ変異体に結合する有効量の作用物質を提供する工程を含み、前記作用物質は、その個体において、（ａ）その細胞療法の細胞の少なくとも一部を除去し；（ｂ）可溶性ＴＮＦ－アルファのレベルを低下させる。
本開示の実施形態は、非分泌性ＴＮＦ－アルファ変異体を発現する細胞を用いた細胞療法を受けたことがあるまたは受けている個体におけるサイトカイン放出症候群の影響を低減する方法を含み、その方法は、その変異体に結合する有効量の１つ以上の作用物質を提供して、その個体において、（ａ）その細胞療法の細胞の少なくとも一部を除去し；（ｂ）可溶性ＴＮＦ１－アルファのレベルを低下させる工程を含む。
ＴＮＦ－アルファ自殺遺伝子を使用する必要が生じたとき、個体には、細胞の表面上でＴＮＦ－アルファ変異体を阻害することができる（例えば、ＴＮＦ－アルファ変異体に直接結合することによって）有効量の１つ以上の阻害剤が提供される。それらの阻害剤は、いくつかの実施形態において、個体に全身性におよび／または局所的に提供され得る。その阻害剤は、ポリペプチド（例えば、抗体）、核酸、小分子（例えば、キサンチン誘導体）、ペプチドまたはそれらの組み合わせであり得る。具体的な実施形態において、それらの抗体は、ＦＤＡに承認されている。阻害剤が抗体であるとき、その阻害剤は、少なくともいくつかの場合において、モノクローナル抗体であり得る。抗体の混合物が使用されるとき、その混合物中の１つ以上の抗体は、モノクローナル抗体であり得る。小分子ＴＮＦ－アルファ阻害剤の例としては、米国特許第５，１１８，５００号（その全体が参照により本明細書中に援用される）に記載されているものなどの小分子が挙げられる。ポリペプチドＴＮＦ－アルファ阻害剤の例としては、米国特許第６，１４３，８６６号（その全体が参照により本明細書中に援用される）に記載されているものなどのポリペプチドが挙げられる。
特定の実施形態において、少なくとも１つの抗体が、自殺遺伝子としてのその活性の引き金を引くＴＮＦ－アルファ変異体を標的化するために使用される。抗体の例としては、例えば、少なくとも、アダリムマブ、アダリムマブ－ａｔｔｏ、セルトリズマブペゴール、エタネルセプト、エタネルセプト－ｓｚｚｓ、ゴリムマブ、インフリキシマブ、インフリキシマブ－ｄｙｙｂまたはそれらの混合物が挙げられる。
本開示の実施形態は、細胞療法の細胞を、非分泌性ＴＮＦ－アルファ変異体を発現するように改変することによって、個体に対する細胞療法の毒性のリスクを低下させる方法を含む。細胞療法は、具体的な実施形態において癌のための細胞療法であり、癌抗原を含む抗原を標的化する操作されたレセプターを含み得る。
特定の実施形態において、本開示の本発明のＮＫ細胞療法に加えて、その病状に対するさらなる治療が、すでに個体に提供されたことがある場合がある、提供される場合がある、および／または提供される予定がある。病状が癌である場合、個体には、手術、放射線照射、免疫療法（本開示の細胞療法以外）、ホルモン療法、遺伝子療法、化学療法などのうちの１つ以上が提供され得る。
ＩＶ．ベクター
ＣＤ７０標的化ＣＡＲは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターをはじめとした任意の好適なベクターによってレシピエント免疫細胞に送達され得る。ウイルスベクターの例としては、少なくとも、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターが挙げられる。非ウイルスベクターの例としては、少なくとも、プラスミド、トランスポゾン、脂質、ナノ粒子などが挙げられる。
免疫細胞に、ＣＤ７０標的化レセプターをコードするベクターが形質導入され、その細胞への別の遺伝子（例えば、自殺遺伝子および／またはサイトカインおよび／または自由選択の治療用の遺伝子産物）の形質導入も必要である場合、そのＣＤ７０標的化レセプター、自殺遺伝子、サイトカインおよび自由選択の治療用の遺伝子は、同じベクター上にまたは同じベクターとともに含められてもよいし、そうでなくてもよい。いくつかの場合において、ＣＤ７０標的化ＣＡＲ、自殺遺伝子、サイトカインおよび自由選択の治療用の遺伝子は、同じウイルスベクター分子などの同じベクター分子から発現される。そのような場合、ＣＤ７０標的化ＣＡＲ、自殺遺伝子、サイトカインおよび自由選択の治療用の遺伝子の発現は、同じ調節エレメントによって制御されてもよいし、そうでなくてもよい。ＣＤ７０標的化ＣＡＲ、自殺遺伝子、サイトカインおよび自由選択の治療用の遺伝子が、同じベクター上に存在するとき、それらは、別個のポリペプチドとして発現されてもよいし、そうでなくてもよい。それらが別個のポリペプチドとして発現される場合、それらは、例えば、２ＡエレメントまたはＩＲＥＳエレメント（またはその両方の種類が、同じベクター上に１回または１回より多く使用されてもよい）によって、ベクター上で隔てられている場合がある。
Ａ．一般的な実施形態
当業者であれば、本開示の抗原レセプターを発現させるために標準的な組換え手法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６（両方が参照により本明細書中に援用される）を参照のこと）によってベクターを構築する能力を充分に備えているだろう。
１．調節エレメント
本開示において有用なベクターに含められる発現カセットは、特に、タンパク質コード配列に作動可能に連結された真核生物転写プロモーター、介在配列を含むスプライスシグナル、および転写終結／ポリアデニル化配列を（５’から３’の方向で）含む。タンパク質をコードする遺伝子の転写を真核細胞において制御するプロモーターおよびエンハンサーは、複数の遺伝的エレメントを含み得る。細胞機構は、各エレメントによって運ばれる調節情報を集め、統合することができ、それにより、異なる遺伝子が、多くの場合は複雑なパターンである異なるパターンの転写制御を展開することが可能になる。本開示の状況において使用されるプロモーターとしては、例えば、構成的プロモーター、誘導性プロモーターおよび組織特異的プロモーターが挙げられる。ベクターが癌治療の生成に利用される場合、プロモーターは低酸素状態下で有効である可能性がある。
２．プロモーター／エンハンサー
本明細書中に提供される発現構築物は、抗原レセプターおよびその他のシストロン遺伝子産物の発現を駆動するプロモーターを含む。プロモーターは、一般に、ＲＮＡ合成のための開始部位の位置を特定するように機能する配列を含む。これの最もよく知られている例は、ＴＡＴＡボックスであるが、哺乳動物のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターおよびＳＶ４０後期遺伝子のプロモーターなど、一部のプロモーターでは、ＴＡＴＡボックスを欠き、開始部位自体と重なっている不連続なエレメントが、開始の場所を固定するのを助ける。さらなるプロモーターエレメントが、転写開始の頻度を制御する。通常、これらは、開始部位の上流の領域に位置するが、いくつかのプロモーターは、開始部位の下流にも機能的エレメントを含むと示されている。コード配列をプロモーター「の支配下に」するためには、転写読み枠の転写開始部位の５’末端を、選択されたプロモーターの「下流」（すなわち、３’）に置く。「上流」のプロモーターは、ＤＮＡの転写を刺激し、コードされるＲＮＡの発現を促進する。
プロモーターエレメント間の間隔は、変更がきくことが多く、エレメントが、反転されるかまたは互いに対して移動された場合でも、プロモーターの機能は保存される。ｔｋプロモーターでは、例えば、プロモーターエレメント間の間隔は、活性が低下し始めるまで最大５０ｂｐ広げられ得る。プロモーターに応じて、個々のエレメントは、協同的にまたは独自に機能して転写を活性化し得るとみられる。プロモーターは、核酸配列の転写性の活性化に関わるシス作用性制御配列のことを指す「エンハンサー」と併せて使用されてもよいし、使用されなくてもよい。
プロモーターは、コードセグメントおよび／またはエキソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって得られることがあるような、ある核酸配列と天然に会合したプロモーターであり得る。そのようなプロモーターは、「内在性」プロモーターと呼ぶことができる。同様に、エンハンサーは、ある核酸配列の下流または上流に位置する、その配列と天然に会合したエンハンサーであり得る。あるいは、ある核酸配列とその天然の環境では天然には会合していないプロモーターのことを指す、組換えプロモーターまたは異種プロモーターの支配下にコード核酸セグメントを置くことによって、一定の利点が得られる。また、組換えエンハンサーまたは異種エンハンサーは、その天然の環境では核酸配列と天然には会合していないエンハンサーのことを指す。そのようなプロモーターまたはエンハンサーには、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、ならびに他の任意のウイルスまたは原核細胞もしくは真核細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー、ならびに「天然に存在」しない、すなわち、種々の転写制御領域の種々のエレメントおよび／または発現を変化させる変異を含む、プロモーターまたはエンハンサーが含まれ得る。例えば、組換えＤＮＡの構築において最もよく使用されるプロモーターとしては、βラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースおよびトリプトファン（ｔｒｐ－）プロモーターシステムが挙げられる。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成的に作製することに加えて、組換えクローニング、および／またはＰＣＲＴＭをはじめとした核酸増幅技術を用いて、ある配列が、本明細書中に開示される組成物に関連して作製され得る。さらに、核以外のオルガネラ（例えば、ミトコンドリア、葉緑体など）内での配列の転写および／または発現を指示する調節配列も同様に使用できることが企図される。
当然、発現のために選択されたオルガネラ、細胞型、組織、器官または生物におけるＤＮＡセグメントの発現を効果的に指示するプロモーターおよび／またはエンハンサーを使用することが重要になる。分子生物学の当業者は、一般に、タンパク質発現のために、プロモーター、エンハンサーおよび細胞型の組み合わせを使用することを承知している（例えば、参照により本明細書中に援用されるＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．１９８９を参照のこと）。使用されるプロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、および／または導入されたＤＮＡセグメントの高レベル発現を指示する、適切な条件下において有用なプロモーター（例えば、組換えタンパク質および／または組換えペプチドの大規模生成において有益なプロモーター）であり得る。そのプロモーターは、異種であっても、内在性であってもよい。
さらに、任意のプロモーター／エンハンサーの組み合わせ（例えば、ｅｐｄ．ｉｓｂ－ｓｉｂ．ｃｈ／のワールドワイドウェブを介したＥｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｄａｔａ Ｂａｓｅ ＥＰＤＢに従って）も、発現を駆動するために使用され得る。Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６細胞質発現系の使用が、別の実行可能な実施形態である。適切な細菌ポリメラーゼが、送達複合体の一部としてまたはさらなる遺伝的発現構築物として提供される場合、真核細胞は、ある特定の細菌プロモーターからの細胞質での転写を支持し得る。
プロモーターの非限定的な例としては、初期ウイルスプロモーターまたは後期ウイルスプロモーター（例えば、ＳＶ４０初期または後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）初期プロモーター）；真核細胞プロモーター（例えば、ベータアクチンプロモーター、ＧＡＤＰＨプロモーター、メタロチオネインプロモーター）；および連鎖状応答エレメントプロモーター（例えば、サイクリックＡＭＰ応答エレメントプロモーター（ｃｒｅ）、血清応答エレメントプロモーター（ｓｒｅ）、ホルボールエステルプロモーター（ＴＰＡ）およびミニマルＴＡＴＡボックス近傍の応答エレメントプロモーター（ｔｒｅ））が挙げられる。ヒト成長ホルモンプロモーター配列（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）に記載されているヒト成長ホルモンミニマルプロモーター、アクセッション番号Ｘ０５２４４、ヌクレオチド２８３～３４１）またはマウス乳腺腫瘍プロモーター（ＡＴＣＣから入手可能，（登録商標）Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＴＣＣ４５００７）を使用することも可能である。ある特定の実施形態において、プロモーターは、ＣＭＶ ＩＥ、デクチン－１、デクチン－２、ヒトＣＤ１１ｃ、Ｆ４／８０、ＳＭ２２、ＲＳＶ、ＳＶ４０、Ａｄ ＭＬＰ、ベータ－アクチン、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩプロモーターであるが、しかしながら、治療用の遺伝子の発現を駆動するために有用な他の任意のプロモーターも本開示の実施に適用できる。
ある特定の態様において、本開示の方法は、エンハンサー配列、すなわち、プロモーターの活性を増加させる核酸配列であって、シスで、かつその向きを問わず、比較的長い距離（標的プロモーターから最大数キロベース離れた距離）にわたって作用する能力を有する核酸配列にも関する。しかしながら、エンハンサーは、所与のプロモーターに対して近位でも機能し得るので、エンハンサーの機能は必ずしもそのような長い距離に限定されない。
３．開始シグナルおよび連結発現
コード配列の効率的な翻訳のために、本開示に提供される発現構築物において、特異的な開始シグナルも使用され得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンまたは隣接配列を含む。外来性の翻訳制御シグナル（ＡＴＧ開始コドンを含む）が提供される必要がある場合がある。当業者であれば、これを判断することおよび必要なシグナルを提供することが容易にできるだろう。インサート全体の翻訳を確保するためには、開始コドンが、所望のコード配列の読み枠と「インフレーム」でなければならないことは周知である。その外来性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然のものまたは合成のものであり得る。適切な転写エンハンサーエレメントを含めることによって、発現効率が高められ得る。
ある特定の実施形態において、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントの使用は、多重遺伝子のメッセージ、すなわちポリシストロニックなメッセージを生成するために使用される。ＩＲＥＳエレメントは、５’メチル化キャップ依存的翻訳のリボソームスキャニングモデルを迂回し、内部の部位において翻訳を開始することができる。ピコルナウイルス科の２つのメンバー（ポリオおよび脳心筋炎）由来のＩＲＥＳエレメント、ならびに哺乳動物のメッセージ由来のＩＲＥＳが、報告されている。ＩＲＥＳエレメントは、異種のオープンリーディングフレームに連結できる。各々がＩＲＥＳによって隔てられた複数のオープンリーディングフレームを一緒に転写することができ、ポリシストロニックなメッセージを生成できる。ＩＲＥＳエレメントのおかげで、各オープンリーディングフレームが、効率的な翻訳のためにリボソームに接近できるようになる。単一のプロモーター／エンハンサーを用いて複数の遺伝子を効率的に発現して、単一のメッセージを転写することもできる。
さらに、本開示に提供される構築物内の遺伝子の連結発現または同時発現をもたらすために、ある特定の２Ａ配列エレメントが使用され得る。例えば、オープンリーディングフレームを連結して単一のシストロンを形成することによって遺伝子を同時発現するために、切断配列が使用され得る。例示的な切断配列は、ウマ鼻炎Ａウイルス（Ｅ２Ａ）又はＦ２Ａ（口蹄疫ウイルス２Ａ）または「２Ａ様」配列（例えば、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス２Ａ；Ｔ２Ａ）またはブタテッショウウイルス－１（Ｐ２Ａ）である。特定の実施形態では、単一のベクターでは、複数の２Ａ配列は同一ではないが、代替の実施形態では、同じベクターが同じ２Ａ配列のうちの２つ以上を利用する。２Ａ配列の例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／００６５７７９号に提供されている。
４．複製開始点
宿主細胞においてベクターを増殖させるために、そのベクターは、１つ以上の複製開始部位（「ｏｒｉ」と呼ばれることが多い）、例えば、複製が開始される特異的な核酸配列である、上に記載されたようなＥＢＶのｏｒｉＰまたはプログラミングにおける機能が似ているかもしくは高められた遺伝的に操作されたｏｒｉＰに対応する核酸配列を含み得る。あるいは、上に記載されたような染色体外で複製する他のウイルスの複製起点、または自律複製配列（ＡＲＳ）を使用することができる。
ｅ．選択マーカーおよびスクリーニング可能なマーカー
いくつかの実施形態において、本開示のＣＤ７０標的化レセプター構築物を含むＮＫ細胞は、マーカーを発現ベクターに含めることによって、インビトロまたはインビボにおいて特定され得る。そのようなマーカーは、発現ベクターを含む細胞を容易に特定できるようにする特定可能な変化を細胞にもたらす。一般に、選択マーカーは、選択を可能にする特性を付与するマーカーである。ポジティブ選択マーカーは、そのマーカーが存在することによってその選択が可能になるマーカーであり、ネガティブ選択マーカーは、その存在が選択を妨げるマーカーである。ポジティブ選択マーカーの例は、薬物耐性マーカーである。
通常、薬物選択マーカーを含めることにより、形質転換体のクローニングおよび特定が助けられ、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチジノールに対して耐性にする遺伝子が、有用な選択マーカーである。条件の実行に基づいて形質転換体の判別を可能にする表現型を付与するマーカーに加えて、比色解析を基礎とする、ＧＦＰなどのスクリーニング可能なマーカーをはじめとした他のタイプのマーカーも企図される。あるいは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などの、ネガティブ選択マーカーとしてスクリーニング可能な酵素が利用され得る。当業者であれば、免疫学的マーカーをおそらくはＦＡＣＳ解析と併せて使用する方法も承知しているだろう。使用されるマーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現されることが可能である限り、重要ではないと考えられている。選択マーカーおよびスクリーニング可能なマーカーのさらなる例は、当業者に周知である。
Ｂ．マルチシストロニックベクター
特定の実施形態において、ＣＤ７０標的化レセプター、自由選択の自殺遺伝子、自由選択のサイトカイン、および／または自由選択の治療用の遺伝子は、マルチシストロニックベクターから発現される（本明細書中で使用される用語「シストロン」とは、遺伝子産物が生成され得る核酸配列のことを指す）。具体的な実施形態において、マルチシストロニックベクターは、ＣＤ７０標的化レセプター、自殺遺伝子、および少なくとも１つのサイトカイン、および／または操作されたレセプター（例えば、Ｔ細胞レセプターおよび／またはさらなる非ＣＤ７０標的化ＣＡＲ）をコードする。いくつかの場合において、マルチシストロニックベクターは、少なくとも１つのＣＤ７０標的化ＣＡＲ、少なくとも１つのＴＮＦ－アルファ変異体および少なくとも１つのサイトカインをコードする。そのサイトカインは、特定のタイプのサイトカイン、例えば、ヒトまたはマウスまたは任意の種のサイトカインであり得る。具体的な場合において、サイトカインは、ＩＬ１５、ＩＬ１２、ＩＬ２、ＩＬ１８および／またはＩＬ２１である。
ある特定の実施形態において、本開示は、複数のシストロンを実質的に同一レベルで発現する能力を有するポリシストロニックベクターを利用したフレキシブルなモジュール式のシステム（本明細書中で使用される用語「モジュール式」とは、例えば、標準的な組換え手法を用いることによる、シストロン全体またはシストロンの構成要素の除去および置換などによってその相互交換可能性を可能にさせる、それぞれシストロンまたはシストロンの構成要素のことを指す）を提供する。このシステムは、複数の遺伝子のコンビナトリアル発現（過剰発現を含む）を可能にする細胞操作に使用され得る。具体的な実施形態において、このベクターによって発現される遺伝子の１つ以上が、１つ、２つまたはそれ以上の抗原レセプターを含む。その複数の遺伝子としては、ＣＡＲ、ＴＣＲ、サイトカイン、ケモカイン、ホーミングレセプター、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性遺伝子変異、デコイレセプター、サイトカインレセプター、キメラサイトカインレセプターなどが挙げられ得るが、これらに限定されない。そのベクターは、（１）１つ以上のレポーター、例えば、細胞アッセイ用および動物イメージング用などの、蛍光レポーターまたは酵素レポーター；（２）１つ以上のサイトカインまたは他のシグナル伝達分子；および／または（３）自殺遺伝子をさらに含み得る。
具体的な場合において、上記ベクターは、２Ａ切断部位などの任意の種類の切断部位によって隔てられた少なくとも４つのシストロンを含み得る。このベクターは、プサイパッケージング配列とともに３’および５’ＬＴＲをｐＵＣ１９骨格に含む、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶまたはＭＭＬＶ）に基づくベクターであってもよいし、そうでなくてもよい。このベクターは、遺伝子交換のために３つ以上の２Ａ切断部位および複数のＯＲＦを含む４つ以上のシストロンを含み得る。このシステムは、サブクローニングによる迅速なインテグレーションのための制限酵素認識部位に隣接した複数の遺伝子（７つ以上）のコンビナトリアル過剰発現を可能にし、このシステムはまた、いくつかの実施形態では、少なくとも３つの２Ａ自己切断部位も含む。したがって、このシステムは、複数のＣＡＲ、ＴＣＲ、シグナル伝達分子、サイトカイン、サイトカインレセプターおよび／またはホーミングレセプターの発現を可能にする。このシステムは、レンチウイルス、アデノウイルスＡＡＶならびに非ウイルスプラスミドを含むがこれらに限定されない、他のウイルスベクターおよび非ウイルスベクターにも適用され得る。
上記システムのモジュール式の性質は、ポリシストロニック発現ベクター内の４つの各シストロンに遺伝子を効率的にサブクローニングすること、および迅速試験などのために遺伝子の交換も可能にする。ポリシストロニック発現ベクター内に戦略的に配置された制限酵素認識部位により、遺伝子の交換が効率的に行える。
本開示の実施形態は、ポリシストロニックベクターを利用するシステムを包含し、そのベクターの少なくとも一部は、例えば、１つ以上のシストロン（または１つ以上のシストロンの構成要素）の除去および置換を可能にすることによって、例えば、そのベクターのモジュールの使用を容易にするために同一性および位置が特異的に選択された１つ以上の制限酵素部位を利用することによって、モジュール式になっている。このベクターは、複数のシストロンが、単一のポリペプチドに翻訳され、別々のポリペプチドにプロセシングされ、それにより、別個の遺伝子産物を実質的に等モル濃度で発現するというこのベクターの利点を付与する実施形態も有する。
本開示のベクターは、そのベクターの１つ以上のシストロンを変更することおよび／または１つ以上の特定のシストロンの１つ以上の構成要素を変更することができるモジュール性が得られるように構成されている。そのベクターは、１つ以上のシストロンの末端に隣接するおよび／または特定のシストロンの１つ以上の構成要素の末端に隣接するユニークな制限酵素部位を利用するようにデザインされ得る。
本開示の実施形態は、それぞれが１つ以上の制限酵素部位に隣接する少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つのシストロンを含むポリシストロニックベクターを含み、少なくとも１つのシストロンが、少なくとも１つの抗原レセプターをコードする。いくつかの場合では、２つ、３つ、４つまたはそれ以上のシストロンが、単一のポリペプチドに翻訳され、別々のポリペプチドに切断されるのに対して、他の場合では、複数のシストロンが、単一のポリペプチドに翻訳され、別々のポリペプチドに切断される。ベクター上の隣接シストロンは、２Ａ自己切断部位などの自己切断部位によって隔てられていることがある。いくつかの場合において、各シストロンが、ベクターから別々のポリペプチドを発現する。特定の場合において、ベクター上の隣接シストロンは、ＩＲＥＳエレメントによって隔てられている。
ある特定の実施形態において、本開示は、例えば１つ、２つまたはそれ以上の抗原レセプターを含み得る複数のシストロンのコンビナトリアル発現（過剰発現を含む）を可能にする細胞操作のためのシステムを提供する。特定の実施形態において、本明細書中に記載されるようなポリシストロニックベクターを使用することにより、そのベクターが同じｍＲＮＡから等モルレベルの複数の遺伝子産物を生成することが可能になる。その複数の遺伝子としては、ＣＡＲ、ＴＣＲ、サイトカイン、ケモカイン、ホーミングレセプター、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性遺伝子変異、デコイレセプター、サイトカインレセプター、キメラサイトカインレセプターなどが挙げられ得るが、これらに限定されない。このベクターは、細胞アッセイ用および動物イメージング用などの１つ以上の蛍光レポーターまたは酵素レポーターをさらに含み得る。このベクターは、ベクターを有する細胞がもはや必要なくなったときまたは提供された宿主にとって有害になったとき、それらの細胞を終結させるための自殺遺伝子産物も含み得る。
本開示の特定の実施形態において、ベクター上のシストロンの少なくとも１つは、２つ以上のモジュール式構成要素を含み、シストロン内のモジュール式構成要素の各々は、１つ以上の制限酵素部位に隣接している。シストロンは、例えば、３つ、４つまたは５つのモジュール式構成要素を含み得る。少なくともいくつかの場合において、シストロンは、対応するモジュール式構成要素によってコードされるレセプターの異なる部分を有する抗原レセプターをコードする。シストロンの第１のモジュール式構成要素は、レセプターの抗原結合ドメインをコードし得る。さらに、シストロンの第２のモジュール式構成要素は、レセプターのヒンジ領域をコードし得る。さらに、シストロンの第３のモジュール式構成要素は、レセプターの膜貫通ドメインをコードし得る。さらに、シストロンの第４のモジュール式構成要素は、第１の共刺激ドメインをコードし得る。さらに、シストロンの第５のモジュール式構成要素は、第２の共刺激ドメインをコードし得る。さらに、シストロンの第６のモジュール式構成要素は、シグナル伝達ドメインをコードし得る。
本開示の特定の態様において、ベクター上の異なる２つのシストロンはそれぞれ、同一でない抗原レセプターをコードする。両方の抗原レセプターが、２つ以上のモジュール式構成要素を含む別個のシストロンを含む、２つ以上のモジュール式構成要素を含むシストロンによってコードされ得る。抗原レセプターは、例えば、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）および／またはＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）であり得る。
具体的な実施形態において、ベクターは、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクター）または非ウイルスベクターである。ベクターは、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）の５’ＬＴＲ、３’ＬＴＲおよび／またはプサイパッケージングエレメントを含み得る。具体的な場合において、プサイパッケージングは、５’ＬＴＲと抗原レセプターコード配列との間に組み込まれている。ベクターは、ｐＵＣ１９配列を含んでもよいし、含まなくてもよい。ベクターのいくつかの態様において、少なくとも１つのシストロンが、サイトカイン（例えば、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、ＩＬ－７、ＩＬ－２１、ＩＬ－１８、ＩＬ－１２またはＩＬ－２）、ケモカイン、サイトカインレセプターおよび／またはホーミングレセプターをコードする。
２Ａ切断部位が、ベクターにおいて使用されるとき、その２Ａ切断部位は、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａおよび／またはＦ２Ａ部位を含み得る。
ＣＤ７０標的化ＣＡＲをコードする１つのシストロンに加えて、ベクターの任意のシストロンが、自殺遺伝子を含み得る。ベクターの任意のシストロンが、レポーター遺伝子をコードし得る。具体的な実施形態において、第１のシストロンが、自殺遺伝子をコードし、第２のシストロンが、ＣＤ７０標的化ＣＡＲをコードし、第３のシストロンが、レポーター遺伝子をコードし、第４のシストロンが、サイトカインをコードする。ある特定の実施形態において、第１のシストロンが、自殺遺伝子をコードし、第２のシストロンが、ＣＤ７０標的化ＣＡＲをコードし、第３のシストロンが、第２のＣＡＲまたは別の抗原レセプターをコードし、第４のシストロンが、サイトカインをコードする。具体的な実施形態において、ＣＤ７０標的化ＣＡＲおよび／または別のレセプターの異なる部分が、対応するモジュール式構成要素によってコードされ、第２のシストロンの第１の構成要素が、抗原結合ドメインをコードし、第２の構成要素が、ヒンジおよび／または膜貫通ドメインをコードし、第３の構成要素が、共刺激ドメインをコードし、第４の構成要素が、シグナル伝達ドメインをコードする。
具体的な実施形態において、上記シストロンのうちの少なくとも１つは、自殺遺伝子をコードする。いくつかの実施形態において、上記シストロンのうちの少なくとも１つは、サイトカインをコードする。ある特定の実施形態において、少なくとも１つのシストロンは、ＣＤ７０標的化ＣＡＲをコードする。シストロンは、レポーター遺伝子をコードしてもよいし、しなくてもよい。ある特定の実施形態において、少なくとも２つのシストロンが、２つの異なる抗原レセプター（例えば、ＣＡＲおよび／またはＴＣＲ）をコードする。シストロンは、レポーター遺伝子をコードしてもよいし、しなくてもよい。
目的の遺伝的積荷の特定の配置において、単一のベクターが、ＣＤ７０標的化ＣＡＲをコードするシストロン、およびＣＤ７０標的化レセプターと同一ではない第２の抗原レセプターをコードするシストロンを含み得る。具体的な実施形態において、第１の抗原レセプターが、ＣＤ７０標的化ＣＡＲをコードし、第２の抗原レセプターが、ＴＣＲをコードするか、またはその逆である。特定の実施形態において、ＣＤ７０標的化ＣＡＲおよび第２の抗原レセプターをそれぞれコードする別個のシストロンを含むベクターは、サイトカインまたはケモカインをコードする第３のシストロンおよび自殺遺伝子をコードする第４のシストロンも含む。しかしながら、その自殺遺伝子および／またはサイトカイン（またはケモカイン）は、ベクター上に存在しないことがある。
特定の実施形態において、少なくとも１つのシストロンが、それ自体がモジュール式である複数の構成要素を含む。例えば、１つのシストロンが、複数の部分を有する抗原レセプターなどの複数の構成要素の遺伝子産物をコードし得る。具体的な場合において、その抗原レセプターは、単一のシストロンからコードされ、それにより、単一のポリペプチドが最終的に生成される。複数の構成要素をコードするシストロンは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上の制限酵素消化部位（そのシストロンを含むベクターに特有の１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上の制限酵素消化部位を含む）によって隔てられた複数の構成要素を有し得る（図１Ａおよび図１Ｂ）。具体的な実施形態において、複数の構成要素を有するシストロンは、複数の対応する部分を有する抗原レセプターであって、その対応する各部分が、ユニークな機能をそのレセプターに属させる抗原レセプターをコードする。具体的な実施形態において、複数の構成要素のシストロンの構成要素の各々または大部分が、ベクターに特有の１つ以上の制限酵素消化部位によって隔てられており、それにより、所望する場合に、別個の構成要素の相互交換可能性が可能になる。
具体的な実施形態において、複数の構成要素のシストロンの各構成要素は、ＣＤ７０標的化ＣＡＲなどのコードされる抗原レセプターの異なる部分に対応する。例証的な実施形態では、構成要素１は、レセプターのＣＤ７０抗原結合ドメインをコードし得；構成要素２は、レセプターのヒンジドメインをコードし得；構成要素３は、レセプターの膜貫通ドメインをコードし得；構成要素４は、レセプターの共刺激ドメインをコードし得、構成要素５は、レセプターのシグナル伝達ドメインをコードし得る。具体的な実施形態において、ＣＤ７０標的化ＣＡＲは、１つ以上の共刺激ドメインを含み得、その各共刺激ドメインは、レセプター内の共刺激ドメインが相互交換可能になるように、ユニークな制限酵素消化部位によって隔てられている。
具体的な実施形態において、４つの別々のシストロンを有するポリシストロニックベクターが存在し、ここで、隣接するシストロンは、２Ａ切断部位によって隔てられているが、具体的な実施形態において、２Ａ切断部位の代わりに、別個のポリペプチドを直接または間接的にシストロンから生成させるエレメント（例えば、ＩＲＥＳ配列）が存在する。例えば、４つの別個のシストロンが、３つの２Ａペプチド切断部位によって隔てられている場合があり、各シストロンは、標準的な組換え手法を用いるとき、特定のシストロンの相互交換可能性（例えば、別のシストロンまたは他のタイプの配列との相互交換可能性）を可能にする、シストロンの各末端に隣接している制限酵素認識部位（Ｘ１、Ｘ２など）を有する。具体的な実施形態において、各シストロンに隣接する制限酵素部位は、組換えを容易にするためにベクターに特有であるが、代替の実施形態において、その制限酵素部位は、ベクターに特有ではない。
特定の実施形態において、ベクターは、特定のシストロン内の相互交換可能性（特定のシストロンの複数の構成要素内の相互交換可能性を含む）を可能にすることによってユニークな第２のレベルのモジュール性を提供する。特定のシストロンの複数の構成要素は、そのシストロン内の１つ以上の構成要素の相互交換可能性を可能にするために１つ以上の制限酵素部位（ベクターに特有のものを含む）によって隔てられ得る。一例として、シストロン２は、５つの別個の構成要素を含み得るが、シストロン１つあたり２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上の構成要素が存在してもよい。一例として、ベクターは、標準的な組換えが、異なる構成要素１、２、３、４および／または５を交換できるように、それぞれがユニークな制限酵素部位Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３およびＸ１４によって隔てられた５つの構成要素を有するシストロン２を含み得る。いくつかの場合において、異なる構成要素（ユニークであるが、１つ以上はユニークではない）の間に複数の制限酵素部位が存在することがあり、複数の制限酵素部位の間に配列が存在することがある（が、あるいは存在しないことがある）。ある特定の実施形態において、シストロンによってコードされるすべての構成要素が、相互交換可能であることを目的としてデザインされる。特定の場合において、あるシストロンの１つ以上の構成要素が、相互交換可能であるようにデザインされているのに対して、そのシストロンの他の１つ以上の構成要素は、相互交換可能であるようにデザインされていないことがある。
具体的な実施形態において、シストロンは、複数の構成要素を有するＣＤ７０標的化ＣＡＲ分子をコードする。例えば、シストロン２は、構成要素１、構成要素２、構成要素３などによって表される別個の構成要素を有するＣＤ７０標的化ＣＡＲ分子をコードする配列を含み得る。そのＣＡＲ分子は、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたはそれ以上の相互交換可能な構成要素を含み得る。具体例では、構成要素１は、ＣＤ７０ｓｃＦｖをコードし；構成要素２は、ヒンジをコードし；構成要素３は、膜貫通ドメインをコードし；構成要素４は、共刺激ドメインをコードし（交換のために、制限酵素認識部位に隣接した第２またはそれ以上の共刺激ドメインをコードする構成要素４’も存在し得るが）；構成要素５は、シグナル伝達ドメインをコードする。特定の例において、構成要素１は、ＣＤ７０ｓｃＦｖをコードし；構成要素２は、ＩｇＧ１ヒンジおよび／または膜貫通ドメインをコードし；構成要素３は、ＣＤ２８をコードし；構成要素４は、ＣＤ３ゼータをコードする。
当業者は、ベクターのデザインにおいて、様々なシストロンおよび構成要素が、必要である場合にはインフレームで維持されるように配置されなければならないことを認識する。
特定の例では、シストロン１は、自殺遺伝子をコードし；シストロン２は、ＣＤ７０標的化ＣＡＲをコードし；シストロン３は、レポーター遺伝子をコードし；シストロン４は、サイトカインをコードし；シストロン２の構成要素１は、ＣＤ７０ｓｃＦｖをコードし；シストロン２の構成要素２は、ＩｇＧ１ヒンジをコードし；シストロン２の構成要素３は、ＣＤ２８をコードし；構成要素４は、ＣＤ３ゼータをコードする。
制限酵素部位は、任意の種類であってよく、その認識部位に任意の数の塩基（例えば、４～８塩基）を含み得る。認識部位の塩基数は、少なくとも４、５、６、７、８またはそれ以上であり得る。その部位は、切断されると、平滑末端または粘着末端を生成し得る。制限酵素は、例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型またはＩＶ型であり得る。制限酵素部位は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｒｅｌａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｚｙｍｅデータベース（ＩｎｔＥｎｚ）またはＢＲＥＮＤＡ（Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）などの利用可能なデータベースから入手することができる。
例示的なベクターは、円形であり得、慣例により、１位（円の上部にある１２時の位置で、残りの配列は時計回りの方向である）が、５’ＬＴＲの開始点に設定されている。
自己切断２Ａペプチドを利用する実施形態において、その２Ａペプチドは、真核細胞において翻訳中のポリペプチドの「切断」を媒介する１８～２２アミノ酸（ａａ）長のウイルスオリゴペプチドであり得る。「２Ａ」という呼称は、ウイルスゲノムの特定の領域のことを指し、種々のウイルス２Ａが、概してそれらが由来するウイルスにちなんで命名されている。初めて発見された２Ａは、Ｆ２Ａ（口蹄疫ウイルス）であり、その後、Ｅ２Ａ（ウマ鼻炎Ａウイルス）、Ｐ２Ａ（ブタテッショウウイルス－１ ２Ａ）およびＴ２Ａ（ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス２Ａ）も同定された。２Ａ媒介性の「自己切断」の機序は、リボソームが、２ＡのＣ末端においてグリシル－プロリルのペプチド結合の形成をスキップすることであると発見された。
具体的な場合において、ベクターは、γ－レトロウイルストランスファーベクターであり得る。そのレトロウイルストランスファーベクターは、ｐＵＣ１９プラスミドなどのプラスミドに基づく骨格を含み得る（ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位とＥｃｏＲＩ制限酵素部位との間に大型フラグメント（２．６３ｋｂ））。その骨格は、５’ＬＴＲ、プサイパッケージング配列および３’ＬＴＲを含む、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）由来のウイルス構成要素を有し得る。ＬＴＲは、レトロウイルスのプロウイルスのどちらかの側に見られる末端反復配列であり、トランスファーベクターの場合、ＣＤ７０標的化ＣＡＲおよび関連する構成要素などの目的の遺伝的積荷の両脇に置かれる。ヌクレオカプシドによるパッケージングのための標的部位であるプサイパッケージング配列も、５’ＬＴＲとＣＡＲコード配列との間にシスで挟まれた形で組み込まれている。したがって、トランスファーベクターの一例の基本構造は、ｐＵＣ１９配列－５’ＬＴＲ－プサイパッケージング配列－目的の遺伝的積荷－３’ＬＴＲ－ｐＵＣ１９配列のように構成され得る。このシステムは、レンチウイルス、アデノウイルスＡＡＶならびに非ウイルスプラスミドを含むがこれらに限定されない、他のウイルスベクターおよび非ウイルスベクターにも適用され得る。
Ｖ．細胞
本開示は、ＣＤ７０標的化レセプターをコードし、かつ少なくとも１つのサイトカインおよび／または少なくとも１つの自殺遺伝子もコードし得る、少なくとも１つのベクターを有する任意の種類の免疫細胞または幹細胞を包含する。いくつかの場合において、種々のベクターが、そのＣＡＲをコードするのに対して、自殺遺伝子および／またはサイトカインをコードする。ＮＫ細胞を含む免疫細胞は、臍帯血、末梢血、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、骨髄またはそれらの混合物に由来し得る。ＮＫ細胞は、例えばＮＫ－９２細胞であるがこれに限定されない細胞株に由来し得る。ＮＫ細胞は、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞などの臍帯血単核細胞であり得る。
本開示は、従来のＴ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞、ＮＫＴおよびインバリアントＮＫＴ細胞、制御性Ｔ細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、樹状細胞、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）またはそれらの混合物をはじめとした任意の種類の免疫細胞または他の細胞を包含する。
いくつかの場合において、それらの細胞は、有効量のユニバーサル抗原提示細胞（ＵＡＰＣ）（任意の好適な比を含む）の存在下において拡大されている。それらの細胞は、１０：１～１：１０；９：１～１：９；８：１～１：８；７：１～１：７；６：１～１：６；５：１～１：５；４：１～１：４；３：１～１：３；２：１～１：２；または１：１（例えば、１：２の比を含む）の比でＵＡＰＣと培養され得る。いくつかの場合において、ＮＫ細胞は、例えば、１０～５００、１０～４００、１０～３００、１０～２００、１０～１００、１０～５０、１００～５００、１００～４００、１００～３００、１００～２００、２００～５００、２００～４００、２００～３００、３００～５００、３００～４００または４００～５００Ｕ／ｍＬという濃度のＩＬ－２の存在下において拡大された。
それらのＮＫ細胞は、ベクターによる遺伝的改変の後、直ちに注入され得るか、または保存され得る。ある特定の態様において、遺伝的改変の後、細胞への遺伝子導入後の約１、２、３、４、５日以内またはそれ以降に、それらの細胞は、数日間、数週間または数ヶ月間、エキソビボでバルク集団として増殖され得る。さらなる態様において、トランスフェクタントは、クローン化され、単一のインテグレートされたまたはエピソームに保持された発現カセットまたはプラスミドの存在、およびＣＤ７０標的化ＣＡＲの発現を示すクローンが、エキソビボで拡大される。拡大のために選択されるクローンは、ＣＤ７０を発現している標的細胞を特異的に認識し、溶解する能力を示す。組換え免疫細胞は、ＩＬ－２、または共通ガンマ鎖に結合する他のサイトカイン（例えば、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１など）を用いた刺激によって拡大され得る。組換え免疫細胞は、人工抗原提示細胞を用いた刺激によって拡大され得る。さらなる態様において、遺伝的に改変された細胞は、凍結保存され得る。
本開示の実施形態は、１つ以上のＣＤ７０標的化ＣＡＲ、および本明細書中に包含されるような１つ以上の自殺遺伝子を発現する細胞を包含する。ＮＫ細胞は、具体的な実施形態において、１つ以上のＣＤ７０標的化ＣＡＲおよび１つ以上の操作された非分泌性の膜結合型ＴＮＦ－アルファ変異体ポリペプチドをコードする組換え核酸を含む。具体的な実施形態において、その細胞は、１つ以上のＣＤ７０標的化ＣＡＲおよびＴＮＦ－アルファ変異体ポリペプチドの発現に加えて、１つ以上の治療用の遺伝子産物をコードする核酸も含む。
上記細胞は、個体から直接入手され得るか、または保管所もしくは他の保存施設から入手され得る。治療としての上記細胞は、それらの細胞が治療として提供される個体に対して自己または同種異系であり得る。
上記細胞は、ある病状に対する治療を必要とする個体に由来し得、ＣＤ７０標的化ＣＡＲ、自由選択の自殺遺伝子、自由選択のサイトカインおよび自由選択の治療用の遺伝子産物を発現するように（例えば、養子細胞療法に向けた形質導入および拡大のための標準的な手法を用いて）操作した後、元々その起源である個体に戻され得る。いくつかの場合において、それらの細胞は、その個体または別の個体に対して後で使用するために保存される。
上記免疫細胞は、細胞集団に含まれ得、その集団は、１つ以上のＣＤ７０標的化レセプターおよび／または１つ以上の自殺遺伝子および／または１つ以上のサイトカインを形質導入された細胞が多数を占め得る。細胞集団は、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の、１つ以上のＣＤ７０標的化レセプターおよび／または１つ以上の自殺遺伝子および／または１つ以上のサイトカインを形質導入された免疫細胞を含み得る。その１つ以上のＣＤ７０標的化レセプターおよび／または１つ以上の自殺遺伝子および／または１つ以上のサイトカインは、別個のポリペプチドであり得る。
上記免疫細胞は、具体的な目的に関してモジュール式になるように、１つ以上のＣＤ７０標的化レセプターおよび／または１つ以上の自殺遺伝子および／または１つ以上のサイトカインを用いて作製され得る。例えば、商業的分配などのために、ＣＤ７０標的化ＣＡＲおよび／または１つ以上の自殺遺伝子および／または１つ以上のサイトカインを発現する細胞（またはその後の形質導入のために変異体をコードする核酸とともに分配される）が作製され得、意図された目的に応じて、ユーザーが、１つ以上の他の目的遺伝子（治療用の遺伝子を含む）を発現するようにそれらを改変してもよい。例えば、ＣＤ７０陽性癌を含むＣＤ７０陽性細胞の処置に関心がある個体は、自殺遺伝子発現細胞（または異種サイトカイン発現細胞）を得るかまたは作製し、ＣＤ７０特異的ｓｃＦｖを含むレセプターを発現するようにそれらを改変し得るか、またはその逆である。
特定の実施形態において、ＮＫ細胞が使用され、１つ以上のＣＤ７０標的化ＣＡＲおよび／または１つ以上の自殺遺伝子および／または１つ以上のサイトカインを発現する形質導入されたＮＫ細胞のゲノムが改変され得る。そのゲノムは、任意の様式で改変され得るが、具体的な実施形態において、そのゲノムは、例えば、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集によって改変される。それらの細胞のゲノムは、任意の目的のためにそれらの細胞の有効性を高めるように改変され得る。
ＩＶ．ＣＤ７０特異的ＣＡＲ細胞の遺伝子編集
特定の実施形態において、ＣＤ７０に特異的な操作されたレセプターを少なくとも含む細胞が、その細胞における１つ以上の内在性遺伝子の発現を改変するために遺伝子編集される。具体的な場合において、ＣＤ７０特異的ＣＡＲ細胞は、１つ以上の内在性遺伝子の発現の阻害（ノックアウトと称されることがある）など、１つ以上の内在性遺伝子の発現レベルが低下するように改変される。そのような細胞は、拡大されてもよいし、されなくてもよい。
特定の場合において、上記ＣＤ７０特異的ＣＡＲ細胞の１つ以上の内在性遺伝子は、発現が破壊されるなど、改変され、ここで、その発現は、部分的または完全に低下される。具体的な場合において、１つ以上の遺伝子が、本開示のプロセスを用いてノックダウンまたはノックアウトされる。具体的な場合において、複数の遺伝子が、ノックダウンまたはノックアウトされ、これは、それらの作製における同じ工程において行われてもよいし、そうでなくてもよい。ＣＤ７０特異的ＣＡＲ細胞において編集される遺伝子は、任意の種類であってよいが、具体的な実施形態において、それらの遺伝子は、その遺伝子産物がＣＤ７０特異的ＣＡＲ細胞（ＣＤ７０特異的ＣＡＲ ＮＫ細胞、例えば一例として、臍帯血に由来するものを含む）の活性および／または増殖を阻害する遺伝子である。具体的な場合において、ＣＤ７０特異的ＣＡＲ細胞において編集される遺伝子は、そのＣＤ７０特異的ＣＡＲ細胞が腫瘍微小環境においてより効果的に働くのを可能にする。具体的な場合において、それらの遺伝子は、ＮＫＧ２Ａ、ＳＩＧＬＥＣ－７、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＩＳＨ、ＦＯＸＯ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＡＤＯＲＡ２、ＮＲ３Ｃ１、ＰＤ１、ＰＤＬ－１、ＰＤＬ－２、ＣＤ４７、ＳＩＲＰＡ、ＳＨＩＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＲＰＳ６、４ＥＢＰ１、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＩＬ２１Ｒ、ＩＣＡＭ１、ＣＤ９５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ１０Ｒ、ＣＤ５およびＣＤ７のうちの１つ以上である。具体的な実施形態では、ＴＧＦＢＲ２遺伝子が、ＣＤ７０特異的ＣＡＲ細胞においてノックアウトまたはノックダウンされる。
いくつかの実施形態において、遺伝子編集は、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）を介した変更など、１つ以上のＤＮＡ結合核酸を用いて行われる。例えば、その変更は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）およびＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質を用いて行われ得る；いくつかの実施形態において、ＣｐＦ１が、Ｃａｓ９の代わりに使用される。一般に、「ＣＲＩＳＰＲシステム」とは、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子（Ｃａｓ遺伝子をコードする配列を含む）、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性な部分的ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイト配列（内在性のＣＲＩＳＰＲシステムの文脈では「直列反復配列」、およびｔｒａｃｒＲＮＡによってプロセシングされた部分的な直列反復配列を包含する）、ガイド配列（内在性のＣＲＩＳＰＲシステムの文脈では「スペーサー」とも称される）、ならびに／またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座由来の他の配列および転写物の発現に関与するかまたはその活性を指示する転写物および他のエレメントのことを総称する。
ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムは、ＤＮＡに配列特異的に結合する非コードＲＮＡ分子（ガイド）ＲＮＡ、およびヌクレアーゼ機能（例えば、２つのヌクレアーゼドメイン）を有するＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）を含み得る。ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上のエレメントが、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムに由来し得、例えば、内在性のＣＲＩＳＰＲシステムを含む特定の生物（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来し得る。
いくつかの態様において、ＣａｓヌクレアーゼおよびｇＲＮＡ（標的配列に特異的なｃｒＲＮＡと既定のｔｒａｃｒＲＮＡとの融合物を含む）が、細胞に導入される。一般に、ｇＲＮＡの５’末端における標的部位が、相補的な塩基対形成によって、Ｃａｓヌクレアーゼをその標的部位、例えば、遺伝子に標的化する。標的部位は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列（例えば、通常、ＮＧＧまたはＮＡＧ）のすぐ５’の位置に基づいて選択され得る。この点において、ｇＲＮＡは、標的ＤＮＡ配列に対応するようにガイドＲＮＡの最初の２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１４、１２、１１または１０ヌクレオチドを改変することによって、所望の配列に標的化される。一般に、ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的配列の部位においてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントを特徴とする。通常、「標的配列」とは、一般に、ガイド配列が相補性を有するようにデザインされる配列のことを指し、標的配列とガイド配列とのハイブリダイゼーションが、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性があれば、完全な相補性は必ずしも必要ない。
ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的部位における二本鎖切断（ＤＳＢ）に続いて、本明細書中で論じられるような破壊または変更を誘導し得る。他の実施形態では、「ニッカーゼ」とみなされるＣａｓ９バリアントが、標的部位において一本鎖にニックを入れるために使用される。例えば特異性を改善するために、対のニッカーゼを使用することができ、そのニッカーゼの各々は、配列を標的化する異なるｇＲＮＡの対によって導かれ、ニックが同時に導入されると、５’オーバーハングが導入される。他の実施形態では、遺伝子発現に影響するように、触媒的に不活性なＣａｓ９が、転写抑制因子または転写活性化因子などの異種エフェクタードメインに融合される。
標的配列は、ＤＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡポリヌクレオチドなどの任意のポリヌクレオチドを含み得る。標的配列は、細胞のオルガネラ内など、細胞の核または細胞質に位置し得る。一般に、標的配列を含む標的化される遺伝子座への組換えのために使用され得る配列または鋳型は、「編集鋳型」または「編集ポリヌクレオチド」または「編集配列」と称される。いくつかの態様では、外来性の鋳型ポリヌクレオチドが、編集鋳型と称されることがある。いくつかの態様において、組換えは、相同組換えである。
通常、内在性のＣＲＩＳＰＲシステムの文脈では、ＣＲＩＳＰＲ複合体（標的配列にハイブリダイズして１つ以上のＣａｓタンパク質と複合体化するガイド配列を含む）の形成によって、標的配列においてまたは標的配列の近くで（例えば、標的配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０塩基対以内またはそれ以上以内において）一方または両方の鎖の切断が生じる。野生型ｔｒａｃｒ配列の全部もしくは一部（例えば、野生型ｔｒａｃｒ配列の約２０ヌクレオチド、約２６ヌクレオチド、約３２ヌクレオチド、約４５ヌクレオチド、約４８ヌクレオチド、約５４ヌクレオチド、約６３ヌクレオチド、約６７ヌクレオチド、約８５ヌクレオチドもしくはそれ以上または約２０ヌクレオチド超、約２６ヌクレオチド超、約３２ヌクレオチド超、約４５ヌクレオチド超、約４８ヌクレオチド超、約５４ヌクレオチド超、約６３ヌクレオチド超、約６７ヌクレオチド超、約８５ヌクレオチド超もしくはそれ以上）を含み得るかまたはそれらからなり得るｔｒａｃｒ配列も、ガイド配列に作動可能に連結されたｔｒａｃｒメイト配列の全部または一部へのｔｒａｃｒ配列の少なくとも一部に沿ったハイブリダイゼーションなどによって、ＣＲＩＳＰＲ複合体の一部を形成し得る。ｔｒａｃｒ配列は、ハイブリダイズしてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に参加する、ｔｒａｃｒメイト配列に対して十分な相補性（例えば、最適にアラインメントされたとき、ｔｒａｃｒメイト配列の長さに沿って少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の配列相補性）を有する。
ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上のエレメントの発現によって、１つ以上の標的部位においてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成が指示されるように、そのＣＲＩＳＰＲシステムのそれらのエレメントの発現を駆動する１つ以上のベクターが細胞に導入され得る。また、構成要素がタンパク質および／またはＲＮＡとして細胞に送達され得る。例えば、Ｃａｓ酵素、ｔｒａｃｒメイト配列に連結されたガイド配列、およびｔｒａｃｒ配列がそれぞれ、別個のベクター上の別個の調節エレメントに作動可能に連結され得る。あるいは、同じまたは異なる調節エレメントから発現されるエレメントの２つ以上が、単一ベクターにおいて組み合わされ得、１つ以上のさらなるベクターが、第１のベクターに含まれていないＣＲＩＳＰＲシステムの任意の構成要素を提供する。そのベクターは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列などの１つ以上の挿入部位（「クローニング部位」とも称される）を含み得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の挿入部位が、１つ以上のベクターの１つ以上の配列エレメントの上流および／または下流に配置される。複数の異なるガイド配列が使用されるとき、細胞内の異なる複数の対応する標的配列に対してＣＲＩＳＰＲ活性を標的化するために単一の発現構築物が使用され得る。
ベクターは、Ｃａｓタンパク質などのＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に連結された調節エレメントを含み得る。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらのホモログまたはそれらの改変バージョンが挙げられる。これらの酵素は公知であり；例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、アクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２としてＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースに見られ得る。
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ由来のもの）であり得る。特定の場合には、ＣｐＦ１をＣａｓ９の代わりにエンドヌクレアーゼとして使用し得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列内および／または標的配列の相補鎖内などの標的配列の位置での一方または両方の鎖の切断を指示し得る。ベクターは、対応する野生型酵素と比べて変異したＣＲＩＳＰＲ酵素をコードし得、変異したＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を切断する能力を欠く。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメインにおけるアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）は、Ｃａｓ９を、両方の鎖を切断するヌクレアーゼからニッカーゼ（一本鎖を切断する）に変換する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ガイド配列、例えば、そのＤＮＡ標的のセンス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれ標的化する２つのガイド配列と組み合わせて使用され得る。この組み合わせは、両方の鎖にニックを入れること、およびＮＨＥＪまたはＨＤＲを誘導するために使用されることができる。
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列は、真核細胞などの特定の細胞における発現に向けてコドンが最適化される。真核細胞は、特定の生物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌまたは非ヒト霊長類を含むがこれらに限定されない哺乳動物）の細胞またはそれらの生物に由来する細胞であり得る。一般に、コドンの最適化とは、天然のアミノ酸配列を維持しつつ、天然の配列の少なくとも１つのコドンをその宿主細胞の遺伝子においてより高頻度にまたは最も高頻度に使用されるコドンで置き換えることによって、目的の宿主細胞において発現が高まるように核酸配列を改変するプロセスのことを指す。様々な種が、特定のアミノ酸のある特定のコドンについて特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間でのコドン使用頻度の差異）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関することが多く、その翻訳効率は、とりわけ、翻訳されるコドンの特性および特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている。選択されるｔＲＮＡが細胞内で優勢であることは、通常、ペプチド合成において最も高頻度に使用されるコドンであることを反映する。したがって、コドン最適化に基づいて、遺伝子を所与の生物における最適な遺伝子発現に適応させることができる。
一般に、ガイド配列は、標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするのに十分およびその標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指示するのに十分な相補性をその標的配列に対して有する任意のポリヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態において、ガイド配列と対応する標的配列との相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを用いて最適にアラインメントしたとき、約５０％、約６０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９９％もしくはそれ以上、または約５０％超、約６０％超、約７５％超、約８０％超、約８５％超、約９０％超、約９５％超、約９７％超、約９９％超もしくはそれ以上である。
最適なアラインメントは、配列をアラインメントするための任意の好適なアルゴリズムを使用して決定され得る。そのアルゴリズムの非限定的な例としては、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍに基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎにおいて利用可能）およびＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔにおいて利用可能）が挙げられる。
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上の異種タンパク質ドメインを含む融合タンパク質の一部であり得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素融合タンパク質は、任意のさらなるタンパク質配列、および必要に応じて任意の２つのドメインの間にリンカー配列を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素に融合され得るタンパク質ドメインの例としては、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、ならびに以下の活性：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性および核酸結合活性のうちの１つ以上を有するタンパク質ドメインが挙げられるがこれらに限定されない。エピトープタグの非限定的な例としては、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ－Ｇタグおよびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが挙げられる。レポーター遺伝子の例としては、グルタチオン－５－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ベータガラクトシダーゼ、ベータ－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自己蛍光タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ分子に結合するかまたは他の細胞分子（マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ－タグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合物、ＧＡＬ４Ａ ＤＮＡ結合ドメイン融合物および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合物を含むがこれらに限定されない）に結合するタンパク質またはタンパク質のフラグメントをコードする遺伝子配列に融合され得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素を含む融合タンパク質の一部を形成し得るさらなるドメインは、参照により本明細書中に援用される米国特許出願公開第２０１１００５９５０２号に記載されている。
ＶＩＩ．処置方法
様々な実施形態において、内在性のＣＤ７０を表面上に発現する細胞が、病状を有する個体における病状を改善する目的のために、あるいは個体におけるその病状のリスクもしくは重症度を低下させるおよび／またはその発生を遅らせる目的のために、標的化される。具体的な場合において、内在性ＣＤ７０を発現している癌細胞が、その癌細胞を殺滅する目的のために標的化される。他の場合において、ＣＤ７０は、ＣＤ７０陽性細胞として標的化されるが、そのＣＤ７０陽性細胞は、癌細胞ではない。そのような場合において、ＣＤ７０陽性細胞は、制御性Ｔ細胞などの免疫調節性細胞であり得る。ＣＤ７０＋制御性Ｔ細胞の標的化および枯渇は、この細胞サブセットの免疫抑制効果を無くすことによって、癌の免疫療法をさらに高め得る。したがって、具体的な実施形態において、本明細書中に記載されるような、ＣＤ７０を標的化する有効量の細胞を提供することによって、癌治療の免疫抑制を低下させる方法が存在する。
本明細書中で企図されるような、ＣＤ７０標的化ＣＡＲ構築物、核酸配列、ベクター、免疫細胞など、および／またはそれを含む薬学的組成物は、腫瘍性の疾患などの癌性疾患の予防、処置または回復のために使用される。特定の実施形態において、本開示の薬学的組成物は、ＣＤ７０を発現している癌であって、例えば固形腫瘍であってもそうでなくてもよい癌を含む癌の予防、回復および／または処置において特に有用であり得る。
ＣＤ７０標的化レセプターが使用される免疫細胞は、ＮＫ、Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、もしくはＮＫＴもしくはインバリアントＮＫＴ（ｉＮＫＴ）、または特定の実施形態において、哺乳動物に対する細胞療法のために操作された誘導性ＮＫＴ細胞であり得る。それらの細胞がＮＫ細胞であるそのような場合において、ＮＫ細胞療法は、任意の種類であってよく、それらのＮＫ細胞も、任意の種類であってよい。具体的な実施形態において、それらの細胞は、１つ以上のＣＤ７０標的化ＣＡＲおよび／または１つ以上の自殺遺伝子および／または１つ以上のサイトカインを発現するように操作されたＮＫ細胞である。具体的な実施形態において、それらの細胞は、ＣＤ７０標的化ＣＡＲを形質導入されたＮＫ細胞である。
特定の実施形態において、本開示は、標準的なベクターおよび／または遺伝子送達系を用いて単独でまたは任意の組み合わせで、および少なくともいくつかの態様では、薬学的に許容され得るキャリアまたは賦形剤とともに、投与され得る、ＣＤ７０ＣＡＲ発現細胞、ＣＤ７０標的化ＣＡＲ構築物、ＣＤ７０標的化ＣＡＲ核酸分子およびＣＤ７０標的化ＣＡＲベクターを部分的に企図する。ある特定の実施形態において、投与の後、上記核酸分子またはベクターは、被験体のゲノムに安定にインテグレートされ得る。
具体的な実施形態において、ある特定の細胞または組織に特異的であって、ＮＫ細胞に長く残る、ウイルスベクターが使用され得る。好適な薬学的キャリアおよび賦形剤は、当該分野で周知である。本開示に従って調製される組成物は、上で特定された疾患を予防するためまたは処置するためまたは遅らせるために使用され得る。
さらに、本開示は、腫瘍性の疾患を予防するため、処置するためまたは回復させるための方法に関し、その方法は、それを必要とする被験体に、本明細書中で企図されるようなおよび／または本明細書中で企図されるようなプロセスによって作製される、ＣＤ７０標的化ＣＡＲ、核酸配列、ベクターを発現する有効量の細胞を投与する工程を含む。
例示的なＣＤ７０標的化ＣＡＲ細胞の組成物の投与に対して予想される適応症は、腫瘍性の疾患（例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍、多発性骨髄腫、乳癌、神経膠芽腫、腎癌、膵癌または肺癌を含む）を含む癌性疾患である。ＣＤ７０標的化ＣＡＲ細胞の組成物の投与に対する例示的な適応症は、ＣＤ７０を発現する任意の悪性腫瘍を含む癌性疾患である。本開示の組成物の投与は、すべてのステージ（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶ）およびタイプの癌（例えば、微小残存病変、初期癌、進行癌および／または転移性癌および／または治療抵抗性癌を含む）に有用である。
本開示は、免疫細胞を介して作用する他の化合物、例えば、二重特異性抗体構築物、標的化されたトキシン、または他の化合物との同時投与プロトコルをさらに包含する。本発明の化合物の同時投与のための臨床レジメンは、他の構成要素の投与と同時、投与の前または投与の後の、同時投与を包含し得る。特定の併用療法としては、化学療法、放射線照射、手術、ホルモン療法または他のタイプの免疫療法が挙げられる。
実施形態は、本明細書中で定義されるようなＣＤ７０標的化ＣＡＲ構築物、本明細書中で定義されるような核酸配列、本明細書中で定義されるようなベクター、および／または本明細書中で定義されるような宿主細胞（例えば、免疫細胞）を含むキットに関する。本開示のキットは、本明細書の上に記載されたような薬学的組成物を単独で、または医学的処置もしくは医学的介入を必要とする個体に投与されるさらなる薬とともに、含むことも企図される。
Ａ．薬学的組成物
本明細書に含まれる形質導入されたＮＫ細胞及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物および製剤も本明細書に提供される。形質導入された細胞は、個体への移入に適した培地および／または個体への移入前を含む凍結保存などの保存に適した培地に含まれ得る本明細書中に包含されるプロセスによって作製されたＮＫ細胞および薬学的に許容され得るキャリアを含む薬学的組成物および製剤も本明細書中に提供される。
本明細書中に記載されるような薬学的組成物および製剤は、所望の程度の純度を有する活性成分（例えば、細胞）を１つ以上の自由選択の薬学的に許容され得るキャリア（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１２）と混合することによって、凍結乾燥された製剤または水溶液の形態で調製され得る。薬学的に許容され得るキャリアは、一般に、使用される投与量および濃度においてレシピエントにとって無毒性であり、それらのキャリアとしては、緩衝剤（例えば、リン酸、クエン酸および他の有機酸）；酸化防止剤（アスコルビン酸およびメチオニンを含む）；保存剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノールアルコール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン（例えば、メチルパラベンまたはプロピルパラベン）；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン）；単糖類、二糖類および他の炭水化物（グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖類（例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）；および／または非イオン性界面活性剤（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な本明細書中の薬学的に許容され得るキャリアとしては、間質薬物分散剤、例えば、中性で活性な可溶性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標），Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）がさらに挙げられる。ｒＨｕＰＨ２０を含むある特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰおよび使用方法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号および同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。１つの態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、１つ以上のさらなるグリコサミノグリカナーゼ、例えば、コンドロイチナーゼと併用される。
Ｂ．併用療法
ある特定の実施形態において、本実施形態の組成物および方法は、少なくとも１つのさらなる治療と併用される免疫細胞集団（ＮＫ細胞集団を含む）を用いる。そのさらなる治療は、放射線療法、手術（例えば、ランペクトミーおよび乳房切除術）、化学療法、遺伝子療法、ＤＮＡ治療、ウイルス治療、ＲＮＡ治療、免疫療法、骨髄移植、ナノ治療、モノクローナル抗体治療または前述の組み合わせであり得る。そのさらなる治療は、アジュバント療法またはネオアジュバント療法の形態であり得る。
いくつかの実施形態において、さらなる治療は、小分子酵素阻害剤または抗転移剤の投与である。いくつかの実施形態において、さらなる治療は、副作用制限剤（例えば、処置の副作用の発生率および／または重症度を下げることを目的とする作用物質、例えば、抗悪心剤など）の投与である。いくつかの実施形態において、さらなる治療は、放射線療法である。いくつかの実施形態において、さらなる治療は、手術である。いくつかの実施形態において、さらなる治療は、放射線療法と手術の併用である。いくつかの実施形態において、さらなる治療は、ガンマ線照射である。いくつかの実施形態において、さらなる治療は、ＰＢＫ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路を標的化する治療、ＨＳＰ９０阻害剤、チューブリン阻害剤、アポトーシス阻害剤および／または化学予防剤である。さらなる治療は、当該分野で公知の化学療法剤の１つ以上であり得る。
本開示の免疫療法は、免疫チェックポイント療法などのさらなる癌治療の前、最中、後または様々な組み合わせで投与され得る。それらの投与は、同時から数分、数日、数週間までの範囲の間隔で行われ得る。免疫細胞療法がさらなる治療薬とは別に患者に提供される実施形態では、それら２つの化合物が、なおも患者に対して有益な併用効果を発揮できるように、各送達時点の間にかなりの期間が経過しないことを保証するのが一般的である。そのような場合、抗体療法と抗癌療法とが、互いの約１２～２４または７２時間以内に、より詳細には、互いの約６～１２時間以内に患者に提供され得ることが企図される。いくつかの状況において、それぞれの投与間に数日（２、３、４、５、６または７）から数週間（１、２、３、４、５、６、７または８）が経過した場合、処置期間をかなり延長することが望ましいことがある。
様々な組み合わせが使用され得る。下記の例の場合、免疫細胞療法が、「Ａ」であり、抗癌療法が、「Ｂ」である。
Ａ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ａ／Ｂ Ｂ／Ｂ／Ａ Ａ／Ａ／Ｂ Ａ／Ｂ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ａ Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ
Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ
Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ
本実施形態の任意の化合物または細胞治療の患者への投与は、それらの作用物質に毒性がある場合はそれを考慮して、そのような化合物を投与するための一般的なプロトコルに従う。ゆえに、いくつかの実施形態では、併用療法に起因し得る毒性をモニタリングする工程が存在する。
１．化学療法
多種多様の化学療法剤が、本実施形態に従って使用され得る。用語「化学療法」とは、薬物を使用して癌を処置することを指す。「化学療法剤」は、癌の処置において投与される化合物または組成物を意味するために使用される。これらの作用物質または薬物は、細胞内でのそれらの活性様式によって、例えば、それらが細胞周期に影響するか否かおよびどのステージにおいて細胞周期に影響するかによって、分類される。あるいは、作用物質は、ＤＮＡを直接架橋する能力、ＤＮＡにインターカレートする能力、または核酸合成に影響することによって染色体異常および有糸分裂異常を誘導する能力に基づいて特徴付けられ得る。
化学療法剤の例としては、アルキル化剤（例えば、チオテパおよびシクロスホスファミド）；スルホン酸アルキル（例えば、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン）；アジリジン（例えば、ベンゾドパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）およびウレドパ（ｕｒｅｄｏｐａ））；エチレンイミンおよびメチルアメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチローロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含む）；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成アナログであるトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ－１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン（ｃａｒｚｅｌｅｓｉｎ）およびビゼレシン（ｂｉｚｅｌｅｓｉｎ）合成アナログを含む）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成アナログであるＫＷ－２１８９およびＣＢ１－ＴＭ１を含む）；エレウセロビン（ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｂｉｎ）；パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコジクチイン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンギスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）；ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルナファジン（ｃｈｌｏｒｎａｐｈａｚｉｎｅ）、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンビキン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロフォスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）およびウラシルマスタード）；ニトロソ尿素（例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチンおよびラニムヌスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ））；抗生物質（例えば、エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特に、カリケアマイシンガンマｌＩおよびカリケアマイシンオメガＩ１））；ジネマイシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）（ジネマイシンＡを含む）；ビスホスホネート（例えば、クロドロネート）；エスペラミシン；ならびにネオカルチノスタチンクロモフォアおよび関連色素タンパク質であるエンジイン抗生物質クロモフォア、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウトラルニシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモミシニス、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ－ドキソルビシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、２－ピロリノ－ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン（例えば、マイトマイシンＣ）、ミコフェノール酸、ノガラルニシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチンおよびゾルビシン；抗代謝産物（例えば、メトトレキサートおよび５－フルオロウラシル（５－ＦＵ））；葉酸アナログ（例えば、デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、プテロプテリンおよびトリメトレキサート）；プリンアナログ（例えば、フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）およびチオグアニン）；ピリミジンアナログ（例えば、アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビンおよびフロクスウリジン）；アンドロゲン（例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタンおよびテストラクトン）；抗副腎（ａｎｔｉ－ａｄｒｅｎａｌｓ）（例えば、ミトタンおよびトリロスタン）；葉酸補給剤（例えば、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ））；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デホファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジコン；エルフォルミチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ）（例えば、メイタンシンおよびアンサミトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎｓ））；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖複合体；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクォン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；２，２’，２”－トリクロロトリエチルアミン；トリコテシン（特に、Ｔ－２トキシン、ベラクリンＡ、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎ）Ａおよびアングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ））；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；タキソイド、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセルゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；白金配位錯体（例えば、シスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチン）；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセロダ（ｘｅｌｏｄａ）；イバンドロネート；イリノテカン（例えば、ＣＰＴ－１１）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド（例えば、レチノイン酸）；カペシタビン；カルボプラチン、プロカルバジン、プリコマイシン、ゲムシタビエン、ナベルビン、ファルネシル－タンパク質タンスフェラーゼ阻害剤、トランスプラチナ（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、ならびに上記のいずれかの薬学的に許容され得る塩、酸または誘導体が挙げられる。
２．放射線療法
ＤＮＡ損傷を引き起こす、広く使用されてきた他の因子としては、γ線、Ｘ線および／または腫瘍細胞への放射性同位体の定方向送達として一般的に知られているものが挙げられる。マイクロ波、陽子ビーム照射（米国特許５，７６０，３９５号及び４，８７０，２８７号）およびＵＶ照射などの他の形態のＤＮＡ損傷因子も企図される。これらの因子のすべてが、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製および修復ならびに染色体のアセンブリおよび維持に対して広範囲のダメージをもたらす可能性が最も高い。Ｘ線の線量の範囲は、長期間（３～４週間）にわたる５０～２００レントゲンという１日線量から、２０００～６０００レントゲンという単回線量までの範囲である。放射性同位体の線量の範囲は、大きく異なり、同位体の半減期、放射される放射線の強度およびタイプ、ならびに腫瘍性細胞による取り込みに依存する。
３．免疫療法
当業者は、さらなる免疫療法が上記実施形態の方法と併用してまたは併せて使用され得ることを理解する。癌の処置の状況において、免疫治療薬は、通常、癌細胞を標的化し、破壊するために免疫エフェクター細胞および免疫エフェクター分子を使用することに頼る。リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））が、そのような例である。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上の何らかのマーカーに特異的な抗体であり得る。その抗体は、単独で治療のエフェクターとして機能し得るか、または他の細胞をリクルートして、実際に細胞殺滅に影響し得る。その抗体はまた、薬物またはトキシン（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）に結合体化され得、標的化剤として役立ち得る。あるいは、そのエフェクターは、腫瘍細胞標的と直接または間接的に相互作用する表面分子を有するリンパ球であり得る。様々なエフェクター細胞には、細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞が含まれる。
抗体薬物複合体は、がん治療薬の開発における画期的なアプローチとして登場した。がんは、世界における主要な死因の一つである。
抗体－薬物結合体（ＡＤＣ）は、殺細胞薬に共有結合的に連結されたモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を含む。このアプローチは、抗原標的に対するＭＡｂの高い特異性を非常に強力な細胞傷害性薬物と組み合わせることにより、豊富なレベルの抗原を有する腫瘍細胞にペイロード（薬物）を送達する「武装した」ＭＡｂをもたらす。また、薬物の標的化送達は、正常組織への曝露を最小限に抑えることから、毒性を低減し、治療指数を改善する。例示的なＡＤＣ薬物としては、ＦＤＡにより２０１３年に承認されたＡＤＣＥＴＲＩＳ（登録商標）（ブレンツキシマブベドチン）およびＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標）（トラスツズマブエムタンシンまたはＴ－ＤＭ１）が挙げられる。現在、がん治療のための様々な段階の臨床試験において、３０以上のＡＤＣ薬剤候補が存在する（Ｌｅａｌ ｅｔ ａｌ．、２０１４）。抗体エンジニアリングとリンカーペイロードの最適化がますます成熟するにつれ、新しいＡＤＣの発見と開発は、このアプローチに適した新しいターゲットの特定と検証、およびターゲティングＭＡｂｓの生成にますます依存するようになってきている。ＡＤＣターゲットの２つの基準は、腫瘍細胞における発現量の増加／高レベル化と強固な内在化である。
免疫療法の１つの態様において、腫瘍細胞は、標的化の影響を受けやすい何らかのマーカー、すなわち、他の大部分の細胞上に存在しない何らかのマーカーを有さなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらのいずれかが、本実施形態の状況において標的化に好適であり得る。一般的な腫瘍マーカーとしては、ＣＤ２０、癌胎児抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ－７２、ＨＭＦＧ、Ｓｉａｌｙｌ Ｌｅｗｉｓ抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、ラミニンレセプター、ｅｒｂ Ｂおよびｐ１５５が挙げられる。免疫療法の代替の態様は、抗癌効果と免疫刺激効果とを組み合わせることである。ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１２、ＧＭ－ＣＳＦ、ガンマ－ＩＦＮなどのサイトカイン、ＭＩＰ－１、ＭＣＰ－１、ＩＬ－８などのケモカイン、およびＦＬＴ３リガンドなどの成長因子をはじめとした免疫刺激分子も存在する。
現在検証されている免疫療法の例としては、免疫アジュバント、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、ジニトロクロロベンゼンおよび芳香族化合物（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔｓ ５，８０１，００５ ａｎｄ ５，７３９，１６９； Ｈｕｉ ａｎｄ Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ， １９９８； Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９９８）；サイトカイン療法、例えば、インターフェロン、および、ＩＬ－１、ＧＭ－ＣＳＦならびにＴＮＦ（Ｂｕｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８； Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８； Ｈｅｌｌｓｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．， １９９８）；遺伝子療法、例えば、ＴＮＦ、ＩＬ－１、ＩＬ－２およびｐ５３（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８； Ａｕｓｔｉｎ－Ｗａｒｄ ａｎｄ Ｖｉｌｌａｓｅｃａ， １９９８； Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔｓ ５，８３０，８８０ ａｎｄ ５，８４６，９４５）；ならびにモノクローナル抗体、例えば、抗ＣＤ２０、抗ガングリオシドＧＭ２および抗ｐ１８５（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ， ２０１２； Ｈａｎｉｂｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８； Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ ５，８２４，３１１）が挙げられる。１つ以上の抗癌療法が、本明細書中に記載される抗体療法とともに使用され得ることが企図される。
いくつかの実施形態において、免疫療法は、免疫チェックポイント阻害剤であり得る。免疫チェックポイントは、シグナルを強める（例えば、共刺激分子）かまたはシグナルを弱めるかのいずれかである。免疫チェックポイントの遮断によって標的化され得る阻害性免疫チェックポイントとしては、アデノシンＡ２Ａレセプター（Ａ２ＡＲ）、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６としても知られる）、ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＤ１５２としても知られるＣＴＬＡ－４）、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、キラー細胞免疫グロブリン（ＫＩＲ）、リンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ３）、プログラム死１（ＰＤ－１）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ－３）、ならびにＴ細胞活性化のＶ－ドメインＩｇサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）が挙げられる。特に、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１軸および／またはＣＴＬＡ－４を標的化する。
免疫チェックポイント阻害剤は、小分子、組換え型のリガンドまたはレセプターなどの薬物であり得るか、または特に、ヒト抗体などの抗体である（例えば．， 国際特許公開公報 ＷＯ２０１５０１６７１８； Ｐａｒｄｏｌｌ， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ， １２（４）： ２５２－６４， ２０１２； いずれも本明細書に参考として援用される）。免疫チェックポイントタンパク質またはそのアナログの公知の阻害剤が、使用され得、特に、キメラ化型、ヒト化型またはヒト型の抗体が使用され得る。当業者が承知しているように、代替のおよび／または等価な名称が、本開示において述べられるある特定の抗体に対して使用され得る。そのような代替のおよび／または等価な名称は、本開示の文脈において相互交換可能である。例えば、ランブロリズマブが、代替のおよび等価な名称であるＭＫ－３４７５およびペンブロリズマブとしても知られていることは公知である。
いくつかの実施形態において、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＰＤ－１がそのリガンド結合パートナーに結合するのを阻害する分子である。具体的な態様において、ＰＤ－１リガンド結合パートナーは、ＰＤＬ１および／またはＰＤＬ２である。別の実施形態において、ＰＤＬ１結合アンタゴニストは、ＰＤＬ１がその結合パートナーに結合するのを阻害する分子である。具体的な態様において、ＰＤＬ１結合パートナーは、ＰＤ－１および／またはＢ７－１である。別の実施形態において、ＰＤＬ２結合アンタゴニストは、ＰＤＬ２がその結合パートナーに結合するのを阻害する分子である。具体的な態様において、ＰＤＬ２結合パートナーは、ＰＤ－１である。アンタゴニストは、抗体、その抗原結合フラグメント、イムノアドヘシン、融合タンパク質またはオリゴペプチドであり得る。例示的な抗体は、米国特許第ＵＳ８７３５５５３号、ＵＳ８３５４５０９号、及びＵＳ８００８４４９号に記載されており、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で提供される方法において使用するための他のＰＤ－１軸アンタゴニストは、米国特許出願番号ＵＳ２０１４０２９４８９８、ＵＳ２０１４０２２０２１、及びＵＳ２０１１０００８３６９に記載されているような当該分野で知られており、これらはすべて、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ－１抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体）である。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブ、ペンブロリズマブおよびＣＴ－０１１からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、イムノアドヘシン（例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のＦｃ領域）に融合されたＰＤＬ１またはＰＤＬ２の細胞外部分またはＰＤ－１結合部分を含むイムノアドヘシン）である。いくつかの実施形態において、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＡＭＰ－２２４である。ＭＤＸ－１１０６－０４、ＭＤＸ－１１０６、ＯＮＯ－４５３８、ＢＭＳ－９３６５５８およびＯＰＤＩＶＯ（登録商標）としても知られるニボルマブは、使用され得る抗ＰＤ－１抗体である（ＷＯ２００６／１２１１６８に開示される）。ＭＫ－３４７５、Ｍｅｒｃｋ３４７５、ランブロリズマブ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）およびＳＣＨ－９００４７５としても知られるペンブロリズマブは、例示的な抗ＰＤ－１抗体である（ＷＯ２００９／１１４３３５）。ｈＢＡＴまたはｈＢＡＴ－１としても知られるＣＴ－０１１も、抗ＰＤ－１抗体である（ＷＯ２００９／１０１６１１）。Ｂ７－ＤＣＩｇとしても知られるＡＭＰ－２２４は、ＰＤＬ２－Ｆｃ融合可溶性レセプターである（ＷＯ２０１０／０２７８２７およびＷＯ２０１１／０６６３４２）。
本明細書中に提供される方法において標的化され得る別の免疫チェックポイントは、ＣＤ１５２としても知られる細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）である。ヒトＣＴＬＡ－４の完全ｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｌ１５００６を有する。ＣＴＬＡ－４は、Ｔ細胞の表面上に見られ、抗原提示細胞の表面上のＣＤ８０またはＣＤ８６に結合したとき「切」スイッチとして作用する。ＣＴＬＡ４は、ヘルパーＴ細胞の表面上に発現される免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、Ｔ細胞に阻害シグナルを伝達する。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞共刺激タンパク質であるＣＤ２８に似ており、両分子は、抗原提示細胞上のＣＤ８０およびＣＤ８６（それぞれＢ７－１およびＢ７－２とも呼ばれる）に結合する。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞に阻害シグナルを伝達するのに対して、ＣＤ２８は、刺激シグナルを伝達する。細胞内ＣＴＬＡ４は、制御性Ｔ細胞にも見られ、それらの細胞の機能にとって重要であり得る。Ｔ細胞レセプターおよびＣＤ２８を介したＴ細胞の活性化により、Ｂ７分子に対する阻害性レセプターであるＣＴＬＡ－４が高発現される。
いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ－４抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体）、それらの抗原結合フラグメント、イムノアドヘシン、融合タンパク質またはオリゴペプチドである。
本方法における使用に適した抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体（またはそれ由来のＶＨおよび／もしくはＶＬドメイン）は、当該分野で周知の方法を用いて作製され得る。あるいは、当該分野で認められている抗ＣＴＬＡ－４抗体を使用することができる。例えば、米国特許第８，１１９，１２９号、ＷＯ０１／１４４２４、ＷＯ９８／４２７５２；ＷＯ００／３７５０４（トレメリムマブとしても知られ；以前はチシリムマブとしても知られた、ＣＰ６７５，２０６）、米国特許第６，２０７，１５６号；Ｈｕｒｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５（１７）：１００６７－１００７１；Ｃａｍａｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２２（１４５）：Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．２５０５（抗体ＣＰ－６７５２０６）；およびＭｏｋｙｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５８：５３０１－５３０４に開示されている抗ＣＴＬＡ－４抗体が、本明細書中に開示される方法において使用され得る。上述の各刊行物の教示が、参照により本明細書に援用される。これらの当該分野で認められている任意の抗体とＣＴＬＡ－４への結合について競合する抗体も使用され得る。例えば、ヒト化ＣＴＬＡ－４抗体が、国際特許出願番号ＷＯ２００１０１４４２４、ＷＯ２００００３７５０４および米国特許第８，０１７，１１４号に記載されており、すべてが参照により本明細書中に援用される。
例示的な抗ＣＴＬＡ－４抗体は、イピリムマブ（１０Ｄ１、ＭＤＸ－０１０、ＭＤＸ－１０１およびＹｅｒｖｏｙ（登録商標）としても知られる）またはその抗原結合フラグメントおよびバリアントである（例えば、ＷＯ０１／１４４２４を参照のこと）。他の実施形態において、その抗体は、イピリムマブの重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲまたは重鎖ＶＲおよび軽鎖ＶＲを含む。したがって、１つの実施形態において、その抗体は、イピリムマブのＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインならびにイピリムマブのＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む。別の実施形態において、その抗体は、ＣＴＬＡ－４上の、上述の抗体と同じエピトープへの結合について競合し、かつ／またはＣＴＬＡ－４上の、上述の抗体と同じエピトープに結合する。別の実施形態において、その抗体は、上述の抗体に対して少なくとも約９０％の可変領域アミノ酸配列同一性（例えば、イピリムマブと少なくとも約９０％、９５％または９９％の可変領域同一性）を有する。
ＣＴＬＡ－４を調節するための他の分子としては、ＣＴＬＡ－４リガンドおよびＣＴＬＡ－４レセプター（例えば、米国特許第５８４４９０５号、同第５８８５７９６号ならびに国際特許出願番号ＷＯ１９９５００１９９４およびＷＯ１９９８０４２７５２（すべてが参照により本明細書中に援用される）に記載されているもの）、ならびにイムノアドヘシン（例えば、米国特許第８３２９８６７号（参照により本明細書中に援用される）に記載されているもの）が挙げられる。
４．手術
癌を有する人のおよそ６０％が、予防的手術、診断的手術または進行度診断手術、根治的手術および緩和手術をはじめとした何らかのタイプの手術を受ける。根治的手術には、癌性組織の全部または一部を物理的に除去、切除および／または破壊する摘出術が含まれ、他の治療（例えば、本実施形態の処置、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子治療、免疫療法および／または代替療法）と併せて使用され得る。腫瘍摘出術とは、腫瘍の少なくとも一部を物理的に除去することを指す。手術による処置には、腫瘍摘出術に加えて、レーザー手術、凍結手術、電気手術および顕微鏡下手術（モース術）が含まれる。
癌性細胞、組織または腫瘍の一部または全部を切除する際、身体に空洞が形成され得る。処置は、さらなる抗癌療法によるその領域の灌流、直接注射または局所適用によって達成され得る。そのような処置は、例えば、１、２、３、４、５、６もしくは７日ごとに、または１、２、３、４および５週間ごとに、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２ヶ月ごとに、反復され得る。これらの処置は、様々な投与量の処置でもあり得る。
５．他の作用物質
処置の治療効果を改善するために、本実施形態のある特定の態様と組み合わせて他の作用物質が使用され得ることが企図される。これらのさらなる作用物質としては、細胞表面レセプターおよびギャップ結合のアップレギュレーションに影響する作用物質、細胞分裂抑制剤および分化剤、細胞接着の阻害剤、アポトーシス誘導物質に対する過剰増殖細胞の感度を高める作用物質、または他の生物学的作用物質が挙げられる。ギャップ結合数を増加させることによる細胞間のシグナル伝達の増加は、隣接する過剰増殖細胞集団に対する抗過剰増殖効果を高め得る。他の実施形態では、処置の抗過剰増殖の有効性を改善するために、本実施形態のある特定の態様と組み合わせて細胞分裂抑制剤または分化剤が使用され得る。本実施形態の有効性を改善するために、細胞接着の阻害剤が企図される。細胞接着阻害剤の例は、接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤およびロバスタチンである。アポトーシスに対する過剰増殖細胞の感度を高める他の作用物質（例えば、抗体ｃ２２５）が、処置の有効性を改善するために本実施形態のある特定の態様と組み合わせて使用され得ることがさらに企図される。
ＶＩＩＩ．本開示のキット
本明細書中に記載される任意の組成物が、キットに含められ得る。非限定的な例では、細胞、細胞を作製するための試薬、ベクター、ならびにベクターおよび／またはその構成要素を作製するための試薬が、キットに含められ得る。ある特定の実施形態において、ＮＫ細胞がキットに含められることがあり、それらは、ＣＤ７０標的化レセプター、自由選択のサイトカインまたは自由選択の自殺遺伝子を発現していてもよいし、まだ発現していなくてもよい。そのようなキットは、細胞を操作するための１つ以上の試薬を有してもよいし、有しなくてもよい。そのような試薬としては、例えば、小分子、タンパク質、核酸、抗体、緩衝液、プライマー、ヌクレオチド、塩および／またはそれらの組み合わせが挙げられる。１つ以上のＣＤ７０標的化ＣＡＲ、自殺遺伝子産物および／またはサイトカインをコードするヌクレオチドが、キットに含められ得る。サイトカインまたは抗体（モノクローナル抗体を含む）などのタンパク質が、キットに含められ得る。操作されたＣＡＲレセプターの構成要素をコードするヌクレオチドが、それを作製するための試薬を含めて、キットに含められ得る。
特定の態様において、上記キットは、本開示のＮＫ細胞療法、およびまた別の癌治療を含む。いくつかの場合において、上記キットは、細胞療法の実施形態に加えて、第２の癌治療（例えば、化学療法、ホルモン療法および／または免疫療法）も含む。上記キットは、ある個体に対する特定の癌に合わされ得、その個体に対するそれぞれの第２の癌治療を含む。
上記キットは、本開示の適切に等分された組成物を含み得る。キットの構成要素は、水性媒質中にまたは凍結乾燥された形態で、包装され得る。キットの容器手段としては、一般に、構成要素が入れられ得る、好ましくは、適切に等分され得る、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジまたは他の容器手段が挙げられる。２つ以上の構成要素がキットに存在する場合、そのキットは、通常、追加の構成要素が別々に入れられ得る、第２、第３または他のさらなる容器も含み得る。しかしながら、構成要素の様々な組み合わせが、１つのバイアルに含められてもよい。本発明のキットはまた、典型的には、組成物を含めるための手段および他の任意の試薬容器を、商業的販売のために厳重に閉じ込められた状態で含む。そのような容器には、所望のバイアルを保持する、射出成形またはブロー成形されたプラスチック容器が含まれ得る。
ＩＸ．実施例
以下の実施例は、本開示のある特定の非限定的な態様を実証するために含められる。以下の実施例に開示される手法は、本開示の主題の実施において十分に機能すると本発明者らが発見した手法であることが当業者によって認識されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に鑑みて、開示される具体的な実施形態において多くの変更を行うことができ、それらの変更は、本開示の主題の趣旨および範囲から逸脱することなく、なおも同様または類似の結果をもたらすと認識するだろう。
実施例１
ＡＭＬを標的化するためのＣＡＲ．ＣＤ７０ＮＫ細胞
特定の実施形態では、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を標的化するために、ＣＤ７０特異的ＣＡＲ ＮＫ細胞を使用する。図５Ａは、形質導入されなかった細胞と比べたときの、ＣＡＲ－ＣＤ７０ＮＫ細胞の形質導入効率を示している。図５Ｂは、種々のＡＭＬ細胞株におけるＣＤ７０の発現を示している。図６は、Ｍｏｌｍ１３およびＭｏｌｍ１４ ＡＭＬ細胞株に対する、ＣＤ７０ＣＡＲ／ＩＬ－１５発現ＮＫ細胞対形質導入されなかった細胞におけるＣＤ７０ＣＡＲの活性についての機能アッセイを示している。アネキシンＶアッセイは、形質導入されなかった細胞と比べて、種々のＡＭＬ細胞株の殺滅が多かったことを示した（図７）。クロム放出アッセイも、ＩＬ－１５も発現するＣＤ７０ＣＡＲ発現ＮＫ細胞を用いたとき、ＡＭＬ細胞株がより多く殺滅されることを示した。
実施例２
肺癌を標的化するＣＡＲ．ＣＤ７０ＮＫ細胞
いくつかの実施形態において、固形腫瘍の一例として、ＣＤ７０を発現している肺癌を標的化し、殺滅する試薬を使用する。図９は、種々の肺癌細胞株におけるＣＤ７０の発現を示している。ＣＤ７０ＣＡＲ発現ＮＫ細胞を使用したことにより、形質導入されなかった細胞およびＩＬ－１５を形質導入されたＮＫ細胞と比べて、種々の肺癌細胞株に対するより高い毒性がもたらされた（図１０Ａおよび図１０Ｂ）。アネキシン染色は、形質導入されなかった細胞およびＩＬ－１５を形質導入されたＮＫ細胞と比較されるＣＤ７０ＣＡＲ発現ＮＫ細胞を比べたとき、種々の肺癌細胞株においてより高い毒性を示した（図１１）。図１２において、肺癌細胞株スフェロイドにおけるカスパーゼの発現によって評価したとき、ＣＤ７０ＣＡＲ発現ＮＫ細胞は、形質導入されなかったＮＫ細胞またはＩＬ－１５のみ（ＣＡＲなし）を形質導入されたＮＫ細胞よりも高い毒性を示した。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）アッセイを用いたとき、形質導入されなかったＮＫ細胞（ＮＴ）およびＩＬ－１５を形質導入されたＮＫ細胞と比べて、ＣＤ７０ＣＡＲ／ＩＬ－１５発現ＮＫ細胞が、ＥＲ１肺癌細胞株に対してより高い細胞傷害性を発揮する（図１３）。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）アッセイを用いたとき、形質導入されなかったＮＫ細胞（ＮＴ）およびＩＬ－１５を形質導入されたＮＫ細胞と比べて、ＣＤ７０ＣＡＲ／ＩＬ－１５発現ＮＫ細胞が、ＥＲ３肺癌細胞株に対してより高い細胞傷害性を発揮する（図１４）。
肺癌以外のＣＤ７０陽性癌も、本開示の方法および組成物で処置され得る（例えば、図１５を参照のこと）。
実施例３
種々の癌に対する、ＣＤ７０ＣＡＲを形質導入された臍帯血由来ナチュラルキラー（ＣＢＮＫ）細胞
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）
図１６Ａ～図１６Ｂは、ＣＢＮＫ細胞におけるＣＤ７０ＣＡＲ形質導入効率および様々な急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）標的におけるＣＤ７０の発現を示している。図１６Ａは、ＣＤ７０ＣＡＲが、形質導入されなかった細胞と比べて、９８％の形質導入効率でＣＢＮＫ細胞への形質導入が成功したことを示している。図１６Ｂは、ＣＤ７０が様々なＡＭＬ標的の表面に発現されたことを示している。
図１７は、Ｍｏｌｍ１３およびＭｏｌｍ１４細胞と共培養したときの、ＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲ細胞における細胞内サイトカインの発現および脱顆粒マーカーの発現を示している。形質導入されなかった（ＮＴ）細胞と比べて、ＣＤ７０ＣＡＲを形質導入されたＣＢＮＫ細胞は、Ｍｏｌｍ１３（左）およびＭｏｌｍ１４（右）と共培養したとき、サイトカイン（インターフェロンガンマおよび腫瘍壊死因子アルファ）の分泌および脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａの発現の増加を示したことから、ＣＤ７０を発現しているＡＭＬ細胞に対する高い細胞傷害活性が示唆される。
図１８は、ＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲ細胞と共培養した後のＡＭＬ標的細胞のアポトーシスを評価するアネキシンＶ染色を示している。形質導入されなかった（ＮＴ）細胞と比べて、ＣＤ７０ＣＡＲを形質導入されたＣＢＮＫ細胞は、アネキシンＶ－ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤＴＭ Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ染色アッセイによって示されたように、ＴＨＰ－１、Ｍｏｌｍ１３およびＭｏｌｍ１４細胞のアポトーシスの増加を示したことから、ＡＭＬ細胞に対する、ＣＤ７０ＣＡＲを形質導入されたＣＢＮＫ細胞の高い細胞傷害活性が示唆される。
図１９は、ＡＭＬ標的細胞に対するＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲの細胞傷害活性を評価するクロム放出アッセイを示している。形質導入されなかった（ＮＴ）細胞と比べて、ＣＤ７０ＣＡＲを形質導入されたＣＢＮＫ細胞は、クロム放出アッセイによって示されたように、ＴＨＰ－１（左）およびＭｏｌｍ１３（右）細胞の高い細胞傷害性を示したことから、ＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲ細胞が、ＡＭＬ細胞に対して高い殺滅活性を有することが示唆される。
図２０Ａ～図２０Ｂは、ＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲ細胞と共培養したときの、ＴＨＰ－１およびＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞に対するＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）細胞毒性アッセイを示している。ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）アッセイによって示されたように、形質導入されなかった（ＮＴ）細胞と比べて、ＣＤ７０ＣＡＲを形質導入されたＣＢＮＫ細胞は、ＴＨＰ－１（図２０Ａ）およびＯＣＩ－ＡＭＬ３（図２０Ｂ）細胞の高い細胞傷害性を示したことから、ＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲ細胞が、ＡＭＬ細胞に対して高い殺滅活性を有することが示唆される。このアッセイでは、ＩＬ１５構築物を形質導入されたＣＢＮＫ細胞も、コントロールとして使用したが、これは、ＮＴよりも高い細胞傷害活性を示すが、ＣＤ７０ＣＡＲほど有効でなかった。
肺癌
図２１は、様々な肺癌細胞株におけるＣＤ７０の発現を示している。フローサイトメトリーを用いて、様々な肺癌細胞株におけるＣＤ７０の表面発現を検出した。
図２２は、様々な肺癌細胞株と共培養したときのＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲ細胞における細胞内サイトカインおよび脱顆粒マーカーの発現を示している。形質導入されなかった（ＮＴ）細胞と比べて、ＣＤ７０ＣＡＲを形質導入されたＣＢＮＫ細胞は、様々な肺癌細胞株と共培養したとき、サイトカイン（インターフェロンガンマおよび腫瘍壊死因子アルファ）の分泌および脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａの発現の増加を示したことから、肺癌に対するＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲの高い細胞傷害活性が示唆される。
図２３は、ＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲ細胞と共培養した後の肺癌細胞のアポトーシスを評価するアネキシンＶ染色を示している。形質導入されなかった（ＮＴ）細胞と比べて、ＣＤ７０ＣＡＲを形質導入されたＣＢＮＫ細胞は、アネキシンＶ－ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤＴＭ Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ染色アッセイによって示されるように、様々な肺癌細胞の高いアポトーシスを示したことから、肺癌細胞に対するＣＤ７０ＣＡＲを形質導入されたＣＢＮＫ細胞の高い細胞傷害活性が示唆される。
図２４は、ＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲ細胞と共培養したときのＥＲ１細胞におけるＩｎｃｕＣｙｔ（登録商標）ｅ細胞毒性アッセイを示している。形質導入されなかった（ＮＴ）細胞と比べて、ＣＤ７０ＣＡＲを形質導入されたＣＢＮＫ細胞は、緑色（カスパーゼ３／７）シグナルの測定値によって評価されるＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）アッセイによって示されたように、ＥＲ１細胞の高い細胞傷害性を示したことから、ＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲ細胞が肺癌細胞に対して高い殺滅活性を有することが示唆される。このアッセイでは、ＣＤ１９ＣＡＲ構築物を形質導入されたＣＢＮＫ細胞も、コントロールとして使用したが、これは、ＮＴよりも高い細胞傷害活性を示すが、ＣＤ７０ＣＡＲほど有効でなかった。５４時間にわたるＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）細胞毒性アッセイの定量が、左のパネルに示されており、代表的な画像が、右のパネルに示されている。
図２５は、ＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲ細胞と共培養したときのＥＲ３細胞におけるＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）細胞毒性アッセイを示している。形質導入されなかった（ＮＴ）細胞と比べて、ＣＤ７０ＣＡＲを形質導入されたＣＢＮＫ細胞は、緑色（カスパーゼ３／７）シグナルの測定値によって評価されるＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）アッセイによって示されたように、ＥＲ３細胞の高い細胞傷害性を示したことから、ＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲ細胞が、肺癌細胞に対して高い殺滅活性を有することが示唆される。ＣＤ１９ＣＡＲ構築物を形質導入されたＣＢＮＫ細胞も、このアッセイにおいてコントロールとして使用したが、これは、ＮＴよりも高い細胞傷害活性を示すが、ＣＤ７０ＣＡＲほど有効でなかった。
乳癌
図２６は、様々なＣＤ７０発現を有する乳癌細胞株に対するＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲの細胞傷害活性を評価するクロム放出アッセイを示している。（左）ＣＤ７０の表面発現を、フローサイトメトリーを用いて様々な乳癌細胞株において検出した。ＭＢＡ－ＭＢ－２３１は、低いＣＤ７０発現を有する／ＣＤ７０発現を有しないのに対して、ＢＴ５４９およびＢＣＸ０１０は、高いＣＤ７０発現を有する。（右）形質導入されなかった（ＮＴ）細胞と比べて、ＣＤ７０ＣＡＲを形質導入されたＣＢＮＫ細胞は、クロム放出アッセイによって示されたように、ＢＴ５４９およびＢＣＸ０１０細胞の高い細胞傷害性を示したことから、ＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲ細胞が、高いＣＤ７０発現を有する乳癌細胞に対して高い殺滅活性を有することが示唆される。ＮＫ細胞に感受性のＫ５６２細胞をポジティブコントロールとして使用する。ｎ．ｓ．有意でない；＊＊＊，Ｐ＜０．００１
図２７Ａ～図２７Ｅは、様々な乳癌細胞と共培養したときのＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲ細胞における細胞内サイトカインおよび脱顆粒マーカーの発現を示している。形質導入されなかった（ＮＴ）細胞と比べて、ＣＤ７０ＣＡＲを形質導入されたＣＢＮＫ細胞は、高いＣＤ７０表面発現を有する乳癌細胞株と共培養したとき、高いサイトカイン（インターフェロンガンマおよび腫瘍壊死因子アルファ）の分泌および脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａの発現を示したことから、乳癌に対するＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲの高い細胞傷害活性が示唆される。ｎ．ｓ．有意でない；＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．０１；＊＊＊，ｐ＜０．００１。
多発性骨髄腫
図２８Ａおよび図２８Ｂは、多発性骨髄腫に対するＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲの細胞傷害活性を評価するクロム放出アッセイを提供している。（図２８Ａ）ＣＤ７０の表面発現は、フローサイトメトリーを使用することによって検出したとき、多発性骨髄腫細胞株であるＭＭ１ｓにおいて高かった。（図２８Ｂ）形質導入されなかった（ＮＴ）細胞と比べて、ＣＤ７０ＣＡＲを形質導入されたＣＢＮＫ細胞は、クロム放出アッセイによって示されたように、ＭＭ１ｓ細胞の高い細胞傷害性を示したことから、ＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲ細胞が、多発性骨髄腫細胞に対して高い殺滅活性を有することが示唆される。
腎細胞癌（ＲＣＣ）
図２９Ａ～図２９Ｂは、ＲＣＣに対するＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲの細胞傷害活性を評価するクロム放出アッセイを示している。（図２９Ａ）ＣＤ７０の表面発現を、フローサイトメトリーを用いて様々なＲＣＣおよび他の癌細胞株において検出した。Ａ４９８、ＳＮ１２Ｃおよび７８６－Ｏは、高いＣＤ７０発現を有する数少ないＲＣＣ細胞株である。（図２９Ｂ）形質導入されなかった（ＮＴ）細胞と比べて、ＣＤ７０ＣＡＲを形質導入されたＣＢＮＫ細胞は、クロム放出アッセイによって示されたように、Ａ４９８およびＳＮ１２Ｃ細胞の高い細胞傷害性を示したことから、ＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲ細胞が、高いＣＤ７０発現を有するＲＣＣ細胞に対して高い殺滅活性を有することが示唆される。
図３０は、ＲＣＣ細胞と共培養したときのＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲ細胞における細胞内サイトカインの産生および脱顆粒マーカーの発現を示している。形質導入されなかった（ＮＴ）細胞と比べて、ＣＤ７０ＣＡＲを形質導入されたＣＢＮＫ細胞は、高いＣＤ７０表面発現を有するＲＣＣ細胞株７８６－Ｏと共培養したとき、サイトカイン（インターフェロンガンマおよび腫瘍壊死因子アルファ）の分泌および脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａの発現の増加を示したことから、乳癌に対するＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲの高い細胞傷害活性が示唆される。＊＊，ｐ＜０．０１
図３１は、ＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲ細胞と共培養したときの７８６－Ｏ ＲＣＣ細胞に対するＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）細胞毒性アッセイを示している。形質導入されなかった（ＮＴ）細胞と比べて、ＣＤ７０ＣＡＲを形質導入されたＣＢＮＫ細胞は、緑色（カスパーゼ３／７）シグナルの測定値によって評価されるＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）アッセイによって示されたように、７８６－Ｏ細胞の高い細胞傷害性を示したことから、ＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲ細胞がＲＣＣに対して高い殺滅活性を有することが示唆される。＊＊，ｐ＜０．０１；＊＊＊，ｐ＜０．００１
膵癌
図３２Ａ～図３２Ｂは、膵癌細胞と共培養したときのＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲ細胞における細胞内サイトカインの発現を示している。（図３２Ａ）ＣＤ７０の表面発現を、フローサイトメトリーを用いて様々な膵癌細胞株において検出した。ＭＩＡ－Ｐａｃａ２は、低いＣＤ７０発現を有する／ＣＤ７０発現を有しないのに対して、ＰＡＮＣ－１は、高いＣＤ７０発現を有する。（図３２Ｂ）形質導入されなかった（ＮＴ）細胞と比べて、ＣＤ７０ＣＡＲを形質導入されたＣＢＮＫ細胞は、ＰＡＮＣ－１細胞株（高ＣＤ７０発現）と共培養したとき、サイトカイン（インターフェロンガンマおよび腫瘍壊死因子アルファ）の分泌の増加を示したが、ＭＩＡ－Ｐａｃａ２細胞株（低ＣＤ７０発現）と共培養したときはその増加を示さなかったことから、高いＣＤ７０発現を有する膵臓細胞に対するＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲの高い細胞傷害活性が示唆される。
神経膠芽腫（ＧＢＭ）
図３３は、ＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲ細胞と共培養したときのＧＳＣ２０ ＧＢＭ細胞に対するＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）細胞毒性アッセイを示している。ＣＤ７０の表面発現を、フローサイトメトリーを用いて様々なＧＢＭ細胞株において検出したところ、ＧＳＣ２０細胞株が、最も高いＣＤ７０表面発現を示した（パネルｉ）。形質導入されなかった（ＮＴ）細胞と比べて、ＣＤ７０ＣＡＲを形質導入されたＣＢＮＫ細胞は、緑色（カスパーゼ３／７）シグナル強度の測定値によって評価されるＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）アッセイによって示されたように、ＧＳＣ２０細胞の高い細胞傷害性を示したことから、ＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲ細胞がＧＢＭ細胞に対して高い殺滅活性を有することが示唆される。５７時間にわたるＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）細胞毒性アッセイの定量が、パネルｉｉに示されており、２３時間までの代表的な画像がパネルｉｉｉに示されている。
Ｒａｊｉ ＷＴまたはＣＤ７０ ＫＯ細胞を移植され、ＣＢＮＫ ＣＤ７０ＣＡＲ細胞で処置された、ＮＳＧマウス（免疫不全）の生存曲線が図３４に提供されている。Ｋａｐｌａｎ Ｍｅｉｅｒプロットは、ＣＤ７０ＣＡＲ構築物を形質導入されたＣＢＮＫ細胞が、形質導入されなかったＣＢＮＫ細胞と比べて、Ｒａｊｉ野生型（ＷＴ）腫瘍を移植されたマウスの生存の改善を示すことを実証している。ＣＤ７０ノックアウト（ＫＯ）Ｒａｊｉ細胞を移植されたマウスでは、生存の改善は見られなかったことから、マウスの生存の改善は、腫瘍細胞に存在するＣＤ７０抗原に特異的であることが示唆される。
本開示およびその利点を詳細に記載してきたが、添付の請求項によって定義される構想の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な変更、置換および改変が本明細書中で行われ得ることが理解されるべきである。さらに、本願の範囲は、本明細書に記載されたプロセス、機械、製造品、合成物、手段、方法および工程の特定の実施形態に限定されると意図されていない。当業者は、本明細書中に記載される対応する実施形態と実質的に同じ機能を果たすまたは実質的に同じ結果を達成する、現在すでに存在しているまたは後に開発される、プロセス、機械、製造品、合成物、手段、方法または工程が本開示に従って利用され得ることを本開示からすぐに認識するだろう。したがって、添付の請求項は、そのようなプロセス、機械、製造品、合成物、手段、方法または工程をそれらの範囲内に含めるように意図されている。

Claims (51)

  1. ＣＤ７０に特異的な操作されたレセプターをコードし、以下：
    （ａ）自殺遺伝子；および
    （ｂ）サイトカイン
    のうちの一方または両方をコードする配列を含む発現構築物。
  2. 前記ＣＤ７０に特異的な操作されたレセプターが、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）またはＴ細胞レセプターである、請求項１に記載の構築物。
  3. 前記ＣＤ７０特異的ＣＡＲが、重鎖および軽鎖を有するｓｃＦｖを含み、前記ＣＡＲをコードする前記配列における前記重鎖が、５’から３’の方向で前記軽鎖の上流に存在する、請求項２に記載の発現構築物。
  4. 前記ＣＤ７０特異的ＣＡＲが、重鎖および軽鎖を有するｓｃＦｖを含み、前記ＣＡＲをコードする前記配列における前記重鎖が、５’から３’の方向で前記軽鎖の下流に存在する、請求項２に記載の発現構築物。
  5. 前記ＣＤ７０特異的ＣＡＲが、コドンが最適化されたｓｃＦｖを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の発現構築物。
  6. 前記ＣＤ７０特異的ＣＡＲが、ヒト化ｓｃＦｖを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の発現構築物。
  7. 前記ＣＤ７０特異的ＣＡＲが、シグナル伝達ペプチドを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の発現構築物。
  8. 前記シグナル伝達ペプチドが、ＣＤ８アルファ、Ｉｇ重鎖または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子レセプター、または１つ以上の他の表面レセプターに由来するシグナルペプチド由来である、請求項７に記載の発現構築物。
  9. 前記ＣＤ７０特異的ＣＡＲが、１つ以上の共刺激ドメインを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の発現構築物。
  10. 前記共刺激ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ－４０（ＣＤ１３４）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ４０Ｌ、２Ｂ４、ＤＮＡＭ、ＣＳ１、ＣＤ４８、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項９に記載の発現構築物。
  11. 前記ＣＤ７０特異的ＣＡＲが、ＣＤ３ゼータを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の発現構築物。
  12. 前記ＣＤ７０特異的ＣＡＲが、前記ｓｃＦｖと膜貫通ドメインとの間にヒンジを含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の発現構築物。
  13. 前記ヒンジが、ＣＤ８－アルファヒンジであり、前記ヒンジが、Ｇｌｙ３を含む人工スペーサーを含むか、または前記ヒンジが、ＩｇＧのＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを含む、請求項１２に記載の発現構築物。
  14. 前記サイトカインが、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－７またはそれらの組み合わせである、請求項１～１３のいずれか１項に記載の発現構築物。
  15. 前記自殺遺伝子が、変異ＴＮＦ－アルファ、誘導性カスパーゼ９、ＨＳＶ－チミジンキナーゼ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５２またはＥＧＦＲｖ３である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の発現構築物。
  16. 前記変異ＴＮＦ－アルファが、操作された非分泌性変異ＴＮＦ－アルファである、請求項１４に記載の発現構築物。
  17. 前記発現構築物が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２または配列番号１３のうちのいずれか１つを含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載の発現構築物。
  18. 請求項１～１７のいずれか１項に記載の発現構築物を含む、免疫細胞。
  19. 前記免疫細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、インバリアントＮＫＴ（ｉＮＫＴ）細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＭＳＣまたは樹状細胞である、請求項１８に記載の免疫細胞。
  20. 前記免疫細胞が、ＮＫ細胞である、請求項１８または１９に記載の免疫細胞。
  21. 前記ＮＫ細胞が、臍帯血、末梢血、人工多能性幹細胞、骨髄または細胞株に由来する、請求項１９または２０に記載の免疫細胞。
  22. 前記ＮＫ細胞株が、ＮＫ－９２細胞株、あるいは腫瘍または健康なＮＫ細胞もしくは前駆細胞に由来する別のＮＫ細胞株である、請求項２１に記載の免疫細胞。
  23. 前記ＮＫ細胞が、臍帯血単核細胞である、請求項１９～２２のいずれか１項に記載の免疫細胞。
  24. 前記ＮＫ細胞が、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞である、請求項１９～２３のいずれか１項に記載の免疫細胞。
  25. 前記ＮＫ細胞が、１つ以上の外因的に提供されたサイトカインを発現する、請求項１９～２４のいずれか１項に記載の免疫細胞。
  26. 前記サイトカインが、ＩＬ－１５、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－７またはそれらの組み合わせである、請求項２５に記載の免疫細胞。
  27. 前記免疫細胞における１つ以上の内在性遺伝子の発現が改変されている、請求項１８～２６のいずれか１項に記載の免疫細胞。
  28. 前記発現が、部分的にまたは完全に低下されている、請求項２７に記載の免疫細胞。
  29. 前記１つ以上の遺伝子の発現が、ＣＲＩＳＰＲを用いて改変されている、請求項２７または２８に記載の免疫細胞。
  30. 前記遺伝子が、ＮＫＧ２Ａ、ＳＩＧＬＥＣ－７、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＩＳＨ、ＦＯＸＯ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＡＤＯＲＡ２、ＮＲ３Ｃ１、ＰＤ１、ＰＤＬ－１、ＰＤＬ－２、ＣＤ４７、ＳＩＲＰＡ、ＳＨＩＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＲＰＳ６、４ＥＢＰ１、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＩＬ２１Ｒ、ＩＣＡＭ１、ＣＤ９５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ１０Ｒ、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＴＬＡ－４、ＴＤＡＧ８、ＣＤ３８およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２７～２９のいずれか１項に記載の免疫細胞。
  31. 前記細胞が、好適な培地中に存在する、請求項１８～３０のいずれか１項に記載の免疫細胞の集団。
  32. 前記免疫細胞が、ＮＫ細胞である、請求項３１に記載の集団。
  33. 個体におけるＣＤ７０陽性細胞を殺滅する方法であって、請求項１～１７のいずれか１項に記載の発現構築物を有する有効量の細胞を前記個体に投与する工程を含む、方法。
  34. 前記細胞が、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、誘導性ＮＫＴ（ｉＮＫＴ）細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ガンマデルタＴ細胞または樹状細胞である、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記ＮＫ細胞が、臍帯血、末梢血、人工多能性幹細胞、骨髄または細胞株に由来する、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記ＮＫ細胞が、臍帯血単核細胞に由来する、請求項３４～３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 前記ＣＤ７０陽性細胞が、癌細胞ではない、請求項３３～３６のいずれか１項に記載の方法。
  38. 前記ＣＤ７０陽性細胞が、制御性Ｔ細胞である、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記個体が、急性骨髄性白血病、リンパ腫、肺癌、腎癌、膀胱癌、メラノーマ、神経膠芽腫、乳癌、頭頸部癌、中皮腫、多発性骨髄腫、膵癌またはそれらの組み合わせを有する、請求項３３～３６のいずれか１項に記載の方法。
  40. 前記細胞が、前記個体に対して同種異系である、請求項３３～３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. 前記細胞が、前記個体に対して自己である、請求項３３～３９のいずれか１項に記載の方法。
  42. 前記個体が、ヒトである、請求項３３～４１のいずれか１項に記載の方法。
  43. 前記細胞が、１回または１回より多く前記個体に投与される、請求項３２～４２のいずれか１項に記載の方法。
  44. 前記個体への前記細胞の投与間の時間が、１～２４時間、１～７日間、１～４週間、１～１２ヶ月間または１年間もしくはそれを超える、請求項４３に記載の方法。
  45. 有効量のさらなる治療を前記個体に提供する工程をさらに含む、請求項３３～４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. 前記さらなる治療が、手術、放射線照射、遺伝子療法、免疫療法またはホルモン療法を含む、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記さらなる治療が、１つ以上の抗体を含む、請求項４５または４６に記載の方法。
  48. 前記細胞が、注射によって、静脈内に、動脈内に、腹腔内に、気管内に、腫瘍内に、筋肉内に、内視鏡的に、病巣内に、頭蓋内に、経皮的に、皮下に、領域性に、灌流によって、腫瘍微小環境に、またはそれらの組み合わせによって前記個体に投与される、請求項３３～４７のいずれか１項に記載の方法。
  49. 前記個体内のＣＤ７０陽性細胞を特定する工程をさらに含む、請求項３３～４８のいずれか１項に記載の方法。
  50. 前記発現構築物を有する細胞を作製する工程をさらに含む、請求項３３～４９のいずれか１項に記載の方法。
  51. 合成物としての、配列番号１、配列番号２、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３の配列。
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