CN113621077A - 一种tim-3/cd28融合蛋白及所述融合蛋白修饰的car-t细胞 - Google Patents

Abstract

本发明具体涉及一种TIM‑3/CD28融合蛋白及所述融合蛋白修饰的CAR‑T细胞。现有CAR‑T细胞存在治疗效果不理想、持久性较差等缺陷，本发明为了提供一种治疗效果更优的CAR‑T细胞，设计了一种分子转换器T3/28，将TIM‑3抑制信号转换成CD28激活信号的，进一步提供了一种19BBz‑T3/28CAR‑T细胞。经验证，19BBz‑T3/28CAR‑T细胞进行免疫治疗，CAR‑T细胞的阳性率在40％‑70％之间，并且在体、内外具有理想的肿瘤杀伤能力。19BBz‑T3/28CAR‑T细胞可有效延长小鼠的生存期，还能够持续性清除不断回输的肿瘤细胞，具备持续抑制肿瘤的能力。

Description

一种TIM-3/CD28融合蛋白及所述融合蛋白修饰的CAR-T细胞

技术领域

本发明属于抗肿瘤免疫治疗技术领域，具体涉及一种TIM-3/CD28融合蛋白，及包含所述融合蛋白作为嵌合抗原抗体修饰的CAR-T细胞。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

CAR，即嵌合抗原受体技术，是依据肿瘤表面肿瘤相关抗原或者是肿瘤特异性抗原的表达情况，利用该抗原的相应抗体偶联一些共刺激分子对T细胞进行特殊的修饰，通过CAR修饰的T细胞对肿瘤细胞进行有效杀伤的技术。CAR-T的scFv识别的TAA不依赖于MHC，并且识别的分子可多样化。CAR的经典结构包括位于细胞内部的几个信号域，以及跨膜部分和细胞外起主要作用的抗原识别蛋白部分(通常为单链抗体scFv片段)。其中，scFv可以使T细胞选择性识别肿瘤细胞，与scFv相连的跨膜区一般来自CD8或者IgG4，CD3ζ信号分子的ITAM序列可以对T细胞进行有效的激活，提高杀伤功能。第一代CAR-T细胞胞内只有CD3ζ，仅具有部分持续性和杀伤能力，因此在临床患者体内并没有发生反应。二代CAR在一代CAR的基础上多了一个共刺激分子，比如OX40(CD134)、CD28、4-1BB(CD137)、CD27。共刺激信号分子的加入，促进了CAR-T细胞在体内的增殖与生存能力。单独的CD3ζ结构并不能够促进T细胞增殖和细胞因子的释放，不过在共刺激因子的协助下这一现象就会大大改善，二者协同可以激活CAR-T细胞信号，延长CAR-T细胞的生存期，提高CAR-T细胞的细胞毒性。与CD28相比，4-1BB能够增强CAR-T细胞的持久性功能，避免过早耗竭，不过使用CD28的CAR-T细胞比含4-1BB的CAR-T细胞具有更强的细胞因子释放能力。尽管CD28的CAR-T细胞初期具有强劲的增殖能力，但缺少持续性杀伤能力。第三代CAR-T疗法在CAR上增加了两个共刺激结构域，然而，一些研究表明多个共刺激结构域并不能增强T细胞功效。

近年来针对CD19抗原来治疗难治愈易复发的慢性淋巴细胞白血病(CLL)和急性淋巴细胞白血病(ALL)的CAR-T技术取得了很大的成功，目前针对CD19抗原的已经上市的CAR-T细胞产品已经获批了三种，分别是Kite(吉利德)的Yescarta、诺华的Kymriah和吉利德的Tecartus，临床数据显示总缓解率不低于80％。目前国内针对CD19靶点的临床试点较多，其CAR-T生产工艺与治疗方案参差不齐，存在复发率相当高的问题。另外由于CAR-T细胞毒性较弱，效果不明显和完全没反应的病例也非常多。所以需要对传统的二代CAR进行改造和优化，以便于解决CAR-T细胞毒性低、脱靶、特异性低下等问题。

T细胞免疫球蛋白黏蛋白3(T cell Immunoglobulin and Mucin Domain-3，TIM-3)又称HAVCR2，属于TIM基因家族。在人类，TIM家族包括TIM-1、TIM-3和TIM-4，位于染色体5q33.2上。在小鼠，TIM家族包括TIM-1～TIM-8，位于染色体11B1.1上。TIM-3属于Ⅰ型跨膜糖蛋白，由281个氨基酸组成，TIM-3分子由一个胞外区(包括IgV和Mucin区)、一个单跨膜结构域和一个C-末端细胞质尾部组成。TIM-3表达于不同类型的免疫细胞，包括T细胞、调节性T细胞(Tregs)、树突状细胞(DC)、B细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK)和肥大细胞，已成为一种新型负调控免疫检查点。TIM-3已知的配体包括半乳糖凝集素-9(galectin9，Gal-9)、癌胚抗原细胞黏附分子-1(carcino-cmbryonic antigen related cellular adhesonmolecule 1，CEACAM-1)、高迁移率族蛋白B1(High mobility group box 1protein，HMGB1)和磷脂酰丝氨酸(PS)。近年来，将TIM-3鉴定为急性髓系白血病干性细胞的标记分子，另外发现，TIM-3及其配体可异位表达于肺癌、肝癌等多种实体肿瘤，呈现癌基因的特性，进而将TIM-3作为靶向实体瘤、白血病治疗的新靶点。TIM-3分子与PD-1等负调控分子具有协同作用，促进肿瘤的发生与发展，但在不同的肿瘤中，TIM-3可能与不同的分子相互作用，发挥不同的作用。TIM-3分子的已知配体都与肿瘤免疫抑制有关。Gal-9多表达于免疫细胞、各脏器实质细胞(肝脏、胸腺、小肠、肾脏等)和肿瘤细胞表面，主要参与调控肿瘤微环境中T细胞的凋亡；HMGB1可抑制TIM-3⁺DC细胞的抗原提呈功能；CEACAM-1⁺T细胞与TIM-3分子胞外功能域结合而引起T细胞耗竭乃至凋亡；TIM-3与PS的结合则可介导凋亡细胞的清除。

CD28分子属于免疫球蛋白超家族，95％的CD4⁺T细胞和50％的CD8⁺T细胞都表达CD28分子。CD28是T淋巴细胞表面表达的共刺激分子，对T细胞的活化起到重要作用。CD28是T细胞的一个重要的共刺激分子，可与抗原递呈细胞的B7分子结合，介导T细胞的共刺激并促进其存活、增殖以及产生细胞因子。CD28和4-1BB是CAR结构中最常用的两个共刺激分子，Kite的CAR-T产品Yescarta是把CD28作为共刺激分子使用来进行研究的。在小鼠模型中，TCR信号与CD28/CTLA4-B7共刺激信号协同能引起多种细胞因子转录和翻译的上调、T细胞增殖等效应，同时证实CD28/CTLA4-B7在自身免疫病、肿瘤免疫和免疫排斥以及老化中均起重要作用。CD28分子胞内的YMNM基序可以与PI3K和连接蛋白Grb2的SH2结构域相结合传递激活信号，从而激活T细胞。

发明内容

本发明的目的在于开发一种简单、易行、高效的分子功能转换开关，提高CAR-T细胞的激活、增殖、持久性等功能，即现有CAR-T的平台基础上，并联TIM-3/CD28(T-3/28)分子功能转换开关，将TIM-3分子的抑制性信号转换为CD28分子的激活信号，从而提高CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。另外TIM-3/CD28 CAR相当于双靶点，分别靶向CD19分子和TIM-3分子的配体，在增强肿瘤靶向作用的同时，降低药物毒性和治疗副作用，其中TIM-3/CD28是以融合蛋白的方式存在并发挥作用。

因此，本发明第一方面，提供一种TIM-3/CD28融合蛋白，并提供了所述融合蛋白作为CAR-T细胞中，T细胞表面嵌合抗原抗体修饰的应用。

其次，本发明还提供了一种CAR-T细胞，由于血液瘤的特殊性，CAR-T细胞更易于针对血液瘤发挥作用，CD19作为B淋巴瘤的最经典靶点，CD19经典的二代CAR在临床上取得了不俗的成绩。但现有技术中以19BBz和1928z作为共刺激分子的CAR-T细胞依然有很大局限性，其中易脱靶、细胞毒性低等问题最为关键。

针对现有技术中的上述缺陷，本发明在目前19BBz CAR的基础上增加了一个T-3/28分子功能转换开关，将TIM-3共抑制信号转化为CD28的共刺激信号，从而提高了CAR-T细胞的功能。

由于肿瘤细胞会表达TIM-3分子的各种配体，尤其是各种细胞都会表达PS，所以TIM-3/CD28 CAR相当于双靶点，同时靶向CD19抗原和TIM-3分子的配体，具有改善脱靶的问题。本发明首先构建了19BBz-TIM-3/CD28 CAR，然后通过慢病毒感染的工艺构建了阳性率高并且稳定性表达的TIM-3/CD28 CAR-T细胞，经检测发现相比于19BBz CAR-T细胞，TIM-3/CD28 CAR-T细胞表达更高比例的分化marker CD27和CD28、增殖marker CD25和Ki67，具有更强的脱颗粒能力。并且TIM-3/CD28 CAR-T细胞在具有CD19靶点特异性的情况下，对B淋巴瘤细胞系Daudi、Raji和Namalwa细胞以及临床患者样本细胞的杀伤能力更强，并且能释放更多的杀伤性效应分子。小鼠体内实验表明，TIM-3/CD28 CAR-T细胞有效抑制了肿瘤细胞的增殖，延长了小鼠的生存周期，取各脏器或组织进行研究发现，较高比例的TIM-3/CD28CAR-T细胞成功地抑制了肿瘤细胞的生长和增殖，各脏器中肿瘤细胞的量明显降低，并且在饲养过程中未发现TIM-3/CD28组小鼠出现体重下降、食欲不振、炸毛等细胞因子风暴现象，说明TIM-3/CD28CAR-T细胞在增强抑瘤能力的同时，并不会造成细胞因子风暴等副作用。

以上一个或多个技术方案的有益效果是：

本发明的T3/28分子功能转换开关增强CAR-T细胞杀伤B细胞淋巴瘤，在体外和小鼠体内得到了验证，通过和对照组相比，T3/28组CAR-T细胞具有比较强的杀瘤能力，能够明显抑制肿瘤细胞的生长，为解决临床治疗中CAR-T细胞杀伤力不足、持续性差的问题提供了一个新颖的治疗方式，为科研探索和临床应用开辟了一片新天地。更为重要的是，T3/28分子功能转换开关在增强CAR-T细胞杀伤效应的同时，并未增加其神经毒性，而且可延长CAR-T细胞的增殖能力及在体内存活的时间，有效提高了CAR-T细胞的寿命。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1CAR以及CAR-T细胞的构建

其中：A为19BBz CAR以及TIM-3/CD28 CAR的序列构成图以及分子模拟结构图；B为CAR-T细胞CD3ζ融合蛋白检测图；C为19BBz和TIM-3/CD28CAR-T细胞GFP流式检测图；D为19BBz和TIM-3/CD28 CAR-T细胞GFP荧光图。

图2CAR-T细胞杀伤B淋巴瘤细胞系的能力和特异性检测情况

其中：A为通过流式检测7-AAD阳性的靶细胞，统计的不同效靶比下，CAR-T细胞对Daudi、Raji和Namalwa细胞的杀伤图；B为不同效靶比下，CAR-T细胞对K562细胞以及K562-CD19细胞的杀伤统计图，E:T＝effector cells：target cells。

图3CAR-T细胞杀伤B淋巴瘤细胞系的效应分子释放情况

其中：A为CAR-T细胞杀伤Daudi细胞后上清中IFN-γ和Granzyme B的检测情况；B为CAR-T细胞杀伤Raji细胞后上清中IFN-γ和Granzyme B的检测情况；C为CAR-T细胞杀伤Nmalwa细胞后上清中IFN-γ和Granzyme B的检测情况；

图4CAR-T细胞增殖分化marker以及脱颗粒情况检测

其中：A为CAR-T细胞表面分化marker CD27和CD28分子的检测情况；B为CAR-T细胞激活和增殖marker CD25和Ki67分子的检测情况；C为各组细胞中CD4和CD8细胞群比例图，以及各组细胞和靶细胞Daudi共孵育后的脱颗粒能力检测情况；D为各组细胞中，和靶细胞共孵育后，CD4⁺和CD8⁺细胞群的脱颗粒情况检测图；

图5UNT细胞、19BBz CAR-T细胞和TIM-3/CD28 CAR-T细胞对临床患者样本的杀伤能力统计图

其中：A为UNT细胞、19BBz CAR-T细胞和TIM-3/CD28 CAR-T细胞对临床B-ALL患者1来源PBMCs的杀伤统计图；B为UNT细胞、19BBz CAR-T细胞和TIM-3/CD28 CAR-T细胞对临床B-ALL患者2来源PBMCs的杀伤统计图；

图6CAR-T细胞在Daudi细胞荷瘤的B-NDG小鼠中的作用研究

其中：A为各组小鼠活体成像图；

左侧为各组小鼠day3、day9、day13、day16、day20和day24的小鼠活体平均光子变化曲线图，右图为各组小鼠day13、day16和day20的小鼠活体成像图，每组5只小鼠；

B为各组小鼠荷瘤后体重变化情况，每隔一天称量一次；C为小鼠生存曲线图；

图7小鼠各器官中T细胞和肿瘤细胞的含量检测

其中：A为血液、骨髓、肝脏和脾脏中CD3⁺T细胞(CAR-T细胞)的比例，其中血液取PBMCs、肝脏和脾脏取单个核细胞、取全骨髓，分别来进行检测的；B为血液、骨髓、肝脏和脾脏中CD19⁺Daudi细胞的比例，其中血液取PBMCs、肝脏和脾脏取单个核细胞、取全骨髓，分别来进行检测的；

图8小鼠体内CAR-T细胞持续性杀瘤实验

其中：A为实验方案；B为活体成像图，检测带有Luc的B淋巴瘤Daudi细胞的存在量；C为小鼠生存曲线图；D为小鼠体内CAR-T细胞持续监测统计图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

术语解释：

TIM-3/CD28：本申请文件中，所述“T3/28”、“TIM-3/CD28融合蛋白”、“分子功能转换开关”均表示SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽。

19BBz：以4-1BB为共刺激分子的靶向CD19抗原的二代CAR。

4-1BB：共刺激分子。

正如背景技术所介绍的，现有技术中存在CAR-T细胞存在治疗效果不理想、持续性不佳等技术缺陷。为了解决如上的技术问题，本发明对现有CAR-T细胞技术优化，增加了TIM-3/CD28作为分子转换开关，以克服CAR-T细胞毒性低、脱靶、特异性低下等问题。

本发明第一方面，提供一种TIM-3/CD28融合蛋白，包括TIM-3分子的胞外区及CD28分子的跨膜区和胞内区，所述融合蛋白的氨基酸序列如下：

(1)如SEQ ID NO:1所示；

(2)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列增加、缺失、替换其中一个或几个氨基酸之后还具有与SEQ ID NO:1所示的多肽相同生理活性的氨基酸序列；

(3)对(1)或(2)中所述氨基酸序列的多肽进行修饰后的衍生多肽。

优选的，上述技术方案(2)中，所述“一个或多个氨基酸”是1-7个氨基酸，优先1-6个氨基酸；更为优选的，为1-3个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。

优选的，上述技术方案(3)中，所述“修饰”方式广泛地包括通过化学或遗传修饰后获得衍生多肽。所述修饰方法包括聚乙二醇(PEG)、链霉亲和素、各种分子，例如生物素、放射性同位素、荧光剂、酶、细胞毒性物质、抗肿瘤剂等，还包括上述融合蛋白与功能基团连接后的衍生多肽，所述功能基团包括但不限于靶向肽或穿膜肽。

本发明第二方面，提供编码第一方面所述融合蛋白的核酸序列。

本发明第三方面，提供一种表达框，所述表达框中至少包括第二方面所述的核酸序列。

本发明第四方面，提供一种CAR-T细胞，所述T细胞表面修饰的嵌合抗原受体中，包括第一方面所述的融合蛋白。

优选的，所述嵌合抗原受体中包括共刺激分子，所述共刺激分子为包括但不限于OX40(CD134)、CD28、4-1BB(CD137)、CD27中的一种。

进一步的，本发明提供的一种可行的实施方式中，所述共刺激分子为4-1BB。

4-1BB即CD137，TNFRSF9(TNF receptor superfamily member 9)为TNF受体超家族成员，主要表达在活化的T细胞、NK细胞、单核细胞表面。通过连接其配体CD137L或利用激活型CD137单克隆抗体激活CD137，既能提供共刺激信号激活T细胞，使T细胞活化增殖并分泌细胞因子，同时它介导的共刺激信号能够诱导抗原提呈细胞增殖并分泌细胞因子。本发明将TIM-3/CD-28与4-1BB共刺激分子联合后，CAT-T细胞显示出持续的肿瘤抑制效果。

根据本领域的一般理解，所述CAR-T细胞中，T细胞表面修饰的嵌合抗原受体中应当还包括抗原识别蛋白及跨膜结构域。

本发明提供的CAR-T细胞中，所述抗原识别蛋白为FMC63。

所述跨膜结构域采用CD8分子跨膜区。

优选的，所述CAR-T细胞表面具有两种嵌合抗原受体，其中一种为CD8 SP-FMC63-Fc-CD8 TM-41BB-CD3ζ，另一种为CD8 SP(CD8分子信号肽)-FMC63-Fc(IgG4)-CD8 TM(CD8分子跨膜区)-41BB-CD3ζ-T2A-TIM3 ECD(TIM-3胞外区)-CD28 TM-CD28 ICD(CD28胞内区)；上述两种CAR分子分别修饰于T细胞膜表面。

优选的，所述CAR-T细胞的构建方法，所述构建方法包括：将包含第三方面所述表达框的表达载体转入T细胞中进行表达。

所述表达载体为本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体，只要能在宿主体内稳定复制及表达上述嵌合抗原抗体修饰，均可以应用于本发明技术方案。

本发明提供的一种可行的实施方式中，所述采用慢病毒表达载体。

进一步的，所述CAR-T细胞的构建方法如下：构建含有目标CAR分子表达框的慢病毒载体，分离得到人T细胞并通过慢病毒转染，并筛选转染阳性细胞。

上述构建方法中，所述T细胞分离包括但不限于根据细胞理化性状、功能，以及细胞表面标志等的差异而进行的分离方法，本领域常见的方式如黏附分离法、尼龙毛柱分离法、羰基铁分离法、E花环沉淀分离、流式细胞术分离法或免疫磁珠法。

本发明提供一种具体的实施方式中，所述T细胞分离以人的外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)为原料，通过CD3/CD28磁珠进行分离和增殖。

上述构建方法中，所述转染阳性细胞的筛选方法包括通过荧光显微镜观察T细胞荧光或利用Western blot检测CD3ζ融合蛋白的表达。

本发明第五方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第四方面所述CAR-T细胞。

优选的，所述药物组合物中，第四方面所述药物组合物作为活性成分。

进一步优选的，所述药物组合物中，还具有其他抗肿瘤活性成分，所述其他抗肿瘤活性成分为包括但不限于细胞毒类药物、激素类药物、生物反应调节剂、单克隆抗体中的一种或几种；

所述细胞毒类药物的实例可以为烷化剂、丝裂霉素、拓扑异构酶抑制剂、微管蛋白抑制剂等；

所述激素类药物的实例如抗雌激素、孕激素、性激素等；

所述生物反应调节剂如干扰素、白细胞介素-2等；

所述单克隆抗体如利妥昔单抗注射液、注射用曲妥珠单抗、贝伐珠单抗等。

本发明第六方面，提供一种肿瘤免疫治疗方法，所述治疗方法包括将第四方面所述CAR-T细胞、或第五方面所述药物组合物施用于有需要的个体。

第六方面优选的实施方式中，所述肿瘤为淋巴瘤，进一步的，为B细胞淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。

进一步的，根据其分型，所述霍奇金淋巴瘤包括经典霍奇金淋巴瘤和结节性淋巴细胞；所述非霍奇金淋巴瘤包括弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞白血病及套细胞淋巴瘤(MCL)。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1 TIM-3/CD28 CAR-T细胞的构建及肿瘤细胞毒性验证

1、19BBz CAR以及TIM-3/CD28 CAR的构建

传统的19BBz CAR的结构从前往后顺序依次为

SP-FMC63-Fc-4-1BB-CD3ζ-TAA，TIM-3/CD28 CAR的结构从前往后顺序依次为SP-FMC63-Fc-4-1BB-CD3ζ-T2A-Tim3 ECD-CD28 TM-CD28 ICD。

该序列由苏州泓迅科技有限公司一次性合成，构建到指定载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro上，前后酶切位点分别为XbaI和BamHI，经测序比对后发现序列一致。

2、流式细胞术

取1～5×10⁵个细胞(UNT、19BBz和TIM-3/CD28 CAR-T)加入1μL相应的流式抗体，37℃避光孵育15min或者常温避光孵育30min，用PBS清洗三遍，然后用流式细胞仪(贝克曼)进行分析，测CAR-T细胞GFP表达实验的过程较简单，直接取一定量的细胞，用PBS清洗一遍即可检测。

3、慢病毒的包装以及CAR-T细胞的构建

首先进行慢病毒包装，待病毒包装成功后再感染T细胞构建CAR-T。

取6×10⁶个HEK293T细胞接种于10cm²细胞培养皿中，过夜，待细胞密度达到80％时，更换6mL新鲜DMEM培养基。

(1)2h后进行包装病毒，向EP管中加入450μl无菌水，混入下述质粒，混匀；

(2)逐滴加入50μLCaCl₂，混匀；

(3)另准备新的1.5mL EP管，加500μL2×HBS；

(4)将2)3)加入4)，混匀，室温静置15min，可见浑浊；

(5)将上述混合液加入HEK293T细胞中，十字法混匀，培养箱培养24h；

(6)24h后更换6mL新鲜培养基，继续培养；

(7)48h后收集第一批病毒，并加入6mL新鲜培养基；

(8)72h后收集第二批病毒，此时可用荧光显微镜观察GFP荧光强度检测转染效率；

收集的病毒离心取上清，用0.22μm的滤膜过滤，然后进行浓缩。浓缩使用Backman超速离心机，32Ti转子，12000rpm×90min，弃上清后使用200μLX-VIVO(loza)培养基重悬，震荡30min后长期冻存于-80℃，并且对病毒进行滴度检测。

取MOI＝50的病毒量感染10×10⁴个T细胞，于24孔板中离心感染，600g×60min，感染后将T细胞转移至新鲜培养基中培养。

4、人T细胞的获取

首先获取健康志愿者的PBMCs：

(1)取10mL血液至50mL ep管中，使用PBS按照1：1的比例进行稀释(10mL)；

(2)取Ficoll按照1:1(10mL)的比例准备于新的50mL离心管中；

(3)将PBS/血液混合液贴壁缓慢加入到Ficoll上层，尽量勿使红细胞沉降至管底；

(4)于水平式离心机，16℃，800g×30min，升速5降速0；

(5)吸取白色雾状层于新的15mL离心管中，加入PBS 1:1清洗，600g×10min，弃上清；

(6)沉淀即为PBMCs，将PBMCs适量放入24孔板中培养，每孔加入10μLCD3/CD28beads(美天旎)进行激活，激活48h后，增殖起来的即为T细胞。5、Western Blot验证CAR的表达

(1)收集CAR-T细胞，UNT细胞作为阴性对照；

(2)将收集的细胞进行离心，用PBS冲洗3遍，每管中加入50μl蛋白裂解液，然后加入10μl的5×蛋白上样液，100℃条件下煮蛋白，变性10min；

(3)电泳。加入5μl蛋白marker，每孔加入10μl样品。上层胶电泳条件80V、30min；下层胶电泳条件120V、120min；

(4)转膜。电泳结束后，将PVDF膜在无水甲醇中浸泡5min，400mA转膜90min。电极板放置顺序：白色夹板(正极)-海绵-滤纸-PVDF膜-蛋白胶-滤纸-海绵-黑色夹板(负极)；

(5)封闭。转膜结束后，取膜于甲醇溶液中固定3min，然后用提前配置好的5％的脱脂牛奶进行封闭，在摇床上摇动封闭1h；

(6)孵育一抗。封闭结束后，4℃过夜孵育一抗。一抗为Mouse anti-human CD3ζ，该抗体以1：1000浓度用5％的脱脂牛奶稀释；

(7)用配置好的1×TBST缓冲液冲洗过夜后的PVDF膜，冲洗3次，每次10min；

(8)孵育二抗，常温下孵育2h。二抗为HRP-羊抗鼠IgG(H+L)，该抗体以1：10000浓度用5％的脱脂牛奶稀释；

(9)用配置好的1×TBST缓冲液冲洗PVDF膜，冲洗3次，每次10min。加入显影液，进行显影，曝光时间3min左右。

6、LDH检测CAR-T细胞的杀伤实验

CAR-T细胞对B淋巴瘤细胞系的杀伤实验主要采用CBA(CytoTox

Non-Radioactive Cytotoxicity Assay)的方法进行体外杀伤检测，设四组效靶比，分别为0.25:1、0.5:1、1:1和2:1。具体如下：

(1)取1×10⁵靶细胞于24孔板中，加入相应数量的CAR-T(UNT)细胞，混匀，终体系为1.5mL，设靶细胞组和效应细胞组；

(2)效应细胞和靶细胞共培养18h，离心，取上清；

(3)将靶细胞组上清去掉，只留细胞，加入裂解液反应45min，使其LDH完全释放；

(4)取各组上清50μL于96孔板中，加入50μL检测试剂，避光反应30min；

(5)30min以后加入50μL终止液，反应1h，用酶标仪读数检测。每组杀伤值按下式计算：

每组杀伤效率(％)＝(实验组数值－效应细胞自然死亡数值－靶细胞自然死亡率数值)/(靶细胞完全死亡数值－靶细胞自然死亡数值)×100％

7、K562-CD19细胞的构建

在NCBI上查找CD19抗原序列(AH005421.2)，在泓迅公司合成序列，酶切酶连构建到慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP上，过程如上，前后酶切位点分别为BamHI和EcoRI，大提质粒进行保存。

8、流式方式检测CAR-T细胞杀伤临床样本的研究

流式方式检测CAR-T细胞杀伤临床样本的方式是：1)靶细胞与效应细胞按照1:1的比例进行混合，各取1×10⁵个细胞置于24孔板中，做同样的各组，每组3个副孔；2)杀伤前检测一组，每孔加入1μL APC荧光标记的抗人的CD19抗体和1μL FITC荧光标记的抗人的CD3抗体，CD19抗体用来标记B淋巴瘤细胞，CD3抗体用来标记CAR-T(UNT)细胞；3)共孵育15min后，用预冷的PBS清洗三次，然后流式上机，记录B淋巴瘤的细胞群比例；4)待杀伤18小时左后，取另一组混合细胞，以同样的方式染上抗体，清洗后上机，记录此时B淋巴瘤细胞群的比例；5)按照以下公式计算杀伤比例：

每组杀伤效率(％)＝(杀伤前B淋巴瘤所占比例－杀伤后B淋巴瘤所占比例)/杀伤前B淋巴瘤所占比例×100％

9、小鼠体内实验

本实施例使用百奥赛图公司提供的B-NDG雌性小鼠，6～8周龄，体重18～22g，饲养条件按照SPF级动物标准执行。首先每只小鼠尾静脉接种5×10⁵个Daudi-luc细胞进行荷瘤造模，记为day 0，随后小鼠被随机分成四组，每组8只小鼠。然后每组分别在day 4、day 8和day 12尾静脉回输效应细胞：组1回输PBS，体系200μL；组2回输1×10⁶个UNT细胞，体系200μL；组3回输1×10⁶个19BBz CAR-T细胞，体系200μL；组4回输1×10⁶个TIM-3/CD28 CAR-T细胞，体系200μL。随后观察小鼠生存情况，每隔一天给小鼠称量体重一次，分别在day 9、day13、day 16、day 20和day 25给小鼠做活体成像实验。第13天，于每组随机各取三只小鼠实施安乐死，分别检测外周血、骨髓、脾脏和肝脏中CD19⁺肿瘤细胞(Daudi)以及CD3⁺T细胞的含量。所有涉及到小鼠的实验完全按照山东大学动物保护和利用委员会的要求执行，当小鼠自然死亡或后肢瘫痪无法行动时，对小鼠实施安乐死，宣布小鼠死亡。

根据实施例1的研究结论，本发明提供的T3/28CAR-T细胞在肿瘤治疗方面的技术进步体现在多个方面，分析如下：

相比于19BBz CAR-T细胞，T3/28CAR-T细胞具有更强的细胞毒性：

为了探究T3/28CAR-T细胞的体外细胞毒性，本发明将T3/28CAR-T细胞以及对照的UNT、19BBz CAR-T细胞分别与多种B细胞来源的淋巴瘤共孵育，通过检测上清中LDH的量，明确各种CAR-T细胞对B细胞淋巴瘤的杀伤能力。本研究中使用的靶细胞为Daudi、Raji、Namalwa以及构建的表达CD19抗原的K562-CD19细胞。杀伤研究中设立多个效靶比，分别为0.25:1、0.5:1、1:1和2:1，杀伤时长为18小时左右。

同时检测了杀伤后上清中的效应分子Granzyme B和IFN-γ的含量，其含量的高低与CAR-T细胞杀伤能力的强弱成正比。采用ELISA方法进行检测。

结果显示：对于靶细胞Daudi、Raji和Namalwa来说，两种CAR-T(19BBz和T3/28)的细胞毒性远远高于对照组UNT细胞，并且随着效靶比的增大，这种趋势随之增大(图2A)。同时，T3/28CAR-T细胞的细胞毒性要显著高于19BBz CAR-T细胞，即T3/28组靶细胞的死亡率高于19BBz组靶细胞的死亡率(图2A)。为了验证本CAR-T细胞的靶点特异性，在K562细胞的基础上，人为构建了稳定表达CD19抗原的靶细胞K562-CD19细胞，并且对这两种靶细胞分别进行了杀伤。研究发现，19BBz CAR-T细胞和T3/28CAR-T细胞对K562细胞具有非常低的细胞毒性，和对照组UNT细胞组无明显差异，但是对于K562-CD19细胞则不同，19BBz和T3/28CAR-T细胞组靶细胞的死亡率远高于UNT组，并且在不同效靶比情况下，T3/28CAR-T细胞的细胞毒性优于19BBz CAR-T细胞，具有统计学差异(图2B)。效应分子的检测结果显示，与靶细胞Daudi、Raji和Namalwa共孵育后，CAR-T细胞释放的Granzyme B和IFN-γ要远高于UNT细胞组，并且除了个别组外，T3/28CAR-T细胞释放的Granzyme B和IFN-γ呈现出高于19BBz组的趋势(图3)。

由上述实验及其结果，可以得出如下结论：

在传统的19BBz CAR-T基础上增加了T3/28分子功能转换开关元件后，增强了CAR-T细胞的杀伤能力，提高了CAR-T细胞杀伤性细胞因子的释放水平，说明T3/28分子功能转换开关在一定程度上增强了CAR-T细胞活性。

T3/28 CAR-T细胞具有更强的增殖能力和脱颗粒能力：

取转导一周左右的CAR-T细胞以及UNT细胞，通过流式细胞术检测其表型，检测的指标分别为T细胞分化marker CD27和CD28，T细胞激活marker CD25和增殖marker Ki67，CD4⁺T和CD8⁺T细胞亚群的比例，同时将各组T细胞与B淋巴瘤Daudi细胞共培养，检测了各组T细胞的脱颗粒能力。

结果显示：

在检测倾向于记忆表型和效应表型的分化marker CD27和CD28时，发现CAR-T细胞表达更高水平的CD27和CD28，同时与19BBz CAR-T细胞相比，更高比例的T3/28CAR-T细胞表达CD27和CD28(图4A)。在检测激活marker CD25和增殖marker Ki67时，发现CAR-T细胞表达更高水平的CD25和Ki67，同时与19BBz CAR-T细胞相比，更高比例的T3/28CAR-T细胞表达CD25和Ki67(图4B)。具有辅助作用的CD4 CAR-T细胞，在一定程度上提升了CAR-T细胞的持续杀伤能力，有利于避免过早耗竭与凋亡，进一步检测了各组T细胞中CD4与CD8细胞群的比例，发现CAR-T组CD4⁺T细胞群比例更高，明显高于UNT组，同时发现T3/28组CAR-T细胞的CD4⁺T细胞亚群的比例显著高于19BBz组(图4C左)。同时将各组T细胞与B淋巴瘤Daudi细胞共培养，检测了各组T细胞的脱颗粒能力，发现共培养后，CD3⁺的CAR-T细胞的脱颗粒能力远高于UNT组，同时T3/28CAR-T细胞的脱颗粒能力要远高于19BBz组，具有统计学差异(图4C右)，说明T3/28分子元件增强了CAR-T细胞的脱颗粒能力。进一步分析，发现T3/28组中CD4和CD8阳性的CAR-T细胞的脱颗粒能力明显优于对照组UNT和19BBz组(图4D)。

由上述实验及其结果，可以得出如下结论：

靶向CD19的CAR-T细胞的增殖能力以及脱颗粒能力明显强于未做任何处理的T细胞；对于两组CAR-T细胞来说，T3/28组CAR-T细胞的增殖能力以及脱颗粒能力明显优于19BBz组，增强持续能力的CD4⁺CAR-T细胞群比例高于19BBz组，说明T3/28分子功能转换开关能够增加CAR-T细胞的增殖能力，提高CAR-T细胞的脱颗粒能力。

T3/28能够增强CAR-T细胞对临床B淋巴瘤样本的杀伤：

虽然T3/28CAR-T细胞在杀伤B淋巴瘤细胞系方面比传统的19BBz二代CAR-T细胞有一定的优势，但是在针对临床B淋巴瘤样本方面是否有优势不得而知。于是本发明收集了两例初治的B-ALL患者的PBMCs，流式检测发现两例患者CD19⁺的B淋巴瘤细胞群比例在80-98％之间，将两例患者的PBMCs分别与UNT、19BBz以及T3/28CAR-T细胞按照1：1的比例共孵育18h左右，用流式检测杀伤前后CD19⁺细胞群的所占比例，根据比例变化计算杀伤情况。

结果显示：

CAR-T细胞对B-ALL样本的杀伤远高于UNT组，CAR-T组B-ALL样本的死亡率超过60％,而UNT组靶细胞的死亡率只有10％左右(图5A、B)。和19BBz CAR-T组相比，T3/28CAR-T组的靶细胞死亡率明显高于前者，死亡率到达80％以上，说明T3/28CAR-T细胞对B-ALL样本的杀伤能力强于19BBz CAR-T细胞(图5A、B)。

由上述实验及其结果，可以得出如下结论：

T3/28分子功能转换开关提高了传统19BBz二代CAR对B-ALL的杀伤，为解决临床上19BBz CAR-T细胞杀伤能力不足的问题提供了一个新颖的解决策略。

T3/28 CAR-T细胞在小鼠体内有效发挥抗B细胞淋巴瘤的效应：

实验用小鼠为SPF级B-NDG雌性小鼠，6～8周龄，体重18～22g，由百奥赛图公司提供，饲养条件按照SPF级动物标准执行。

B-NDG小鼠尾静脉接种Daudi-luc细胞进行荷瘤造模，然后小鼠被随机分成4组，每组8只，然后分三次尾静脉回输效应细胞：组1回输PBS，组2回输UNT细胞，组3回输19BBzCAR-T细胞，组4回输T3/28CAR-T细胞。观察小鼠生存情况，期间检测小鼠体重变化，利用小动物活体成像仪动态检测肿瘤生长情况。第13天，于每组随机各取三只小鼠，分别检测外周血、骨髓、脾脏和肝脏中CD19⁺肿瘤细胞以及CD3⁺T细胞的含量。所有涉及到小鼠的实验完全按照山东大学动物保护和利用委员会的要求执行，当小鼠自然死亡或后肢瘫痪无法行动时，对小鼠实施安乐死，宣布小鼠死亡。

结果显示：各组间小鼠体重差异不大，只有后期小鼠状态较差时体重才会下降，从20～22g下降到15～17g(图6A)。小鼠活体成像统计结果显示，PBS组和UNT组小鼠肿瘤生长非常快，20天时，小鼠全身组织基本皆有Daudi细胞浸润，而19BBz组和T3/28组小鼠肿瘤生长较慢，说明CAR-T细胞成功地抑制了肿瘤细胞的生长和增殖，其中T3/28组效果显著优于19BBz组，光子变化曲线得到一致的结果(图6A)，说明T3/28CAR-T细胞抑瘤效果优于19BBzCAR-T细胞。统计小鼠生存情况，发现T3/28组小鼠生存周期最长，在30天左右，和其他各组间具有统计学差异，19BBz组小鼠生存周期次之，在25天左右，UNT和PBS组最差(图6C)，说明CAR-T细胞能够发挥抑瘤作用，并且19BBz CAR-T细胞抑瘤效果弱于T3/28CAR-T细胞。另外检测了外周血、骨髓、肝脏和脾脏中CD3⁺T细胞的含量(图7A)，除了骨髓和肝脏中T3/28组和19BBz组没有统计学差异外，基本趋势是T3/28组中CAR-T细胞含量最高，尤其在外周血中，将近占PBMCs的20％，19BBz组中CAR-T细胞含量次之，明显高于PBS和UNT组。同时检测了外周血、骨髓、肝脏和脾脏中CD19⁺Daudi细胞的含量(图7B)，发现19BBz组和T3/28组小鼠各脏器中Daudi细胞含量最少，低于UNT和PBS组，并且在肝脏中，T3/28组Daudi细胞显著低于19BBz组。综合分析，T3/28组中各脏器肿瘤细胞含量最低，19BBz组次之，PBS组和UNT组无明显差异，含量最高。

由上述实验及其结果，得出如下结论：

相比于传统的19BBz二代CAR-T细胞，T3/28CAR-T细胞在体内能够明显抑制肿瘤细胞的生长和增殖，并且T3/28CAR-T细胞在体内的增殖速度大于19BBz CAR-T细胞，说明T3/28分子功能转换开关能够提高CAR-T细胞的体内抑瘤功能，T3/28分子功能转换开关并未增加19BBz的神经毒性，而且可延长CD19 CAR-T细胞的增殖能力及在体内存活的时间，有效提高了CAR-T细胞的寿命，相关结果对T3/28分子开关的体内作用做出了初步的阐述。

T3/28 CAR-T细胞在小鼠体内具有持续发挥抗B细胞淋巴瘤的效应：

实验用小鼠为SPF级B-NDG雌性小鼠，6～8周龄，体重18～22g，由百奥赛图公司提供，饲养条件按照SPF级动物标准执行。

B-NDG小鼠尾静脉注射CAR-T细胞，回输量为1×10⁷，每组5只小鼠，组1回输UNT细胞，组2回输19BBz CAR-T细胞，组3回输T3/28CAR-T细胞。然后分三次尾静脉注射肿瘤细胞，分别在第6、第14和第21天肿瘤，每只小鼠每次种2×10⁴。观察小鼠生存情况，期间检测小鼠体重变化，利用小动物活体成像仪动态检测肿瘤生长情况。所有涉及到小鼠的实验完全按照山东大学动物保护和利用委员会的要求执行，当小鼠自然死亡或后肢瘫痪无法行动时，对小鼠实施安乐死，宣布小鼠死亡。

结果显示：在进行3次肿瘤回输挑战后，进行了4次小鼠活体成像(图8A)，发现T3/28CAR-T回输组肿瘤生长缓慢，19BBz和UNT回输组小鼠肿瘤生长明显快于T3/28CAR-T回输组(图8B)，并且经过小鼠生存统计发现，T3/28CAR-T组小鼠生存期最长，其中有2只(40％)小鼠达到了完全缓解，并且长期无瘤(图8C)。在不断回输肿瘤细胞的情况下，长期追踪小鼠体内CAR-T细胞的变化情况，发现，T3/28CAR-T组小鼠体内CAR-T细胞含量长期存在，前期增殖速度明显高于19BBz组，后期CAR-T细胞所占比例也明显高于对照组，具有显著的统计学差异(图8D)。

由上述实验及其结果，得出如下结论：

相比于传统的19BBz二代CAR-T细胞，T3/28CAR-T细胞在体内具有持续性增殖的能力，抑制肿瘤的持续性能力显著，达到不断清除肿瘤的目的，提高小鼠生存期。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> 一种TIM-3/CD28融合蛋白及所述融合蛋白修饰的CAR-T细胞

<130> 2010

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 268

<212> PRT

<213> TIM/CD28

<400> 1

Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln

20 25 30

Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu

35 40 45

Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly

50 55 60

Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser

65 70 75 80

Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr

85 90 95

Ile Glu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile

100 105 110

Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val

115 120 125

Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe

130 135 140

Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala

145 150 155 160

Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile

165 170 175

Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu

180 185 190

Arg Asp Ser Gly Ala Thr Ile Arg Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly

195 200 205

Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile

210 215 220

Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met

225 230 235 240

Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro

245 250 255

Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

260 265

Claims (10)

1.一种TIM-3/CD28融合蛋白，包括TIM-3分子的胞外区及CD28分子的跨膜区和胞内区，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如下：

(1)如SEQ ID NO:1所示；

(2)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列增加、缺失、替换其中一个或几个氨基酸之后还具有与SEQ ID NO:1所示的多肽相同生理活性的氨基酸序列；

(3)对(1)或(2)中所述氨基酸序列的多肽进行修饰后的衍生多肽。

2.如权利要求1所述TIM-3/CD28融合蛋白，其特征在于，所述“一个或多个氨基酸”是1-7个氨基酸，优先1-6个氨基酸；更为优选的，为1-3个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。

3.编码权利要求1或2所述融合蛋白的核酸序列。

4.一种表达框，所述表达框中包括权利要求3所述的核酸序列。

5.一种CAR-T细胞，其特征在于，所述T细胞表面修饰的嵌合抗原受体中，包括权利要求1或2所述的融合蛋白。

6.如权利要求5所述CAR-T细胞，其特征在于，所述T细胞表面修饰的嵌合抗原受体中所述共刺激分子为包括但不限于OX40(CD134)、CD28、4-1BB、CD27中的一种；优选的，所述共刺激分子为4-1BB；

优选的，T细胞表面修饰的嵌合抗原受体中应当还包括抗原识别蛋白及跨膜结构域；所述抗原识别蛋白为CD8 SP-FMC63-Fc；所述跨膜结构域采用CD8分子跨膜区；

优选的，所述CAR-T细胞具有两种嵌合抗原受体，其中一种为CD8 SP-FMC63-Fc-CD8TM-41BB-CD3ζ，另一种为CD8 SP-FMC63-Fc-CD8 TM-41BB-CD3ζ-T2A-TIM3 ECD-CD28 TM-CD28 ICD。

7.如权利要求6所述CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞的构建方法，所述构建方法包括：将包含权利要求4所述表达框的表达载体转入T细胞中进行表达；

优选的，所述表达载体为细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体；

进一步的，为慢病毒表达载体。

8.如权利要求6所述CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞的构建方法如下：构建含有目标CAR分子表达框的慢病毒载体，分离得到人T细胞并通过慢病毒转染，并筛选转染阳性细胞；

优选的，所述T细胞分离包括但不限于粘附分离法、尼龙毛柱分离法、羰基铁分离法、E花环沉淀分离、流式细胞术分离法或免疫磁珠法；

进一步的，所述T细胞分离以人的外周血单个核细胞为原料，通过CD3/CD28磁珠进行分离和增殖；

优选的，构建方法中，所述转染阳性细胞的筛选方法包括通过荧光显微镜观察T细胞荧光或利用Western blot检测CD3ζ融合蛋白的表达。

9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求6-8任一项所述CAR-T细胞；

优选的，所述药物组合物中，权利要求6-8任一项所述CAR-T作为活性成分；

进一步优选的，所述药物组合物中，还具有其他抗肿瘤活性成分，所述其他抗肿瘤活性成分为包括但不限于细胞毒类药物、激素类药物、生物反应调节剂、单克隆抗体中一种或几种；

所述细胞毒类药物为烷化剂、丝裂霉素、拓扑异构酶抑制剂或微管蛋白抑制剂；

所述激素类药物为抗雌激素、孕激素、或性激素；

所述生物反应调节剂为干扰素或白细胞介素-2；

所述单克隆抗体为利妥昔单抗注射液、注射用曲妥珠单抗、或贝伐珠单抗。

10.一种肿瘤免疫治疗方法，其特征在于，所述治疗方法包括将权利要求6-8任一项所述CAR-T细胞、或权利要求9所述药物组合物施用于有需要的个体；

优选的，所述肿瘤为淋巴瘤，进一步的，为B细胞淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤；

更进一步的，根据其分型，所述霍奇金淋巴瘤包括经典霍奇金淋巴瘤和结节性淋巴细胞；所述非霍奇金淋巴瘤包括弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞白血病及套细胞淋巴瘤。

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