CN117343908A - 一种通过真菌精准激活的car-t细胞、制备方法、应用及药物组合物 - Google Patents
一种通过真菌精准激活的car-t细胞、制备方法、应用及药物组合物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种通过真菌精准激活的CAR‑T细胞、制备方法、应用及药物组合物，属于生物医药领域，CAR‑T细胞包括两个抗原识别域；第一个抗原识别域是真菌表面抗原的单链抗体，识别真菌，提供CAR‑T细胞活化的专有信号；第二个抗原识别域是肿瘤表面抗原的单链抗体，启动CAR‑T细胞杀伤肿瘤细胞；第一个抗原识别域与第二个抗原识别域之间信号串联，且第一个抗原识别域在上游。本发明具有特异性扩增、治疗肿瘤等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种CAR-T细胞，尤其涉及一种通过真菌精准激活的CAR-T细胞、制备方法、应用及药物组合物。
背景技术
近年来，免疫疗法在肿瘤治疗中占据了越来越重要的地位。其中，嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，CAR-T)免疫疗法在血液性肿瘤中得到了广泛应用并逐渐向实体瘤领域发展。嵌合抗原受体（CAR）基因包括肿瘤抗原相对应的抗体的抗原结合部分（ScFv）与CD3-ζ链或FcεRIγ的胞内段。CAR-T细胞是通过将CAR基因转染入患者的T细胞，使患者自身的T细胞能够表达肿瘤特异性的CAR，从而清除肿瘤细胞。
CAR-T细胞的数量是影响CAR-T疗效的决定性因素，效应CAR-T细胞的数量越多，杀伤肿瘤细胞的效果越好。但是，回输体内的CAR-T细胞受到肿瘤微环境等抑制因素的影响，迅速耗竭衰老，CAR-T细胞的数量难以维持治疗所需。因此，增加体内、特别是肿瘤内CAR-T细胞的数量，是进一步提高CAR-T疗效的关键。
目前，CAR-T细胞的扩增主要是通过细胞因子刺激，但基因改造后仅有部分T细胞表达CAR，不表达CAR的T细胞在非特异性刺激下甚至增殖得更快，从而导致基因改造效率进一步降低。近年来研发的纳米人工抗原递呈细胞（aAPC）为CAR-T细胞提供了活化必须的第一&二信号，但由于该纳米材料的生物相容性欠佳，至今仍未被批准用于人体。因此，在免疫细胞治疗领域，亟需一种生物相容性好的、能够在体内外特异性扩增CAR-T细胞状态的新方法。
发明内容
本发明提供一种通过真菌精准激活的CAR-T细胞、制备方法、应用及药物组合物，以克服现有技术的缺陷。
为实现上述目的，本发明提供一种通过真菌精准激活的CAR-T细胞，具有这样的特征：包括两个抗原识别域；第一个抗原识别域是真菌表面抗原的单链抗体，识别真菌，提供CAR-T细胞活化的专有信号；第二个抗原识别域是肿瘤表面抗原的单链抗体，启动CAR-T细胞杀伤肿瘤细胞；第一个抗原识别域与第二个抗原识别域之间信号串联，且第一个抗原识别域在上游。
进一步，本发明提供一种通过真菌精准激活的CAR-T细胞，还可以具有这样的特征：其中，所述真菌表面抗原的单链抗体中的真菌表面抗原是真菌细胞壁成分或通过酵母菌展示技术外接的抗原。其中，通过酵母菌展示技术外接的抗原包括但不限于FITC和OVA等模式抗原。
进一步，本发明提供一种通过真菌精准激活的CAR-T细胞，还可以具有这样的特征：其中，所述真菌表面抗原的单链抗体中的真菌表面抗原是β-葡聚糖或甘露糖。
进一步，本发明提供一种通过真菌精准激活的CAR-T细胞，还可以具有这样的特征：其中，所述肿瘤表面抗原的单链抗体中的肿瘤表面抗原是HER2、EGFRⅧ、CEA或GUCY2C。
进一步，本发明提供一种通过真菌精准激活的CAR-T细胞，还可以具有这样的特征：其中，所述CAR-T细胞的序列由β葡聚糖单链可变区、HER2单链可变区、CD8a铰链区、CD28跨膜区和胞内区、41BB胞内区以及CD3ζ胞内区串联构成。
进一步，本发明提供一种通过真菌精准激活的CAR-T细胞，还可以具有这样的特征：其中，所述β葡聚糖单链可变区包含SEQ ID NO:1所示的VH1序列和SEQ ID NO:2所示的VL1序列；所述HER2单链可变区包含SEQ ID NO:3所示的VH2序列和SEQ ID NO:4所示的VL2序列。
本发明还提供上述通过真菌精准激活的CAR-T细胞的制备方法，具有这样的特征：包括以下步骤：步骤一、设计CAR-T细胞质粒；步骤二、通过步骤一的质粒进行包装慢病毒；步骤三、分离原代T细胞；步骤四、磁珠分选步骤三得到的原代T细胞；步骤五、通过步骤二获得的病毒转染步骤四获得的T细胞，得到CAR-T细胞。
本发明还提供上述通过真菌精准激活的CAR-T细胞在制备治疗肿瘤药物中的应用。
本发明还提供一种治疗肿瘤的药物组合物，具有这样的特征：包括上述通过真菌精准激活的CAR-T细胞和真菌；所述真菌与CAR-T细胞中真菌表面抗原的单链抗体中的真菌为同一种真菌。
本发明还提供上述药物组合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明CAR-T细胞有两个抗原识别域，第一部分是真菌表面抗原的单链抗体，识别真菌，提供CAR-T细胞活化的专有信号；第二部分是肿瘤表面抗原的单链抗体，启动CAR-T细胞杀伤肿瘤细胞。两部分之间信号串联，且第一部分真菌激活域在上游。没有真菌存在时，第二部分识别肿瘤后，可将信号传导至胞内，启动杀伤信号，所以该CAR-T细胞的杀伤不依赖于真菌；当真菌存在时，第一部分真菌激活域在上游提供一个额外的扩增信号，特异性扩增CAR-T细胞。
本发明CAR-T细胞及其药物组合物提供了肿瘤治疗性真菌的开发与新应用。具体的，工程化细菌已被广泛用于改善肠道微生态、提高肿瘤免疫原性，但是工程化真菌的研究尚处于起步阶段。与工程化细菌相比，工程化真菌具有完整的细胞结构，可作为CAR-T的靶细胞。将真菌作为CAR-T的饲养细胞，以刺激CAR-T细胞在体内外特异性扩增，国内外尚无相关研究。本发明采用酵母菌等真菌的优势在于：在肿瘤局部提供CAR-T特异性扩增的专有信号；该工程化真菌可通过招募免疫细胞浸润肿瘤，进一步增强抗肿瘤免疫的疗效；该工程化布拉迪酵母菌稳定性好，耐酸性强，可通过口服/肛塞给药；该策略生物相容性好，临床转化能力强，有望大规模推广应用。
本发明CAR-T细胞及其药物组合物提供了CAR-T细胞特异性扩增的全新策略。具体的，目前CAR-T的扩增方法大多属于非特异性扩增，且以体外扩增为主。亟需研发新的策略，解决CAR-T细胞难扩增、易耗竭的问题。本发明将CAR-T细胞免疫治疗的需求与工程化真菌的特点有机结合，着眼于解决CAR-T疗法中存在的实际且迫切的问题，提出用工程化真菌在体内外特异性扩增CAR-T细胞。该新型CAR-T细胞的优势在于：在体内外均能获得特异性扩增的专有信号，CAR-T细胞产率大幅提升；具有第四代CAR-T的特点，但CAR的质粒大小仅为10kb左右，避免因为过于复杂导致基因转染错误；本发明具有普适性，不局限于HER2阳性的肠癌。
附图说明
图1是用布拉迪酵母菌特异性激活CAR-T细胞的模式图；
图2是本发明CAR-T细胞的体外实验结果图，其中a为慢病毒包装及转染，b为CAR-T细胞荧光图，c为形成淋巴细胞克隆团（证明CAR-T细胞活力良好），d为流式细胞术检测CAR阳性的细胞占比图，e为流式细胞术检测CAR-T细胞的增殖情况图；
图3是本发明药物组合物的体内实验结果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
本实施例提供一种通过真菌精准激活的CAR-T细胞，包括两个抗原识别域：第一个抗原识别域是真菌细胞壁β-葡聚糖的单链抗体，识别布拉迪酵母菌，提供CAR-T细胞活化的专有信号；第二个抗原识别域是肠癌表面抗原HER2（Human Epidermal Growth FactorReceptor 2）的单链抗体，启动CAR-T细胞杀伤肿瘤细胞。第一个抗原识别域与第二个抗原识别域之间信号串联，且第一个抗原识别域在上游。
当然，真菌细胞壁β-葡聚糖的单链抗体中的β-葡聚糖也可以替换为其他真菌表面抗原，包括甘露糖等其他通过酵母菌展示技术外接的抗原；肠癌表面抗原HER2的单链抗体中的HER2也可以替换为EGFRⅧ、CEA、GUCY2C等其他肿瘤表面抗原。
本实施例通过真菌精准激活的CAR-T细胞的制备方法包括以下步骤：
步骤一、设计CAR-T细胞质粒。
CAR-T细胞的序列由β葡聚糖单链可变区、HER2单链可变区、CD8a铰链区、CD28跨膜区和胞内区、41BB胞内区以及CD3ζ胞内区串联构成。
其中，β葡聚糖单链可变区包含SEQ ID NO:1所示的VH1序列和SEQ ID NO:2所示的VL1序列；HER2单链可变区包含SEQ ID NO:3所示的VH2序列和SEQ ID NO:4所示的VL2序列。
步骤二、通过步骤一的质粒进行包装慢病毒。
准备15cm皿，接种5*106个293T细胞，待细胞增长至汇合度70%左右加入按一定比例混合好的包装质粒（如图2中a所示）、表达质粒和PEI，轻轻晃动培养皿，充分混匀。将培养皿置于37℃、5CO2培养箱，培养 6~8 小时后，将含有转染试剂的培养基去掉，更换为新鲜的完全培养基。分别于转染后48h、72h收集含有病毒的培养基上清，1200 xg离心10分钟，将培养基中的细胞碎片等去掉。取一个新的无菌离心管，加入5mL 20% sucrose，然后沿着离心管内壁，轻轻加入含有病毒的培养基上清，配平后，20000g 4℃离心2小时。离心结束后，在生物安全柜中，小心将离心管中的液体吸去，加入按照100倍比例浓缩的 PBS，将离心管置于4℃冰箱中过夜，第二天将沉淀重悬。按照 100μL/管分装，将病毒置于-80℃保存。
步骤三、分离原代T细胞。
断颈处死8周龄C57BL/6小鼠，75%酒精浸泡5min，于超净台中固定小鼠，灭菌显微手术器械剪开小鼠右侧腹部皮肤，暴露腹膜，换另一套器械剪开腹膜，钝性分离取出脾脏，使用PBS冲洗脾脏2次，剪成小块，放入70μm 细胞筛网中；研磨直至看不见明显组织块，加入匀浆冲洗液将细胞冲入离心管；离心组织研磨液（450g，10min，室温），弃上清；用样本稀释液重悬细胞，调整细胞密度为 2×108~1×109/mL。
步骤四、磁珠分选步骤三得到的原代T细胞。
计数原代T细胞以1×107个，以300g离心10min，以80uL的MACS Buffer每107个细胞重悬，按照20uL每107个细胞加入CD8+T磁珠，4℃孵育15min；然后按照1～2mL每107个细胞加入MACS Buffer洗涤，以300g离心10min，弃去上清；以MACS Buffer重悬细胞至108个/mL，将离心管置于稳定强磁场中，小心弃去上清，移去磁场，使用MACS Buffer稍用力洗涤并以300g离心10min，得到T细胞，将分选得到的T细胞重悬于RPMI1640培养基中，并添加10％FBS，100U/mL IL-2和5ng/mL IL-15备用。
步骤五、通过步骤二获得的病毒转染步骤四获得的T细胞，得到CAR-T细胞。
调整细胞密度至1*106细胞/mL，加入细胞因子及抗体复合物（终浓度为 100U/mLIL-2、10ng/mL IL-7、5ng/mL IL-15、100ng/mL Anti-CD3 (OKT3)、250ng/mL Anti-CD137），连续培养48小时。按照 MOI=20~50，计算所需要的病毒量。
计算公式如下： 所需病毒量（mL）=(MOI*细胞数量)/病毒滴度从‐80℃ 冰箱取出病毒后，迅速在 37℃水浴锅中融化。在六孔板中加入上述计算所得的病毒量，添加终浓度为 4-8μg/mL的polybrene，充分混匀后，使用封口膜将六孔板四边密封，800 xg 离心1小时。离心结束后，撕掉封口膜，将六孔板置于37℃ 5% CO2的培养箱中，继续培养24小时。然后250xg离心10分钟，去掉含有病毒的培养基上清，用新鲜培养基重悬细胞沉淀，将细胞转移至新的六孔板中，每2-3天更换新鲜培养基并加入100U/ml IL-2，继续培养14天左右后取部分细胞使用免疫荧光术检测检测T细胞表面CAR分子的表达。如图2中b所示，表达绿色荧光的细胞即为转染后稳定表达CAR基因的CAR-T细胞。
本实施例通过真菌精准激活的CAR-T细胞用于治疗肿瘤，具体的，与布拉迪酵母菌共同用于肿瘤的治疗。当然，CAR-T细胞中真菌表面抗原的单链抗体中的真菌为其他真菌，则布拉迪酵母菌相应地替换为其他相同的真菌。下面通过体外实验和体内实验说明CAR-T细胞对肿瘤的治疗。
一、布拉迪酵母菌对CAR-T 细胞扩增作用的体外验证：
将处于对数生长期的布拉迪酵母菌用生理盐水清晰后重悬为105/ml，按500μl/孔加入24孔板中，对已验证转染效率的CAR-T细胞进行计数，并用完全培养基（1640+10%FBS）重悬为106/ml，按500μl/孔加入已经接种布拉迪酵母菌的24孔板中。于37℃，5%CO2 培养箱孵育24h后对CAR-T细胞进行计数。转移24孔板内的淋巴细胞至流式管中，PBS洗涤，用50μl含1%BSA的PBS重悬，加入anti-humanCD69-APC 1μl，混匀，4℃孵育避光30min，并设阴性对照组、同型对照组。每个样本加1ml PBS离心洗涤，200μl PBS重悬。用流式细胞术检测CAR阳性的细胞占比和CAR-T细胞的增殖情况，结果分别如图2中d和e所示。从图2中d可以看出，与酵母菌共孵育后，CAR-T阳性率明显增高，从图2中e可以看出，与酵母菌共孵育后，CAR-T繁殖效率明显提高。
二、布拉迪酵母菌对CAR-T细胞扩增作用的体内验证：
通过AOM/DSS法构建结直肠癌模型小鼠，具体为，第一天腹腔注射偶氮甲烷AOM（10mg/kg），用常规饮用水喂食一周；用2.5%浓度DSS替换饮用水喂食一周；用常规饮用水喂食2周。
将107个CAR-T细胞经尾静脉回输至小鼠体内，每日灌喂108个布拉迪酵母菌。取小鼠眼眶血，检测小鼠外周血中CAR-T细胞的数目, 用流式细胞术检测CAR阳性的细胞占比和CAR-T细胞的表面活化因子CD69的表达情况。将CAR-T细胞注射入小动物体内的方式包括但不限于尾静脉注射。
回输CAR-T细胞21天后，比较实验组和对照组小鼠的结直肠癌负荷，取肿瘤组织研磨为单细胞悬液，用流式细胞术检测CAR阳性的细胞占比和肿瘤局部的免疫微环境，结果如图3所示。
从图3可以看出，口服S.boulardii酵母菌后，小鼠肿瘤内免疫抑制细胞MDSCs显著下降，CD8+T细胞显著上升。
目前CAR-T的扩增技术大多属于非CAR特异性，即在CAR-T细胞扩增的同时，普通T细胞也会扩增。本发明在CAR结构上游增加β-葡聚糖等真菌表面抗原单链抗体片段，通过真菌细胞壁的抗原为CAR-T细胞扩增提供特异性“CAR信号”。受到“CAR”信号刺激后，CAR-T细胞特异性扩增；而普通T细胞不识别“CAR信号”所以不会扩增，因而CAR-T细胞的数量和占比将大幅提升。
此外，目前能刺激CAR-T特异性扩增的产品是纳米人工抗原递呈细胞（aAPC），但该纳米材料的生物相容性欠佳，回输体内后可能会导致栓塞等严重副作用，至今仍未被批准用于人体。而本发明选用的布拉迪酵母菌等真菌是常用的益生真菌，可通过口服进入肠道，在肠道肿瘤局部刺激CAR-T特异性扩增，且不存在体内应用的障碍，有望大规模推广应用。
同时，实体瘤CAR-T的疗效欠佳的关键原因之一，是肿瘤局部抑制性的免疫微环境导致CAR-T细胞耗竭。布拉迪酵母菌的细胞壁中含有大量的甘露糖和β-葡聚糖，是天然的免疫激动剂，口服布拉迪酵母菌可下调肠道中的免疫抑制性细胞MDSCs，从而增强抗肿瘤免疫的疗效。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的试剂、材料和操作步骤均为相应领域内广泛使用的试剂、材料和常规步骤。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
SEQ ID NO:1
LQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTLSSYWLEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSTNYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREGWYFDVWGAGTTVTVSSAKTTPPSVYPLA
SEQ ID NO:2
DIVMTQSPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLYSNGNTHLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGFYYCVQGTHFPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVS
SEQ ID NO:3
SEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSAAA
SEQ ID NO:4
ARPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRT。
Claims (10)
1.一种通过真菌精准激活的CAR-T细胞，其特征在于：
包括两个抗原识别域；
第一个抗原识别域是真菌表面抗原的单链抗体，识别真菌，提供CAR-T细胞活化的专有信号；
第二个抗原识别域是肿瘤表面抗原的单链抗体，启动CAR-T细胞杀伤肿瘤细胞；
第一个抗原识别域与第二个抗原识别域之间信号串联，且第一个抗原识别域在上游。
2.根据权利要求1所述的通过真菌精准激活的CAR-T细胞，其特征在于：
其中，所述真菌表面抗原的单链抗体中的真菌表面抗原是真菌细胞壁成分或通过酵母菌展示技术外接的抗原。
3.根据权利要求2所述的通过真菌精准激活的CAR-T细胞，其特征在于：
其中，所述真菌表面抗原的单链抗体中的真菌表面抗原是β-葡聚糖或甘露糖。
4.根据权利要求1所述的通过真菌精准激活的CAR-T细胞，其特征在于：
其中，所述肿瘤表面抗原的单链抗体中的肿瘤表面抗原是HER2、EGFRⅧ、CEA或GUCY2C。
5.根据权利要求1所述的通过真菌精准激活的CAR-T细胞，其特征在于：
其中，所述CAR-T细胞的序列由β葡聚糖单链可变区、HER2单链可变区、CD8a铰链区、CD28跨膜区和胞内区、41BB胞内区以及CD3ζ胞内区串联构成。
6.根据权利要求5所述的通过真菌精准激活的CAR-T细胞，其特征在于：
其中，所述β葡聚糖单链可变区包含SEQ ID NO:1所示的VH1序列和SEQ ID NO:2所示的VL1序列；
所述HER2单链可变区包含SEQ ID NO:3所示的VH2序列和SEQ ID NO:4所示的VL2序列。
7.如权利要求1~6任意一项所述的通过真菌精准激活的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于：
包括以下步骤：
步骤一、设计CAR-T细胞质粒；
步骤二、通过步骤一的质粒进行包装慢病毒；
步骤三、分离原代T细胞；
步骤四、磁珠分选步骤三得到的原代T细胞；
步骤五、通过步骤二获得的病毒转染步骤四获得的T细胞，得到CAR-T细胞。
8.如权利要求1~6任意一项所述的通过真菌精准激活的CAR-T细胞在制备治疗肿瘤药物中的应用。
9.一种治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于：
包括如权利要求1~6任意一项所述的通过真菌精准激活的CAR-T细胞和真菌；
所述真菌与CAR-T细胞中真菌表面抗原的单链抗体中的真菌为同一种真菌。
10.如权利要求9所述的药物组合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117343908B (zh) | 2024-02-09 |
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