CN109479871A - 冻存液、其制备方法、应用及华通氏胶组织的冻存方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种冻存液、其制备方法、应用及华通氏胶组织的冻存方法。按体积比计算，所述冻存液由如下成分组成：DMEM/F 12培养基75～85％，二甲基亚砜10％，人血白蛋白5～10％，右旋糖酐1～2％以及表皮生长因子20‑40mg/ml。该冻存液具有对细胞损伤小，毒副作用低的特点，具有高度的可控性。应用该冻存液，可以在组织块冻存复苏后，保证培养的脐带间充质干细胞的活性，同时能够符合临床使用对于安全性的要求。

Description

冻存液、其制备方法、应用及华通氏胶组织的冻存方法

技术领域

本发明涉及细胞冻存技术领域，尤其涉及一种冻存液、其制备方法、应用及华通氏胶组织的冻存方法。

背景技术

脐带是胎儿时期连接胎儿与母体胎盘的索状或管状结构，由两条动脉和一条静脉构成。在脐带的动静脉之间包含有特殊的胚胎粘液样结缔组织—华通氏胶(WhartonpsJelly)。

华通氏胶是构成脐带的凝胶状物质。其是一种粘膜组织，含有黏多糖、成纤维细胞和巨噬细胞。华通氏胶内的部分细胞具有干细胞的特质，可以从脐带的华通氏胶中分离出脐带间充质干细胞，属于目前比较理想的干细胞来源。

目前，临床应用的干细胞种类繁多。在各种不同来源的干细胞中，来自脐带华通氏胶的脐带间充质干细胞具有免疫原性低，移植不会出现免疫排斥等副作用，采集过程简单的优点。

另外，脐带间充质干细胞还具有很强的增值和分化能力，极少出现病毒和微生物感染，对产妇和新生儿无损害。因此，脐带间充质干细胞是临床治疗应用中理想的干细胞。

为了确保日后使用的干细胞来源或者其他应用需要，通常会将相关的组织或者细胞进行低温冻存。现有的脐带组织块冷冻的方法主要包括如下步骤：对脐带组织进行消毒、清洗后，剪碎组织块。然后，将组织块和冻存液加入冻存管中，放入4℃冰箱中预冷30min，再在－80℃中过夜，最后移至液氮罐中冷冻备用。

在实现本发明的过程中，申请人发现现有技术中存在如下问题：现有的脐带组织冻存法虽然达到了冻存人脐带组织的目的，但人们选择单一的冷冻保护剂二甲基亚砜及所有培养基中含有动物血清成分，不仅未能提供丰富的营养物质，不利于长时间冷冻保存，而且动物血清属于异体血清，其存在很多不确定性因素，将给日后的临床试验或者疾病治疗带来严重威胁。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种冻存液、其制备方法、应用及华通氏胶组织的冻存方法，旨在解决现有技术中冻存液存在异体血清，临床应用安全性和可靠性较低的问题。

为了达到上述目的，本发明实施例第一方面提供一种冻存液。按体积比计算，所述冻存液由如下成分组成：

DMEM/F 12培养基 75～85％

二甲基亚砜 10％

人血白蛋白 5～10％

右旋糖酐 1～2％

表皮生长因子 20-40mg/ml。

可选地，按体积比计算，所述冻存液由如下成分组成：

DMEM/F 12培养基 80％

二甲基亚砜 10％

人血白蛋白 8％

右旋糖酐 2％

表皮生长因子 20-40mg/ml。

本发明实施例第二方面提供一种冻存液的制备方法。所述制备方法包括如下步骤：

按照体积比计算，将75～85％的DMEM/F 12培养基、10％的二甲基亚砜、5～10％的人血白蛋白、1～2％的右旋糖酐混合均匀，形成混合溶液；

向所述混合溶液中，按照20-40mg/ml的比例加入表皮生长因子；

将加入表皮生长因子以后的混合溶液置于2～6℃的低温环境中，冷冻预定的时间，获得所述冻存液。

可选地，所述预定的时间为1小时。

可选地，所述将加入表皮生长因子以后的混合溶液置于2～6℃的低温环境中，具体包括：将所述加入表皮生长因子以后的混合溶液置于2～6℃冰箱中预冷。

可选地，所述按照体积比计算，将75～85％的DMEM/F 12培养基、10％的二甲基亚砜、5～10％的人血白蛋白、1～2％的右旋糖酐混合均匀，形成混合溶液，具体包括：按照体积比计算，将80％的DMEM/F 12培养基、10％的二甲基亚砜、8％的人血白蛋白、2％的右旋糖酐混合均匀，形成混合溶液。

本发明实施例第三方面提供如上所述的冻存液在脐带华通氏胶组织低温冷冻保存中的应用。

本发明实施例第四方面提供一种华通氏胶组织的冻存方法。所述冻存方法包括如下步骤：

预处理脐带样本；

从脐带样本中剥离华通氏胶并剪碎为碎块；

将所述碎块使用如上所述的冻存液重悬，分装至若干支冻存管中；

将所述冻存管放置在4℃环境下预冷；

经过程序降温处理后，将冻存管移入液氮罐中低温保存。

可选地，所述将所述冻存管放置在4℃环境下预冷，具体包括：将所述冻存管放置在4℃冰箱中，预冷30分钟。

可选地，所述预处理脐带样本，具体包括：

将采集的脐带样本放置在二级生物安全柜中，使用生理盐水清洗；

将清洗后的脐带样本放入医用酒精中浸泡1分钟；

剪去所述脐带样本的结扎两端；

使用生理盐水冲洗所述脐带样本表面和血管内的血液和凝块。

本发明实施例提供的冻存液，既不是单一冷冻保护剂的冷冻保存液，也不是高浓度冷冻保护液的玻璃化冻存液。该冻存液具有对细胞损伤小，毒副作用低的特点，具有高度的可控性。在组织块冻存复苏后，可以保证培养的脐带间充质干细胞的活性，同时能够符合临床使用对于安全性的要求，具有良好的应用前景。

附图说明

一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定，附图中具有相同参考数字标号的元件表示为类似的元件，除非有特别申明，附图中的图不构成比例限制

图1为本发明具体实施例的冻存液的制备方法的方法流程图；

图2为本发明具体实施例的华通氏胶组织的冻存方法的方法流程图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例中揭露的数值及其数值范围是近似值，而并非确定值。在误差或者实验条件允许的情况下，可以包括在误差范围内的所有值。本发明实施例中提供的数值范围用于表示在混合物中的组分的相对量以及其他方法实施例中列举的温度或者其他参数的范围。

本发明实施例中表述的术语“冻存”是指通过程序性降温的方式(通常为液氮)，在超低温环境中保存细胞或者组织，确保细胞或者组织在保存过程中的生物活性或者繁殖能力不丧失。

在冻存过程中，需要在冻存管中加入相应的冻存液以确保细胞或者组织在冻存过程中不受到损伤，在复苏后可以重新进行传代培养并保持生物特性不改变。

如何配置合适的冻存液配方，用以保持相关的组织或者细胞是干细胞在组织工程学及再生医学中广泛应用的基础和前提。为了干细胞或者华通氏胶组织的低温冻存需求，在本实施例中，可以应用本发明提供的冻存液，确保冻存过程中华通氏胶可组织的活性或者繁殖潜力不会丧失，并具有足够的安全性以确保满足临床应用的要求。

图1为本发明实施例提供的冻存液的制备方法。如图1所示，所述制备方法包括如下步骤：

110、按照体积比计算，将75～85％的DMEM/F 12培养基、10％的二甲基亚砜、5～10％的人血白蛋白、1～2％的右旋糖酐混合均匀，形成混合溶液。

在本实施例中，DMEM/F 12培养基是由DMEM培养基和F12培养基通过1比1的比例混合形成的培养基，其利用了F12含有较丰富的成分和DMEM含有较高浓度的营养成分的优点，可以作为培养基基础，支持各类型细胞的增值。

在较佳实施例中，上述成分的体积比具体选用：80％的DMEM/F 12培养基、10％的二甲基亚砜、8％的人血白蛋白以及2％的右旋糖酐。

120、向所述混合溶液中，按照20-40mg/ml的比例加入表皮生长因子。

表皮生长因子是一种小肽，由53个氨基酸残基组成，是类EGF大家族的其中一个成员。其在体内和体外都能够对多种组织细胞有强烈的促分裂作用。

130、将加入表皮生长因子以后的混合溶液置于2～6℃的低温环境中，冷冻预定的时间，获得所述冻存液。

具体的，所述2～6℃的低温环境具体可以是由常规的冰箱所提供的，可以通过将混合溶液放置在冰箱中来完成预冷的过程。在本实施例中，所述预冷的时间具体可以是1小时。

上述制备方法制备的冻存液可以用作脐带组织(华通氏胶组织)的长期冻存中，作为保护液使用，应用保持脐带组织的活性，实现良好的冻存效果。

以下结合具体实例，详细描述应用上述任一方法实施例公开的冻存液，对脐带的华通氏胶组织的低温冻存方法。图2为本发明实施例提供的华通氏胶组织的低温冻存方法的方法流程图。

如图2所示，所述方法可以包括如下步骤：

210、预处理脐带样本。所述脐带样本具体可以来自于家属或者本人同意后，从足月健康产妇处取得的新生儿脐带。在一些实施例中，可以应用该新生儿脐带为对应的新生儿建立脐带间充质干细胞的个人细胞库，以便于在未来的临床应用或者治疗中发挥相应的作用。

220、从脐带样本中剥离华通氏胶并剪碎为碎块。

剥离的方法具体可以基于外科器械，根据华通氏胶的解剖学位置进行。在本实施例中，可以将脐带剪成3cm或者其他合适的长度，然后沿脐带纵轴切开后，使用手术钳等钝性分离血管周围组织，暴露动脉和静脉。在暴露动脉和静脉以后，使用带齿镊将脐动、静脉剔除以剥离所述华通氏胶。

在剥离获得所述华通氏胶以后，为了便于分装保存，可以将华通氏胶使用剪刀等剪切为若干小块(如尺寸为1mm³的小块)。

230、将所述碎块使用如上方法实施例提供的冻存液重悬，分装至若干支冻存管中。所述冻存液可以采用上述方法实施例提供的配方配置而成。

240、将所述冻存管放置在4℃环境下预冷。在重悬以后，需要首先将冻存管降低到4℃的温度，然后再进行程序降温。在本实施例中，所述预冷时间可以设置为30分钟。当然，也可以根据实际需要设置为更多或者更少的时间。

250、经过程序降温处理后，将冻存管移入液氮罐中低温保存。

所述液氮罐用于提供低温冻存的超低温环境。在一些实施例中，也可以使用其他合适的超低温设备来冻存所述冻存管，从而长期保存所述人脐带华通氏胶组织。

为了进一步的验证本发明实施例提供的冻存液和冻存方法对于华通氏胶组织的冻存效果，以下提供相应的复苏、传代培养以及鉴定的具体结果来说明。

在本实施例中，所述复苏和传代培养的方法包括如下步骤：

1)、从液氮罐中取出冻存6个月以上的，保存有华通氏胶组织的冻存管并放入37℃水浴锅中解冻。

2)、离心弃上清，并且用培养基重悬沉淀组织块。重悬混匀后，将组织块均匀铺平，接种至细胞培养瓶(规格为75cm²)中。该细胞培养瓶置于37℃、5％二氧化碳、饱和湿度的培养箱中静置培养。

3)、一周后更换培养基，当至细胞融合度达70～80％时，将培养基倒出进行消化。所述消化过程为：向细胞培养瓶中加入20ml生理盐水洗涤2～3次，每瓶加入3ml胰蛋白酶消化液，静置消化3min，加入生理盐水终止消化。

4)、收集细胞悬液，将所得悬液过滤后，转入50ml离心管中，离心弃上清，得到原代的脐带间充质干细胞(记为P0)。

5)、将P0代细胞按5000/cm2的密度，接种在细胞培养瓶中(规格为75cm²)，该细胞培养瓶置于37℃、5％二氧化碳、饱和湿度的培养箱中，静置培养。

6)、当细胞融合度达70～80％(培养2～3天)时，倾出培养基，向培养瓶中加入20ml生理盐水洗涤2～3次，每瓶加入3ml胰蛋白酶消化液，静置消化3分钟后，加入生理盐水终止消化。

7)、收集细胞悬液并转入50ml离心管中。放入离心机中离心，弃上清后得到P1代脐带间充质干细胞。

在获得所述P1代脐带间充质干细胞以后，可以以来自未经冻存的组织块的P1代脐带间充质干细胞作为对照组，所述P1代脐带间充质干细胞作为实验组，通过流式细胞检测分析，检测两者之间的标记物差异。

所述检测结果如下表格所示：

实验组：

对照组：

根据上述流式细胞学检测结构显示：试验组和对照组的标记物表达水平相同。亦即两者均能够高表达细胞阳性标记物CD73、CD90、CD105，均不表达阴性标记物CD34、HLA-DR。

该鉴定结果说明：应用本发明实施例提供的冻存液及冻存方法冻存后的组织能保持它原有的活性。经过冻存后组织培养获得的脐带间充质干细胞与新鲜的，未经过冻存的组织培养获得的脐带间充质干细胞之间并无差异。

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种冻存液，其特征在于，按体积比计算，所述冻存液由如下成分组成：

DMEM/F 12培养基75～85％

二甲基亚砜10％

人血白蛋白 5～10％

右旋糖酐1～2％

表皮生长因子20-40mg/ml。

2.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，按体积比计算，所述冻存液由如下成分组成：

DMEM/F 12培养基80％

二甲基亚砜10％

人血白蛋白 8％

右旋糖酐2％

表皮生长因子20-40mg/ml。

3.一种冻存液的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

按照体积比计算，将75～85％的DMEM/F 12培养基、10％的二甲基亚砜、5～10％的人血白蛋白、1～2％的右旋糖酐混合均匀，形成混合溶液；

向所述混合溶液中，按照20-40mg/ml的比例加入表皮生长因子；

将加入表皮生长因子以后的混合溶液置于2～6℃的低温环境中，冷冻预定的时间，获得所述冻存液。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述预定的时间为1小时。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述将加入表皮生长因子以后的混合溶液置于2～6℃的低温环境中，具体包括：

将所述加入表皮生长因子以后的混合溶液置于2～6℃冰箱中预冷。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述按照体积比计算，将75～85％的DMEM/F 12培养基、10％的二甲基亚砜、5～10％的人血白蛋白、1～2％的右旋糖酐混合均匀，形成混合溶液，具体包括：

按照体积比计算，将80％的DMEM/F 12培养基、10％的二甲基亚砜、8％的人血白蛋白、2％的右旋糖酐混合均匀，形成混合溶液。

7.权利要求1或2所述的冻存液在脐带华通氏胶组织低温冷冻保存中的应用。

8.一种华通氏胶组织的冻存方法，其特征在于，所述方法包括：

预处理脐带样本；

从脐带样本中剥离华通氏胶并剪碎为碎块；

将所述碎块使用如权利要求1或2所述的冻存液重悬，分装至若干支冻存管中；

将所述冻存管放置在4℃环境下预冷；

经过程序降温处理后，将冻存管移入液氮罐中低温保存。

9.根据权利要求8所述的冻存方法，其特征在于，所述将所述冻存管放置在4℃环境下预冷，具体包括：

将所述冻存管放置在4℃冰箱中，预冷30分钟。

10.根据权利要求8所述的冻存方法，其特征在于，所述预处理脐带样本，具体包括：

将采集的脐带样本放置在二级生物安全柜中，使用生理盐水清洗；

将清洗后的脐带样本放入医用酒精中浸泡1分钟；

剪去所述脐带样本的结扎两端；

使用生理盐水冲洗所述脐带样本表面和血管内的血液和凝块。