CN106489913A - 一种细胞冻存液 - Google Patents

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姚玲玲
杨敏
孟得龙
杨苗
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents

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Abstract

本发明公开了一种细胞冻存液，以质量百分比计，各组成成分及用量分别为：人血白蛋白5‑9％、二甲基亚砜8‑9％、右旋糖酐40 1‑3％、基础培养基82‑84％。本发明的有益之处在于：(1)冻存液中含有二甲基亚砜和右旋糖酐40，其中，前者是有效的渗透保护剂，后者可以平衡细胞渗透压，降低细胞冰点，有效减少结晶对细胞的伤害；(2)冻存液中含有人血白蛋白，可大大提高冻存细胞的复苏率；(3)冻存液中不含非人源的血清和蛋白质，避免了细胞污染和过敏的风险，提高了临床安全性，可在临床上安全使用；(4)适用范围广，可用于外周血单核细胞、脐带血干细胞、骨髓血干细胞、脂肪干细胞等多种人源细胞的冻存；(5)可现配现用，也可低温或室温保存三个月。

Description

一种细胞冻存液
技术领域
本发明涉及一种细胞冻存液，属于生物技术领域。
背景技术
细胞冻存液是细胞冻存过程中的核心试剂，关系到细胞储存质量和复苏后细胞数量及活性问题。
细胞冻存对细胞的危害来源于：降温过程中，电解质的变化和细胞内外的结晶。
现有的细胞冻存液，大都是异种血清、二甲基亚砜和基础培养基的混合液。因异种血清成分复杂，引入的外源蛋白会增加细胞污染和过敏的风险，不适用于临床。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种细胞冻存液，其不仅能够有效减少细胞冻存对细胞的危害，而且可在临床上安全使用。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种细胞冻存液，其特征在于，以质量百分比计，各组成成分及用量分别为：
本发明的有益之处在于：
(1)冻存液中含有二甲基亚砜和右旋糖酐40，其中，前者是有效的渗透保护剂，后者可以平衡细胞渗透压，降低细胞冰点，有效减少结晶对细胞的伤害；
(2)冻存液中含有人血白蛋白，可大大提高冻存细胞的复苏率；
(3)冻存液中不含非人源的血清和蛋白质，避免了细胞污染和过敏的风险，提高了临床安全性，可在临床上安全使用；
(4)适用范围广，可用于外周血单核细胞、脐带血干细胞、骨髓血干细胞、脂肪干细胞等多种人源细胞的冻存；
(5)冻存浓度范围比较广，可以冻存0.5-2.5×107/ml浓度比的细胞；
(6)可现配现用，也可低温或室温保存三个月。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。
一、准备各相关试剂
表1各组的组成成分及用量
现有的细胞冻存液，大都是异种血清、二甲基亚砜和基础培养基的混合液。因异种血清成分复杂，引入的外源蛋白会增加细胞污染和过敏的风险，所以不适用于临床。
而在本发明的冻存液中，我们未使用非人源的血清和蛋白质，所以避免了细胞污染和过敏的风险，提高了临床安全性，可在临床上安全使用。
本发明的冻存液中含有二甲基亚砜和右旋糖酐40，其中，前者是有效的渗透保护剂，后者可以平衡细胞渗透压，降低细胞冰点，有效减少结晶对细胞的伤害。
此外，本发明的冻存液中还含有人血白蛋白，可大大提高冻存细胞的复苏率。
二、制备方法
准备基础培养基(DMEM培养基，购自美国Life公司)、人血白蛋白(购自武汉禾元生物)、二甲基亚砜(购自sigma)、右旋糖酐40(购自四川科伦药业)。
在百级无菌操作台内进行相关试剂的配制。
三、使用方法
细胞计数后，直接使用本发明的冻存液进行细胞重悬，密度为0.5-2.5×107/ml。
四、冻存效果
选用骨髓干细胞进行试验。收集足量的骨髓干细胞，用前述不同组分组合配制的冻存液(现配)进行细胞重悬，将符合密度要求(1.5×107/ml)的细胞装入冻存管。使用程序梯度降温仪给冻存管进行降温，之后转入-196℃液氮环境。
冻存一段时间后，进行细胞复苏，观察各组细胞的复苏情况。
1、观察骨髓干细胞的特性
冻存一周，然后复苏，观察骨髓干细胞的特性。
观察结果显示：
(1)骨髓干细胞保持了很高的增殖活力。
(2)骨髓干细胞形态稳定，没有发生重大变化。
2、测定骨髓干细胞的安全冻存时间
冻存一周、一个月、两年，然后复苏，计算各组细胞的复苏率。
计算结果见表2。
表2各组细胞的复苏率
一周后细胞复苏率 一个月后细胞复苏率 两年后细胞复苏率
第1组 69％ 60％ 41％
第2组 70％ 60％ 42％
第3组 67％ 59％ 40％
第4组 82％ 79％ 75％
第5组 84％ 80％ 77％
第6组 80％ 77％ 75％
第7组 90％ 88％ 86％
第8组 92％ 90％ 87％
第9组 89％ 87％ 85％
由表2可知：
(1)冻存一周，第8组冻存液的冻存效果最好，细胞复苏率高达92％，而第3组冻存液的细胞复苏率仅为67％；
(2)冻存一个月，第8组冻存液的冻存效果最好，细胞复苏率高达90％，而第3组冻存液的细胞复苏率仅为59％；
(3)冻存两年，第8组冻存液的冻存效果最好，细胞复苏率高达87％，而第1组冻存液的细胞复苏率仅为40％。
以上试验结果说明：
(1)本发明的细胞冻存液，通过添加二甲基亚砜和右旋糖酐40，可以平衡细胞渗透压，降低细胞冰点，有效减少结晶对细胞的伤害，从而可以长期安全保存细胞，冻存两年细胞复苏率仍高达87％；
(2)发明的细胞冻存液，通过添加人血白蛋白，大大提高了冻存细胞的复苏率，冻存一周细胞复苏率高达92％，冻存一个月细胞复苏率高达90％。
此外，经试验，将本发明的细胞冻存液分别在室温和低温(4℃)条件下保存三个月后再用来冻存细胞，其仍可以获得与现配冻存液相近的使用效果。
五、适用的细胞类型
选用外周血单核细胞、脐带血干细胞、骨髓血干细胞、脂肪干细胞共计4种人源细胞进行试验。
选用冻存效果最好的第8组冻存液(现配)。
采用与第四步相同的试验方法进行试验。
试验结果见表3。
表3针对不同类型的细胞冻存液的冻存效果
细胞名称 一周后细胞复苏率 一个月后细胞复苏率
外周血单核细胞 93％ 91％
脐带血干细胞 91％ 90％
骨髓血干细胞 92％ 90％
脂肪干细胞 92％ 91％
由表3可知：对于不同类型的细胞，使用本发明的细胞冻存液冻存一周，细胞复苏率最小的也能达到91％；冻存一个月，细胞复苏率最小的也能达到90％。
以上试验结果说明：本发明的细胞冻存液适用的细胞类型不限。
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (1)

1.一种细胞冻存液，其特征在于，以质量百分比计，各组成成分及用量分别为：
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