CN107094754A - 一种人类活性免疫细胞冻存液及其冻存方法 - Google Patents

一种人类活性免疫细胞冻存液及其冻存方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物冻存技术领域，具体涉及一种人类活性免疫细胞冻存液及其冻存方法，包含二甲基亚砜、乙酰胺、右旋糖酐、无血清细胞培养基，其中，所述的无血清细胞培养基为SAF‑CHO‑G‑001细胞培养基。本发明冻存液中不含血清，能够最大限度的降低二甲基亚砜的毒性，同时对冻存方法进行优化，共同提高细胞的存活率和活性。

Description

一种人类活性免疫细胞冻存液及其冻存方法
技术领域
本发明属于生物冻存技术领域，具体涉及一种人类活性免疫细胞冻存液及其冻存方法。
背景技术
人类活性免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。人类活性免疫细胞可以分为多种，在人体中各种免疫细胞担任着重要的角色。人类活性免疫细胞包括吞噬细胞和淋巴细胞，淋巴细胞中的T细胞、B细胞是发挥特异性免疫的主要细胞群。从血液中分离出来的单个核细胞包括：T细胞、B细胞、NK细胞和DC细胞等，是免疫细胞治疗中的初始细胞来源，经各类细胞因子诱导扩增培养，得到一群具有高效杀伤活性的免疫细胞群。
目前人类活性免疫细胞的培养主要应用于肿瘤细胞免疫治疗。肿瘤细胞免疫治疗是采集人体自身活性免疫细胞，经过体外培养，使其数量成千倍增多，靶向性杀伤功能增强，然后再回输到人体来杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变的细胞，打破免疫耐受，激活和增强机体的免疫能力，兼顾治疗和保健的双重功效。肿瘤自体细胞免疫疗法适用于多种实体肿瘤，包括恶性黑色素瘤、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、宫颈癌、肺癌、喉癌、鼻咽癌、胰腺癌、肝癌、胃癌等实体瘤手术后防止复发，也可以用于多发性骨髓瘤、B淋巴瘤和白血病等血液系统恶性肿瘤的复发，对于大多数细胞免疫治疗的适应人群还可以用于上述肿瘤的进一步巩固治疗，达到延长生存期、提高生活质量和抑制肿瘤恶化的目的。
常见的人类活性免疫细胞治疗种类包括NK细胞、CIK细胞、DC-CIK细胞、TIL细胞、LAK细胞、CART细胞等。所有这些经诱导和扩增培养的免疫细胞，他的初始细胞来源都是外周血或脐血的单个核细胞，而且是直接分离培养。随着年龄的增长，人类活性免疫细胞在体内的活性也会随之降低，所以在年轻时期冻存具有较高活性的免疫细胞，对于未来罹患肿瘤相关疾病的治疗可以起到很好的保障。因此人类活性免疫细胞冻存及冻存后的复苏培养具有非常大的意义。
目前，细胞冻存主要是采取-196℃超低温条件下的保存方案，在超低温条件下，细胞的代谢功能停滞，但并未死亡。而细胞复苏则主要采用冻存细胞在37℃快速解冻的方法，以恢复细胞的活性和功能。影响免疫细胞冻存和复苏活性的主要因素包括冷冻及复苏的方式和冷冻剂的选择。造成细胞损伤的两种因素一种是细胞内冰晶形成和重结晶，一般是由不适当的降温程序导致；另一种是溶质损伤，一般是由于冷冻使得电解质和溶质浓度升高所致，冷冻保护剂可以避免冷冻时细胞内冰晶的形成，保护细胞膜和细胞器免受损伤。现有的免疫细胞冻存液存在以下技术问题：(1)现有的冻存液所使用的培养基主要有天然培养基和基础培养基两种。天然培养基主要以动物血清(小牛血清、马血清等)为主，基础培养基在人工合成时还需添加一定量的血清使细胞生长和繁殖，但是只要加入血清，就会引入了外源蛋白，同时增加了动物病原污染的可能性，会对人体过继免疫治疗产生一定影响。(2)冻存液中的渗透性冷冻保护剂主要有二甲基亚砜、甘油、乙二醇和丙二醇，其中，以二甲基亚砜效果最好，但是二甲基亚砜对细胞的毒性作用较大，影响细胞的活性，对细胞复苏后的洗脱要求很高。(3)冻存管在冷冻过程中，降温程序单一，通常是在冰箱中冷冻至-80℃后转移至液氮罐中，此过程中降温速率一致，缺乏对细胞悬液中相变过程中的计算考虑，容易出现冰晶损伤和溶液损伤。以上三个技术问题，严重影响了细胞复苏后的活性和存活率。
发明内容
根据以上现有技术的不足，本发明提供一种人类活性免疫细胞冻存液及其冻存方法，该冻存液中不含血清，能够最大限度的降低二甲基亚砜的毒性，同时对冻存方法进行优化，共同提高细胞的存活率和活性。
本发明所述的一种一种人类活性免疫细胞冻存液，其特征在于：包含二甲基亚砜、乙酰胺、右旋糖酐、无血清细胞培养基，其中，所述的无血清细胞培养基为SAF-CHO-G-001细胞培养基。
其中，优选方案如下：
本发明冻存液的配方可以按体积百分比计算，包含5～10％二甲基亚砜、5～10％乙酰胺、5～10％右旋糖酐、70～85％无血清细胞培养基。
优选按体积百分比计算，包含8％二甲基亚砜、8％乙酰胺、8％右旋糖酐、76％无血清细胞培养基。
也可以优选按体积百分比计算，包含10％二甲基亚砜、5％乙酰胺、10％右旋糖酐、75％无血清细胞培养基。
本发明所述的人类活性免疫细胞的冻存方法，其特征在于按照以下步骤进行：
(1)将二甲基亚砜、乙酰胺、右旋糖酐、无血清细胞培养基按比例混匀制得冻存液；
(2)将冻存液放入程序降温仪中降温至4℃并维持；
(3)取培养好的人体活性免疫细胞，转移至离心管中，1800～2000rpm条件下离心5～8分钟，弃上清，沿离心管壁缓慢滴加步骤(2)中的冻存液，滴加程序为：前3min以0.3ml/min速度滴加，后5min以0.6ml/min速度滴加，余下的冻存液以0.75ml/min速度滴加，最终细胞密度为1×105个/mL～1.5×105个/mL，轻轻吹吸混匀并分装于冻存管中；
(4)将该冻存管转移至程序降温仪中，按照温度下降速度为0.1～0.3℃/min的速率将冻存管冷冻至-10℃，并维持2～4小时，然后按照温度下降速度为0.6～1.5℃/min的速率将冻存管冷冻至-40℃，并维持2～4小时，再按照温度下降速度为5～8℃/min的速率将冻存管冷冻至-80℃，并维持2～4小时，最后浸入液氮中长期保存。
其中，步骤(4)中的降温程序优选为：按照温度下降速度为0.1℃/min的速率将冻存管冷冻至-10℃，并维持2小时，然后按照温度下降速度为0.8℃/min的速率将冻存管冷冻至-40℃，并维持2小时，再按照温度下降速度为8℃/min的速率将冻存管冷冻至-80℃，并维持2小时，最后浸入液氮中长期保存。
本发明所具有的优点为：
(1)采用无血清细胞培养基，未知组分少，减少对细胞活性的干扰；培养基中不存在血清中的抗体、补体等成分，对培养细胞影响小；杂蛋白含量少，生产的产品后期处理较容易。
(2)冻存液配方中加入了乙酰胺，作为二甲基亚砜的毒性中和剂，乙酰胺可大大降低其生物化学毒性，减小对细胞活性的影响，同时降低细胞复苏后的洗脱要求。
(3)冻存液配方中加入了右旋糖苷作为细胞外的非渗透性保护物质，在冷冻过程中可减少细胞内冰晶的形成，复苏时还可以减轻由于渗透压的改变而引起的细胞肿胀。右旋糖苷与二甲基亚砜的联合使用能发挥叠加或协调低温保护作用。
(4)经申请人研究发现，二甲基亚砜在常温下对人体活性免疫细胞的毒性作用较大，而在4℃时，其毒性作用大大减弱，且仍能以较快的速度渗透到细胞内。所以，将冻存液预冷到4℃然后滴加到细胞悬液中，到达细胞内外二甲基亚砜平衡。
(5)经申请人研究发现，人体活性免疫细胞在0～-5℃液体样本转变为固体发生相变时会产生热量，引起样本的回温，造成样本额外伤害。申请人在冷冻至-10℃时只以0.1～0.3℃/min(该速率明显慢于目前行业内的慢冻速率)的速率进行，通过慢冻来减少冰晶损伤和溶液损伤，然后在冷冻至-40℃和-80℃时，逐步提高降温速率，最后转移至液氮罐中。通过对降温程序的优化，提高细胞复苏后的活性和存活率。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：
一种人类活性免疫细胞冻存液，按体积百分比计算，包含8％二甲基亚砜、8％乙酰胺、8％右旋糖酐、76％SAF-CHO-G-001细胞培养基。
冻存时按照以下步骤进行：
(1)将二甲基亚砜、乙酰胺、右旋糖酐、SAF-CHO-G-001细胞培养基按比例混匀制得冻存液；
(2)将冻存液放入程序降温仪中降温至4℃并维持；
(3)取培养好的CD4+淋巴细胞，转移至离心管中，1800rpm条件下离心5～8分钟，弃上清，沿离心管壁缓慢滴加步骤(2)中的冻存液，滴加程序为：前3min以0.3ml/min速度滴加，后5min以0.6ml/min速度滴加，余下的冻存液以0.75ml/min速度滴加，最终细胞密度为1×105个/mL～1.5×105个/mL，轻轻吹吸混匀并分装于冻存管中；
(4)将该冻存管转移至程序降温仪中，按照温度下降速度为0.1℃/min的速率将冻存管冷冻至-10℃，并维持2小时，然后按照温度下降速度为0.8℃/min的速率将冻存管冷冻至-40℃，并维持2小时，再按照温度下降速度为8℃/min的速率将冻存管冷冻至-80℃，并维持2小时，最后浸入液氮中长期保存。
(5)15d后，从液氮中取出冻存管，按照常规方法，置37℃水浴2min左右速溶，用台盼蓝法检测复苏细胞活性，计算复苏细胞存活率。结果见表1。
实施例2：
一种人类活性免疫细胞冻存液，按体积百分比计算，包含10％二甲基亚砜、5％乙酰胺、10％右旋糖酐、75％SAF-CHO-G-001细胞培养基。
冻存时按照以下步骤进行：
(1)将二甲基亚砜、乙酰胺、右旋糖酐、SAF-CHO-G-001细胞培养基按比例混匀制得冻存液；
(2)将冻存液放入程序降温仪中降温至4℃并维持；
(3)取培养好的CD4+淋巴细胞，转移至离心管中，1800rpm条件下离心5～8分钟，弃上清，沿离心管壁缓慢滴加步骤(2)中的冻存液，滴加程序为：前3min以0.3ml/min速度滴加，后5min以0.6ml/min速度滴加，余下的冻存液以0.75ml/min速度滴加，最终细胞密度为1×105个/mL～1.5×105个/mL，轻轻吹吸混匀并分装于冻存管中；
(4)将该冻存管转移至程序降温仪中，按照温度下降速度为0.2℃/min的速率将冻存管冷冻至-10℃，并维持3小时，然后按照温度下降速度为0.8℃/min的速率将冻存管冷冻至-40℃，并维持3小时，再按照温度下降速度为5℃/min的速率将冻存管冷冻至-80℃，并维持2小时，最后浸入液氮中长期保存。
(5)15d后，从液氮中取出冻存管，按照常规方法，置37℃水浴2min左右速溶，用台盼蓝法检测复苏细胞活性，计算复苏细胞存活率。结果见表1。
实施例3：
一种人类活性免疫细胞冻存液，按体积百分比计算，包含5％二甲基亚砜、5％乙酰胺、5％右旋糖酐、85％SAF-CHO-G-001细胞培养基。
冻存时按照以下步骤进行：
(1)将二甲基亚砜、乙酰胺、右旋糖酐、SAF-CHO-G-001细胞培养基按比例混匀制得冻存液；
(2)将冻存液放入程序降温仪中降温至4℃并维持；
(3)取培养好的CD4+淋巴细胞，转移至离心管中，1800rpm条件下离心5～8分钟，弃上清，沿离心管壁缓慢滴加步骤(2)中的冻存液，滴加程序为：前3min以0.3ml/min速度滴加，后5min以0.6ml/min速度滴加，余下的冻存液以0.75ml/min速度滴加，最终细胞密度为1×105个/mL～1.5×105个/mL，轻轻吹吸混匀并分装于冻存管中；
(4)将该冻存管转移至程序降温仪中，按照温度下降速度为0.3℃/min的速率将冻存管冷冻至-10℃，并维持4小时，然后按照温度下降速度为1.5℃/min的速率将冻存管冷冻至-40℃，并维持4小时，再按照温度下降速度为8℃/min的速率将冻存管冷冻至-80℃，并维持4小时，最后浸入液氮中长期保存。
(5)15d后，从液氮中取出冻存管，按照常规方法，置37℃水浴2min左右速溶，用台盼蓝法检测复苏细胞活性，计算复苏细胞存活率。结果见表1。
对比例1：
一种人类活性免疫细胞冻存液，按体积百分比计算，包含8％二甲基亚砜、8％乙酰胺、8％右旋糖酐、76％SAF-CHO-G-001细胞培养基。
冻存时按照以下步骤进行：
(1)将二甲基亚砜、乙酰胺、右旋糖酐、SAF-CHO-G-001细胞培养基按比例混匀制得冻存液；
(2)取培养好的CD4+淋巴细胞，转移至离心管中，1800rpm条件下离心5～8分钟，弃上清，沿离心管壁缓慢滴加步骤(1)中的冻存液，滴加程序为：前3min以0.3ml/min速度滴加，后5min以0.6ml/min速度滴加，余下的冻存液以0.75ml/min速度滴加，最终细胞密度为1×105个/mL～1.5×105个/mL，轻轻吹吸混匀并分装于冻存管中；
(4)将该冻存管转移至冰箱中降温至至-80℃，并维持24小时，然后浸入液氮中长期保存。
(5)15d后，从液氮中取出冻存管，按照常规方法，置37℃水浴2min左右速溶，用台盼蓝法检测复苏细胞活性，计算复苏细胞存活率。结果见表1。
对比例2：
一种人类活性免疫细胞冻存液，按体积百分比计算，包含10％二甲基亚砜、90％RPMI-1640细胞培养基。
冻存时按照以下步骤进行：
(1)将二甲基亚砜、RPMI-1640细胞培养基按比例混匀制得冻存液；
(2)将冻存液放入程序降温仪中降温至4℃并维持；
(3)取培养好的CD4+淋巴细胞，转移至离心管中，1800rpm条件下离心5～8分钟，弃上清，沿离心管壁缓慢滴加步骤(2)中的冻存液，滴加程序为：前3min以0.3ml/min速度滴加，后5min以0.6ml/min速度滴加，余下的冻存液以0.75ml/min速度滴加，最终细胞密度为1×105个/mL～1.5×105个/mL，轻轻吹吸混匀并分装于冻存管中；
(4)将该冻存管转移至程序降温仪中，按照温度下降速度为0.1℃/min的速率将冻存管冷冻至-10℃，并维持2小时，然后按照温度下降速度为0.8℃/min的速率将冻存管冷冻至-40℃，并维持2小时，再按照温度下降速度为8℃/min的速率将冻存管冷冻至-80℃，并维持2小时，最后浸入液氮中长期保存。
(5)15d后，从液氮中取出冻存管，按照常规方法，置37℃水浴2min左右速溶，用台盼蓝法检测复苏细胞活性，计算复苏细胞存活率。结果见表1。
对比例3：
一种人类活性免疫细胞冻存液，按体积百分比计算，包含10％二甲基亚砜、90％RPMI-1640细胞培养基。
冻存时按照以下步骤进行：
(1)将二甲基亚砜和RPMI-1640细胞培养基按比例混匀制得冻存液；
(2)取培养好的CD4+淋巴细胞，转移至离心管中，1800rpm条件下离心5～8分钟，弃上清，沿离心管壁缓慢滴加步骤(1)中的冻存液，滴加程序为：前3min以0.3ml/min速度滴加，后5min以0.6ml/min速度滴加，余下的冻存液以0.75ml/min速度滴加，最终细胞密度为1×105个/mL～1.5×105个/mL，轻轻吹吸混匀并分装于冻存管中；
(4)将该冻存管转移至冰箱中降温至至-80℃，并维持24小时，然后浸入液氮中长期保存。
(5)15d后，从液氮中取出冻存管，按照常规方法，置37℃水浴2min左右速溶，用台盼蓝法检测复苏细胞活性，计算复苏细胞存活率。结果见表1。
表1：实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2和对比例3经15d后复苏细胞存活率统计。
实施例1 实施例2 实施例3 对比例1 对比例2 对比例3
存活率 97.6％ 89.9％ 92.1％ 80.5％ 79.6％ 69.2％
以上结果表明，本发明的冻存液和冻存方法可以有效提高人体活性免疫细胞冻存后复苏细胞的存活率。

Claims (6)

1.一种人类活性免疫细胞冻存液，其特征在于：包含二甲基亚砜、乙酰胺、右旋糖酐、无血清细胞培养基，其中，所述的无血清细胞培养基为SAF-CHO-G-001细胞培养基。
2.根据权利要求1所述的一种人类活性免疫细胞冻存液，其特征在于：按体积百分比计算，包含5～10％二甲基亚砜、5～10％乙酰胺、5～10％右旋糖酐、70～85％无血清细胞培养基。
3.根据权利要求2所述的一种人类活性免疫细胞冻存液，其特征在于：按体积百分比计算，包含8％二甲基亚砜、8％乙酰胺、8％右旋糖酐、76％无血清细胞培养基。
4.根据权利要求2所述的一种人类活性免疫细胞冻存液，其特征在于：按体积百分比计算，包含10％二甲基亚砜、5％乙酰胺、10％右旋糖酐、75％无血清细胞培养基。
5.一种权利要求1所述的人类活性免疫细胞的冻存方法，其特征在于按照以下步骤进行：
(1)将二甲基亚砜、乙酰胺、右旋糖酐、无血清细胞培养基按比例混匀制得冻存液；
(2)将冻存液放入程序降温仪中降温至4℃并维持；
(3)取培养好的人体活性免疫细胞，转移至离心管中，1800～2000rpm条件下离心5～8分钟，弃上清，沿离心管壁缓慢滴加步骤(2)中的冻存液，滴加程序为：前3min以0.3ml/min速度滴加，后5min以0.6ml/min速度滴加，余下的冻存液以0.75ml/min速度滴加，最终细胞密度为1×105个/mL～1.5×105个/mL，轻轻吹吸混匀并分装于冻存管中；
(4)将该冻存管转移至程序降温仪中，按照温度下降速度为0.1～0.3℃/min的速率将冻存管冷冻至-10℃，并维持2～4小时，然后按照温度下降速度为0.6～1.5℃/min的速率将冻存管冷冻至-40℃，并维持2～4小时，再按照温度下降速度为5～8℃/min的速率将冻存管冷冻至-80℃，并维持2～4小时，最后浸入液氮中长期保存。
6.根据权利要求5所述的一种人类活性免疫细胞的冻存方法，其特征在于所述的步骤(4)中的降温程序为：按照温度下降速度为0.1℃/min的速率将冻存管冷冻至-10℃，并维持2小时，然后按照温度下降速度为0.8℃/min的速率将冻存管冷冻至-40℃，并维持2小时，再按照温度下降速度为8℃/min的速率将冻存管冷冻至-80℃，并维持2小时，最后浸入液氮中长期保存。
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