CN103704206A - 胎盘保存液 - Google Patents

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Abstract

一种胎盘保存液，pH值为7.33-7.83，每1000ml溶液有10mmol-15mmol磷酸二氢钾、30mmol-40mmol氯化钠、40mmol-50mmol氯化钾、8mmol-10mmol硫酸镁、70mmol-100mmol组氨酸、1.5mmol-2.0mmol别嘌呤、3mmol还原型谷胱苷肽、1ml-8ml2-巯基乙醇、8mol-10mmol腺苷、100000U-1000000U青霉素、60mg-100mg链霉素和50mg-70mg庆大霉素。本发明提供的胎盘保存液能对分娩后的胎盘进行长期保存，避免细胞活性的降低，并将胎盘染菌率控制在较低水平。

Description

胎盘保存液
技术领域
本发明涉及一种用于组织保存的组合物，尤其涉及一种胎盘保存液，用于胎盘的体外保存。
背景技术
人类胎盘由羊膜、绒毛膜和基蜕膜构成。羊膜和绒毛膜来源于胎儿，不同区域的蜕膜则起源于母体。胎盘除在胎儿发育、营养支持和维持耐受中发挥重要作用外，还是一个干细胞储备库。胎盘组织容易得到，易于处理，不需要侵入性操作，对其研究不会涉及伦理道德问题，因此目前已成为寻找人类干细胞新来源的研究热点。
胎盘干细胞的发现，解决了干细胞的来源问题。胎盘的取材几乎不受限制，在产妇知情同意的基础上就可以获得胎盘。胎盘的平均重量约为500克，其中含有丰富的干细胞资源。胎盘是伴随胚胎发育过程中的附属品，其中的细胞成分相应也是处于胚胎发育早期，具有更强的增殖和分化能力。胎盘作为胎儿和母体之间的免疫屏障，其中的细胞成分同样具有很强的免疫调节能力，尤其是胎盘干细胞具有很低的免疫原性，这在异体移植治疗过程中具有无可比拟的优势。
然而胎盘在与胎儿离断之后，缺少血液供应，其中的细胞成分会很快丧失活性，不利于胎盘干细胞的分离培养。简单安全的保存胎盘对胎盘干细胞的分离培养及临床应用都有着重要的意义。
生理盐水是一种常用的胎盘保存液，虽然配制简便，但不利于胎盘的体外保存，尤其不利于对胎盘中干细胞的获取。为实现动物器官、组织或细胞的体外保存，技术人员已为之付出了大量努力。
中国发明专利ZL00108778.9公开了一种动物细胞或器官的保存剂，是一种含有0.1wt%-50wt%以儿茶素类为主要成分的多酚类，以及Euro-Collins液、UW液、血清和抗生素溶液的保存液，实现了可以不冷冻动物细胞而进行保存，但并不适用于胎盘组织的保存。
中国发明专利ZL200610130638.2公开了一种间充质干细胞保存液及其用途，以人白蛋白和肝素作为主要成分，辅以人用细胞因子、磷酸根离子、金属离子或单糖组成。该保存液能使人间充质干细胞在运输过程中的保持高存活率,减少了细胞之间和细胞与容器内壁的黏附,减少临床输注人间充质干细胞时血管内出现细胞团栓塞的可能性。可使间充质干细胞在环境温度4℃-15℃时在24小时内保持单细胞悬液为主的状态,大大增加了临床使用人间充质干细胞的范围,所用的成分为符合临床使用的成分,可满足临床使用人间充质干细胞的需要。
中国发明专利ZL200910117522.9公开了一种从胎盘、脐带或脂肪组织中分离提取干细胞的方法，使用pH7.4±0.2的磷酸缓冲液为保养液。与生理盐水类似，经该保养液保存的胎盘获取的干细胞数量无显著差异。
中国发明专利申请201210288706.3公开了一种冷冻保护液以及冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的方法，由胎牛血清、二甲基亚砜和右旋糖酐40按体积比为7-9∶1∶1组成。采用三者组成的组合物对细胞的活性实现协同保护，防止细胞形成冰晶受到损伤，确保了复苏后的干细胞活性与新制备的羊膜和绒毛膜干细胞活性无差别。
中国发明专利申请201310243569.6记载了一种培养人脐带间充质干细胞的方法，使用含有青霉素钠和硫酸链霉素的AIM-V培养基为脐带保护液，其用量分别为100-200U/mL和100-200U/mL。AIM-V培养基含有L-谷氨酰胺，加入抗生素后能使胎盘的染菌率下降，但获取的干细胞数量与生理盐水亦无显著差异。
发明内容
本发明的目的在于提供一种胎盘保存液，以利于胎盘的体外保存，提高获取的干细胞数量，将胎盘染菌率控制在较低水平。
本发明提供的一种胎盘保存液，pH值为7.33-7.83，每1000ml溶液加入的各组分和用量如下：
磷酸二氢钾10mmol-15mmol、
氯化钠30mmol-40mmol、
氯化钾40mmol-50mmol、
硫酸镁8mmol-10mmol、
组氨酸70mmol-100mmol、
别嘌呤醇1.5mmol-2.0mmol、
还原型谷胱苷肽3mmol、
2-巯基乙醇1ml-8ml、
腺苷8mol-10mmol、
青霉素100000U-1000000U、
链霉素60mg-100mg和
庆大霉素50mg-70mg。
本发明中，以磷酸二氢钾、组氨酸、氯化钠和氯化钾相组合共同作用，作为缓冲剂，有效防止细胞酸化或碱化。
本发明还加入2-巯基乙醇，以其硫氢基为活性部分，能诱导细胞的增殖，为非特异性的激活作用。同时，还能避免过氧化物对培养细胞的损害。每1000ml胎盘保存液中，用量优先选择1ml-8ml。
本发明还使用人参皂苷（ginsenoside，GS）如：但不仅限于Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3、Rh2、Rg1和Rg2等，尤其是Rg1，用量优先选择20mg-50mg。
为促进保持细胞的活性，本发明还使用5,7-二羟基-3’,4’-二甲基黄酮。每1000ml盘保存液中，其用量优先选择45mg-55mg。
地塞米松具有胎盘组织保存液中可以有效的起到保护细胞活性的作用。每1000ml胎盘保存液中，用量优先选择0.01mmol-0.08mmol。
与使用生理盐水相比，人参皂苷、5,7-二羟基-3’,4’-二甲基黄酮和地塞米松等单独使用对促进保持细胞活性并不显著，当共同使用后，则能使细胞数量得到显著提高。
本发明技术方案实现的有益效果：
本发明提供的胎盘保存液，能对分娩后的胎盘组织进行5天的保存、避免细胞活性的降低，将胎盘染菌率控制在较低水平。
本发明很好地解决了胎盘分娩之后不能长期保存、细胞活性降低、易滋生细菌等问题，对胎盘干细胞的分离培养起到了非常重要的保证作用。
附图说明
图1为使用生理盐水保存的胎盘中所获得的间充质干细胞；
图2为使用本发明提供个胎盘保存液保存的胎盘中所获得的间充质干细胞。
具体实施方式
以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
本发明实施例其它所用的试剂若未经说明，均购自西格玛－奥德里奇（Sigma－Aldrich）公司。
实施例1胎盘保存液的制取
以去离子水为溶剂，加入10mmol-15mmol磷酸二氢钾、30mmol-40mmol氯化钠、40mmol-50mmol氯化钾、8mmol-10mmol硫酸镁、70mmol-100mmol组氨酸、1.5mmol-2.0mmol别嘌呤、45mg-55mg5,7-二羟基-3’,4’-二甲基黄酮、3mmol还原型谷胱苷肽、1ml-8ml2-巯基乙醇、8mol-10mmol腺苷、20mg-50mg人参皂苷Rg1、0.01mmol-0.08mmol地塞米松、100000U-1000000U青霉素、60mg-100mg链霉素和50mg-70mg庆大霉素，制成1000ml胎盘保存液，pH7.33-7.83。分装，封口，0℃-4℃保存。
实施例2细胞的增殖能力
将胎盘置于生理盐水保存，5天后取出胎盘并分离获得间充质干细胞（参见图1）。
将胎盘置于实施例1制取的胎盘保存液中保存，5天后取出胎盘并分离获得间充质干细胞（参见图2）。
从图1和图2比较可见，使用胎盘保存液后，干细胞形态保持更好。通过计算细胞数量，证明胎盘保存液保存后的胎盘细胞增殖能力更强，同一时间培养的间充质干细胞数量更多。结果见表1。
表1
生理盐水保存胎盘 保存液保存胎盘
4天后分离获得细胞数量 2×107 2×107
细胞培养三天后的数量 4.3×107 7.5×107
实施例3胎盘的染菌率
将胎盘分别置于生理盐水和实施例1制取的胎盘保存液中保存5天后，进行染菌实验（参见表2）。
表2
胎盘保存液（n=45） 生理盐水（n=38）
细菌污染例数 1 3
染菌率 2.22% 7.89%
实施例4
以去离子水为溶剂，加入10mmol-15mmol磷酸二氢钾、30mmol-40mmol氯化钠、40mmol-50mmol氯化钾、8mmol-10mmol硫酸镁、70mmol-100mmol组氨酸、1.5mmol-2.0mmol别嘌呤、3mmol还原型谷胱苷肽、1ml-8ml2-巯基乙醇、8mol-10mmol腺苷、100000U-1000000U青霉素、60mg-100mg链霉素和50mg-70mg庆大霉素，制成1000ml胎盘保存液，pH7.33-7.83。分装，封口，0℃-4℃保存。5天后取出胎盘并分离获得间充质干细胞，细胞扩增情况见表3。
表3
生理盐水保存胎盘 实施例4中的保存液保存胎盘
5天后分离获得细胞数量 2×107 2×107
细胞培养三天后的数量 4.5×107 4.8×107
实施例5
以去离子水为溶剂，加入10mmol-15mmol磷酸二氢钾、30mmol-40mmol氯化钠、40mmol-50mmol氯化钾、8mmol-10mmol硫酸镁、70mmol-100mmol组氨酸、1.5mmol-2.0mmol别嘌呤、45mg-55mg5,7-二羟基-3’,4’-二甲基黄酮、3mmol还原型谷胱苷肽、8mol-10mmol腺苷、100000U-1000000U青霉素、60mg-100mg链霉素和50mg-70mg庆大霉素，制成1000ml胎盘保存液，pH7.33-7.83。分装，封口，0℃-4℃保存。5天后取出胎盘并分离获得间充质干细胞，细胞扩增情况见表4。
表4
生理盐水保存胎盘 实施例5中的保存液保存胎盘
5天后分离获得细胞数量 2×107 2×107
细胞培养三天后的数量 4.5×107 4.3×107
实施例6
以去离子水为溶剂，加入10mmol-15mmol磷酸二氢钾、30mmol-40mmol氯化钠、40mmol-50mmol氯化钾、8mmol-10mmol硫酸镁、70mmol-100mmol组氨酸、1.5mmol-2.0mmol别嘌呤、3mmol还原型谷胱苷肽、8mol-10mmol腺苷、20mg-50mg人参皂苷Rg1、100000U-1000000U青霉素、60mg-100mg链霉素和50mg-70mg庆大霉素，制成1000ml胎盘保存液，pH7.33-7.83。分装，封口，0℃-4℃保存。5天后取出胎盘并分离获得间充质干细胞，细胞扩增情况见表5。
表5
生理盐水保存胎盘 实施例6中的保存液保存胎盘
5天后分离获得细胞数量 2×107 2×107
细胞培养三天后的数量 4.5×107 4.7×107
实施例7
以去离子水为溶剂，加入10mmol-15mmol磷酸二氢钾、30mmol-40mmol氯化钠、40mmol-50mmol氯化钾、8mmol-10mmol硫酸镁、70mmol-100mmol组氨酸、1.5mmol-2.0mmol别嘌呤、3mmol还原型谷胱苷肽、8mol-10mmol腺苷、0.01mmol-0.08mmol地塞米松、100000U-1000000U青霉素、60mg-100mg链霉素和50mg-70mg庆大霉素，制成1000ml胎盘保存液，pH7.33-7.83。分装，封口，0℃-4℃保存。5天后取出胎盘并分离获得间充质干细胞，细胞扩增情况见表6。
表6
生理盐水保存胎盘 实施例7中的保存液保存胎盘
5天后分离获得细胞数量 2×107 2×107
细胞培养三天后的数量 4.5×107 4.2×107

Claims (6)

1.一种胎盘保存液，其特征在于pH值为7.33-7.83，每1000ml溶液加入的各组分和用量如下：
磷酸二氢钾10mmol-15mmol、
氯化钠30mmol-40mmol、
氯化钾40mmol-50mmol、
硫酸镁8mmol-10mmol、
组氨酸70mmol-100mmol、
别嘌呤醇1.5mmol-2.0mmol、
还原型谷胱苷肽3mmol、
2-巯基乙醇1ml-8ml、
腺苷8mol-10mmol、
青霉素100000U-1000000U、
链霉素60mg-100mg和
庆大霉素50mg-70mg。
2.根据权利要求1所述的胎盘保存液，其特征在于还加入2-巯基乙醇1ml-8ml。
3.根据权利要求1所述的胎盘保存液，其特征在于还加入人参皂苷20mg-50mg。
4.根据权利要求1所述的胎盘保存液，其特征在于还加入人参皂苷Rg1，用量为20mg-50mg。
5.根据权利要求1所述的胎盘保存液，其特征在于还加入5,7-二羟基-3’,4’-二甲基黄酮45mg-55mg。
6.根据权利要求1所述的胎盘保存液，其特征在于还加入地塞米松0.01mmol-0.08mmol。
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