CN106417254A

CN106417254A - 一种牙齿标本保存液及其应用以及牙齿标本保存方法

Info

Publication number: CN106417254A
Application number: CN201610881470.2A
Authority: CN
Inventors: 葛啸虎; 陈海佳; 王飞; 王一飞; 冯德龙; 王小燕
Original assignee: Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Priority date: 2016-09-30
Filing date: 2016-09-30
Publication date: 2017-02-22

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种牙齿标本保存液及其应用以及牙齿标本保存方法。本发明所述保存液包括氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、青霉素、链霉素和两性霉素B。本发明选择氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、青霉素、链霉素和两性霉素B组成一种新型的牙齿标本保存液，相对于现有保存液，本发明保存液能提供更适合牙髓干细胞的生存环境，不影响其活性，同时极大地降低了细菌污染细胞的程度，无论从保存和运输都提供了有效保护。

Description

一种牙齿标本保存液及其应用以及牙齿标本保存方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及一种牙齿标本保存液及其应用以及牙齿标本保存方法。

背景技术

牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)是存在于牙齿牙髓组织中的一类具有自我更新、增殖能力强，及多向分化能力的间充质干细胞。牙髓干细胞具有多向分化的潜能，它除了能形成矿化结节能力的细胞外，经过不同细胞因子的诱导，还能够分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、血管内皮、肝、神经等细胞系类型。

成功从离体的牙齿中提取出足够量符合标准的牙髓干细胞，首先遇到的问题就是离体牙齿保存的问题。口腔环境较其他组织环境不同，口腔内的细菌数量很多，种类相当繁杂，离体牙齿保存不当极易发生染菌，且牙齿内细胞量较少，离体牙齿保存不当也极易发生牙髓干细晌提取失败的情况。

文献《六种保存液对牙周膜成纤维细胞活性的影响》(陈富波等，口腔材料器械，2012年第21卷第4期)中公开了6种脱位牙的保存液，虽然该文献研究内容是保存液对已提取的牙周膜成纤维细胞活性的影响，但是经过试验研究发现，这6种脱位牙保存液无法对牙齿标本提供有效的保护，存在易染菌和影响牙髓干细胞的问题。

中国专利CN104705289A公开了一种离体牙齿保存液，每升保存液中有以下组分：

青霉素0.3-0.6g、链霉素0.5-1g、甲硝唑0.02-0.04g、两性霉素B0.015-0.025g、羟甲基纤维素5-10g、胰岛素50-100μg，余量为MEM。

上述保存液能够有效保持牙髓干细胞的活性，并在一定程度上降低细菌污染，但是对于细菌污染的降低程度仍然不够理想，需要提供更加优异的保存液来加大对牙齿标本的保护程度。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种牙齿标本保存液及其应用以及牙齿标本保存方法，使得所述保存液能够有效保护牙齿标本，进而保证牙齿中的牙髓干细胞活性，显著降低细菌感染细胞的程度。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种牙齿标本保存液，包括：

氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、青霉素、链霉素和两性霉素B。

针对现有的牙齿保存液存在较大的细菌感染问题，本发明调整了牙齿标本保存液的组分，在保证牙齿中牙髓干细胞活性较高的前提下，显著地降低了细胞感染细菌的程度。

其中，所述保存液在具体实施过程中各组分浓度为：

氯化钠8g/L、氯化钾0.2g/L、磷酸氢二钠1.44g/L、磷酸二氢钾0.24g/L、青霉素50U-500U/mL、链霉素50μg-500μg/mL和两性霉素B 0.5μg-5μg/mL，pH值7.2。

进一步优选地，所述青霉素浓度为100U/mL，所述链霉素浓度为100μg/mL，所述两性霉素B浓度为1μg/mL。

同时，本发明还提供了所述保存液的制备方法，配制氯化钠8g/L、氯化钾0.2g/L、磷酸氢二钠1.44g/L、磷酸二氢钾0.24g/L的混合溶液，调pH值为7.2，灭菌后加入青霉素、链霉素以及两性霉素B，使其终浓度分别为500U-50U/mL、500μg-50μg/mL、5μg-0.5μg/mL。在实际配制过程中，可以定容到1L来进行配制。

在本发明所述保存液与专利CN104705289A保存液的对比试验中，从本发明保存的牙齿中提取的牙髓干细胞活性和其相当，但是细胞细菌污染的比例仅是10％，而现有保存液的比例是30％。此外，本发明还采用了《六种保存液对牙周膜成纤维细胞活性的影响》中牛奶、HBSS和DMEM高糖培养基3种脱位牙保存液进行相同的试验，结果显示这三种保存液在牙髓干细胞活性和细菌污染程度上都不及本发明保存液。

基于上述的技术效果，本发明提出了所述保存液在保存牙齿标本、制备保存牙齿标本的产品和/或对牙齿标本消毒中的应用。

根据应用，本发明提供了一种牙齿标本的保存方法，将采集的牙齿标本进行消毒，然后放入到本发明所述的保存液中，在低温环境下保存。

其中，所述消毒为采用酒精或碘伏消毒，所述低温为2-8℃，更优选为4℃。

由以上技术效果可知，本发明选择氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、青霉素、链霉素和两性霉素B组成一种新型的牙齿标本保存液，相对于现有保存液，本发明保存液能提供更适合牙髓干细胞的生存环境，不影响其活性，同时极大地降低了细菌污染细胞的程度，无论从保存和运输都提供了有效保护。

具体实施方式

本发明实施例公开了一种牙齿标本保存液及其应用以及牙齿标本保存方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品、应用和方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品、应用及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种牙齿标本保存液及其应用以及牙齿标本保存方法进行详细说明。

实施例1：配制本发明所述保存液

8g氯化钠(NaCl)，0.2g氯化钾(KCl)、1.44g磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)，0.24g磷酸二氢钾(KH₂PO₄)，调pH 7.2，定容1L；然后高压蒸汽灭菌，取10mL溶液加入青霉素，使其终浓度为100U/mL，加入链霉素使其终浓度为100μg/mL,加入两性霉素B，使其终浓度为1μg/ml，放置4℃备用。

实施例2：配制本发明所述保存液

8g氯化钠(NaCl)，0.2g氯化钾(KCl)、1.44g磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)，0.24g磷酸二氢钾(KH₂PO₄)，调pH 7.2，定容1L；然后高压蒸汽灭菌，取10mL溶液加入青霉素，使其终浓度为50U/mL，加入链霉素使其终浓度为500μg/mL,加入两性霉素B，使其终浓度为0.5μg/ml，放置4℃备用。

实施例3：配制本发明所述保存液

8g氯化钠(NaCl)，0.2g氯化钾(KCl)、1.44g磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)，0.24g磷酸二氢钾(KH₂PO₄)，调pH 7.2，定容1L；然后高压蒸汽灭菌，取10mL溶液加入青霉素，使其终浓度为500U/mL，加入链霉素使其终浓度为50μg/mL,加入两性霉素B，使其终浓度为5μg/ml，放置4℃备用。

实施例4：对比试验

1、牙齿标本保存方法

将采集的牙齿标本进行碘伏消毒，然后放入到保存液中，在4℃下保存72小时，所述牙齿取自18-30岁以内无龋病、无酿炎的完整健康的智齿，大小差异不明显。

2、保存液

本发明实施例1-3保存液、CN104705289A实施例1保存液、牛奶、HBSS和DMEM高糖培养基。

3、牙髓干细胞提取方法

将牙齿经过碘伏消毒1min后，用PBS清洗2次。再用钳子钳开牙齿，组织镊取出牙髓。放置在0.3％I型胶原酶+0.4％分散酶消化30-60min后，以1200rpm离心10min中，用PBS清洗一次后，过100μm细胞筛，再次以1200rpm离心5min。用含10％胎牛血清，100U/ml青霉素及100μg/ml链霉素、1μg/ml两性霉素B的DMEM/F12培养基重悬细胞，接种到25ml培养瓶中，在37℃，5％CO₂培养，每2天换液一次，

当细胞待细胞达到汇合点(即细胞长满瓶底的70％-80％)时，用2.5g/L胰蛋白酶消化进行传代，按1:3传代，第5代细胞进行细胞活力检测及取样进行微生物检测。

4、试验结果

见表1。

表1不同保存液保存后牙髓干细胞活性和细菌污染细胞比例

保存液	细胞活力	细菌污染细胞比例
			实施例1	90％±1.5％	10％
实施例2	91.5％±1％	8％
			实施例3	93％±2％	7％
现有专利实施例1	92％±1％	30％
			牛奶	78％±4％	45％
HBSS	85％±3％	25％
			DMEM高糖培养基	94％±2％	34％

由上表可知，本发明保存液和现有专利的保存液保存后的牙齿标本，在分离的细胞活力上无明显差异，但分离后的牙髓干细胞细菌污染比例本发明明显低于现有专利，说明现有专利保存液有利于细菌的增殖，而本发明保存液大大抑制了细菌增殖的趋势，同时不损伤牙髓干细胞活性。

虽然DMEM高糖培养基处理中牙髓干细胞的活性较高，但是其染菌细胞比例也是比较高的。而牛奶和HBSS无论在染菌方面和细胞活性方面都比较差。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种牙齿标本保存液，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述保存液，其特征在于，包括

3.根据权利要求2所述保存液，其特征在于，所述青霉素浓度为100U/mL。

4.根据权利要求2所述保存液，其特征在于，所述链霉素浓度为100μg/mL。

5.根据权利要求2所述保存液，其特征在于，所述两性霉素B浓度为1μg/mL。

6.根据权利要求2所述保存液，其特征在于，由以下方法制备获得：

配制氯化钠8g/L、氯化钾0.2g/L、磷酸氢二钠1.44g/L、磷酸二氢钾0.24g/L的混合溶液，调pH值为7.2，灭菌后加入青霉素、链霉素以及两性霉素B，使其终浓度分别为500U-50U/mL、500μg-50μg/mL、5μg-0.5μg/mL。

7.权利要求1-6任意一项所述保存液在保存牙齿标本、制备保存牙齿标本的产品和/或对牙齿标本消毒中的应用。

8.一种牙齿标本的保存方法，其特征在于，将采集的牙齿标本进行消毒，然后放入到权利要求1-6任意一项所述的保存液中，在低温环境下保存。

9.根据权利要求8所述保存方法，其特征在于，所述消毒为采用酒精或碘伏消毒。

10.根据权利要求8所述保存方法，其特征在于，所述低温为2-8℃。