CN102250832A - 一种促进冷冻胚胎解冻后体外发育的培养液 - Google Patents
一种促进冷冻胚胎解冻后体外发育的培养液 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种促进胚胎OPS法玻璃化冷冻解冻后体外发育的培养液，其是将冷冻2-细胞胚胎解冻后在含10-9mol/L褪黑素(MT)的培养液中进行培养，提高了胚胎的囊胚发育率、增加胚胎内细胞数，从而提高胚胎的质量，并为进一步开展家畜胚胎的OPS冷冻保存研究提供有益的参考。
Description
技术领域
本发明属于农业-畜牧兽医领域，具体地说，涉及一种促进冷冻胚胎解冻后体外发育的培养液。
背景技术
胚胎冷冻是长期保存动物种质资源的一项实用技术。胚胎冷冻技术的发展和应用减少了时间和空间对胚胎操作造成的限制，并可有效避免因家畜的活体运输所造成的疾病传播。自Rail和Fahy1985年报道玻璃化冷冻方法以来，该法因不需要昂贵的冷冻设备、操作简便、冷冻过程短，而受到广泛的重视，得到迅速的发展。玻璃化冷冻法是利用高浓度冷冻保护剂在快速降温过程中形成的玻璃态，有效地避免冷冻过程中有害冰晶的形成，从而使胚胎避免所受的物理性伤害1997年，Vajta等报道，用OPS法(open pulled straw，开放式拉长麦管)玻璃化冷冻牛体外生产胚胎获得成功。在小鼠原核胚、2-细胞胚胎、4-细胞胚胎、桑椹胚、囊胚、孵化囊胚、转基因胚胎及其他大家畜胚胎的冷冻保存上都得到了广泛的应用。随后又有多种可提高冷冻降温速度的冷冻载体被相继用于胚胎的冷冻保存，使冷冻降温速度大大提高，冷冻损伤得以减少。但玻璃化冷冻法所用的高浓度冷冻保护剂对胚胎的化学毒害作用很大，虽然有个例报道复苏后仅剩1个卵裂球存活的胚胎移植后也获得了妊娠，但通常认为超过50％卵裂球损伤的胚胎为死亡胚胎，其发育潜能差、着床率约为1％。着床率降低的原因可能是损伤后的卵裂球分解代谢产生某些毒性物质，不利于胚胎发育。因此，研究者迄今仍在不断探索冷冻后解冻胚胎体外培养或移植时胚胎质量提高的方法。
褪黑素(Melatonin，MT)是主要由动物松果体分泌的一种吲哚类神经内分泌激素，具有调节生长和繁殖等多方面的生理功能。近年来研究报道表明，MT可以促进卵母细胞的体外成熟和胚胎的体外发育。例如，MT浓度在10-6～10-4mol/L时，能显著增加小鼠的体外受精率(27.6％vs 43.9％或40.4％)，在10-8～10-6mol/L时，可提高胚胎发育到4-细胞胚(16.0vs 26.7％)、8-细胞胚(12.1vs.25.8或23.5％)和囊胚的比率(8.9vs 23.5或17.5％)(Ishizuka等，2000)。常规慢速(细管)冷冻绵羊桑椹胚解冻后在含有MT的发育液中培养24h，囊胚的孵化率增加，胚胎的退化率降低(Abecia等，2002)。另外，在牛胚胎的体外发育液中添加MT的试验组囊胚发育率68.85％(42/61)显著高于对照组50.79％(32/63)(Papis等，2007)；在猪的卵母细胞体外成熟和孤雌激活胚胎体外发育的研究中也发现，培养液中添加10-9mol/LMT显著增加胚胎的卵裂率和囊胚细胞数，囊胚率没有显著提高(N.Rodriguez-Osorio等，2007)；10ng/mL MT能显著提高猪卵母细胞体外成熟过程中极体的排出率(84.6％vs75.6％)和孤雌激活后胚胎发育到囊胚的比率，但对卵裂率和囊胚细胞数的影响不显著(Jung-TeakKang等，2008)。这些研究说明：在不同时期的培养液中添加MT对卵母细胞的体外成熟和胚胎的体外发育都有积极的影响。
发明内容
本发明的目的是提供一种促进OPS法玻璃化冷冻胚胎解冻后体外发育的培养液。
为了实现本发明目的，本发明的一种促进冷冻胚胎解冻后体外发育的培养液，所述培养液的配方见表1：
表1培养液配方
优选地，所述培养液的配方见表2：
表2培养液配方
优选培养液中褪黑素的浓度为10-9～10-7mol/L，更优选10-9mol/L。
本发明还提供上述培养液在促进OPS法玻璃化冷冻胚胎解冻后体外发育中的应用，其是将冷冻胚胎解冻后在上述培养液中进行培养，体外发育成囊胚。
前述的应用，培养时间为90～96h。
前述的应用，所述胚胎为2-细胞胚胎。优选所述2-细胞胚胎为OPS法玻璃化冷冻后的哺乳动物胚胎，更优选来源于小鼠胚胎。
本发明的优点在于：
(1)本发明促进OPS法玻璃化冷冻胚胎解冻后体外发育的培养液，在基础培养液中添加10-9～10-7mol/L的MT，对OPS法冷冻后的小鼠2-细胞胚胎进行培养，提高了胚胎的后期发育能力、增加胚胎内细胞数，从而提高胚胎的质量，并为进一步开展家畜胚胎的冷冻保存研究提供有益的参考。
(2)本发明方法中的MT是直接用培养液溶解的，不使用常规的DMSO和乙醇溶解，避免了DMSO和乙醇可能对胚胎造成的毒害作用。
(3)本发明方法中，添加10-9mol/L的MT能够使OPS法冷冻后的小鼠2-细胞胚胎体外发育的囊胚率、囊胚细胞数恢复至新鲜胚胎体外培养的水平，且使孵化囊胚率高于新鲜胚胎组。充分说明了添加MT能够改善冷冻对胚胎造成的损伤，且MT能够促进胚胎的细胞增殖。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中使用的试剂和材料均为市售商品。
实施例
1、小鼠的超数排卵
5-6周龄的昆明白系雌鼠(购自中国军事医学科学院实验动物中心)，自由采食和饮水，控光(光照14h/d)，室内温度为20-22℃。经过一周的适应性饲养后，隔日腹腔注射PMSG和hCG各10IU/只，然后与性成熟同系公鼠交配，次日早上检查阴道栓，有栓雌鼠用于获取2-细胞胚胎。
2、2-细胞胚胎采集
在注射hCG 48h后颈椎脱臼处死有栓雌鼠，剪取输卵管，在显微镜下找到输卵管壶腹部，用注射器针尖划破管壁，收集形态正常的2-细胞胚胎于M2液(表3)中洗净后备用。操作在室温25℃，37℃恒温台上进行。
表3M2液配方
3、2-细胞胚胎的冷冻、解冻和培养
1)2-细胞胚胎的冷冻
随机选取形态正常的体内2-细胞胚胎，直接由PBS液移入10％EG或10％EG+10％DMSO的溶液中预平衡30s，然后移入EDFS30玻璃化溶液中平衡25s，用口吸管将胚胎连同玻璃化溶液一起吸入OPS管细端，直接投入液氮中冷冻保存。每支OPS管装入5-6枚胚胎为宜。
2)2-细胞胚胎的解冻和培养
解冻前2h将解冻液和PBS液在37℃恒温台上或25℃室温下充分平衡。将OPS管由液氮中取出后，直接浸入含有0.5mol/L蔗糖溶液的表面皿中，在实体显微镜下回收胚胎并移入0.5mol/L蔗糖液滴中平衡5min，用PBS液洗3次，然后再用添加MT的培养液(表2)洗两遍，放入含10-3、10-5、10-7、10-9、10-11、0mol/L MT的培养液中进行培养，90h后统计胚胎的囊胚率、孵化囊胚率和囊胚细胞数。
表2培养液配方
4、囊胚细胞计数
囊胚首先在0.1％PVA-PBS液中洗3遍，放入10μg/mL Hoechst33342液滴中染色10min，然后在PBS液中洗3遍以上，以除去染色液，最后将胚胎吸到载玻片上，保持胚胎周围有一点水。用四角沾有凡士林的盖玻片轻轻往下压，在荧光显微镜下计囊胚细胞数。
小鼠的2-细胞胚胎冷冻-解冻后培养在含有10-11～10-3mol/L MT的培养液中，结果表明，除了10-3mol/L MT组外，其余各试验组(10-11～10-5mol/L MT)的囊胚率和孵化囊胚率都高于未添加MT的冷冻对照组；10-7mol/L组和10-9mol/L组囊胚率最高仅稍低于新鲜未冷冻的对照组(79.79±8.72％vs 81.17±1.51％，76.77±8.56％vs 81.17±1.51％)。10-11-10-5mol/L MT组的孵化囊胚率高于冷冻或新鲜未冷冻的对照组，与10-3mol/L MT组差异极显著。10-9mol/L MT组囊胚细胞数与冷冻对照组差异显著(75.14±7.33％vs 66.94±7.92％)，与新鲜对照组差异不显著(75.14±7.33vs 71.30±1.68)。新鲜和冷冻2-细胞胚胎培养结果比较显示，添加10-11-10-5mol/L MT能够恢复甚至提高冷冻胚胎解冻后体外培养的后期发育能力及囊胚细胞数(表4)。
表4MT对冷冻解冻后小鼠2-细胞胚胎后期发育能力的影响
注：表中同列肩注不同者表示差异显著(P＜0.05)；肩注相同者示表无显著差异(P＞0.05)。
结果表明：与冷冻对照组相比，添加10-11～10-5mol/L MT囊胚率都显著提高(P＜0.05)，与新鲜对照组相比，差异不显著(P＞0.05)。10-9mol/L组的孵化囊胚率最高，且显著高于新鲜对照组和冷冻对照组(67.15％vs 53.34％，67.15％vs 55.21％，P＜0.05)，且囊胚细胞数最多。因此，在培养液中添加MT时，10-9mol/L为最佳添加浓度。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种促进冷冻胚胎解冻后体外发育的培养液，其特征在于，所述培养液的配方见下表：
2.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述培养液的配方见下表：
3.根据权利要求1或2所述的培养液，其特征在于，褪黑素的浓度为10-9～10-7mol/L。
4.根据权利要求3所述的培养液，其特征在于，褪黑素的浓度为10-9mol/L。
5.权利要求1-4任一项所述的培养液在促进冷冻胚胎解冻后体外发育中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，其是将冷冻胚胎解冻后在权利要求1-4任一项所述的培养液中进行培养，体外发育成囊胚。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，培养时间为90～96h。
8.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述胚胎为2-细胞胚胎。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述2-细胞胚胎为OPS冷冻后的哺乳动物胚胎。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述2-细胞胚胎为OPS冷冻后的小鼠胚胎。
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