ITMI20120913A1 - Uso della n-acetil-5-metossitriptamina o suoi analoghi per favorire il meccanismo di impianto dell' embrione, e relative composizioni e mezzi di coltura - Google Patents

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Description

“Uso della N-acetil-5-metossitriptamina o suoi analoghi per favorire il meccanismo di impianto dell’embrione, e relative composizioni e mezzi di colturaâ€
La presente invenzione si riferisce all’uso della N-acetil-5-metossitriptamina (melatonina) e/o suoi analoghi, per l’uso in campo medico o veterinario nella fecondazione assistita per la prevenzione del fallimento dell’impianto in utero dell’embrione mediante somministrazione topica di una quantità efficace in un soggetto mammifero di sesso femminile che necessita di tale trattamento, e relative composizioni e mezzi di coltura.
L’impianto in utero dell’embrione umano à ̈ un meccanismo complesso che coinvolge sia l’embrione, sia l’epitelio endometriale. Le fasi di apposizione, adesione e invasione coinvolgono una varietà di molecole che giocano un ruolo unico nel processo, il dialogo molecolare tra il concepito e l’endometrio prevede interazioni tra cellule e tra cellule e fattori biochimici.
Questi meccanismi, qualora adeguatamente espressi o inibiti, contribuiscono a determinare lo stato di recettività o non-recettività dell’endometrio nei confronti dell’embrione.
Lo stato di recettività o non-recettività endometriale, pur essendo un concetto ampiamente condiviso, à ̈ clinicamente difficile da definire: la normalità istologica dell’endometrio non implica necessariamente una normalità funzionale; d’altro canto l’espressione temporale e spaziale di particolari strutture endometriali, denominate pinopodi, à ̈ fortemente suggestiva dello stato stesso di recettività.
L’impianto à ̈ una complessa sequenza di segnali che sono cruciali per l’instaurarsi della gravidanza; si suppone che un gran numero di mediatori molecolari sotto l’influenza di segnali ovarici siano coinvolti nell’interazione embrio-endometriale. Questi mediatori comprendono un’ampia varietà di molecole come ormoni, citochine, fattori di crescita, lipidi, molecole di adesione e altro (1).
Il fallimento dell’impianto nelle tecniche di procreazione medico assistita (PMA) rimane tuttora un problema irrisolto ed à ̈ considerato una delle maggiori cause di infertilità nelle donne sane. Considerando poi, che la percentuale di impianto delle tecniche di PMA à ̈ intorno al 25%, l’inadeguata recettività uterina à ̈ ritenuta responsabile di circa i due terzi di tutti i fallimenti (per un terzo à ̈ ritenuto responsabile l’embrione) (2).
L’endometrio à ̈ recettivo all’invasione della blastocisti per un intervallo di tempo limitato e definito “finestra d’impianto†. Il “dialogo†per la sincronizzazione fra “ovulazione-prime fasi di sviluppo embrionale-modificazioni cellulari dell’epitelio endometriale per l’impianto†à ̈ tenuto da una serie di messaggeri ormonali e biochimici.
Durante la “finestra d’impianto†, l’epitelio endometriale esprime, mediante regolazione ormonale e biochimica, alcune strutture dette pinopodi, capaci di permettere l’adesione e l’invasione della blastocisti.
La finestra d’impianto sarebbe caratterizzata secondo studi di microscopia elettronica (3) dalla massima espressività dei pinopodi.
La formazione dei pinopodi à ̈ considerata come un marker specifico della recettività endometriale, essi appaiono circa una settimana dopo l’ovulazione, ma la loro completa espressione varia da paziente a paziente e sembra mantenersi per un solo giorno. (4) L’espressione dei pinopodi à ̈ direttamente proporzionale all’aumento dei livelli plasmatici del progesterone (5).
Il concetto di recettività endometriale o “finestra d’impianto†, correlato all’espressione dei pinopodi, unanimemente accettato dalla comunità scientifica, à ̈ da qualche decennio oggetto di studio per chi affronta le problematiche della riproduzione assistita.
In sintesi: il progesterone, l’ormone pro-gestazione, à ̈ il mediatore principale e intorno ad esso ruotano una serie di altri mediatori che possono favorire l’evento impianto.
Da quanto sopra riportato, emerge come il problema dell’ottenimento della gravidanza mediante le tecniche di fecondazione assistita sia imputabile in gran parte alle scarse conoscenze del fenomeno impianto.
Appare quindi evidente, anche alla luce delle numerose restrizioni legislative nel campo della procreazione assistita, l’esigenza di ottimizzare la fase di impianto.
Gli autori della presente invenzione hanno ora riscontrato che uno dei mediatori in grado di svolgere un ruolo critico insieme al progesterone nell’espressione dei pinopodi, con effetti molto positivi per l’annidamento embrionale à ̈ la N-acetil-5-metossi triptamina (melatonina).
La melatonina à ̈ prodotta dalla pineale, ghiandola neuroendocrina regolata dalla luce: il buio ne stimola la sintesi e la secrezione.
L’uso della melatonina non presenta effetti collaterali, né problemi di sovradosaggio, né à ̈ riportata in letteratura alcuna controindicazione (6).
Sono molteplici i vantaggi già noti e associati all’utilizzo della melatonina anche in processi diversi che possono interferire positivamente con l’impianto. A questo proposito, esiste inoltre una correlazione inversamente proporzionale con il rischio di carcinoma dell’endometrio e i livelli sierici di melatonina con azione protettiva accertata.
È stato dimostrato da alcuni autori (7) che la melatonina inibisce la proliferazione delle cellule atipiche endometriali, definite di Ishikawa, responsabile del carcinoma dell’endometrio. Attraverso esperimenti con radioligandi e antagonisti della melatonina come il luzindole, i risultati del gruppo di ricercatori hanno dimostrato che l’effetto inibitore à ̈ esercitato dalla melatonina attraverso i recettori MT2 presenti nelle membrane delle cellule proliferative di Ishikawa.
Altro determinante da considerare à ̈ il periodo della menopausa, durante il quale la melatonina diminuisce la sua produzione e infatti durante tale periodo il rischio di carcinoma endometriale risulta più elevato.
Ad esempio, studi in vitro e in vivo (6, 8) hanno dimostrato una potente azione antiossidante della melatonina, un’azione superiore a quella del mannitolo, del glutatione e della vitamina E nella protezione da danno ossidativo dovuto a radicali idrossilici tossici e ad altri prodotti catabolici cellulari derivanti da cambiamenti nel metabolismo degenerativo o proliferativo e da/per ossidazione lipidica.
La melatonina (9-10) ha inoltre importanti proprietà antiestrogeniche e stimola la produzione di progesterone che si pone in antitesi con l’azione degli estrogeni stessi (elevati livelli di estrogeni si associano ad un peggiore esito delle tecniche di fecondazione assistita) (11).
A questo riguardo ricordiamo che la superovulazione mediante gonadotropine indotta in cicli di PMA determina una iperestrogenizzazione con aumento dell’iperplasia endometriale, un fattore di rischio importante per il carcinoma endometriale sopra menzionato.
Alcuni autori (12) affermano che esiste un sinergismo fra gonadotropina corionica umana (hCG) e melatonina: infatti la melatonina aumenta, incrementando tra l’altro la produzione di progesterone (sia in vivo che in vitro), a 6-7 giorni dal picco ovulatorio di hCG.
A questo proposito si evidenzia come il picco di melatonina post-ovulatorio coincida esattamente con la finestra di impianto endometriale e con la formazione della blastocisti (lo stadio di sviluppo embrionale in cui avviene l’annidamento in utero). La correlazione positiva tra melatonina e progesterone e negativa tra melatonina ed estradiolo verrebbe potenziata dall’hCG: infatti, in assenza di quest’ultima, la melatonina ha un effetto molto blando sulla produzione di progesterone.
Forma oggetto della presente invenzione la N-acetil-5-metossi triptamina o un suo analogo, per l’uso in campo medico o veterinario nelle tecniche di fecondazione assistita per la prevenzione del fallimento dell’impianto nell’utero mediante somministrazione topica di una quantità efficace in un soggetto mammifero di sesso femminile che necessita di tale trattamento.
Preferibilmente, detto analogo della N-acetil-5-metossi triptamina à ̈ scelto tra agomelatina, 6-idrossi melatonina solfato, serotonina, 5 idrossitriptofano o loro derivati.
In una forma di realizzazione preferita dell’invenzione il soggetto mammifero di sesso femminile à ̈ una donna affetta da infertilità o poliabortività.
Secondo un’ulteriore forma di realizzazione preferita, la somministrazione topica di N-acetil-5-metossi triptamina o un suo analogo, preferibilmente di N-acetil-5-metossi triptamina, avviene mediante irrigazione endometriale.
Ancora secondo un’ulteriore forma preferita di realizzazione dell’invenzione, detta somministrazione topica viene effettuata in un’unica somministrazione al momento del prelievo ovocitario.
Preferibilmente, detto principio attivo à ̈ presente in una concentrazione variabile da 4 x 10<-9>g/ml a 25 x 10<-9>g/ml, ancora più preferibilmente superiore o uguale a 10 x 10<-9>g/ml.
In una forma di realizzazione alternativa, à ̈ possibile l’uso concomitante con una terapia sistemica a base di N-acetil-5-metossi triptamina, HCG o progesterone, o una loro combinazione, dal giorno del prelievo ovocitario.
In forme alternative preferite di realizzazione della presente invenzione, le tecniche di riproduzione assistita sono scelte dal gruppo che consiste in rapporti mirati; inseminazione intrauterina (IUI); fertilizzazione in vitro (IVF); iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi (ICSI), iniezione intracitoplasmica di spermatozoi morfologicamente selezionati (IMSI) e tecniche Tese-Tesa (Testicular Sperm Aspiration-Extraction).
Costituisce un ulteriore oggetto della presente invenzione una composizione atta alla somministrazione topica comprendente N-acetil-5-metossi triptamina o un suo analogo, o una loro combinazione come principio attivo, in una quantità efficace per la prevenzione del fallimento dell’impianto nell’utero nella fecondazione assistita, insieme ad uno o più eccipienti o adiuvanti fisiologicamente accettabili.
Preferibilmente, detto principio attivo à ̈ presente nella composizione in una concentrazione variabile da 4 x 10<-9>g/ml a 25 x 10<-9>g/ml, preferibilmente superiore o uguale a 10 x 10<-9>g/ml.
Secondo una forma di realizzazione preferita il principio attivo nella suddetta composizione à ̈ formulato come irrigazione endometriale in un mezzo di coltura cellulare ad una concentrazione finale variabile da 4 x 10<-9>g/ml a 25 x 10<-9>g/ml, preferibilmente superiore o uguale a 10 x 10 g/ml. Tale mezzo di coltura per blastocisti può preferibilmente comprendere le seguenti componenti:
– fonte di D-glucosio
- antibiotico, preferibilmente Gentamicina - albumina sierica umana
- amminoacidi essenziali e non essenziali, preferibilmente L-taurina,
- sali di calcio: calcio lattato, calcio pantotenato;
- sali di sodio: cloruro di sodio, bicarbonato di sodio e sodio piruvato;
- sali di potassio: cloruro di potassio, fosfato di potassio;
- sali di magnesio: magnesio cloruro, magnesio solfato;
- acqua;
e avere un pH compreso tra 7,5 e 7,8.
Ancora preferibilmente detto mezzo di coltura à ̈ il Sydney IVF ®Blastocyst medium.
L’invenzione si riferisce altresì ad un mezzo di coltura cellulare in vitro o in vivo, comprendente le seguenti componenti:
– fonte di D-glucosio
- antibiotico, preferibilmente Gentamicina - albumina sierica umana
- amminoacidi essenziali e non essenziali, preferibilmente L-taurina,
- sali di calcio: calcio lattato, calcio pantotenato;
- sali di sodio: cloruro di sodio, bicarbonato di sodio e sodio piruvato;
- sali di potassio: cloruro di potassio, fosfato di potassio;
- sali di magnesio: magnesio cloruro, magnesio solfato;
- acqua;
caratterizzato dal fatto di comprendere ulteriormente N-acetil-5-metossi triptamina o un suo analogo, o una loro combinazione, in cui detto principio attivo à ̈ presente in una concentrazione variabile da 4 x 10<-9>g/ml a 25 x 10<-9>g/ml, preferibilmente superiore o uguale a 10 x 10<-9>g/ml.
Costituisce ulteriore oggetto della presente invenzione un mezzo di coltura cellulare, per l’espansione di pinopodi e l’ottenimento di un modello di studio in vitro.
Tale mezzo di coltura cellulare può essere impiegato anche per colture embrionali, realizzando ad esempio un terreno di coltura che à ̈ utilizzato per trasferire l’embrione in utero, un terreno che à ̈ quindi inserito in utero.
Aspetti particolarmente vantaggiosi dell’uso secondo la presente invenzione sono legati alla modalità di somministrazione topica proposta che non compromette il ciclo di trattamento di PMA, essendo una modalità molto meno invasiva della biopsia endometriale già applicata in donne sottoposte a ciclo di PMA (13). Infine, grazie alle proprietà di inibizione della sintesi delle prostaglandine (14), proprie della melatonina, questo lavaggio diminuisce le contrazioni dell’utero e favorisce ulteriormente l’impianto.
La presente invenzione verrà ora descritta a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo due forme preferite di realizzazione con particolare riferimento alle figure allegate, in cui:
- la Figura 1 mostra l’endometrio prima del trattamento con la composizione secondo la presente invenzione, quindi in assenza dei pinopodi;
- la Figura 2 mostra l’endometrio a 1/2 giorni dal trattamento con la composizione secondo la presente invenzione: inizia a vedersi la formazione dei pinopodi;
- la Figura 3 mostra l’endometrio a 3/4 giorni dal trattamento con la composizione secondo la presente invenzione: massimo sviluppo dei pinopodi;
- la Figura 4 mostra l’endometrio a 5/6 giorni dal trattamento con la composizione secondo la presente invenzione: inizia lo sfaldamento dei pinopodi che si mostrano irregolari(apoptosi cellulare).
A titolo esemplificativo, ma non limitativo della presente invenzione, si riportano di seguito gli studi comparativi condotti (in vitro ed in vivo) dagli autori della presente invenzione per valutare l’incremento della percentuale d’impianto embrionale umano in tecnologie di PMA attraverso l’utilizzo di melatonina.
ESEMPIO 1: Studio in vivo
MATERIALI E METODI
La melatonina (o N-acetil-5-metossitriptamina; Numero CAS 73-31-4) utilizzata à ̈ stata ottenuta presso la Farmalabor come prodotto in polvere con titolo ≥99%.
Il mezzo di coltura utilizzato per la somministrazione della melatonina attraverso lavaggio (o irrigazione) endometriale all’interno della cavità uterina delle pazienti in seguito a prelievo ovocitario à ̈ il Sydney IVF® Blastocyst medium fornito dalla Cook Ireland Ltd. (Numero catalogo G20722 e G20929).
Tale mezzo di coltura à ̈ utilizzato normalmente per migliorare il clivaggio, differenziamento ed espansione in vitro della blastocisti.
Il terreno contiene D-glucosio, tutti i 20 L-amminoacidi essenziali, la L-taurina, Gentamicina, albumina sierica umana, calcio lattato, calcio pantotenato; cloruro di sodio, bicarbonato di sodio e sodio piruvato; cloruro di potassio, fosfato di potassio; magnesio cloruro, magnesio solfato; acqua purificata.
Altre caratteristiche del mezzo di coltura:
pH: 7,5 - 7,8 (utilizzo tampone bicarbonato).
Osmolarità: 280-290 mOsm/kg
Endotossine : < 0,4 EU/ml
MEA: ≥ 80%
Analisi statistica
E’ stata condotta un’analisi statistica (IMPRUN.TXT) di regressione lineare a più variabili
Metodi statistici:
Il ruolo del numero di embrioni impiantati, della loro qualità e del procedimento di lavaggio con la soluzione contenente la melatonina nell’aumentare la probabilità di concepimento à ̈ stato calcolato mediante regressione logistica non condizionale, aggiustando in funzione dell’età materna.
Il rapporto tra la probabilità di concepimento associata a ciascuna procedura (numero di embrioni, loro qualità ed applicazione del procedimento di lavaggio con Blastocyst medium contenente la melatonina) e la probabilità di concepimento in riferimento rispettivamente alla categoria inferiore di numero di embrioni (uno), alla qualità meno che ottimale degli embrioni impiantati, o alla assenza del procedimento di lavaggio, à ̈ stato definito come Odds Ratio (OR), ed à ̈ stato calcolato mediante regressione logistica non condizionale, aggiustando in funzione dell’età materna.
Nella regressione logistica, l’OR corrisponde all’antilogaritmo su base naturale del coefficiente di regressione β associato a ciascuna covariata nel modello di regressione.
Il valore così calcolato esprime pertanto il vantaggio ottenuto con ciascuna procedura, indipendentemente dalle altre condizioni.
Gli intervalli di confidenza al 95% (IF95%) a due code degli OR sono stati calcolati con la formula diWald (e<β ± (z>α/2<* se>β<)>).
Controlli di sterilità
Per effettuare i controlli di sterilità del mezzo di coltura addizionato con melatonina à ̈ stato impiegato uno strumento BACT/ALERT 3D-60 (BIOMERIEUX). I flaconi di coltura Bact/ALERT trovano impiego nei sistemi di rilevazione microbica in procedure qualitative per il recupero e la rilevazione di microrganismi anaerobici e aerobici facoltativi (batteri) nel sangue e altri fluidi normalmente sterili come il Blastocyst medium utilizzato nella presente sperimentazione.
Il sistema di rilevazione microbica Bact/ALERT viene utilizzato per determinare se nei campioni di sangue o di altri fluidi normalmente sterili come il blastocyst medium da noi utilizzato, con sospetta batteriemia sono presenti microorganismi. Il sistema Bact/ALERT ed i flaconi di coltura offrono un sistema di rilevazione microbica e un terreno di coltura con condizioni ambientali e nutrizionali adatte ai microrganismi comunemente presenti nelle infezioni del sangue e di altri fluidi normalmente sterili.
I flaconi inoculati (da un min di 5 ml ad un massimo di 10 ml di campione in esame) vengono incubati nello strumento, dove sono sottoposti a monitoraggio continuo ai fini della rilevazione dell’eventuale crescita di microrganismi nei flaconi Bact/ALERT.
Il sistema di rilevazione microbica Bact/ALWERT utilizza un sensore colorimetrico e luce riflessa per monitorare la presenza e la produzione di anidride carbonica (CO2) disciolta nel terreno di coltura.
I microorganismi eventualmente presenti nel campione metabolizzano i substrati nel terreno di coltura producendo anidride carbonica. La produzione di CO2determinata dalla crescita dei microorganismi induce il sensore gas permeabile verde-azzurro presente sul fondo di ogni flacone di coltura ad assumere una colorazione gialla.
La colorazione più chiara indica un aumento delle unità di riflettanza monitorale dal sistema.
La riflettanza del flacone viene monitorata e registrata dallo strumento ogni 10 minuti.
I flaconi di coltura sono determinati positivi o negativi dal software di gestione dei sistemi di rilevazione microbica Bact/ALERT dopo 6 giorni di incubazione.
Non à ̈ necessario alcun intervento fino a quando lo strumento Bact/ALERT non segnala un flacone di coltura positivo o negativo.
Pazienti
Le pazienti sottoposte a fecondazione assistita sono state randomizzate il giorno del prelievo ovocitario in tre gruppi:
Gruppo A: 430 pazienti da sottoporre a irrigazione endometriale con 1,5 ml di soluzione fisiologica. Gruppo B: 436 pazienti da sottoporre a irrigazione endometriale con una soluzione di 1,5 ml di soluzione fisiologica addizionato con concentrazione finale di melatonina (10x10 g/ml).
Gruppo C: pazienti non sottoposte a irrigazione endometriale.
Arruolamento in vivo di pazienti sottoposte a fecondazione assistita per irrigazione endometriale con concentrazione nota (concentrazione finale di 10x10<-9>g/ml) di melatonina al momento del prelievo ovocitario e correlata visualizzazione ecoguidata del diametro di falda liquida creatasi nel fondo dell’utero.
Prima di effettuare qualsiasi irrigazione endometriale sono stati eseguiti esami colturali per prova di sterilità a 2-4-6 giorni e una volta riscontrata la coltura negativa veniva utilizzata in utero.
Lo studio à ̈ stato effettuato coinvolgendo pazienti in diversi centri privati specializzati in PMA, quali il Centro di BRA, il Centro Promea di Torino e di Cagliari, il Centro Genera di Perugia e il centro pubblico policlinico di Bari. A tali centri à ̈ stato inviato il mezzo di coltura addizionato con melatonina dopo averlo sottoposto alle prove di sterilità per eseguire il seguente protocollo di trattamento.
In breve, il trattamento consiste in un lavaggio endometriale all’interno della cavità uterina senza alcuna cellula in cocultura, impiegando solo mezzo di coltura addizionato con la melatonina con concentrazione finale di 10x10<-9>g/ml (precedenti studi erano stati effettuati con un terzo e la metà della concentrazione finale poi mantenuta senza dare gli stessi risultati - dati non mostrati).
Eseguito il prelievo ovocitario, (momento corrispondente all’ovulazione dopo la somministrazione dell’HCG nei protocolli di PMA) dopo aver controllato l’emostasi vaginale, à ̈ stata raccordata una siringa sterile da 2,5 ml ad un catetere intrauterino monolume con apertura apicale ed à ̈ stato aspirato il mezzo di coltura (Blastocyst medium) modificato con aggiunta di melatonina fino ad un volume di 1,5 ml.
E’ stato introdotto il catetere nell’orifizio interno uterino con le medesime modalità con cui l’operatore effettua l’embryo-transfer (ET) convenzionale.
Quindi à ̈ stato iniettato lentamente il medium modificato e, a fine irrigazione, lo spessore della falda liquida endocavitaria à ̈ stato misurato con ecografia transaddominale (lavaggio ed ecografia devono essere contemporanei, la falda liquida arriva a circa 10 mm e poi scompare subito).
RISULTATI
In vivo lo studio multicentrico ha coinvolto 863 pazienti sottoposte a fecondazione assistita e a irrigazione endometriale (misure ecografiche falda liquida) con melatonina che a 3-4 giorni da questo sono state sottoposte a trasferimento embrionale. Per quest’ultimo à ̈ stato calcolato con analisi statistica (IMPRUN. TXT) di regressione lineare a più variabili il CI (intervallo di confidenza o intervallo fiduciale) del 95%.
L’analisi univariata mostra che l’impianto di 3 embrioni comporta un significativo aumento, pari a circa 3 volte (OR=2,8, IF 95% 1,7-4,4), della probabilità di concepimento.
Un numero di embrioni pari a due non appare invece sufficiente a migliorare la probabilità di concepimento (OR=1,0, IF 95% 1,7-4,4).
D’altra parte, anche la qualità ottimale degli embrioni impiantati appare essere un fattore importante nell’aumentare la probabilità di concepimento (OR = 2.9, IF 95% 1.8 - 4.7). Nell’analisi univariata, lo stesso grado di rilevanza appare associato al ricorso alla procedura di lavaggio (OR = 2.2, IF 95% 1.6 - 2.9).
L’analisi multivariata permette di controllare l’effetto indipendente di ciascuna variabile, al netto, quindi, dell’effetto delle altre procedure applicate e dell’età materna. In questo caso, il ricorso alla procedura di lavaggio raddoppia la probabilità di successo del concepimento (OR = 2.2, IF 95% 1.6 - 3.0).
Un miglioramento analogo risulta associato all’impianto di tre embrioni, piuttosto che all’impianto di un solo embrione (OR = 2.1, IF 95% 1.2 - 3.7), e al ricorso ad embrioni di qualità ottimale (OR = 1.9, IF 95% 1.1 - 3.3).
Il ricorso a tutte le tre procedure precedentemente riportate sembra pertanto costituire la scelta di elezione nelle procedure di fecondazione assistita. In conclusione, gli studi in vivo hanno dimostrato che l’irrigazione di melatonina delle cellule endometriali consente di ottenere il doppio delle gravidanze rispetto agli altri due gruppi che non si diversificavano significativamente.
Ciò consente di ottenere un valido e innovativo presidio per l’aumento delle percentuali d’impianto in tecniche di fecondazione assistita (ART).
ESEMPIO 2: Studio in vitro
MATERIALI E METODI
La melatonina e il mezzo di coltura impiegati sono i medesimi utilizzati per lo studio in vivo.
Microscopia elettronica (SEM)
E’ stato utilizzato un microscopio elettronico ad emissione di campo ad alta risoluzione modello FE HITACHI S 4000 operante a 15-20 KW.
Allestimento preparati
Piccoli pezzi di tessuto endometriale di circa 1 mm di grandezza subito dopo il prelievo dalla paziente sono stati posti in una soluzione fissativa composta da paraformaldeide 1% e gluteraldeide 0,5% in tampone cacodilato 0,1 M pH 7,2 per un tempo di 3 ore.
Dopo questa fissazione i pezzi vengono lavati in PBS 20 min x 3 volte (1 ora totale) e quindi si effettua la post fissazione in una soluzione di tetrossido di osmio 2% e ferrocianuro di potassio 2,5%.
Il preparato viene mantenuto al buio per 3 ore quindi si procede ad un lavaggio accurato in rotazione in PBS, con 4 ricambi di 20 min ciascuno.
Si procede alla disidratazione dei campioni di tessuto con acetone in serie ascendente con 3 ricambi in 1 ora per ogni gradazione 50%-70%-80%-90%-95% e 2 ricambi con acetone puro.
A questo punto si procede all’essiccazione al punto critico con CO2liquida nell’apposito apparecchio ad alta pressione che sostituisce l’acetone al 10% con CO2liquida, poi si porta lentamente alla temperatura di punto critico e la CO2evapora. A questo punto i campioni di tessuto sono perfettamente anidri e possono essere montati sui portapreparati del microscopio elettronico.
I campioni vengono attaccati con uno speciale biadesivo conduttore di elettricità e per posizionarli si usano due sottilissimi aghi e il preparato à ̈ pronto per essere osservato con microscopio elettronico a scansione (SEM).
Campioni biologici
Previo consenso informato, sono stati posti in coltura frammenti di endometrio prelevato da pazienti sottoposte ad isteroscopia diagnostica.
Per ogni paziente sono stati allestiti due bracci: una parte del tessuto à ̈ stata messa in coltura con terreno convenzionale Blastocyst Medium privo di melatonina, una parte con terreno convenzionale Blastocyst medium addizionato con melatonina.
Allestimento colture
Coltura in vitro di endometrio (prelevato mediante isteroscopia dalle pazienti sottoposte a controlli pre-fecondazione assistita) con melatonina per 3-6 giorni e correlata visualizzazione di pinopodi mediante microscopia elettronica (SEM).
RISULTATI
Gli studi in vitro hanno dimostrato che la cocoltura da 3 a 5 giorni di tessuto endometriale in provetta con aggiunta permanente di melatonina, comporta un aumento indiscutibile dei pinopodi (a livello di microscopia elettronica (SEM)), a prescindere dall’età della paziente e dalla fase del ciclo mestruale in cicli spontanei o manipolati con stimolazione farmacologica di super-ovulazione, rispetto alla coltura di controllo. Tali pinopodi sono strutture definite fra i marker più importanti d’impianto che per ogni donna (con variabilità di 5 giorni, ovvero una donna può mestruare a 26 giorni con ciclo corto o mestruare a 33 giorni) à ̈ di 48 ore. Di fatto, i due terzi del successo nell’instaurarsi di una gravidanza dipendono dal corretto momento d’impianto, l’altro terzo dipende dalla qualità dell’embrione.
L’esame al microscopio elettronico SEM ha dimostrato che l’aggiunta di melatonina porta ad una completa espressione morfologica dei pinopodi come mostrato nelle Figure 1-4.
Ciò sottolinea l’importanza dei pinopodi durante la finestra d’impianto e l’aumento dell’espressione degli stessi indotta in coltura con terreni addizionati con melatonina.
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Claims (15)

  1. RIVENDICAZIONI 1. N-acetil-5-metossi triptamina o un suo analogo, per l’uso in campo medico o veterinario nella fecondazione assistita per la prevenzione del fallimento dell’impianto nell’utero mediante somministrazione topica di una quantità efficace in un soggetto mammifero di sesso femminile che necessita di tale trattamento.
  2. 2. N-acetil-5-metossi triptamina o un suo analogo secondo la rivendicazione 1, in cui detto analogo à ̈ scelto tra agomelatina, 6-idrossi melatonina solfato, serotonina, 5 idrossitriptofano o loro derivati.
  3. 3. N-acetil-5-metossi triptamina o un suo analogo secondo ognuna delle rivendicazioni 1-2, in cui detto soggetto mammifero di sesso femminile à ̈ una donna affetta da infertilità o poliabortività.
  4. 4. N-acetil-5-metossi triptamina o un suo analogo secondo ognuna delle rivendicazioni 1-3, in cui detta somministrazione topica avviene mediante irrigazione endometriale.
  5. 5. N-acetil-5-metossi triptamina o un suo analogo, secondo ognuna delle rivendicazioni 1-4, in cui detta somministrazione topica viene effettuata in un’unica somministrazione al momento del prelievo ovocitario.
  6. 6. N-acetil-5-metossi triptamina o un suo analogo, secondo ognuna delle rivendicazioni 1-5, in cui detto principio attivo à ̈ presente in una concentrazione variabile da 4 x 10<-9>g/ml a 25 x 10<-9>g/ml, preferibilmente superiore o uguale a 10 x 10<-9>g/ml.
  7. 7. N-acetil-5-metossi triptamina o un suo analogo secondo ognuna delle rivendicazioni 1-6, per l’uso concomitante mediante somministrazione sistemica di N-acetil-5-metossi triptamina, HCG o progesterone, o una loro combinazione, dal giorno del prelievo ovocitario.
  8. 8. N-acetil-5-metossi triptamina o un suo analogo secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti, in cui le tecniche di fecondazione assistita sono scelte dal gruppo che consiste in rapporti mirati; inseminazione intrauterina (IUI); fertilizzazione in vitro (IVF); iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi (ICSI), iniezione intracitoplasmica di spermatozoi morfologicamente selezionati (IMSI) e tecniche Tese-Tesa (Testicular Sperm Extraction).
  9. 9. Composizione atta alla somministrazione topica comprendente N-acetil-5-metossi triptamina o un suo analogo, o una loro combinazione come principio attivo, preferibilmente N-acetil-5-metossi triptamina, in una quantità efficace per la prevenzione del fallimento dell’impianto nell’utero nella fecondazione assistita, insieme ad uno o più eccipienti o adiuvanti fisiologicamente accettabili.
  10. 10. Composizione secondo la rivendicazione 9, in cui detto principio attivo à ̈ presente in una concentrazione variabile da 4 x 10<-9>g/ml a 25 x 10<-9>g/ml, preferibilmente superiore o uguale a 10 x 10<-9>g/ml.
  11. 11. Composizione secondo ognuna delle rivendicazioni 9-10, in cui detto principio attivo à ̈ formulato come irrigazione endometriale in un mezzo di coltura cellulare ad una concentrazione finale variabile da 4 x 10<-9>g/ml a 25 x 10<-9>g/ml, preferibilmente superiore o uguale a 10 x 10<-9>g/ml.
  12. 12. Composizione secondo la rivendicazione 11, in cui detto mezzo di coltura per blastocisti, comprende le seguenti componenti: – fonte di D-glucosio - antibiotico, preferibilmente Gentamicina - albumina sierica umana - amminoacidi essenziali e non essenziali, preferibilmente L-taurina, - sali di calcio: calcio lattato, calcio pantotenato; - sali di sodio: cloruro di sodio, bicarbonato di sodio e sodio piruvato; - sali di potassio: cloruro di potassio, fosfato di potassio; - sali di magnesio: magnesio cloruro, magnesio solfato; - acqua; e ha un pH compreso tra 7,5 e 7,8.
  13. 13. Composizione secondo la rivendicazione 12, in cui detto mezzo di coltura à ̈ il Sydney IVF ®Blastocyst medium.
  14. 14. Mezzo di coltura cellulare in vitro o in vivo, comprendente: – fonte di D-glucosio - antibiotico, preferibilmente Gentamicina - albumina sierica umana - amminoacidi essenziali e non essenziali, preferibilmente L-taurina, - sali di calcio: calcio lattato, calcio pantotenato; - sali di sodio: cloruro di sodio, bicarbonato di sodio e sodio piruvato; - sali di potassio: cloruro di potassio, fosfato di potassio; - sali di magnesio: magnesio cloruro, magnesio solfato; - acqua; caratterizzato dal fatto di comprendere ulteriormente N-acetil-5-metossi triptamina o un suo analogo, o una loro combinazione, in cui detto principio attivo à ̈ presente in una concentrazione variabile da 4 x 10<-9>g/ml a 25 x 10<-9>g/ml, preferibilmente superiore o uguale a 10 x 10<-9>g/ml.
  15. 15. Uso del mezzo di coltura cellulare secondo la rivendicazione 14, per l’espansione di pinopodi e l’ottenimento di un modello di studio in vitro.
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