CN102480931B - 精子用稀释液以及使用其的人工授精方法 - Google Patents

精子用稀释液以及使用其的人工授精方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种精子用稀释液，其含有基础稀释液和能与钙离子形成络合物的EDTA、EGTA等螯合剂。进而，含有抑制类固醇激素、细胞因子等白血球的游走的免疫抑制因子。通过用该精子用稀释液稀释冷冻精子以进行人工授精，能够抑制精子在受精前灭绝、精子或胚胎在子宫内被白血球吞食，从而能够提高受胎率以及着床率。

Description

精子用稀释液以及使用其的人工授精方法
技术领域
本发明涉及用于非人类哺乳动物、特别是猪等的人工授精用冷冻精子的稀释的精子用稀释液，以及使用该精子用稀释液的人工授精方法。
背景技术
人工授精法在畜产领域是重要的技术。至今，家畜的人工授精以牛为中心发展起来。但是，其受胎率还有改善的余地，进而，对于牛以外的家畜，其状况是还没有充分确立人工授精技术。
例如，日本的养猪产业中主要进行自然交配，由于需要饲养种雄猪，因此花费经费。另外，种雄猪体重达到300kg以上则作业也产生危险。进而，自然交配时由于需要很多体力，因此妨碍由交配得到的优良品种的育成(例如，肉质、产子数优异的品种的改良)的高效发展。
现在，日本的养猪产业中，尽管有进行人工授精法的例子，但现在的体制中，由于在经营者订货后发送液状精液，相对于种雌猪的突然发情而产生时间差，有时会错失发情。
因此，对于各经营者而言，期望开发出能够保管冷冻精液以应对种雌猪突然发情的技术。但是，就对于猪使用了冷冻精液的人工授精而言，冷冻解冻后的精液的运动性显著地降低，其受精能也低，进而，受胎率因季节、品种等要因而变化，受胎率、一胎总产子数低(非专利文献1以及非专利文献2)，因此相当于在养猪产业领域中完全没有实行。
现有技术文献
非专利文献：
非专利文献1：冈崎哲司另外2人，“ブタ凍結融解精子的運動性·着床率に及ぼす希釈液の渗透压とGlycerol濃度の影(稀释液的渗透压和甘油(Glycerol)浓度对猪冷冻解冻精子的运动性和着床率的影响”，日本畜产学会第107回大会，一般讲演V29-29
非专利文献2：豚凍結精液利用技術マニュァル(猪冷冻精液利用技术手册)(责任编辑丹羽太左卫门1989)，社团法人日本家畜人工授精师协会
发明内容
发明所要解决的问题
本发明人等提出了人工授精法，该人工授精法使用从采集到的精子除去精浆并冷冻后的冷冻精子(日本特愿2007-325313)。通过对溶解在含有精浆的稀释液中的冷冻精子进行人工授精，可以提高受胎率。
但是，因为精浆中含细菌等病原体，所以从食用安全的观点出发而受到关注，存在不能用于“无特定疾病SPF(Specific Pathogen Free)猪”的生产的问题。
另外，添加于稀释液的精浆，其成分因个体间、季节而变化，因此受胎率和着床率容易变得不稳定。
进而，需要饲养用于确保精浆的种雄猪。
本发明是鉴于上述情况而完成的，其目的在于提供一种精子用稀释液以及使用其的人工授精方法，该精子用稀释液虽然是不含精浆的精子用稀释液，但可以获得与含精浆的稀释液相同或更高的受胎率。
解决问题的手段
根据本发明的第一方面实施方式的精子用稀释液的特征在于，含有能够与钙离子形成络合物的螯合剂。
另外，所述螯合剂优选是EGTA。
另外，所述螯合剂优选是EGTA和EDTA。
进而，优选含有抑制白血球的游走的免疫抑制因子。
另外，所述免疫抑制因子优选是从类固醇激素和细胞因子中选择的一种以上。
所述类固醇激素优选是从皮质醇和皮质醇衍生物中选择的一种以上。
另外，所述皮质醇衍生物优选是从地塞米松、泼尼松以及氢化可的松中选择的一种以上。
另外，所述细胞因子优选是从巨噬细胞游走抑制因子以及SerpinE1中选择的一种以上。
另外，优选用于除去精浆并冷冻后的冷冻精子的稀释。
另外，所述冷冻精子优选是非人类哺乳动物的冷冻精子。
另外，所述非人类哺乳动物优选是多胎动物。
另外，所述多胎动物优选是猪。
根据本发明第二方面实施方式的人工授精方法的特征在于，对于从非人类哺乳动物中采精得到的精液中除去精浆并冷冻后的冷冻精子，通过上述的精子用稀释液稀释来调制人工精液，将所述人工精液注入所述非人类哺乳动物的子宫内来进行人工授精。
另外，作为所述非人类哺乳动物，优选使用多胎动物。
另外，作为所述多胎动物，优选使用猪。
发明效果
本发明的精子用稀释液，由于不含任何精浆，因此没有细菌感染的问题，可以在无特定疾病SPF猪的生产中利用。
另外，由于不使用精浆，因此没有季节、采集精浆的个体差异的影响，可以实现稳定的人工授精。
进而，因为不需要精浆，所以还有如下优点，即不必为了确保精浆而饲养很多雄猪。
附图说明
图1是表示实验例1中的精子蛋白质酪氨酸残基的磷酸化检测结果的图。
图2是表示实验例2中的精子运动率的测定结果的图。
图3是表示实验例2中的精子运动率的测定结果的图。
图4是表示实验例2中的精子蛋白质酪氨酸残基的磷酸化检测结果的图。
图5是表示实验例2中的精子顶体损伤率的测定结果的图。
图6是表示实验例2中的被摄入精子中的钙离子的观察结果的图。
图7是表示实验例2中的精子蛋白质酪氨酸残基的磷酸化检测结果的图。
图8是表示实验例2中的精子运动率的测定结果的图。
图9是表示实验例3中的精浆中的细胞因子的检测结果的图。
图10是表示实施例2中的子宫内白血球数的相对值的图。
具体实施方式
(精子用稀释液)
本发明人等发现：冷冻精子，在解冻后由于产生精子的机能障碍导致精子灭绝从而人工授精的受精率低，而在使用添加有精浆的稀释液的情况下该机能障碍得以抑制，显示出高繁殖成绩。还发现下述情况并完成了本实施方式的精子用稀释液：对于该机能障碍，钙离子的存在影响精子的运动性和蛋白质的酪氨酸残基的磷酸化。
根据本实施方式的精子用稀释液，在后述的基础稀释液中含有能够与钙离子形成络合物的螯合剂。精子用稀释液通过含有螯合剂，从而在对冷冻精子进行解冻之际，能够抑制由于钙离子的参与而发生的精子的蛋白质的磷酸化，从而能够抑制机能障碍。
更详细说明的话，在精子的中段部存在线粒体，因而在此处生产精子运动所用的能量(ATP)。对于线粒体(更具体而言，是产生ATP的酶)，当钙离子发生作用时则ATP的生产被活化，虽然精子变得剧烈运动，但如果精子早早被活化则精子在到达卵管前就灭绝了。
根据本实施方式的精子用稀释液，在稀释液中含有螯合剂，通过该螯合剂与钙离子形成络合物，从而抑制钙离子作用于精子的线粒体。
根据本实施方式的精子用稀释液，通过在基础稀释液中添加能够与钙离子形成络合物的螯合剂而得到。
这里，所谓基础稀释液，是指调制成使采精后的精液在室温下一定时间内，可以保持其精液中的精子所具有的机能不降低的稀释液，是含葡萄糖、柠檬酸钠、重碳酸钠、EDTA-2Na、柠檬酸、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、氯化钾等成分的液体。作为基础稀释液，只要是该领域中通常使用的液体即可，没有特别限定，例如，可以举出，Modena液(モデナ液，商品名)(0.15M葡萄糖，26.7mM柠檬酸钠，11.9mM碳酸氢钠，15.1mM柠檬酸，6.3mM EDTA-2Na，46.6mM三羟甲基氨基甲烷和1,000IU/ml青霉素)等。
作为螯合剂，只要是能够与钙离子特异性地形成络合物的物质即可，没有特别限定，但优选使用乙二醇四乙酸(EGTA，ethylene glycol Bis(2-aminoethyl)-N，N，N’，N’-tetra acetic acid))。EGTA由于特定地与钙离子形成络合物，因此可以有效抑制钙离子作用于精子的线粒体。
另外，优选与EGTA一同使用乙二胺四乙酸(EDTA(ethylene diaminetetraacetic acid))。EDTA是除钙离子外，还能与镁离子、锌离子等各种二价离子形成络合物的物质。
如果同时添加EDTA和EGTA，则可以对用EDTA没能螯合的钙离子而通过EGTA进行螯合，可以将基础稀释液中存在的几乎全部钙离子螯合。例如，使用EDTA作为螯合剂时，如果想要用EDTA螯合全部的钙离子，则必须使基础稀释液中添加的EDTA的浓度很高。基础稀释液中含有钙离子以外的镁离子、锌离子等各种二价离子，如果EDTA的浓度过高，则有可能连这些二价离子也被过度螯合，可能影响精子机能(受精)。因此，优选同时添加EDTA和EGTA双方。
在同时添加EDTA和EGTA双方的情况下，根据后述的实验结果可知，优选精子用稀释液中的EDTA的浓度为3～9mM/L左右，EGTA的浓度为3～9mM/L左右，更优选EDTA的浓度为6.3mM，EGTA的浓度为6mM。
进而，精子用稀释液中，为了使精子、胚胎等在子宫内不被白血球吞食，优选含有免疫抑制因子。这是因为：对于雌性来说精子是异物，所以精子侵入子宫内的话则导致中性白细胞、巨噬细胞等白血球游走，从而使得精子、胚胎被吞食进而影响着床率。
所谓着床率，是指子宫内胎儿相对于卵子数目的比例。特别是，对于猪等多胎动物，由于排出10～20个卵子，所以，从生产效率上来说，要求一次使更多的卵子受精，生产多胎。
可以认为：在自然交配中，由于不易产生上述的吞食，可以认为精液中的精浆中含抑制白血球的游走的免疫抑制因子，该免疫抑制因子抑制过度的白血球增加，防止其后对胚胎的攻击。
因此，精子用稀释液中，如果含有能够抑制白血球的游走的免疫抑制因子，则可以抑制精子、胚胎被吞食，可以实现着床率的提高。
作为该免疫抑制因子，优选类固醇激素、细胞因子。
作为类固醇激素，优选是精浆所含成分的皮质醇(cortisol)。通过使稀释液中含有皮质醇，使细胞性免疫机构不发挥功能，阻碍了白血球等游走。由此，精子、胚胎的吞食得以抑制，能够实现着床率的提高。
在用于猪的人工授精的情况下，1次人工授精所用的精子用稀释液中添加的皮质醇的量优选为100ng～10,000ng左右。更优选为500ng～5,000ng。这与自然交配中的雄猪射出的整个精浆中所含的皮质醇的量大致等量。
需要说明的是，由于下述原因，即皮质醇含于原本的精浆中，注入子宫内后1～2日内被分解而排出体外，另外，由于局部注入因而不扩散到整个身体，所以对生物体无不良影响，不会发生生产出畸形子猪等弊端。
另外，作为其他的类固醇激素，对于皮质醇衍生物地塞米松(dexamethasone)、泼尼松(prednisolone)或氢化可的松(hydrocortisone)等，可以认为其化学转化为皮质醇，从而也可以发挥同样的免疫抑制作用，所以也可以使用它们。
作为细胞因子，优选巨噬细胞游走抑制因子(MIF，macrophage migrationinhibitory factor)、Serpin E1等。巨噬细胞游走因子和Serpin E1均为精浆中所含的物质。
巨噬细胞游走抑制因子和Serpin E1等细胞因子是信号传递物质，抑制在子宫内不必要地聚积中性白细胞、巨噬细胞等白血球，发挥免疫抑制作用。
(人工授精方法)
对于使用上述精子用稀释液的人工授精方法进行说明。作为例示，以下对猪的人工授精方法进行说明。
将从雄猪的精液中除去精浆并冷冻后的冷冻精子进行解冻，解冻后立即添加到精子用稀释液中，调制人工精液。或者，也可以在冷冻精子解冻时将冷冻精子添加到精子用稀释液中。
更详细地，关于冷冻精子的解冻，在使用填充到5ml吸管中冷冻后的精子的情况下，在37℃进行60秒解冻，在0.5ml吸管的情况下，在35℃进行20秒，优选在37℃进行20秒，更优选在70℃进行8秒，尤其优选在60℃的温水中进行8秒。或者，也可以在冷冻精子中直接添加精子用稀释液。
一次猪人工授精所用的人工精液的量为50ml左右，可以将人工精液中的精子的最终浓度调节为1×106细胞/ml～1×109细胞/ml、优选1×108细胞/ml水平。
通过在面临发情期的雌猪的子宫内注入调制好的人工精液，即可进行人工授精。
雌猪在人工授精后，约114日龄分娩。分娩后，子猪经20～40日龄的母乳期间而断奶，断奶4日后左右雌猪再次发情。对应于雌猪的再次发情，可与上述同样地进行人工授精。通过以这种循环进行人工授精，可以使一头雌猪在一生中生产更多的子猪。
需要说明的是，精子用稀释液能够在冷冻库中简易地保管。因此，可以在需要时解冻使用，可以对应雌猪等发情期的时机而容易地使用。
用于本实施方式的精子用稀释液所稀释的冷冻精子，优选使用从精液中除去精浆并冷冻后的冷冻精子。由此，可以进行完全无菌状态下的人工授精，例如，可以用于无特定疾病SPF猪的生产。
另外，根据哺乳动物的种别，在冷冻精液之际，存在由于精浆对冷冻有不良影响而不能进行冷冻，而难以人工授精的情况。对于这种情况下，也可以除去精浆并冷冻精子，通过用本实施方式的精子用稀释液来稀释该冷冻精子，从而可以进行人工授精。
另外，本实施方式的精子用稀释液可以用于任一种非人类哺乳动物的人工授精。
另外，本实施方式的精子用稀释液，可以用于家畜等非人类哺乳动物，特别适用于多胎动物的人工授精。由于在猪等多胎动物中着床率高，因此可以一次出产多胎，可以提高生产效率。
另外，就猪等而言，使用仅从血统优良的雄猪采集的精子，也有利于肉质改善等的育种改良等繁殖技术的提高。
另外，由于完全不使用精浆，因此不必饲养大量的种雄猪等。
(实验例1)
用含Ca2+培养基培养猪的精子，研究Ca2+对精子的蛋白质的酪氨酸残基的磷酸化的影响。
作为含Ca2+培养基，使用的是mTBM(modified Tris-buffer medium)。mTBM组成如表1所示。
[表1]
  11mM  葡萄糖
  5mM  丙酮酸钠
  113.1mM  NaCl
  3mM  KCl
  7.5mM  CaCl2·2H2O
  20mM  Tris
  0.1％(w/v)  BSA(牛血清白蛋白)
另外，所使用的猪的精子是如下采精并冷冻后的精子。将用于采精的雄猪在各个分别的猪房中分别饲养，早晚2次喂食共计2.5kg的种猪用饲料。对猪接种日本脑炎和猪细小病毒感染症疫苗。本研究中，选择对猪繁殖·呼吸障碍症候群(PRRS)、伪狂犬病为抗体阴性的猪。间隔1周进行采精。采精前，喂食，确认疾病征兆等，确认是良好的猪，不使猪兴奋而进行采精。
将假母台放入雄猪的猪房内，将雄猪放在台上，用生理盐水清洗阴茎以及包皮内，并除去尿。采精用手压法进行，用纱布覆盖预先灭菌的杯子，一边除去与精液一同流出的果冻状的物质即胶样物，一边将精液装入杯中。精液仅采集最初的50～100mL的浓厚份(存在总精液量的约8成的精子)，采精后立即通过离心分离从精液中除去精浆。
其后，用预处理液稀释精子，用2.5小时使其达到15℃，通过离心除去上清后，在渗透压400mOsm/kg的溶液中保持约1.5小时，同时冷却至4～5℃。需要说明的是，所使用的溶液是将NSF(Niwa and Sasaki freezing extender；80％(v/v)，0.31mol单乳糖水合物(Lactosemonohydrate)，20％(v/v)蛋黄(egg yolk)，1000U/ml青霉素G钾(penicillin G potassium)，1mg/ml硫酸链霉素(strept omycin sulfate)；渗透压300mOsm/kg)用超纯水调制成渗透压400mOsm/kg而得到的溶液。接着添加耐冻剂和0.15％的OEP(Orvus EsPaste界面活性剂)。另外，添加等量的二次稀释液。使该情况下的精子浓度为1×109细胞/ml。添加耐冻剂后，保持在4～5℃30分左右，然后冷冻。冷冻使用的是液体氮。将除去了精浆的精子填充到吸管中后，在距离液体氮表面4cm左右的地方，在液体氮蒸气中冷冻10分钟，然后保存在液体氮中。
将如上所述得到的猪的冷冻精子在60℃解冻8秒，将精子添加到含Ca2+培养基(mTBM)中，进行精子的培养。培养进行3小时。
另外，作为参考例1，使用含精浆培养基，与上述同样地添加精子进行培养。含精浆培养基，是在上述的含Ca2+培养基(mTBM)中添加精浆至终浓度10％(v/v)而调制得到。需要说明的是，精浆是如下调制来使用的，即，如上所述，通过离心分离从采精得到的精液中除去精子后，进而通过离心分离从其上清除去固形物。
另外，作为参考例2，使用不含Ca2+培养基，与上述同样地添加精子来进行培养。不含Ca2+培养基是从上述含Ca2+培养基(mTBM)中除去Ca成分(CaCl2·2H2O)来调制的。
培养后，各培养了精子的培养基分别取出20μl，保存在+80℃，用于蛋白质的酪氨酸残基的磷酸化检测。酪氨酸残基的磷酸化检测是通过免疫印记法检测的。
利用免疫印记法进行的酪氨酸残基的磷酸化检测如下。向在+80℃保存的精子中添加SDS样品缓冲液17μl，移液。以10,000rpm离心2分钟，进行2分钟的超声波处理，之后，在100℃加热5分钟，在100V下电泳2小时左右。转印到膜上，用添加5％BSA的TBS进行封闭后，向添加有0.5％BSA和0.1％Tween20的TBS(20mMTris-HCl，pH7.5，0.15MNaCl)中添加1∶2,000稀释后的抗磷酸化酪氨酸抗体(一次抗体，小鼠IgG)，在4℃使其在膜上反应12小时。用添加有0.1％Tween20的TBS清洗2小时后，使添加有0.5％BSA和0.1％Tween20的TBS与1∶2,000稀释后的抗小鼠IgG抗体(二次抗体)反应1小时。用添加有0.1％Tween20的TBS清洗1小时。添加发色基质，反应5分钟，使膜感光。
培养后的精子中的精子蛋白质酪氨酸残基的磷酸化检测结果示于图1。
用含Ca2+培养基培养的精子中，在图1中的箭头表示的条带附近，检测到强的蛋白质磷酸化条带。可以认为：在含Ca2+培养基中，由于磷酸化，精子变得不能维持正常的细胞膜。
另一方面，用参考例1中的含精浆培养基培养的精子中，没有检测到同样的精子蛋白质酪氨酸残基的磷酸化条带，可以认为，由于添加了精浆，没能发生精子蛋白质酪氨酸残基的磷酸化。另外，用参考例2中的不含Ca2+培养基培养的精子中，检测到些微的蛋白质磷酸化条带。可以认为这是：尽管除去了Ca成分(CaCl2·2H2O)，但由于mTBM中使用了纯水，受到该纯水中存在的微量Ca2+的影响。
由上述的结果可知，钙离子的存在与精子的机能障碍有关，冷冻精子的稀释液中，为了提高人工授精后的受胎率，必须抑制Ca2+对精子发生作用。
(实验例2)
通过在培养基中添加螯合剂来培养猪的精子，来验证精子的运动性降低、精子顶体损伤率、精子蛋白质酪氨酸残基的磷酸化是否被抑制。
首先，验证添加EDTA的影响。
调制EDTA的浓度分别为0mM、3mM、6.3mM、12mM的培养基。EDTA0mM培养基、EDTA3mM培养基是从Modena液中除去EDTA-2Na以将EDTA浓度分别调节为0mM、3mM。另外，EDTA6.3mM培养基是原样使用Modena液。另外，EDTA12mM培养基是在Modena液中添加EDTA-2Na以将EDTA浓度调节为12mM。
与实验例1同样地将冷冻精子解冻并添加到各培养基中，培养精子。培养时间是1小时、3小时、6小时。
培养后，用运动性解析装置(computer-assisted perm motility analysis(CASA)system)，算出精子运动率。在38℃保温的板上放置培养后的培养基5μl，用计算机解析运动着的精子的比例。
图2中示出了培养后的各精子运动率。
结果是：在任一培养时间下，EDTA6.3mM培养基培养的精子运动率最高。
接着，验证添加EGTA的影响。本验证如下进行：用向上述精子运动率最高的EDTA6.3mM培养基(Modena液)中进一步添加了EGTA的培养基培养精子，进行培养后的精子运动率的测定、精子蛋白质酪氨酸残基的磷酸化检测、精子顶体损伤率的测定。
首先，调制EGTA0mM培养基、EGTA3mM培养基、EGTA6mM培养基、EGTA9mM培养基。EGTA0mM培养基是原样使用Modena液。另外，EGTA3mM培养基、EGTA6mM培养基、EGTA9mM培养基是在Modena液中分别添加EGTA以将培养基中的EGTA浓度分别调节为3mM、6mM、9mM来使用的。这里，由于一旦添加EGTA则培养基中的pH倾向于酸性，因此添加NaOH调节为pH7.0～7.1。
与实验例1同样地，将冷冻精子解冻并添加到各培养基中，培养精子。培养时间是1小时、3小时、6小时。
对于培养后的各精子，进行精子运动率的测定、精子蛋白质酪氨酸残基的磷酸化检测、精子顶体损伤率的测定。
对于精子运动率的测定和精子蛋白质酪氨酸残基的磷酸化检测，与上述同样地进行。另外，精子顶体损伤率的测定如下进行。在载玻片上涂抹培养基5μl并风干，用99％甲醇固定10分钟。甲醇干燥后，用水性笔(liquid pen)进行标记。将FITC-花生凝集素(FITC-peanut lectin)添加到涂抹精子中(1样品约30μl)，在37℃湿润条件下孵育30分钟。之后用PBS清洗(5分钟×3次)，用DAPI(VECTOR，VECTASHIELD with DAPI，H-1200)封入，用指甲油封入后进行观察。
精子运动率的测定结果示于图3，培养3小时后的精子蛋白质酪氨酸残基的磷酸化检测结果示于图4，精子顶体损伤率的测定结果示于图5。
当精子稀释液中含有EGTA时，与不含EGTA的情况相比，精子运动率提高，另外，精子顶体损伤率降低。并且，用EGTA6mM培养基培养的精子其精子运动率最高，另外，酪氨酸残基的磷酸化被最大程度地抑制。并且可知精子顶体损伤率也低。由该结果可知，在精子用稀释液中，除EDTA外，还含有EGTA则效果提高，进而，当含有EGTA6mM左右时效果更大。
另外，观察精子的细胞内摄入的钙离子。
将猪的冷冻精子解冻并分别添加到含EDTA培养基以及含EDTA·EGTA培养基中。作为含EDTA培养基，使用的是Modena液。作为含EDTA·EGTA培养基，使用向Modena液中添加EGTA并调节为EGTA浓度6mM。
向各培养基中添加5μM的FLUO3/AM和0.02％PluronicF127，在暗室中在37℃培养30分钟，使精子的细胞内摄入FLUO3。
其后，通过离心分离除去上清，将新的各培养基添加到精子中。然后，取各培养基5μl至载玻片上，用荧光显微镜观察。其结果示于图6。
FLUO3是与钙离子结合发出萤光的物质。精子的细胞内，当摄入培养基中存在的钙离子时，则在细胞内，FLUO3与钙离子结合，发出绿色荧光。观察图6的话，各培养时间中，由含EDTA培养基所培养的精子，与由含EDTA·EGTA培养基所培养的精子相比，发强光。特别是随着培养时间的增加，由含EDTA培养基所培养的精子发出非常强的光，而由含EDTA·EGTA培养基所培养的精子仅在中段部发光。可知通过EGTA，可以抑制将培养基中的钙离子摄入精子中。
接着，用含EDTA培养基、含EDTA·EGTA培养基和含精浆培养基培养猪的精子，对于培养的各精子，进行酪氨酸残基的磷酸化检测和精子运动率的测定。
作为含EDTA培养基，原样使用了Modena液(EDTA6.3mM)。含EDTA·EGTA培养基是在Modena液中添加EGTA以调节为EGTA浓度6mM。含精浆培养基是在Modena液中添加精浆并调节至最终浓度为10％(v/v)。将冷冻精子解冻并添加到各培养基中，培养精子1小时。
对于培养的各精子，进行了精子蛋白质酪氨酸残基的磷酸化检测。其结果示于图7。
含EDTA培养基和含精浆培养基所培养的精子，在箭头所示的位置检测到较弱的蛋白质磷酸化条带，而含EDTA·EGTA培养基，在同样的位置完全没有检测到蛋白质磷酸化条带，可知蛋白质的磷酸化完全被抑制。
进而，对于培养后的各精子，测定精子运动率。其结果示于图8。
由图8中的精子运动率的结果可知，与含精浆培养基所培养的精子相比，含EDTA·EGTA培养基所培养的精子的运动性更高。
如此，含EDTA·EGTA培养基培养的精子，因为不发生蛋白质的酪氨酸残基的磷酸化，解冻后的精子的细胞膜正常，进而也确认了精子运动率的提高。因此可知，通过使基础稀释液中含有EDTA·EGTA等能够与钙离子形成络合物的螯合剂，由此可以调制不添加精浆的精子用稀释液。
由以上的实验结果可以推断：钙离子与由冷冻精子解冻后的蛋白质酪氨酸残基的磷酸化所引起的精子的活化或顶体的损伤有关，通过在稀释液中添加螯合钙离子的EDTA、EGTA，可以抑制精子细胞内的钙离子增加、以及与之相伴的活化或顶体的损伤，其结果维持了精子的运动性。
(实施例1)
使用向含有EDTA和EGTA的精子用稀释液中添加了猪的冷冻精子所调制的人工精液，进行猪的人工授精。
首先，向Modena液中添加EGTA，调制精子用稀释液。EDTA的浓度为6.3mM，EGTA的浓度为6mM。与实验例2同样地，添加NaOH，调节为pH7.0～7.1。
将冷冻精子在60℃解冻8秒，立即添加到精子用稀释液中，调制人工精液(以下，记为人工精液A1)。精子的浓度为1×108sperm/ml。
对于进行人工授精的雌猪，注射血清性性腺刺激激素(PMSG)1,000IU/头，然后，PMSG注射72小时后投放人类胎盘性性腺刺激激素(hCG)750IU/头，诱发过排卵。投放hCG40小时后，将50ml(总精子数50亿)左右上述调制的人工精液A1注入雌猪的子宫，进行人工授精。
人工授精后，第21天利用超声波妊娠鉴定用监视器确认胎儿。第21天进行是因为：猪以21天为周期出现发情，因此在受精后第21天进行妊娠鉴定时，如果没有受精或者出现受精卵退化等则阴部会显示发情的征兆。
另外，同时，在第21天利用止回(non-return)法确认是否再发情(return)，确定妊娠。
另外，作为参考例，使用在含精浆稀释液(精浆10％(v/v))中解冻了冷冻精子而调制的人工精液(以下，人工精液B1)并与上述同样地进行人工授精，该含精浆稀释液为在Modena液中添加精浆所调制得到。
接着，测定各受胎率和着床率。受胎率示于表2，着床率示于表3。这里，受胎率通过计算进行了人工授精的头数和受胎了的头数来算出。另外，着床率通过计算6头雌猪的总黄体数以及总的子宫内胎儿数来算出。
[表2]
[表3]
  总黄体数   子宫内总胎儿数   着床率(％)
  人工精液A1   130   66   51
  人工精液B1   100   78   78
添加有EDTA·EGTA的人工精液A1，其受胎率为90％，与添加有精浆10％的人工精液B1是同等高的值。
但是，着床率是51％，比添加有精浆10％的人工精液B1的78％低，很多胎儿被吞食。另外，进行了3头雌猪的卵管还流的结果是：使用了人工精液A1的人工授精中，总黄体数是51，子宫内胚胎数是42，卵管内受精率是82％，因此如果胎儿不被吞食，则可以认为是与人工精液B1同样的着床率。使用人工精液A1进行人工授精的情况下，可以认为是由于受精后子宫内免疫机能的破绽而导致胎儿被吞食了。
(实验例3)
由实施例1的结果，可以认为为了使精子发挥本来的受精机能，进一步提高着床率，精浆的存在是必要的，而在精浆中可以认为含有能够抑制精子的吞食的免疫抑制因子。因而尝试了精浆中的免疫抑制因子的鉴定。
从17头雄猪回收精浆，用EIA法进行了精浆中的类固醇激素的测定。另外，用膜抗体阵列(Proteome Profiler TM Array，Human Cytokine Array Panel A，AR Y 005)，进行了精浆中的细胞因子的检测。
精浆中的类固醇激素的测定结果示于表4，精浆中的细胞因子的检测结果示于图9。
[表4]
  皮质醇(ng/ml)
  精浆中   0.92
如表4所示，从精浆中检测到了0.92ng/ml的皮质醇。另外，如图9中的圆形所示，检测到了MIF、Serpin E1。需要说明的是，图9所示的膜中，有3处(左上，左下，右上)是肯定发光的部位，在此外的部位标记出2处排列着合计36种特异的抗细胞因子抗体。从而构成为，当存在对所标记的抗细胞因子抗体发生特异性反应的细胞因子时，则标记处发光。
由上述的结果鉴定了：精浆中含皮质醇、MIF、SerpinE1的免疫抑制因子。如果稀释液中含有这些因子，则可以认为能够实现着床率的提高。
(实施例2)
使用在含有皮质醇、EDTA和EGTA的精子用稀释液中添加猪的冷冻精子所调制成的人工精液，进行猪的人工授精。
首先，将皮质醇和EGTA添加到Modena液中，调制精子用稀释液。皮质醇的浓度是100ng/mL，EDTA的浓度是6.3mM，EGTA的浓度是6mM。与实施例1同样地添加NaOH，调整为pH7.0～7.1。
将冷冻精子在60℃解冻8秒，立即添加到精子用稀释液中，调制人工精液(以下，记为人工精液A2)。精子的浓度是1×108sperm/mL。
使用如此调制的精子用稀释液进行人工授精。对于其手法，除了没有给雌猪喂PMSG以外，与实施例1相同。
另外，与实施例1同样地，用添加有EDTA、EGTA的精子用稀释液稀释冷冻精子来调制人工精液A1，用人工精液A1同样地进行人工授精。
受胎率以及着床率示于表5。受胎率通过计数进行了人工授精的雌猪的头数以及受胎了的雌猪的头数来算出。另外，着床率通过计数4头雌猪的总子宫内胎儿数以及总黄体数，除以头数求平均来算出。
[表5]
使用含有皮质醇的精子用稀释液进行了人工授精的受胎率是92％，比不添加皮质醇有所提高，进而，着床率是83％，与不添加皮质醇无添加的场合的51％相比，大幅提高。
另外，计测了人工授精后的子宫内白血球数的结果，如图10的子宫内白血球数的相对值所示，与人工精液A1相比，在人工精液A2的情况下子宫内白血球数大幅减少，另外，也少于实施例1中的使用了精浆的人工精液B1。因此可知，通过皮质醇的免疫抑制作用，抑制了受精后的胚胎的吞食，提高了着床率。
另外，上述的副肾皮质激素(皮质醇等类固醇激素)在作为通常家畜的治疗时每1头注射5～50mg，但本实施例中的人工授精仅在子宫内注入了很少的5μg，是用作治疗的场合的1,000～10,000之一左右，可以认为对母猪的肉或子宫内胎儿无影响。实际上，使用精子用稀释液进行了人工授精的母猪，现在妊娠2个月龄的4头，1个月龄的是头，完全没有母猪的健康状态异常、流产等。另外，出产后，也没有发现畸形子的存在，因此没有添加皮质醇引起的弊端。
根据以上的实验结果，实现了不添加精浆的精子用稀释液的调制。
本申请基于2009年6月17日申请的日本国专利申请2009-144703号。日本国专利申请2009-144703号的说明书、权利要求书、附图全体作为参照而引入本说明书中。
产业上的可利用性
如以上说明，精子用稀释液含有能够与钙离子形成络合物的螯合剂，另外，含有抑制白血球的游走的免疫抑制因子。如果向该精子用稀释液中添加冷冻精子来进行人工授精，则精子可以到达卵子而不灭绝，另外，精子、胚胎不被白血球吞食，表现出高受胎率以及着床率。可以很好地用于畜产业界等进行非人类哺乳动物繁殖的行业，特别是能够有效利用于猪等多胎动物的人工授精法繁殖中。

Claims (6)

1.一种精子用稀释液，其特征在于，含有能够与钙离子形成络合物的螯合剂，所述螯合剂是EGTA和EDTA，进一步，含有抑制白血球游走的免疫抑制因子，
其中所述精子用稀释液被用于在冷冻精子被解冻之际或之后稀释所述冷冻精子，以便制备人工精液，
所述冷冻精子是通过去除精浆并进行冷冻而制备的，
其中，所述冷冻精子是非人类哺乳动物的冷冻精子，所述非人类哺乳动物是多胎动物，所述多胎动物是猪。
2.如权利要求1中记载的精子用稀释液，其中，所述免疫抑制因子是从类固醇激素和细胞因子中选择的一种以上。
3.如权利要求2中记载的精子用稀释液，其中，所述类固醇激素是从皮质醇和皮质醇衍生物中选择的一种以上。
4.如权利要求3中记载的精子用稀释液，其中，所述皮质醇衍生物是从地塞米松、泼尼松和氢化可的松中选择的一种以上。
5.如权利要求2中记载的精子用稀释液，其中，所述细胞因子是从巨噬细胞游走抑制因子和SerpinE1中选择的一种以上。
6.一种人工授精方法，其特征在于，对于从非人类哺乳动物采精得到的精液中除去精浆且冷冻后的冷冻精子，通过权利要求1～5中任一项记载的精子用稀释液稀释来调制人工精液，将所述人工精液注入所述非人类哺乳动物的子宫内进行人工授精，
其中，使用多胎动物作为所述非人类哺乳动物，使用猪作为所述多胎动物。
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