KR20120028388A - 정자용 희석액 및 이것을 이용한 인공수정 방법 - Google Patents
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Abstract
정자용 희석액은, 기초희석액에 칼슘이온과 착체를 형성하는 EDTA, EGTA 등의 킬레이트제가 함유되어 있다. 또한, 스테로이드 호르몬이나 사이토카인 등 백혈구의 유주를 억제하는 면역억제인자가 함유되어 있다. 이 정자용 희석액으로 동결 정자를 희석하고 인공수정을 실시함으로써, 정자가 수정 전에 사멸하거나 자궁 내에서 정자나 배아가 백혈구에 의해 탐식되는 것이 억제되어 수태율 및 착상율이 향상된다.
Description
본 발명은, 사람이 아닌 포유동물, 특히 돼지 등의 인공수정용 동결 정자의 희석에 이용하는 정자용 희석액 및 이것을 이용한 인공수정 방법에 관한 것이다.
인공수정법은 축산분야에 있어서 중요한 기술이다. 이제까지 가축의 인공수정은 소를 중심으로 진행되어 왔다. 그러나, 그 수태율에는 아직 개선의 여지가 있으며, 더우기 소 이외의 가축에 대해서는 인공수정 기술이 충분히 확립되어 있지 않은 상황이다.
예를 들면, 일본의 양돈산업에서는 주로 자연교배가 이루어지고 있어 씨돼지를 사육해야 하므로 경비가 든다. 또한, 씨돼지는 체중이 300㎏ 이상이 되기 때문에 작업에도 위험성이 생긴다. 또, 자연교배에는 막대한 노력을 필요로 하기 때문에 교배에 따른 우량종의 육성(예를 들면, 육질(肉質), 산자수(産子數)에 출중한 품종의 개량)의 효율적인 진전을 방해할 수 있다.
현재, 일본의 양돈산업에 있어서, 인공수정법을 실시한 예는 있지만, 현재의 체제에서는 사업자의 주문 후에 액상 정액을 발송하기 때문에 씨돼지의 갑작스러운 발정에 대해 시간차가 생겨 발정을 놓치는 일이 있다.
이 때문에, 각 사업자에게 동결 정액을 보관하게 하여, 갑작스러운 씨돼지의 발정에도 대응할 수 있는 기술의 개발이 요구되고 있다. 그렇지만, 돼지에게 있어 동결 정액을 이용한 인공수정이란, 동결 융해 후에는 정액의 운동성 및 수정 능력이 현저히 낮고, 더우기 계절이나 품종 등의 요인에 따라 수태율이 변동하기 때문에 수태율과 한번에 낳는 총 산자수가 낮아져서(비특허문헌 1 및 비특허문헌 2), 양돈산업분야에서는 전혀 이루어지지 않는 것이나 다름이 없다.
(선행기술문헌)
(비특허문헌)
비특허문헌 1: 오카자키 테츠지 외 2명, 「돼지 동결 융해 정자의 운동성?착상율에 미치는 희석액의 침투압과 글리세롤(Glycerol) 농도의 영향」, 일본축산학회 제107회 대회 일반 강연 V29-29
비특허문헌 2: 돼지 동결 정액 이용 기술메뉴얼(니와 후토시 사에몬 감수 1989), 사단법인 일본 가축 인공수정사 협회
본 발명자들은, 채취한 정자으로부터 정장(seminal plasma)을 제거하고 동결한 동결 정자를 이용한 인공수정법을 제안하고 있다(일본국 특원 2007-325313). 정장을 함유하는 희석액에 융해한 동결 정자를 인공수정함으로써 수태율의 향상을 이룰 수 있다.
그렇지만, 정장에는 세균 등의 병원체가 포함되어 있기 때문에, 음식의 안전 면에서 주목받고 있는 「특정 질병 프리 SPF(Specific Pathogen Free) 돼지」의 생산에는 이용할 수 없다는 문제가 있다.
또한, 희석액에 첨가하는 정장은, 그 성분이 개체간이나 계절에 따라 변동하기 때문에 수태율?착상율이 불안정하게 되기 쉽다.
나아가, 정장을 확보하기 위한 씨돼지를 사육할 필요가 있다.
본 발명은 상기 사항을 감안하여 이루어진 것으로써, 그 목적은 정장을 포함하지 않는 정자용 희석액일지라도, 정장을 포함한 희석액과 마찬가지 혹은 그 이상의 수태율을 얻을 수 있는 정자용 희석액 및 이것을 이용한 인공수정 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 제1의 상태에 관한 정자용 희석액은,
칼슘이온과 착체(complex)를 형성하는 킬레이트제(chelating agent)를 함유하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 킬레이트제가 EGTA인 것이 바람직하다.
또한, 상기 킬레이트제가 EGTA 및 EDTA인 것이 바람직하다.
나아가, 백혈구의 유주(遊走)를 억제하는 면역억제인자를 함유하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 면역억제인자가 스테로이드 호르몬 및 사이토카인(cytokine)으로부터 선택되는 1종 이상인 것이 바람직하다.
상기 스테로이드 호르몬이 코르티솔(cortisol) 및 코르티솔 유도체로부터 선택되는 1종 이상인 것이 바람직하다.
또한, 상기 코르티솔 유도체가, 덱사메타손(dexamethasone), 프리드니손(prednisone) 및 히드로코르티손(hydrocortisone)으로부터 선택되는 1종 이상인 것이 바람직하다.
또한, 상기 사이토카인이 대식 세포(macrophage) 유주저지인자 및 세르핀(Serpin) E1로부터 선택되는 1종 이상인 것이 바람직하다.
또한, 정장이 제거되어 동결된 동결 정자의 희석에 이용되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 동결 정자가 사람이 아닌 포유동물의 동결 정자인 것이 바람직하다.
또한, 상기 사람이 아닌 포유동물이 다태(多胎) 동물인 것이 바람직하다.
또한, 상기 다태동물이 돼지인 것이 바람직하다.
본 발명의 제2의 상태에 관한 인공수정 방법은,
사람이 아닌 포유동물로부터 채취한 정액으로부터 정장을 제거하고 동결한 동결 정자를 상기 정자용 희석액으로 희석하여 인공 정액을 조제하고,
상기 인공 정액을 상기 사람이 아닌 포유동물의 자궁 내에 주입하여 인공수정하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 사람이 아닌 포유동물로서 다태동물을 이용하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 다태동물로서 돼지를 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 관한 정자용 희석액에 있어서는, 정장을 전혀 함유하고 있지 않기 때문에 세균 감염의 문제가 없고, 특정 질병 프리 SPF 돼지의 생산에도 이용할 수 있다.
또한, 정장을 이용하지 않기 때문에, 계절이나 정장을 채취하는 개체차의 영향이 없어 안정된 인공수정을 실현할 수 있다.
나아가, 정장이 필요없기 때문에 정장 확보를 위해 다수의 수퇘지를 사육할 필요가 없다고 하는 이점이 있다.
[도 1] 실험예 1에 있어서의 정자 단백질 티로실 잔기(tyrosyl residue)의 인산화 검출 결과를 나타내는 도이다.
[도 2] 실험예 2에 있어서의 정자 운동율의 측정 결과를 나타내는 도이다.
[도 3] 실험예 2에 있어서의 정자 운동율의 측정 결과를 나타내는 도이다.
[도 4] 실험예 2에 있어서의 정자 단백질 티로실 잔기의 인산화 검출 결과를 나타내는 도이다.
[도 5] 실험예 2에 있어서의 정자 첨체(尖體) 손상율의 측정 결과를 나타내는 도이다.
[도 6] 실험예 2에 있어서의 정자에 들어있는 칼슘이온의 관찰 결과를 나타내는 도이다.
[도 7] 실험예 2에 있어서의 정자 단백질 티로실 잔기의 인산화 검출 결과를 나타내는 도이다.
[도 8] 실험예 2에 있어서의 정자 운동율의 측정 결과를 나타내는 도이다.
[도 9] 실험예 3에 있어서의 정장 중의 사이토카인의 검출 결과를 나타내는 도이다.
[도 10] 실시예 2에 있어서의 자궁 내 백혈구수의 상대치를 나타내는 도이다.
[도 2] 실험예 2에 있어서의 정자 운동율의 측정 결과를 나타내는 도이다.
[도 3] 실험예 2에 있어서의 정자 운동율의 측정 결과를 나타내는 도이다.
[도 4] 실험예 2에 있어서의 정자 단백질 티로실 잔기의 인산화 검출 결과를 나타내는 도이다.
[도 5] 실험예 2에 있어서의 정자 첨체(尖體) 손상율의 측정 결과를 나타내는 도이다.
[도 6] 실험예 2에 있어서의 정자에 들어있는 칼슘이온의 관찰 결과를 나타내는 도이다.
[도 7] 실험예 2에 있어서의 정자 단백질 티로실 잔기의 인산화 검출 결과를 나타내는 도이다.
[도 8] 실험예 2에 있어서의 정자 운동율의 측정 결과를 나타내는 도이다.
[도 9] 실험예 3에 있어서의 정장 중의 사이토카인의 검출 결과를 나타내는 도이다.
[도 10] 실시예 2에 있어서의 자궁 내 백혈구수의 상대치를 나타내는 도이다.
(정자용 희석액)
동결 정자에서는 융해 후에 정자의 기능 장해가 생기기 때문에 정자가 사멸하여 인공수정에 있어서의 수정율이 낮았지만, 정장이 첨가된 희석액을 이용한 경우, 이 기능 장해가 억제되어 높은 번식 성적을 나타내는 것을 본 발명자들은 발견했다. 그리하여, 이 기능 장해에 칼슘이온의 존재가 정자의 운동성과 단백질의 티로실 잔기의 인산화에 영향을 주고 있는 것을 발견하여, 본 실시 형태에 관한 정자용 희석액을 완성하였다.
본 실시 형태에 관한 정자용 희석액은, 후술하는 기초희석액에 칼슘이온과 착체를 형성하는 킬레이트제가 함유되어 있다. 정자용 희석액이 킬레이트제를 함유하고 있기 때문에, 동결 정자를 융해했을 때 칼슘이온의 관여에 의해 생기는 정자 단백질의 인산화와 기능 장해가 억제된다.
보다 상세하게 설명하자면, 정자의 중편부에는 미토콘드리아가 존재하고 여기에서 정자의 운동에 이용되는 에너지(ATP)가 생산되고 있다. 미토콘드리아(보다 상세하게는 ATP를 생산하는 효소)에 칼슘이온이 작용하면 ATP의 생산이 활성화되므로 정자가 격렬하게 운동하게 되는데, 정자가 서둘러 활성화되면 정자가 난관에 도착하기도 전에 사멸해 버린다.
본 실시 형태에 관한 정자용 희석액에서는, 희석액 중에 킬레이트제가 함유되어 있고, 이 킬레이트제가 칼슘이온과 착체를 형성하기 때문에 칼슘이온이 정자의 미토콘드리아에 작용하는 것을 억제하고 있다.
본 실시 형태에 관한 정자용 희석액은, 기초희석액에 칼슘이온과 착체를 형성하는 킬레이트제를 첨가함으로써 얻을 수 있다.
여기서, 기초희석액이란, 채취한 정액을 실온 하에서 일정 시간, 그 정액 중 정자가 가지는 기능을 저하시키지 않고 유지할 수 있도록 조제된 희석액으로, 글루코오스, 구연산나트륨, 중탄산나트륨, EDTA-2Na, 구연산, 트리스(tris), 염화칼륨 등의 성분을 포함하고 있는 액체이다. 기초희석액으로서 이 분야에서 통상 이용되는 액체라면 특별하게 한정하지는 않지만, 예를 들면, 모데나액(Modena solution)(0.15M 글루코오스, 26.7mM 구연산나트륨, 11.9mM 탄산수소나트륨, 15.1mM 구연산, 6.3mM EDTA-2Na, 46.6mM 트리스 및 1,000IU/㎖ 페니실린) 등을 들 수 있다.
킬레이트제로서 칼슘이온과 특이하게 착체를 형성하는 물질이라면, 특별하게 한정하지는 않지만, 에틸렌글리콜비스(2-아미노에틸)4-아세트산 (EGTA(ethylene glycol Bis(2-aminoethyl)-N,N,N',N'-tetraacetic acid))을 이용하는 것이 바람직하다. EGTA는 칼슘이온과 특이하게 착체를 형성하기 때문에, 정자의 미토콘드리아에 칼슘이온이 작용하는 것을 효과적으로 억제할 수 있다.
또한, EGTA와 함께, 에틸렌디아민4-아세트산(EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid))을 이용하는 것이 바람직하다. EDTA는, 칼슘이온 외에 마그네슘이온이나 아연이온 등 다양한 2가이온과 착체를 형성하는 물질이다.
EDTA 및 EGTA 쌍방을 첨가하면, EDTA로 킬레이트화할 수 없었던 칼슘이온을 EGTA로 킬레이트화 할 수 있고, 기초희석액에 존재하는 대부분의 칼슘이온을 킬레이트화 할 수 있게 된다. 예를 들면, 킬레이트제로서 EDTA만을 이용하는 경우, 모든 칼슘이온을 EDTA로 킬레이트화하려고 한다면, 기초희석액에 첨가하는 EDTA의 농도를 높게 해야 한다. 기초희석액에는 칼슘이온 이외의 마그네슘이온이나 아연이온 등 다양한 2가이온이 포함되어 있고, EDTA의 농도가 지나치게 높으면, 이러한 2가이온까지 과잉으로 킬레이트화 할 우려가 있어, 정자 기능(수정)에 영향을 미칠 수도 있다. 이 때문에, EDTA 및 EGTA 쌍방을 첨가하는 것이 바람직하다.
EDTA와 EGTA의 쌍방을 첨가하는 경우, 후술의 실험 결과로부터, 정자용 희석액 중 EDTA의 농도가 3 ~ 9mM/L, EGTA의 농도가 3 ~ 9mM/L 정도인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는, EDTA의 농도가 6.3mM, EGTA의 농도가 6mM이다.
나아가, 정자용 희석액에는, 자궁 내에서 정자나 배아(胚) 등이 백혈구에 의해서 탐식되지 않도록 면역억제인자가 함유되어 있는 것이 바람직하다. 정자는 암컷에게 있어서는 이물질이기 때문에, 정자가 자궁 내에 침입하면 호중구(好中球)나 대식 세포 등의 백혈구가 유주하여, 정자나 배아가 탐식되고 이는 곧 착상율에 영향을 주기 때문이다.
착상율이란, 난자의 수에 대한 자궁 내 태아의 비율이다. 특히, 돼지 등의 다태동물은 10 ~ 20개의 난자가 배란되므로, 생산 효율면에서 한 번에 많은 난자를 수정시켜서 다수의 새끼를 출산하게 하는 것이 요구된다.
자연교배에서는 상술의 탐식은 생기기 어렵기 때문에, 정액 중의 정장에는 백혈구의 유주를 억제하는 면역억제인자가 포함되어 있고, 이 면역억제인자가 백혈구의 과잉 증가를 억제하여, 그 후 배아로의 공격을 막고 있는 것으로 생각할 수 있다.
따라서, 정자용 희석액에, 백혈구의 유주를 억제할 수 있는 면역억제인자가 함유되어 있다면, 정자나 배아가 탐식되는 것을 억제할 수 있어 착상율의 향상을 실현할 수 있다.
이 면역억제인자로서, 스테로이드 호르몬이나 사이토카인이 바람직하다.
스테로이드 호르몬으로서는, 정장에 포함되어 있는 성분인 코르티솔(cortisol)이 바람직하다. 희석액에 코르티솔을 함유시킴으로써, 세포성 면역기구가 기능하지 않도록 하여 백혈구 등의 유주를 막는다. 이로써 정자나 배아의 탐식이 억제되어 착상율의 향상이 실현된다.
돼지의 인공수정에 이용하는 경우, 1회의 인공수정에서 이용하는 정자용 희석액 중에 첨가하는 코르티솔량은 100ng ~ 10,000ng 정도인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 500ng ~ 5,000ng이다. 이것은, 자연교배에 있어서의 수퇘지로부터 사출되는 모든 정장 중에 포함된 코르티솔량과 대략 같은 양이다.
덧붙여, 코르티솔은 원래 정장에 포함되어 있는 것, 자궁 내에 주입 후 1 ~ 2일간 분해되어 체외로 배출되는 것, 또한, 국소적으로 주입하므로 몸 전체에 퍼지지 않아 생체에 악영향을 미치는 일이 없고, 기형의 새끼 돼지가 출산되는 등의 폐해가 생길 우려는 없다.
또한, 다른 스테로이드 호르몬으로서, 코르티솔 유도체인 덱사메타손(dexamethasone), 프리드니손(prednisone) 혹은 히드로코르티손(hydrocortisone) 등에 대해서도, 코르티솔로 화학변화하여, 같은 면역억제 작용을 나타낸다고 생각되므로 이것들을 이용해도 괜찮다.
사이토카인으로서는, 대식세포 유주저지인자(MIF(macrophage migration inhibitory factor)), 세르핀 E1 등이 바람직하다. 대식세포 유주인자 및 세르핀 E1은 모두 정장 중에 포함되어 있는 물질이다.
대식세포 유주저지인자 및 세르핀 E1 등의 사이토카인은, 시그널 전달 물질로, 자궁 내에 호중구나 대식세포 등의 백혈구가 불필요하게 집적되는 것을 억제하여 면역억제 작용을 발휘한다.
(인공수정 방법)
상술한 정자용 희석액을 이용한 인공수정 방법에 대해 설명한다. 예시로써, 아래에 돼지의 인공수정 방법에 대해 설명한다.
수퇘지의 정액으로부터 정장을 제거하고 동결해 둔 동결 정자를 융해하고, 융해 후 즉시 정자용 희석액에 첨가하여 인공정액을 조제한다. 또는, 동결 정자의 융해 시에 동결 정자를 정자용 희석액에 첨가해 두어도 된다.
보다 상세하게는, 동결 정자의 융해는, 정자를 5㎖ 스트로(straw)에 충전해 동결한 것을 이용하는 경우, 37℃로 60초간, 0.5㎖ 스트로의 경우에는 35℃로 20초간, 바람직하게는 37℃로 20초간, 보다 바람직하게는 70℃로 8초간, 가장 바람직하게는 60℃의 온수 속에서 8초간 실시하면 좋다. 혹은, 동결 정자에 직접 정자용 희석액을 첨가해도 된다.
1회의 돼지 인공수정에 이용하는 인공 정액의 양은 50㎖ 정도로, 인공 정액 중 정자의 최종 농도가, 1×106 세포/㎖ ~ 1×109 세포/㎖, 바람직하게는 1×108 세포/㎖의 오더가 되도록 조제하면 된다.
그리고, 발정기를 맞은 암퇘지의 자궁 내에 조제한 인공 정액을 주입함으로써 인공수정을 실시할 수 있다.
암퇘지에서는 인공수정 후, 대략 114일령으로 분만에 이른다. 분만 후, 새끼 돼지가 20 ~ 40일령의 포유 기간을 거쳐 이유(離乳)하고, 이유 4일 후 정도에 암퇘지에게 발정이 다시 온다. 암퇘지의 재발정에 맞춰, 상기와 같이 인공수정을 실시하면 된다. 이러한 사이클로 인공수정을 실시함으로써, 한 마리당 암퇘지의 일평생 보다 많은 새끼 돼지를 출산하게 할 수 있다.
덧붙여, 정자용 희석액은, 냉동고에서 간편하게 보관이 가능하다. 이 때문에, 필요한 때 융해하여 이용할 수 있고, 암퇘지 등의 발정기 타이밍에 맞춰 쉽게 이용할 수 있다.
본 실시 형태에 관한 정자용 희석액으로 희석되는 동결 정자는, 정액으로부터 정장을 제거하고 동결한 동결 정자를 이용하는 것이 바람직하다. 이로써, 완전한 무균상태에서의 인공수정을 실시할 수 있으며, 예를 들면, 특정 질병 프리 SPF 돼지의 생산에도 이용할 수 있다.
또한, 포유동물의 종별에 따라서는, 정액을 동결할 때, 정장이 동결에 악영향을 미쳐 동결을 할 수 없기 때문에 인공수정이 곤란한 경우가 있다. 이러한 경우에도, 정장을 제거해 정자를 동결하고, 이 동결 정자를 본 실시 형태에 관한 정자용 희석액으로 희석함으로써 인공수정을 실시할 수 있다.
또한, 본 실시 형태에 관한 정자용 희석액은, 사람이 아닌 포유동물의 모든인공수정에 이용해도 된다.
또한, 본 실시 형태에 관한 정자용 희석액은, 가축 등의 사람이 아닌 포유동물에 대해 이용할 수 있지만, 특히, 다태동물의 인공수정에 매우 적합하게 이용할 수 있다. 돼지 등의 다태동물에 있어서도 착상율이 높기 때문에, 한 번에 다수의 새끼를 출산하게 하여 생산 효율을 높일 수 있다.
또한, 돼지 등에 있어서도, 우수한 혈통의 수퇘지에서만 채취한 정자를 이용해 육질 개선 등의 육종 개량 등 번식기술의 향상에도 이바지한다.
또한, 정장을 전혀 이용하지 않기 때문에, 다수의 씨돼지 등을 사육할 필요가 없다.
(실험예 1)
Ca2+ 함유배지에서 돼지의 정자를 배양해, Ca2+가 정자의 단백질의 티로실 잔기의 인산화에 미치는 영향에 대해 검토했다.
Ca2+ 함유배지로서 mTBM(modified Tris-buffer medium)을 이용했다. mTBM의 조성을 표 1에 나타낸다.
[표 1]
또한, 돼지의 정자는, 아래와 같이 하여 채정(採精), 동결한 것을 이용했다. 채정에 사용하는 수퇘지를, 각각 개개의 돼지우리에서 별도로 사육해 아침, 저녁 2회, 합계 2.5㎏의 씨돼지용 사료를 먹게 했다. 돼지에게는 일본 뇌염?브타파르보위르스 감염증 백신을 접종했다. 본 검토에는, 돼지 번식?호흡장해 증후군(PRRS), 오제스키병(Aujeszky disease)에 대해 항체 음성인 돼지를 선택했다. 채정은 1주일 간격을 두고 했다. 채정 전에는 먹는 것, 병의 징조 등을 확인하고, 양호한 돼지로 흥분하지 않게 하여 채정을 실시하였다.
의빈대(dummy)를 수퇘지의 우리에 넣고 수퇘지를 받침대에 태워서, 페니스 및 포피 내를 생리식염수로 세정하고 오줌을 제거했다. 채정은 수압법(手壓法)으로 실시하고, 미리 멸균한 컵에 거즈를 씌워 정액과 함께 나오는 젤리 형태의 물질인 교질(colloid)을 제거하면서 정액을 컵에 넣었다. 정액은, 처음 50 ~ 100mL의 농후부(모든 정액량의 약 80%의 정자가 존재함)만을 채취하고, 채정 후 원심분리에 의해 정장을 정액으로부터 바로 제거했다.
그 후, 전(前)처리액을 이용해 정자를 희석하고, 2.5시간 들여 15℃로 하여, 원심에 의한 상청(上淸) 제거 후, 침투압 400mOsm/㎏의 용액 속에 약 1.5시간 유지하면서, 4 ~ 5℃까지 냉각했다. 덧붙여, 사용한 용액은 NSF(Niwa and Sasaki freezing extender; 80%(v/v), 0.31mol Lactose monohydrate, 20%(v/v) egg yolk, 1000U/㎖ penicillin G potassium, 1㎎/㎖ streptomycin sulfate; 침투압 300mOsm/㎏)를 가장 깨끗한 물로, 침투압 400mOsm/㎏으로 조제한 용액이다. 다음으로 내동제(耐凍劑)와 0.15%의 OEP(Orvus Es Paste 계면활성제)를 첨가했다. 또한, 2차 희석액을 동량 첨가했다. 이 경우의 정자 농도를 1×109 세포/㎖로 했다. 내동제의 첨가 후, 30분 정도, 4 ~ 5℃로 유지하고, 그 후, 동결했다. 동결에는 액체 질소를 사용했다. 스트로에 정장을 제거한 정자를 충전한 후, 액체 질소 표면으로부터 4㎝ 정도 떨어진 곳으로, 액체 질소 증기 속에서 10분간 동결하고, 그 후, 액체 질소 속에 보존해 두었다.
상술한 대로 해서 얻어진 돼지의 동결 정자를 60℃에서 8초간 융해하고, Ca2+ 함유배지(mTBM)에 정자를 첨가하여 정자의 배양을 실시했다. 배양은 3시간 했다.
또한, 참고예 1로서, 정장 함유배지를 사용하여, 상기와 마찬가지로 정자를 첨가하여 배양했다. 정장 함유배지는, 상술의 Ca2+ 함유배지(mTBM)에, 최종농도가10%(v/v)가 되도록 정장을 첨가하여 조제했다. 덧붙여, 정장은 상술한 대로 채취한 정액으로부터 원심분리에 의해 정자를 제거한 후, 나아가 원심분리에 의해 그 상청으로부터 고형물을 제거함으로써 조제하여 사용했다.
또한, 참고예 2로서, Ca2+ 불함유배지를 사용하여, 상기와 마찬가지로 정자를 첨가하여 배양했다. Ca2+ 불함유배지는, 상술의 Ca2+ 함유배지(mTBM)로부터 Ca성분(CaCl2?2H2O)을 제거하여 조제했다.
배양 후, 각각 정자를 배양한 배지를 20㎕씩 꺼내서 80℃로 보존하고, 단백질의 티로실 잔기의 인산화 검출에 사용했다. 티로실 잔기의 인산화 검출은, 웨스턴블럿법(Western blot)에 의해 검출했다.
웨스턴블럿법에 따른 티로실 잔기의 인산화 검출은 다음과 같다. -80℃에서 보존한 정자에 SDS 샘플 완충액 17㎕를 첨가하여 피펫조작(pipetting)했다. 10,000rpm으로 2분간 원심하여 초음파 처리를 2분간 실시하고, 그 후, 100℃에서 5분간 가열하고, 100V로 2시간 정도 영동(migration)했다. 멤브레인(membrane)으로 전사하여, 5% BSA 첨가 TBS에서의 블로킹 후, 0.5% BSA 및 0.1% 트윈 20(Tween 20)을 첨가한 TBS(20mM Tris-HCl, pH7.5, 0.15M NaCl)에 1:2,000 희석한 항인산화 티로실 항체(1차 항체, 마우스 IgG)를 첨가하여, 멤브레인에 12시간 4℃로 반응하게 하였다. 0.1% 트윈 20을 첨가한 TBS에서 2시간 세정 후, 0.5% BSA 및 0.1% 트윈 20을 첨가한 TBS에 1:2,000로 희석한 항마우스 IgG 항체(2차 항체)를 1시간 반응하게 하였다. 0.1% 트윈 20을 첨가한 TBS에서 1시간 세정했다. 발색 기질을 첨가하여 5분간 반응하게 하여 필름에 감광시켰다.
배양한 각각의 정자에 있어서의 정자 단백질 티로실 잔기의 인산화 검출 결과를 도 1에 나타낸다.
Ca2+ 함유배지에서 배양한 정자에서는, 도 1 중의 화살표로 나타낸 밴드 부근에 강한 단백질 인산화 밴드가 검출되었다. Ca2+ 함유배지에서는, 인산화에 의해 정자는 정상적인 세포막을 유지할 수 없게 된다고 생각된다.
한편, 참고예 1에 있어서의 정장 함유배지에서 배양한 정자에서는, 마찬가지의 정자 단백질 티로실 잔기의 인산화 밴드는 검출되지 않고, 정장이 첨가됨으로써, 정자 단백질 티로실 잔기의 인산화가 생기지 않았던 것으로 생각된다. 또한, 참고예 2에 있어서의 Ca2+ 불함유배지에서 배양한 정자에서는, 약간의 단백질 인산화 밴드가 검출되었다. 이것은, Ca 성분(CaCl2?2H2O)을 제거했으나, mTBM에는 깨끗한 물이 이용되어, 이 깨끗한 물 속에 존재하는 미량의 Ca2+ 영향으로 생각할 수 있다.
상기의 결과로부터, 칼슘이온의 존재가 정자의 기능 장해에 관여하는 것을 알 수 있고, 동결 정자의 희석액에 있어서는, Ca2+가 정자에 작용하는 것을 억제하는 것이, 인공수정 후의 수태율 향상을 위해 필수인 것을 알 수 있었다.
(실험예 2)
배지에 킬레이트제를 첨가하여 돼지의 정자를 배양함으로써, 정자의 운동성 저하, 정자 첨체 손상율, 정자 단백질 티로실 잔기의 인산화가 억제되는지 아닌지를 검증했다.
우선, EDTA 첨가에 의한 영향에 대해 검증했다.
EDTA의 농도가 각각 0mM, 3mM, 6.3mM, 12mM인 배지를 조제했다. EDTA 0mM 배지, EDTA 3mM 배지는, 모데나액으로부터 EDTA-2Na를 제거하고, EDTA 농도를 각각 0mM, 3mM로 조제했다. 또한, EDTA 6.3mM 배지는 모데나액을 그대로 사용했다. 또한, EDTA 12mM 배지는, 모데나액에 EDTA-2Na를 첨가하여 EDTA 농도를 12mM로 조제했다.
각각의 배지에, 실험예 1과 마찬가지로 동결 정자를 융해하여 첨가하고 정자를 배양했다. 배양 시간은 1시간, 3시간, 6시간으로 했다.
배양 후, 운동성 해석장치(computer-assisted perm motility analysis(CASA) system)를 이용해 정자 운동율을 산출했다. 38℃로 따뜻해진 플레이트 위에 배양 후의 배지 5㎕를 얹고, 컴퓨터로 움직이고 있는 정자의 비율을 해석했다.
도 2에, 배양한 각각의 정자 운동율을 나타낸다.
모든 배양 시간에 있어서도, EDTA 6.3mM 배지에서 배양한 정자가 가장 정자 운동율이 높은 결과가 되었다.
이어서, EGTA 첨가에 의한 영향에 대해 검증했다. 본 검증은, 상기의 정자 운동율이 가장 높았던 EDTA 6.3mM 배지(모데나액)에, 더욱 EGTA를 첨가한 배지에서 정자를 배양하고, 배양 후의 정자 운동율의 측정, 정자 단백질 티로실 잔기의 인산화 검출, 정자 첨체 손상율의 측정을 실시했다.
우선, EGTA 0mM 배지, EGTA 3mM 배지, EGTA 6mM 배지, EGTA 9mM 배지를 조제했다. EGTA 0mM 배지는 모데나액을 그대로 사용했다. 또한, EGTA 3mM 배지, EGTA 6mM 배지, EGTA 9mM 배지는, 모데나액에 각각 EGTA를 첨가하고, 배지 속의 EGTA 농도를 각각 3mM, 6mM, 9mM로 조제하여 사용했다. 또한, EGTA를 첨가하면 배지 중 pH가 산성으로 기울기 때문에, NaOH를 첨가해 pH 7.0 ~ 7.1로 조제했다.
각각의 배지에, 실험예 1과 마찬가지로, 동결 정자를 융해하여 첨가하고 정자를 배양했다. 배양 시간은 1시간, 3시간, 6시간으로 했다.
배양한 각각의 정자에 대하여 정자 운동율의 측정, 정자 단백질 티로실 잔기의 인산화 검출, 정자 첨체 손상율을 측정했다.
정자 운동율의 측정 및 정자 단백질 티로실 잔기의 인산화 검출에 대해서는 상기와 마찬가지로 했다. 또한, 정자 첨체 손상율의 측정은 다음과 같이 했다. 슬라이드 글라스에 배지를 5㎕ 도말(Smear)하여 바람에 말리고, 99% 메탄올로 10분간 고정했다. 메탄올의 건조 후, 리퀴드 펜으로 마킹했다. FITC-피넛 렉틴(FITC-peanut lectin)을 도말 정자에 첨가(1 샘플에 대해 대략 30㎕)하고, 37℃ 습윤 조건에서 30분간 배양(incubation)했다. 그 후 PBS로 세정(5분간×3회)하고, DAPI(VECTOR, VECTASHIELD with DAPI, H-1200)로 봉입하여, 매니큐어(manicure) 봉입한 후에 관찰했다.
정자 운동율의 측정 결과를 도 3에, 3시간 배양 후의 정자 단백질 티로실 잔기의 인산화 검출 결과를 도 4에, 정자 첨체 손상율의 측정 결과를 도 5에 각각 나타낸다.
정자 희석액에 EGTA가 함유되어 있으면, EGTA가 함유되어 있지 않은 경우에 비해 정자 운동율이 높고, 또한, 정자 첨체 손상율이 낮아지고 있다. 그리고, EGTA 6mM 배지에서 배양한 정자가 정자 운동율이 가장 높고, 또한, 티로실 잔기의 인산화가 가장 억제되어 있다. 그리고, 정자 첨체 손상율도 낮은 것을 알 수 있다. 이 결과로부터, 정자용 희석액에는 EDTA에 더하여 EGTA가 함유되어 있으면 효과가 커지는 것, 나아가, EGTA가 6mM 정도 함유되고 있으면 보다 효과가 큰 것을 알 수 있다.
또한, 정자의 세포 내에 들어있는 칼슘이온의 관찰을 실시했다.
EDTA 함유배지 및 EDTA?EGTA 함유배지에, 돼지의 동결 정자를 융해하여 각각 첨가했다. EDTA 함유배지로서 모데나액을 이용했다. EDTA?EGTA 함유배지는 모데나액에 EGTA를 첨가하여 EGTA 농도를 6mM로 조제해 이용했다.
각각의 배지에 5㎛의 FLUO3/AM와 0.02% Pluronic F127을 첨가하여, 37℃로 30분간 암실에서 배양하여 정자의 세포 내에 FLUO3을 들어가게 했다.
그 후, 원심분리로 상청액을 제거하고, 새로운 각각의 배지를 정자에 첨가했다. 그리고, 각각의 배지 5㎕를 슬라이드에 꺼내 형광 현미경으로 관찰했다. 그 결과를 도 6에 나타낸다.
FLUO3은, 칼슘이온과 결합하여 형광을 발하는 물질이다. 정자의 세포 내에, 배지 중에 존재하는 칼슘이온이 들어가면, 세포 내에서 FLUO3과 칼슘이온이 결합하여 녹색으로 형광 발색한다. 도 6을 보면, 각 배양 시간에 있어서 EDTA 함유배지에서 배양한 정자에서는, EDTA?EGTA 함유배지에서 배양한 정자에 비해 강하게 발광하고 있다. 특히, 배양 시간의 증가에 따라서, EDTA 함유배지에서 배양한 정자에서는 매우 강하게 발광을 하고 있지만, EDTA?EGTA 함유배지에서 배양한 정자에서는 약하게 중편부가 발광하는 것에 머문다. EGTA에 의해, 배지 중의 칼슘이온이 정자에 들어가는 것을 억제하는 것을 알 수 있다.
이어서, EDTA 함유배지, EDTA?EGTA 함유배지 및 정장 함유배지에서 돼지 정자를 배양하고, 배양한 각각의 정자에 대해 티로실 잔기의 인산화 검출 및 정자 운동율을 측정했다.
EDTA 함유배지로서 모데나액(EDTA 6.3mM)를 그대로 이용했다. EDTA?EGTA 함유배지는 모데나액에 EGTA를 더하여 EGTA 농도가 6mM가 되도록 조제했다. 정장 함유배지는, 모데나액에 최종농도가 10%(v/v)가 되도록 정장을 첨가하여 조제했다. 동결 정자를 융해하여 각각의 배지에 첨가하고 1시간 정자를 배양했다.
배양한 각각의 정자에 대해, 정자 단백질 티로실 잔기의 인산화 검출을 실시했다. 그 결과를 도 7에 나타낸다.
EDTA 함유배지 및 정장 함유배지에서 배양한 정자에서는, 화살표로 나타낸 위치에 약한 단백질 인산화 밴드가 검출되고 있는데, EDTA?EGTA 함유배지에서는, 같은 위치에 단백질 인산화 밴드가 전혀 검출되지 않고 단백질의 인산화가 완전히 억제되고 있는 것을 알 수 있다.
나아가, 배양 후, 각각의 정자에 대해 정자 운동율을 측정했다. 그 결과를 도 8에 나타낸다.
도 8에 있어서의 정자 운동율의 결과로부터, 정장 함유배지에서 배양한 정자보다도 EDTA?EGTA 함유배지에서 배양한 정자 쪽에 높은 운동성이 인정된다.
이와 같이, EDTA?EGTA 함유배지에서 배양한 정자에서는, 단백질의 티로실 잔기의 인산화가 생기지 않으므로, 융해 후 정자의 세포막이 정상이고, 나아가 정자 운동율의 향상도 인정되었다. 따라서, 기초희석액에 EDTA?EGTA 등의 칼슘이온과 착체를 형성하는 킬레이트제를 함유시킴으로써, 정장 불첨가의 정자용 희석액을 조제할 수 있는 것을 알 수 있다.
이상의 실험 결과으로부터, 동결 정자 융해 후의 단백질 티로실 잔기의 인산화가 원인으로 일어나는 정자의 활성화나 첨체의 손상에는 칼슘이온이 관여하고 있으며, 희석액에 칼슘이온을 킬레이트하는 EDTA, EGTA를 첨가함으로써, 정자 세포 내의 칼슘이온 증가와 그것에 따른 활성화나 첨체의 손상을 억제할 수 있고, 결과적으로 정자의 운동성이 지속되는 것이 증명되었다.
(실시예 1)
EDTA 및 EGTA를 함유하는 정자용 희석액에 돼지의 동결 정자를 첨가하여 조제한 인공 정액을 사용하여 돼지의 인공수정을 실시했다.
우선, EGTA를 모데나액에 첨가하여 정자용 희석액을 조제했다. EDTA의 농도는 6.3mM, EGTA의 농도는 6mM이다. 그리고, 실험예 2와 마찬가지로, NaOH를 첨가하여 pH7.0 ~ 7.1로 조절했다.
동결 정자를 60℃에서 8초간 융해하고, 즉시 정자용 희석액에 첨가하여, 인공 정액(이하, 인공 정액 A1)을 조제했다. 정자의 농도는 1×108 sperm/㎖이다.
인공수정하는 암퇘지는, 혈청성 성선자극 호르몬(PMSG) 1,000 IU/두(頭)를 주사하고, 그리고, PMSG 주사 72시간 후에 사람 태반성 성선자극 호르몬(hCG) 750 IU/두를 투여하여 과배란을 야기했다. hCG를 투여하고 40시간 후에, 상술한 바와 같이 조제한 인공 정액 A1을 50㎖(총정자수 50억) 정도 암퇘지의 자궁에 주입하여 인공수정을 실시했다.
인공수정 후, 21일째 초음파 임신 감정으로 새끼를 모니터로 확인했다. 21일째 하는 것은, 돼지는 21일 주기로 발정이 오기 때문에, 수정 후 21일째 임신 감정할 때 수정하지 않은, 혹은 수정란이 퇴행한 것 등이 있으면 음부는 발정의 징후를 나타내기 때문이다.
또한, 동시에 21일째 논리턴법(Nonreturn法)으로 재발정(리턴)이 오고 있는지 어떤지도 확인하여 임신을 결정했다.
또한, 참고예로서, 모데나액에 정장을 첨가하여 조제한 정장 함유 희석액(정장 10%(v/v))에, 상기와 같이, 동결 정자를 융해하여 조제한 인공 정액(이하, 인공 정액 B1)을 사용하여 상기와 마찬가지로 인공수정을 실시했다.
그리고, 각각의 수태율과 착상율을 측정했다. 수태율을 표 2에, 착상율을 표 3에 각각 나타낸다. 또한, 수태율은 인공수정을 실시한 마리수와 수태한 마리수를 카운트하는 것으로 산출했다. 또한, 착상율은, 6마리 암퇘지의 총황체수 및 총자궁 내 새끼수를 카운트하는 것으로 산출했다.
[표 2]
[표 3]
EDTA?EGTA가 첨가된 인공 정액 A1에서는, 수태율이 90%로 정장 10% 첨가된 인공 정액 B1과 같은 높은 수치였다.
그렇지만, 착상율은 51%로, 정장을 10% 첨가한 인공 정액 B1의 78%에 비해 낮고, 대부분의 새끼는 탐식되어 있었다. 또한, 3마리 암퇘지의 난관 환류를 실시한 결과, 인공 정액 A1을 사용한 인공수정에서는 총황체수가 51, 자궁내 배아수가 42로, 난관 내 수정율은 82%였기 때문에 새끼가 탐식되지 않으면 인공 정액 B1과 같은 착상율이었다고 생각할 수 있다. 인공 정액 A1을 사용하여 인공수정을 실시한 경우에서는, 수정 후 자궁 내 면역기능의 파탄에 의해 새끼가 탐식된 것으로 생각할 수 있다.
(실험예 3)
실시예 1의 결과로부터, 정자가 본래의 수정기능을 다하여, 착상율을 더욱 향상시키기 위해서는 정장의 존재가 필요하다고 생각되고, 정장 속에는, 정자의 탐식을 억제할 수 있는 면역억제인자가 포함되어 있다고 생각된다. 그래서, 정장 속의 면역억제인자의 분류를 시험했다.
17마리의 수퇘지로부터 정장을 회수하고, EIA법을 사용하여 정장 속의 스테로이드 호르몬을 측정했다. 또한, 멤브레인 항체 어레이(Proteome ProfilerTM Array, Human Cytokine Array Panel A, ARY005)를 사용하여, 정장 속 사이토카인을 검출했다.
정장 속의 스테로이드 호르몬의 측정 결과를 표 4에, 정장 속의 사이토카인의 검출 결과를 도 9에 각각 나타낸다.
[표 4]
표 4에 나타내는 바와 같이, 정장 속에서 0.92ng/㎖의 코르티솔이 검출되었다. 또한, 도 9 중의 둥근 화살표로 나타내는 바와 같이 MIF, 세르핀 E1이 검출되었다. 또한, 도 9에 나타내는 멤브레인에서는, 3군데(좌상, 좌하, 우상)가 반드시 빛나는 곳으로, 그것 이외의 부위에 합계 36종류의 특이한 항사이토카인 항체가 줄지어 2군데 플롯되어 있다. 그리고, 플롯된 항사이토카인 항체에 특이하게 반응하는 사이토카인이 존재하면 플롯된 곳이 빛나는 구조이다.
상기의 결과로부터, 정장에는 코르티솔, MIF, 세르핀 E1의 면역억제인자가 포함되어 있는 것을 확인했다. 희석액 중에 이들 인자가 함유되어 있으면 착상율의 향상을 실현할 수 있다고 생각된다.
(실시예 2)
코르티솔, EDTA 및 EGTA를 함유하는 정자용 희석액에 돼지의 동결 정자를 첨가하여 조제한 인공 정액을 사용해 돼지의 인공수정을 실시했다.
우선, 코르티솔 및 EGTA를 모데나액에 첨가하여 정자용 희석액을 조제했다. 코르티솔의 농도는 100ng/㎖, EDTA의 농도는 6.3mM, EGTA의 농도는 6mM이다. 그리고, 실시예 1과 마찬가지로 NaOH를 첨가하여 pH 7.0 ~ 7.1로 조정했다.
동결 정자를 60℃에서 8초간 융해하여 즉시 정자용 희석액에 첨가하고, 인공 정액(이하, 인공 정액 A2)을 조제했다. 정자의 농도는 1×108 sperm/㎖이다.
이와 같이 하여 조제한 정자용 희석액을 사용하여 인공수정을 실시했다. 그 방법에 대해서는 암퇘지에 PMSG를 투여하지 않은 이외에 실시예 1과 같다.
또한, 실시예 1과 마찬가지로, 동결 정자를 EDTA, EGTA를 첨가한 정자용 희석액으로 희석하여 조제한 인공 정액 A1을 사용해 마찬가지로 인공수정을 실시했다.
수태율 및 착상율을 표 5에 나타낸다. 수태율은 인공수정을 실시한 암퇘지의 마리수 및 수태한 암퇘지의 마리수를 카운트하는 것으로 산출했다. 또한, 착상율은 4마리 암퇘지의 총자궁내 새끼수 및 총황체수를 카운트하여 마리수로 평균하는 것으로 산출했다.
[표 5]
코르티솔을 함유하는 정자용 희석액을 사용하여 인공수정한 수태율은 92%로, 코르티솔 무첨가에 비해 향상되고, 나아가 착상율은 83%로 코르티솔 무첨가 경우의 51%에 비해 큰폭으로 향상되고 있다.
또한, 인공수정 후 자궁 내 백혈구수를 계측했는데, 도 10의 자궁내 백혈구수의 상대치로 나타내는 바와 같이, 인공 정액 A2에서는, 인공 정액 A1에 비해, 자궁내 백혈구수가 대폭 감소하고 있고, 또한, 실시예 1에 있어서의 정장을 사용한 인공 정액 B1에 비해서도 적다. 따라서, 코르티솔의 면역억제 작용에 따라 수정 후 배아의 탐식이 억제되어 착상율이 향상된 것을 알 수 있다.
또한, 상기의 부신피질 호르몬(코르티솔 등의 스테로이드 호르몬)은 통상 가축의 치료로서 1마리당 5 ~ 50㎎ 주사하지만, 본 실시예에서의 인공수정에서는 자궁내 불과 5㎍ 주입했을 뿐으로, 치료로서 사용하는 경우의 1,000 ~ 10,000분의 1 정도이므로, 어미 돼지의 고기 혹은 자궁 내 새끼에게 영향은 없다고 생각된다. 실제, 정자용 희석액을 사용해 인공수정한 어미 돼지는 현재 임신 2개월령이 4마리, 1개월령이 6마리로 어미 돼지의 건강 상태의 이상이나, 유산 등은 전혀 없었다. 또한, 출산 후에도, 기형자의 존재는 확인할 수 없었으므로, 코르티솔의 첨가에 따른 폐해는 없었다.
이상의 실험 결과로부터, 정장 무첨가의 정자용 희석액의 조제를 실현했다.
본 출원은, 2009년 6월 17일에 출원된 일본국 특허출원 2009-144703호에 근거한다. 본 명세서 중에 일본국 특허출원 2009-144703호의 명세서, 특허청구의 범위, 도면 전체를 참조하여 넣은 것으로 한다.
(산업상의 이용 가능성)
이상 설명한 바와 같이, 정자용 희석액은, 칼슘이온과 착체를 형성하는 킬레이트제가 함유되어 있고, 또한, 백혈구의 유주를 억제하는 면역억제인자가 함유되어 있다. 이 정자용 희석액에 동결 정자를 첨가하여 인공수정을 하면, 정자가 사멸하지 않고 난자까지 도착할 수 있고, 또한, 정자나 배아가 백혈구에 탐식되는 일 없이 높은 수태율 및 착상율을 나타낸다. 축산업계 등, 사람이 아닌 포유동물을 번식하는 업계에서 매우 적합하게 이용할 수 있고, 특히, 돼지 등의 다태동물에의 인공수정법에 따른 번식에 효과적으로 이용 가능하다.
Claims (15)
- 칼슘이온과 착체를 형성하는 킬레이트제를 함유하는 것을 특징으로 하는 정자용 희석액.
- 청구항 1에 있어서,
상기 킬레이트제가 EGTA인 것을 특징으로 하는 정자용 희석액. - 청구항 1에 있어서,
상기 킬레이트제가 EGTA 및 EDTA인 것을 특징으로 하는 정자용 희석액. - 청구항 1 내지 3의 어느 한 항에 있어서,
백혈구의 유주를 더욱 억제하는 면역억제인자를 함유하는 것을 특징으로 하는 정자용 희석액. - 청구항 4에 있어서,
상기 면역억제인자가 스테로이드 호르몬 및 사이토카인으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 정자용 희석액. - 청구항 5에 있어서,
상기 스테로이드 호르몬이 코르티솔 및 코르티솔 유도체로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 정자용 희석액. - 청구항 6에 있어서,
상기 코르티솔 유도체가 덱사메타손, 프리드니손 및 히드로코르티손으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 정자용 희석액. - 청구항 5에 있어서,
상기 사이토카인이 대식세포 유주저지인자, 및 세르핀 E1으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 정자용 희석액. - 청구항 1 내지 8의 어느 한 항에 있어서,
정장이 제거되어 동결된 동결 정자의 희석에 사용되는 것을 특징으로 하는 정자용 희석액. - 청구항 9에 있어서,
상기 동결 정자가 사람이 아닌 포유동물의 동결 정자인 것을 특징으로 하는 정자용 희석액. - 청구항 10에 있어서,
상기 사람이 아닌 포유동물이 다태동물인 것을 특징으로 하는 정자용 희석액. - 청구항 11에 있어서,
상기 다태동물이 돼지인 것을 특징으로 하는 정자용 희석액. - 청구항 1 내지 8의 어느 한 항에 있어서,
사람이 아닌 포유동물로부터 채취한 정액으로부터 정장을 제거하여 동결한 동결 정자를 정자용 희석액으로 희석해 인공 정액을 조제하고,
상기 인공 정액을 상기 사람이 아닌 포유동물의 자궁 내에 주입하여 인공수정을 실시하는 것을 특징으로 하는 인공수정 방법. - 청구항 13에 있어서,
상기 사람이 아닌 포유동물로서 다태동물을 사용하는 것을 특징으로 하는 인공수정 방법. - 청구항 14에 있어서,
상기 다태동물로서 돼지를 사용하는 것을 특징으로 하는 인공수정 방법.
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