ES2620506T3 - Disolución diluyente de esperma y método para inseminación artificial usando la misma - Google Patents
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Abstract
Diluyente de esperma que comprende un agente de quelación que forma un complejo con un ion calcio, en el que dicho agente de quelación comprende EGTA y EDTA; y un factor inmunosupresor que suprime la migración de leucocitos, en el que dicho factor inmunosupresor comprende cortisol.
Description
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DESCRIPCION
Disolucion diluyente de esperma y metodo para inseminacion artificial usando la misma Campo tecnico
La presente invencion se refiere a un diluyente de esperma que va a usarse para dilucion de esperma congelado para inseminacion artificial de un mamlfero no humano, especialmente un cerdo o similar, y a un metodo de inseminacion artificial usando el diluyente de esperma.
Tecnica anterior
La inseminacion artificial es una tecnologla importante en el campo de la crla de animales. La inseminacion artificial de ganado se ha llevado a cabo hasta ahora principalmente con vacas. Sin embargo, todavla es necesario mejorar la tasa de concepcion, y, en lo que se refiere a ganado distinto de vacas, todavla no se ha establecido la tecnologla de inseminacion artificial.
Por ejemplo, puesto que el cruzamiento natural se lleva a cabo principalmente en la industria porcina japonesa, deben mantenerse cerdos macho y por tanto se requiere un alto coste. Ademas, puesto que el peso corporal de un cerdo macho llega a ser no inferior a 300 kg, la operacion conlleva riesgo. Ademas, puesto que se requiere mucho esfuerzo para el cruzamiento natural, se impide el desarrollo eficaz de buenas estirpes (por ejemplo, la mejora para obtener razas excelentes en cantidad de carne y tamano de la camada) mediante cruzamiento.
En la actualidad, en algunos casos en la industria porcina japonesa, se lleva a cabo inseminacion artificial. Sin embargo, puesto que en el sistema actual se envla semen llquido solo una vez que lo solicitan las granjas de cerdos, el lapso de tiempo puede dar como resultado que se pierda el estro en los casos en que el estro se produce repentinamente.
Por tanto, se ha demandado el desarrollo de una tecnologla que permita el almacenamiento de semen congelado en cada granja de cerdos y que posibilite de ese modo hacer frente a la aparicion repentina del estro de un cerdo hembra. Sin embargo, en los casos de inseminacion artificial usando semen congelado en cerdos, la movilidad del esperma es notablemente escasa tras la congelacion-descongelacion; la capacidad de fecundacion del esperma es baja; la tasa de concepcion varla dependiendo de factores tales como la estacion y la raza; la tasa de concepcion es baja; y el tamano de la camada es pequeno (documento no de patente 1 y documento no de patente 2); de modo que la inseminacion artificial usando semen congelado no se lleva a cabo casi en absoluto en el campo de la industria porcina. Ademas, el documento EP 1147774 da a conocer un metodo para la inseminacion artificial de animales. El metodo comprende inseminar artificialmente al animal con esperma, combinado con un inhibidor de fosfodiesterasa o un equivalente funcional del mismo y opcionalmente una sal soluble de un metal alcalinoterreo y el uso de un inhibidor de fosfodiesterasa y una sal soluble de un metal alcalinoterreo en una composicion que comprende ademas esperma para la reduction del reclutamiento de neutrofilos polimorfonucleares y un metodo para la inseminacion artificial de animales.
Documentos de la tecnica anterior
Bibliografla no de patente y bibliografla de patente
Documento no de patente 1: Tetsuji Okazaki y otros 2 autores, “Influences of Osmotic Pressure and Glycerol Concentration of Diluent on Motility and Implantation Rate of Pig Freeze-thawed Sperm”, 107th Meeting of Japanese Society of Animal Science, General Lecture, V29-29.
Documento no de patente 2: Manual for Using Pig Frozen Semen (Tazaemon Niwa ed., 1989), Artificial Inseminator's Association of Japan.
Documento de patente: EP 1147774.
Divulgation de la invencion
Problema que va a resolver la invencion
Los presentes inventores propusieron un metodo de inseminacion artificial usando esperma congelado preparado recogiendo esperma seguido por la retirada del plasma seminal y congelando (solicitud de patente japonesa n.° 2007-325313). Mediante la inseminacion artificial de esperma congelado descongelado en un diluyente que contiene plasma seminal, se ha logrado la mejora de la tasa de concepcion.
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Sin embargo, existe el problema de que, puesto que el plasma seminal contiene patogenos tales como bacterias, el plasma seminal no puede usarse para producir “cerdos SPF (libres de patogenos especlficos)”, lo que ha atraldo la atencion en vista de la seguridad de los alimentos.
Ademas, puesto que los caracteres del plasma seminal que van a anadirse al diluyente varlan entre individuos y dependiendo de la estacion, es probable que la tasa de concepcion y la tasa de implantacion sean inestables.
Ademas, deben mantenerse cerdos macho para asegurar el plasma seminal.
La presente invencion se realizo en vista de los hechos descritos anteriormente y se dirige a proporcionar un diluyente de esperma con el que, incluso sin inclusion de plasma seminal en el mismo, pueda obtenerse una tasa de concepcion equivalente a o mayor que la tasa obtenida con un diluyente que contiene plasma seminal, y un metodo de inseminacion artificial usando el diluyente de esperma.
Medios para resolver los problemas
El diluyente de esperma, que es el primer modo de la presente invencion, comprende un agente de quelacion que forma un complejo con un ion calcio, en el que dicho agente de quelacion comprende EGTA y EDTA; y un factor inmunosupresor que suprime la migration de leucocitos, en el que dicho factor inmunosupresor comprende cortisol.
Se describe que el factor inmunosupresor puede comprender una o mas seleccionadas de una hormona esteroidea y citocina.
Se describe que la hormona esteroidea comprende un derivado de cortisol.
Ademas se describe que, el derivado de cortisol comprende preferiblemente una o mas seleccionadas de dexametasona, prednisona e hidrocortisona.
Ademas se describe que, la citocina puede comprender uno o mas seleccionados de factor inhibidor de la migracion de macrofagos y serpina E1.
Segun una realization de la presente invencion, el diluyente de esperma se usa preferiblemente para diluir esperma congelado preparado retirando el plasma seminal y congelando.
Ademas, el esperma congelado es preferiblemente esperma congelado de un mamlfero no humano.
Ademas, el mamlfero no humano es preferiblemente un animal multlparo.
Ademas, el animal multlparo es preferiblemente un cerdo.
En el metodo de inseminacion artificial, que es el segundo modo de la presente invencion,
esperma congelado preparado retirando plasma seminal del semen recogido de un mamlfero no humano y congelando se diluye con el diluyente de esperma, para preparar semen artificial; y
el semen artificial se inyecta en el utero del mamlfero no humano, para llevar a cabo inseminacion artificial.
Ademas, preferiblemente se usa un animal multlparo como mamlfero no humano.
Ademas, preferiblemente se usa un cerdo como animal multlparo.
Efecto de la invencion
Puesto que el diluyente de esperma de la presente invencion no contiene plasma seminal en absoluto, no hay problema de infection bacteriana, y por tanto puede usarse para la production de cerdos SPF libres de patogenos especlficos.
Ademas, puesto que no se usa plasma seminal, no hay influencia de las estaciones ni diferencias entre los individuos de los que se recoge el plasma seminal, de modo que puede realizarse inseminacion artificial estable.
Ademas, puesto que el plasma seminal es innecesario, no hay necesidad de mantener muchos cerdos macho para asegurar el plasma seminal, lo que es ventajoso.
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Breve descripcion de los dibujos
La figura 1 es un diagrama que muestra resultados de deteccion de fosforilacion de residuos de tirosina en las protelnas del esperma en el ejemplo experimental 1;
la figura 2 es un diagrama que muestra resultados de medicion de la movilidad del esperma en el ejemplo experimental 2;
la figura 3 es un diagrama que muestra resultados de medicion de la movilidad del esperma en el ejemplo experimental 2;
la figura 4 es un diagrama que muestra resultados de deteccion de fosforilacion de residuos de tirosina en las protelnas del esperma en el ejemplo experimental 2;
la figura 5 es un diagrama que muestra resultados de medicion de la tasa de dano acrosomal del esperma en el ejemplo experimental 2;
la figura 6 es un diagrama que muestra resultados de observacion de iones calcio incorporados en esperma en el ejemplo experimental 2;
la figura 7 es un diagrama que muestra resultados de deteccion de fosforilacion de residuos de tirosina en las protelnas del esperma en el ejemplo experimental 2;
la figura 8 es un diagrama que muestra resultados de medicion de la movilidad del esperma en el ejemplo experimental 2;
la figura 9 es un diagrama que muestra resultados de deteccion de citocinas en plasma seminal en el ejemplo experimental 3; y
la figura 10 es un diagrama que muestra valores relativos del recuento de leucocitos en el utero en el ejemplo 2. Mejor modo de llevar a cabo la invencion (Diluyente de esperma)
Los presentes inventores descubrieron que, en esperma congelado, el esperma muere debido a la aparicion de un dano funcional tras la descongelacion, lo que conduce a disminucion en la fecundidad en la inseminacion artificial, y que este dano funcional no se observa en casos en que se usa un diluyente complementado con plasma seminal, lo que conduce a un alto rendimiento reproductor. Los presentes inventores descubrieron ademas que, en este dano funcional, el aumento del nivel de los iones calcio influye en la movilidad del esperma y en la fosforilacion de residuos de tirosina de protelnas, completando de ese modo el diluyente de esperma del presente modo.
En el diluyente de esperma de la presente tecnica, un agente de quelacion, que forma un complejo con un ion calcio, esta contenido en el diluyente de base mencionado posteriormente. La inclusion del agente de quelacion en el diluyente de esperma suprime la fosforilacion de las protelnas del esperma producida por la implicacion de iones calcio tras la descongelacion del esperma congelado, dando como resultado una disminucion del dano funcional.
Mas particularmente, en la parte media del esperma, hay una region rica en mitocondrias donde se genera la energla (ATP) que va a usarse para el movimiento del esperma. Cuando los iones calcio actuan sobre las mitocondrias (mas particularmente, activa enzimas para producir ATP en las mitocondrias), se acelera la produccion de ATP, lo que conduce al movimiento rapido del esperma, aunque una activacion demasiado temprana del esperma produce la muerte del esperma antes de que esperma alcance el oviducto.
En un diluyente de esperma del presente modo, un agente de quelacion esta contenido en el diluyente, y el agente de quelacion forma un complejo con un ion calcio, impidiendo de ese modo que los iones calcio actuen sobre las mitocondrias del esperma.
El diluyente de esperma del presente modo se obtiene anadiendo un agente de quelacion que forma un complejo con un ion calcio a un diluyente de base.
En este caso, el diluyente de base significa un diluyente preparado de manera que el semen recogido puede almacenarse en el mismo a temperatura ambiente durante un periodo determinado sin deterioro de la funcion del esperma en el semen, diluyente que es un llquido que contiene componentes tales como glucosa, citrato de sodio,
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bicarbonato de sodio, EDTA-2Na, acido citrico, Tris y/o cloruro de potasio. El diluyente de base no esta limitado siempre que el diluyente de base sea un llquido usado habitualmente en este campo, y ejemplos del diluyente de base incluyen disolucion de Modena (glucosa 0,15 M, citrato de sodio 26,7 mM, hidrogenocarbonato de sodio 11,9 mM, acido citrico 15,1 mM, EDTA-2Na 6,3 mM, Tris 46,6 mM y penicilina 1.000 Ul/ml).
El agente de quelacion no esta limitado siempre que el agente de quelacion sea una sustancia que forme un complejo especlficamente con un ion calcio, y preferiblemente se usa acido tetraacetico de etilenglicol (EGTA (acido bis(2-aminoetil)-N,N,N',N'-tetraacetico de etilenglicol)). Puesto que el EGTA forma un complejo especlficamente con un ion calcio, puede suprimirse eficazmente la accion de los iones calcio sobre las mitocondrias del esperma.
Ademas, junto con EGTA, se usa preferiblemente acido etilendiaminatetraacetico (EDTA). El EDTA es una sustancia que forma complejos con, ademas de con un ion calcio, diversos iones divalentes tales como un ion magnesio e ion zinc.
Al anadir tanto EDTA como EGTA, los iones calcio que no se han quelado con EDTA pueden quelarse con EGTA, y la mayorla de los iones calcio que existen en el diluyente de base pueden quelarse finalmente. Por ejemplo, en los casos en que solo se usa EDTa como agente de quelacion, es necesario que la concentracion de EDTA en el diluyente de base sea alta con el fin de quelar todos los iones calcio con EDTA. Puesto que el diluyente de base contiene varios iones divalentes distintos de los iones calcio, tales como iones magnesio e iones zinc, tambien puede producirse quitacion excesiva de estos iones divalentes donde la concentracion de EDTA es demasiado alta, afectando a la funcion del esperma (fecundacion). Por tanto, preferiblemente se anaden tanto EDTA como EGTA.
Basandose en los resultados experimentales mencionados posteriormente, en los casos en que se anaden tanto EDTA como EGTA, las concentraciones de EDTA y EGTA en el diluyente de esperma son de manera preferible aproximadamente de 3 a 9 mM y aproximadamente de 3 a 9 mM, respectivamente, de manera mas preferible de 6,3 mM y 6 mM, respectivamente.
Ademas, con el fin de impedir que los leucocitos envuelvan (fragmenten o ataquen) al esperma, los embriones o similares en el utero, el diluyente de esperma contiene preferiblemente un factor inmunosupresor. Puesto que el esperma constituye una sustancia extrana para una hembra, la invasion del esperma en el utero produce migracion de leucocitos tales como neutrofilos y macrofagos, produciendo la fagocitosis del esperma, los embriones o similares, lo que afecta a la tasa de implantacion.
La tasa de implantacion es la razon del numero de fetos en el utero con respecto al numero de ovulos. Puesto que, especialmente en un animal multlparo tal como un cerdo, se liberan de 10 a 20 ovulos, es necesario en vista de la eficacia de produccion fecundar la mayor cantidad de ovulos posible de una vez para permitir que nazcan un gran numero de fetos.
Puesto que no es probable que se produzca la fagocitosis anterior en un cruzamiento natural, se cree que el plasma seminal en el semen contiene un factor inmunosupresor que suprime la migracion de leucocitos y el aumento excesivo en los leucocitos, impidiendo de ese modo el ataque posterior a los embriones.
Por tanto, la inclusion de un factor inmunosupresor, que puede suprimir la migracion de leucocitos, en el diluyente de esperma puede suprimir la fagocitosis del esperma o los embriones y obtener la mejora de la tasa de implantacion.
Como factor inmunosupresor, se prefieren hormonas esteroideas y citocinas.
Una hormona esteroidea preferida es el cortisol, que es un componente contenido en el plasma seminal. Mediante la inclusion de cortisol en el diluyente, se inhibe la inmunidad de la funcion de celular y de ese modo se bloquea la migracion de leucocitos y similares. De este modo, se suprime la fagocitosis del esperma o los embriones, y se obtiene la mejora de la tasa de implantacion.
En los casos en que el diluyente se usa para inseminacion artificial de cerdos, la cantidad de cortisol que va a anadirse en el diluyente de esperma usado para cada vez que hay inseminacion artificial es de manera preferible aproximadamente de 100 ng a 10,000 ng. La cantidad de cortisol es mas preferiblemente de 500 ng a 5,000 ng. Esta cantidad es casi igual que la cantidad de cortisol contenida en el plasma seminal total producido por un cerdo macho durante el cruzamiento natural.
Puesto que el cortisol esta contenido originalmente en plasma seminal, y se descompone y se descarga al exterior del organismo en 1 o 2 dlas tras la inyeccion en el utero, y puesto que el cortisol se inyecta localmente y no se extiende por todo el organismo, el organismo vivo no resulta afectado adversamente y no hay influencia perjudicial tal como produccion de lechones con deformaciones.
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Ademas, en lo que se refiere a otras hormonas esteroideas, tambien se considera que los derivados de cortisol tales como dexametasona, prednisolona e hidrocortisona cambian quimicamente para dar cortisol y de ese modo muestran una accion inmunosupresora similar. Por tanto, tambien pueden usarse estas hormonas esteroideas.
Los ejemplos preferidos de las citocinas incluyen factores inhibidores de la migracion de macrofagos (MIF) y serpina E1. Tanto los factores inhibidores de la migracion de macrofagos como la serpina E1 son sustancias contenidas en el plasma seminal.
Las citocinas tales como los factores inhibidores de la migracion de macrofagos y la serpina E1 son transductores de senales y suprimen la acumulacion innecesaria de leucocitos tales como neutrofilos y macrofagos en el utero, y por tanto tienen una accion inmunosupresora.
(Metodo de inseminacion artificial)
Ahora se describiran metodos de inseminacion artificial que usan el diluyente de esperma mencionado anteriormente. Como ejemplo, a continuacion se describira un metodo de inseminacion artificial de cerdos.
Se descongela esperma congelado preparado retirando plasma seminal del semen de un cerdo macho seguido por congelacion, e inmediatamente tras la descongelacion, se anade el esperma a un diluyente de esperma para preparar un semen artificial. Alternativamente, tras la descongelacion del esperma congelado, el esperma congelado puede anadirse al diluyente de esperma.
Mas particularmente, la descongelacion del esperma congelado se lleva a cabo a 37°C durante 60 segundos en los casos en que se usa esperma congelado preparado llenando esperma en una pajuela de 5 ml seguido por congelacion del esperma; o se lleva a cabo a 35°C durante 20 segundos, preferiblemente a 37°C durante 20 segundos, mas preferiblemente a 70°C durante 8 segundos, lo mas preferiblemente a 60°C durante 8 segundos en agua templada en los casos de una pajilla de 0,5 ml. Alternativamente, el diluyente de esperma puede anadirse directamente al esperma congelado.
El volumen del semen artificial usado para inseminacion artificial de un cerdo es de aproximadamente 50 ml cada vez, y el semen artificial puede prepararse de manera que la concentracion final del esperma sea del orden de 1x106 celulas/ml a 1x109 celulas/ml, preferiblemente del orden de 1x108 celulas/ml.
A continuacion, mediante la inyeccion del semen artificial preparado en el utero de un cerdo hembra en estado de estro, puede llevarse a cabo la inseminacion artificial.
Aproximadamente en el dia 114 tras la inseminacion artificial, se produce el parto del cerdo hembra. Tras el parto, los lechones pasan el periodo de lactancia durante de 20 a 40 dias, seguido por el destete, y aproximadamente 4 dias tras el destete, el cerdo hembra entra en estro de nuevo. La inseminacion artificial puede llevarse a cabo de la misma manera que la descrita anteriormente en el momento de reaparicion del estro en el cerdo hembra. Al llevarse a cabo la inseminacion artificial en un ciclo de este tipo, puede nacer un mayor numero de lechones durante el tiempo de vida de un cerdo hembra.
El diluyente de esperma puede almacenarse simplemente en un congelador. Por tanto, el diluyente de esperma puede usarse tras descongelarse cuando sea necesario, y puede usarse facilmente en el momento del estro de un cerdo hembra o similar.
Puesto que el esperma congelado va a diluirse con el diluyente de esperma del presente modo, preferiblemente se usa esperma congelado preparado retirando plasma seminal del semen y congelando. De este modo, la inseminacion artificial puede llevarse a cabo en condiciones completamente esteriles, de modo que, por ejemplo, el esperma puede usarse tambien para la produccion de cerdos SPF libres de patogenos especificos.
Ademas, dependiendo de la especie del mamifero, la inseminacion artificial puede ser dificil puesto que el plasma seminal afecta adversamente a la congelacion del esperma y por tanto no puede llevarse a cabo la congelacion. Incluso en tales casos, retirando el plasma seminal y congelando el esperma, seguido por la dilucion del esperma congelado con un diluyente de esperma del presente modo, puede llevarse a cabo la inseminacion artificial.
Ademas, el diluyente de esperma del presente modo puede usarse para la inseminacion artificial de cualquier mamifero no humano.
Ademas, el diluyente de esperma del presente modo puede usarse para mamiferos no humanos tales como animales domesticos, y puede usarse de manera adecuada para la inseminacion artificial de animales multiparos. Puesto que la tasa de implantacion es alta tambien en animales multiparos tales como cerdos, pueden nacer muchos fetos de una vez, de modo que pueda aumentarse la eficacia de produccion.
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Ademas, tambien en cerdos y similares, el diluyente de esperma del presente modo es util para la mejora de las tecnicas de crla tales como crla para mejorar la calidad de la carne y similares mediante el uso de esperma recogido solo de cerdos macho que tienen buenos pedigrles.
Ademas, puesto que no se usa plasma seminal en absoluto, no hay necesidad de mantener muchos cerdos macho. (Ejemplo experimental 1)
Mediante el cultivo de esperma de cerdo en un medio que contiene Ca2+, se estudio la influencia de Ca2+ sobre la fosforilacion de residuos de tirosina de las protelnas del esperma.
Como medio que contiene Ca2+, se uso mTBM (medio de tampon Tris modificado). La composition de mTBM se muestra en la tabla 1.
[TABLA 1]
- 11 mM
- Glucosa
- 5 mM
- Piruvato de sodio
- 113,1 mM
- NaCl
- 3 mM
- KCl
- 7,5 mM
- CaCl2-2H2O
- 20 mM
- Tris
- 0,1% (p/v)
- BSA (albumina serica bovina)
El esperma de cerdo que iba a usarse se recogio y se congelo tal como se describe a continuation. Los cerdos macho que iban a usarse para recoger el esperma se mantuvieron separados en pocilgas separadas, y se suministro un total de 2,5 kg de alimento para cerdos macho un total de dos veces por la manana y por la tarde. Se inoculo a los cerdos con vacuna frente a infection por encefalitis japonesa/parvovirus porcino. Para este estudio, se seleccionaron cerdos negativos para anticuerpos frente al slndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS) y para la enfermedad de Aujeszky. La recogida de esperma se llevo a cabo a intervalos de 1 semana. Antes de la recogida de esperma, se comprobo el apetito, los slntomas de enfermedades y similares para confirmar que los cerdos estaban en buenas condiciones, y se recogio el esperma de manera que los cerdos no se inquietaran.
Se coloco un cerdo hembra ficticio en la pocilga de cada cerdo macho y el cerdo macho monto al cerdo hembra ficticio, seguido por lavado del pene y el interior del prepucio con suero salino fisiologico para retirar la orina. La recogida de esperma se llevo a cabo mediante la tecnica manual con guantes, en la que se cubrio un recipiente esteril con gasa y entonces se coloco el semen en el interior del recipiente a la vez que se retiraba la sustancia gelatinosa, que es una sustancia similar a gelatina emitida junto con el semen. La recogida de semen se realizo para de 50 a 100 ml solo de la fraction rica en esperma (aproximadamente existe en la fraction un 80% del esperma total en el semen), y se retiro inmediatamente el plasma seminal mediante centrifugation del semen tras la recogida de esperma.
A continuacion, se diluyo el esperma usando un llquido de pretratamiento, y se ajusto la temperatura de la dilution resultante durante 2,5 horas a 15°C, seguido por retirada del sobrenadante mediante centrifugacion y enfriamiento del producto resultante en una disolucion con una presion osmotica de 400 mOsm/kg durante aproximadamente 1,5 horas hasta una temperatura de 4 a 5°C. La disolucion era una disolucion preparada ajustando la presion osmotica de NSF (expansor de congelation de Niwa y Sasaki; 80% (v/v), 0,31 mol de lactosa monohidratada, yema de huevo al 20% (v/v), penicilina G potasica 1000 U/ml, sulfato de estreptomicina 1 mg/ml; presion osmotica, 300 mOsm/kg) a 400 mOsm/kg con agua ultrapura. Posteriormente, se anadio un agente crioprotector y OEP al 0,15% (tensioactivo Orvus Es Paste) a la dilucion como un segundo diluyente. Ademas, se anadio una cantidad igual del diluyente secundario a la mezcla de esperma. La concentracion de espermatozoides (concentracion final) se ajusto en este caso a 1x109 celulas/ml. Tras la adicion del agente crioprotector, se mantuvo la temperatura de la mezcla resultante a de 4 a 5°C durante aproximadamente 30 minutos, seguido por congelacion de la mezcla. Para la congelacion de la mezcla se uso nitrogeno llquido. Tras llenar una pajilla con la mezcla de esperma, se congelo el
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esperma durante 10 minutos en vapor de nitrogeno llquido a una distancia de aproximadamente 4 cm desde la superficie del nitrogeno llquido, y se almaceno a continuation en nitrogeno llquido.
El esperma congelado de cerdo obtenido se descongelo a 60°C durante 8 segundos, y el esperma se anadio a un medio que contiene Ca2+ (mTBM), seguido por el cultivo del esperma. El cultivo se llevo a cabo durante 3 horas.
Ademas, como ejemplo de referencia 1, el esperma se anadio a un medio que contiene plasma seminal y se cultivo de la misma manera que la descrita anteriormente. La preparation del medio que contiene plasma seminal se llevo a cabo anadiendo plasma seminal al medio que contiene Ca2+ (mTBM) mencionado anteriormente hasta una concentration final del 10% (v/v). El plasma seminal se preparo retirando el esperma del semen recogido mediante centrifugation y sometiendo adicionalmente el producto resultante a centrifugation para retirar los solidos del sobrenadante.
Ademas, como ejemplo de referencia 2, el esperma congelado-descongelado se anadio a un medio libre de Ca2+ y se cultivo de la misma manera que la descrita anteriormente. La preparacion del medio libre de Ca2+ se llevo a cabo retirando el componente de Ca (CaCh-2H2O) del medio que contiene Ca2+ (mTBM) mencionado anteriormente.
Tras el cultivo, se recogieron 20 ml de cada uno de los medios en que se cultivo el esperma y se almacenaron a -80°C para usarse para la detection de fosforilacion de residuos de tirosina de protelnas. La detection de fosforilacion de residuos de tirosina se llevo a cabo mediante inmunotransferencia de tipo Western.
La deteccion de fosforilacion de residuos de tirosina mediante inmunotransferencia de tipo Western fue tal como sigue. Al esperma almacenado a -80°C, se anadieron 17 ml de un tampon de muestra de SDS, y se mezclo la mezcla resultante mediante pipeteo. Tras la centrifugacion a 10.000 rpm durante 2 minutos, se sometio la mezcla a ultrasonicacion durante 2 minutos, seguido por calentamiento de la mezcla a 100°C durante 5 minutos y sometiendo el producto resultante a electroforesis a 100 V durante aproximadamente 2 horas. Se transfirieron las protelnas sobre una membrana y se bloqueo la membrana con TBS complementado con BSA al 5%, seguido por adicion de un anticuerpo anti-tirosina fosforilada (anticuerpo primario, IgG de raton) que se diluyo 2.000 veces con TBS (Tris- HCl 20 mM, pH 7,5; NaCl 0,15 M) complementado con BSA al 0,5% y Tween 20 al 0,1%, y haciendo reaccionar el anticuerpo con la membrana durante 12 horas a 4°C. Tras lavar la membrana durante 2 horas con TBS complementado con Tween 20 al 0,1%, se hizo reaccionar un anticuerpo anti-IgG de raton (anticuerpo secundario) que se habla diluido 2.000 veces con TBS complementado con BSA al 0,5% y Tween 20 al 0,1% con la membrana durante 1 hora. Entonces se lavo la membrana con TBS complementado con Tween 20 al 0,1% durante 1 hora. Se anadio un sustrato colorante a la membrana, y se dejo que la reaction continuara durante 5 minutos, seguido por exposition de la membrana a una pellcula.
Los resultados de deteccion de fosforilacion de residuos de tirosina de las protelnas del esperma en el esperma cultivado en los medios respectivos se muestran en la figura 1.
En el esperma cultivado en el medio que contiene Ca2+, se detecto una banda que indicaba una fuerte fosforilacion de protelnas cerca de la banda indicada por la flecha en la figura 1. Se cree que en un medio que contiene Ca2+, el esperma no puede mantener su membrana celular normal debido a la fosforilacion.
Por otra parte, en el esperma cultivado en el medio que contiene plasma seminal en el ejemplo de referencia 1, no se detecto ninguna banda similar que indicara fosforilacion de residuos de tirosina de las protelnas del esperma, y por tanto se cree que la adicion del plasma seminal evitaba la aparicion de fosforilacion de residuos de tirosina de las protelnas del esperma. Ademas, en el esperma cultivado en el medio libre de Ca2+ en el ejemplo de referencia 2, se detecto una banda que indicaba fosforilacion de protelnas en cierto grado. Se considero que esto se habla producido, incluso tras la retirada del componente de Ca (CaCh-2H2O), por la influencia de una pequena cantidad de Ca2+ que existe en el agua pura que uso para mTBM.
A partir de los resultados anteriores, se revelo que la existencia de iones calcio esta implicada en una perdida funcional de esperma, y la supresion de la accion de Ca2+ sobre el esperma en un esperma congelado diluido es indispensable para la mejora de la tasa de conception tras la insemination artificial.
(Ejemplo experimental 2)
Se llevaron a cabo pruebas para confirmar si cultivar esperma de cerdo en un medio al que se anadio un agente de quelacion suprime o no la disminucion en la movilidad del esperma, la tasa de dano acrosomal del esperma y la fosforilacion de residuos de tirosina de las protelnas del esperma.
En primer lugar, se estudio la influencia de la adicion de EDTA.
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Se prepararon medios que tenlan concentraciones de EDTA de 0 mM, 3 mM, 6,3 mM y 12 mM. El medio de EDTA 0 mM y el medio de EDTA 3 mM se prepararon retirando EDTA-2Na de la disolucion de Modena y ajustando la concentracion de EDTA a 0 mM y 3 mM, respectivamente. Como medio de EDTA 6,3 mM, se uso disolucion de Modena tal cual. Ademas, el medio de EDTA 12 mM se preparo anadiendo EDTA-2Na a disolucion de Modena para lograr una concentracion de EDTA de 12 mM.
A cada medio, se le anadio esperma congelado tras la descongelacion como en el ejemplo experimental 1, y se cultivo el esperma. El tiempo de cultivo fue de 1 hora, 3 horas o 6 horas.
Tras el cultivo, se calculo la movilidad del esperma usando un analizador de movilidad (sistema de analisis de movilidad de esperma asistido por ordenador (CASA)). Sobre una placa precalentada hasta 38°C, se colocaron 5 ml del medio tras el cultivo y se analizo la razon de esperma en movimiento usando un ordenador.
La figura 2 muestra la movilidad del esperma cultivado en cada condicion.
Como resultado, con cualquier tiempo de cultivo, el esperma cultivado en el medio de EDTA 6,3 mM mostro la movilidad del esperma mas alta.
Posteriormente se estudio la influencia de la adicion de EGTA. En este estudio, se cultivo esperma en un medio preparado mediante la adicion adicional de EGTA al medio de EDTA 6,3 mM (disolucion de Modena), que mostro la movilidad del esperma mas alta tal como se describio anteriormente. Tras el cultivo, se llevaron a cabo la medicion de la movilidad del esperma, la detection de fosforilacion de residuos de tirosina de las protelnas del esperma y la medicion de la tasa de dano acrosomal del esperma.
Se prepararon medio de EGTA 0 mM, medio de EGTA 3 mM, medio de EGTA 6 mM y medio de EGTA 9 mM. Como medio de EGTA 0 mM, se uso disolucion de Modena tal cual. Ademas, el medio de EGTA 3 Mm, el medio de EGTA 6 Mm y el medio de EGTA 9 mM se prepararon anadiendo EGTA a disolucion de Modena para lograr concentraciones de EGTA de 3 mM, 6 mM y 9 mM, respectivamente, en el medio. Puesto que la adicion de EGTA da como resultado un pH mas acido del medio, se anadio NaOH al medio para ajustar el pH de 7,0 a 7,1.
A cada medio, se anadio esperma congelado tras la descongelacion como en el ejemplo experimental 1, y se cultivo el esperma. El tiempo de cultivo fue de 1 hora, 3 horas o 6 horas.
El esperma cultivado en cada condicion se sometio a medicion de la movilidad del esperma, deteccion de fosforilacion de residuos de tirosina de las protelnas del esperma y medicion de la tasa de dano acrosomal del esperma.
La medicion de la movilidad del esperma y la deteccion de fosforilacion de residuos de tirosina de las protelnas del esperma se llevaron a cabo de la misma manera que la descrita anteriormente. La medicion de la tasa de dano acrosomal del esperma se llevo a cabo tal como sigue. Sobre un portaobjetos se extendieron 5 ml del medio, seguido por secado con aire y 10 minutos de fijacion con metanol al 99%. Tras secar el metanol, se realizo una marca con una pluma llquida. Se anadio FITC-lectina de cacahuete al esperma extendido (aproximadamente 30 ml por muestra), seguido por 30 minutos de incubation a 37°C en una atmosfera humeda. A continuation, se lavo el esperma con PBS (5 minutos x 3 veces) y se incluyo en DAPI (VECTOR, VECTASHIELD con DAPI, H-1200) y entonces en Manicure, seguido por observacion del esperma.
El resultado de la medicion de la movilidad del esperma se muestra en la figura 3; el resultado de la deteccion de fosforilacion de residuos de tirosina de las protelnas del esperma tras 3 horas de cultivo se muestra en la figura 4; y el resultado de la medicion de la tasa de dano acrosomal del esperma se muestra en la figura 5.
En los casos en que el EGTA estaba contenido en el diluyente de esperma, la movilidad del esperma fue alta y la tasa de dano acrosomal del esperma fue baja en comparacion con los casos en los que EGTA no estaba contenido. Ademas, el esperma cultivado en el medio de EGTA 6 mM tenia la movilidad del esperma mas alta y mostro la fosforilacion mas suprimida de residuos de tirosina. Ademas, puede observarse que la tasa de dano acrosomal del esperma tambien fue bajo. A partir de estos resultados, puede observarse que puede obtenerse un efecto positivo en los casos en los que el diluyente de esperma contiene EGTA ademas de EDTA, y que el efecto maximo se observa cuando EGTA esta contenido a una concentracion de aproximadamente 6 mM.
Ademas, se observaron iones calcio incorporados en las celulas de esperma.
A cada uno de un medio que contiene EDTA y un medio que contiene EDTA/EGTA, se anadio esperma congelado de cerdo tras la descongelacion. Como medio que contiene EDTA se uso disolucion de Modena. El medio que contiene EDTA/EGTA se preparo anadiendo EGTA a la disolucion de Modena para ajustar la concentracion de EGTA A 6 mM.
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A cada medio se le anadieron FLUO3/AM 5 mM y Pluronic F127 al 0,02%, y se cultivo el esperma a 37°C durante 30 minutos en una sala oscura, permitiendo asi que FLUO3 se incorporara en las celulas de esperma.
A continuation, se retiro el sobrenadante mediante centrifugation y se anadio una nueva alicuota de cada medio al esperma. A continuacion se retiraron 5 ml de cada medio sobre un portaobjetos y se observo el esperma bajo un microscopio de fluorescencia. Los resultados se muestran en la figura 6.
FLUO3 es una sustancia que emite fluorescencia uniendose a un ion calcio. Cuando los iones calcio que existen en el medio se incorporan en las celulas de esperma, FLUO3 se une a un ion calcio, dando como resultado la emision de fluorescencia verde. Tal como puede observarse en la figura 6, para cada tiempo de cultivo, el esperma cultivado en el medio que contiene EDTA mostro una emision mas fuerte que el esperma cultivado en el medio que contiene EDTA/EGTA. El esperma cultivado en el medio que contiene EDTA mostro una emision muy fuerte especialmente cuando el tiempo de cultivo fue largo, pero el esperma cultivado en el medio que contiene EDTA/ EGTA solo mostro una emision debil de la parte media. Puede observarse que la incorporation de iones calcio en el medio en el esperma podria suprimirse con EGTA.
Posteriormente, se cultivo el esperma congelado-descongelado en un medio que contiene EDTA, un medio que contiene EDTA/EGTA y un medio que contiene plasma seminal, y se sometio el esperma cultivado en cada medio a detection de fosforilacion de residuos de tirosina y medicion de la movilidad del esperma.
Como medio que contiene EDTA se uso disolucion de Modena (EDTA 6,3 mM) tal cual. El medio que contiene EDTA/EGTA se preparo anadiendo EGTA a la disolucion de Modena para ajustar la concentration de EGTA a 6 mM. El medio que contiene plasma seminal se preparo anadiendo plasma seminal a disolucion de Modena hasta una concentracion final del 10% (v/v). El esperma congelado se descongelo y se anadio a cada medio, seguido por cultivo del esperma durante 1 hora.
El esperma cultivado en cada medio se sometio a deteccion de fosforilacion de residuos de tirosina de las proteinas del esperma. Los resultados se muestran en la figura 7.
En el esperma cultivado en el medio que contiene EDTA y el medio que contiene plasma seminal, se detectaron bandas debiles que indican fosforilacion de proteinas en la position indicada por la flecha, mientras que en el esperma cultivado en el medio que contiene EDTA/EGTA no se detecto ninguna banda que indicara fosforilacion de proteinas en la misma posicion, lo que sugiere que la fosforilacion de proteinas se suprimio completamente.
Ademas, el esperma tras el cultivo en cada medio se sometio a medicion de la movilidad del esperma. Los resultados se muestran en la figura 8.
En los resultados que muestran la movilidad del esperma en la figura 8, se observo una movilidad mas alta para el esperma cultivado en el medio que contiene EDTA/EGTA en comparacion con el esperma cultivado en el medio que contiene plasma seminal.
Por tanto, en el esperma cultivado en el medio que contiene EDTA/EGTA, puesto que no se produjo fosforilacion de residuos de tirosina de proteinas, la membrana celular del esperma tras la descongelacion era normal, y tambien se observo mejora de la movilidad del esperma. Por tanto, puede observarse que, mediante la inclusion de un agente de quelacion que forma un complejo con un ion calcio tal como EDTA/EGTA en un diluyente de base, puede prepararse un diluyente de esperma libre de plasma seminal.
A partir de los resultados experimentales anteriores, se demostro que los iones calcio estan implicados en la activation del esperma y en el dano del acrosoma debido a la fosforilacion de residuos de tirosina de proteinas tras descongelar el esperma congelado, y que la adicion de EDTA y/o EGTA, que quelan un ion calcio, a un diluyente posibilita la supresion del aumento en los iones calcio en las celulas de esperma y por tanto de la activacion del esperma y el dano del acrosoma, supresion que da como resultado el mantenimiento de la movilidad del esperma.
(Ejemplo 1)
Usando semen artificial preparado anadiendo esperma congelado de cerdo a un diluyente de esperma que contiene EDTA y EGTA, se llevo a cabo la insemination artificial de cerdos.
Se anadio EGTA a la disolucion de Modena para preparar un diluyente de esperma. La concentracion de EDTA fue de 6,3 mM y la concentracion de EGTA fue de 6 mM. A continuacion, como en el ejemplo experimental 2, se anadio NaOH al diluyente para ajustar el pH de 7,0 a 7,1.
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Se descongelo el esperma congelado a 60°C durante 8 segundos y se anadio al diluyente de esperma inmediatamente a continuacion, para preparar semen artificial (a continuacion en el presente documento denominado semen artificial A1). La concentracion de espermatozoides fue de 1x108 espermatozoides/ml.
Los cerdos hembra que iban a someterse a inseminacion artificial se prepararon mediante la inyeccion de 1.000 Ul/individual de gonadotropina serica (PMSG) y luego la administracion de 750 UU/individuo de gonadotropina corionica humana (hCG) 72 horas tras la inyeccion de PMSG, induciendo de ese modo superovulacion. La inseminacion artificial se llevo a cabo 40 horas tras la administracion de hCG, mediante la inyeccion de aproximadamente 50 ml (numero total de espermatozoides, 5 mil millones) de semen artificial A1 preparada tal como se describio anteriormente al utero de un cerdo hembra.
El dla 21 tras la inseminacion artificial, se confirmaron los fetos en un monitor en un diagnostico de gestacion por ecografla. El motivo por el cual se llevo a cabo la confirmation en el dla 21 fue que, puesto que el estro se produce en un cerdo a intervalos de 21 dlas, la existencia de ovulos sin fecundar u ovulos fecundados degenerados da como resultado la aparicion de un signo de estro en la region genital tras el diagnostico de gestacion en el dla 21 tras la fecundacion.
Ademas, se confirmo si se habla producido reaparicion mediante el metodo sin reaparicion al mismo tiempo en el dla 21, diagnosticando de ese modo la gestacion.
Ademas, como ejemplo de referencia, se llevo a cabo inseminacion artificial de la misma manera que la descrita anteriormente usando un semen artificial (a continuacion en el presente documento denominado semen artificial B1) preparado congelando esperma congelado de la misma manera que la descrita anteriormente en un diluyente que contiene plasma seminal preparado anadiendo plasma seminal a la disolucion de Modena (plasma seminal al 10% (v/v)).
Posteriormente, se midieron la tasa de conception y la tasa de implantation para cada semen artificial. Las tasas de conception se muestran en la tabla 2, y las tasas de implantacion se muestran en la tabla 3. La tasa de concepcion se calculo contando el numero de individuos en los que se llevo a cabo la inseminacion artificial y el numero de individuos en los que hubo gestacion. Ademas, la tasa de implantacion se calculo contando el numero total de cuerpos luteos y el numero total de fetos en el utero en 6 individuos de cerdos hembra.
[TABLA 2]
- Numero de individuos en los que se llevo a cabo la inseminacion artificial Numero de individuos en los que hubo gestacion Tasa de concepcion (%)
- Semen artificial A1
- 10 9 90
- Semen artificial B1
- 12 10 83
[TABLA 3]
- Numero total de cuerpos Numero total de fetos en Tasa de implantacion (%)
- luteos el utero
- Semen artificial A1
- 130 66 51
- Semen artificial B1
- 100 78 78
En el caso del semen artificial A1 que contiene EDTA/EGTA, la tasa de concepcion fue del 90%, que era un valor alto equivalente a la tasa de concepcion en el caso del semen artificial B1 que contiene el 10% de plasma seminal.
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Sin embargo, la tasa de implantacion fue del 51%, que fue menor que la tasa de implantacion del 78% en el caso del semen artificial B1 que contiene el 10% de plasma seminal, y la mayorla de los fetos se hablan fagocitado. Ademas, en el caso de inseminacion artificial usando el semen artificial A1, el lavado del oviducto de 3 individuos de cerdos hembra dio como resultado un numero total de cuerpos luteos de 51 y un numero de fetos en el utero de 42, lo que indica una fecundidad en el oviducto del 82%. Por tanto, sin fagocitosis de los fetos, la tasa de implantacion puede haber sido similar a la tasa de implantacion observada con el semen artificial B1. Se cree que, en el caso de la inseminacion artificial usando el semen artificial A1, los fetos se fagocitaron debido a la falta de inmunidad intrauterina tras la fecundacion.
(Ejemplo experimental 3)
A partir de los resultados en el ejemplo 1, se cree que se requiere la existencia de plasma seminal para lograr la funcion de fecundacion intrlnseca y para la mejora adicional de la tasa de implantacion, y que el plasma seminal contiene factores inmunosupresores mediante los cuales puede suprimirse la fagocitosis del esperma. Por tanto, se han realizado intentos para identificar los factores inmunosupresores en el plasma seminal.
Se recogio plasma seminal de 17 individuos de cerdos macho, y se midieron las hormonas esteroideas en el plasma seminal usando el metodo de EIA. Ademas, usando una matriz de anticuerpos de membrana (Proteome Profiler™ Array, Human Cytokine Array Panel A, ARY005), se detectaron las citocinas en el plasma seminal.
El resultado de la medicion de hormonas esteroideas en el plasma seminal se muestra en la tabla 4, y el resultado de la deteccion de citocinas en el plasma seminal se muestra en la figura 9.
[Tabla 4]
- Cortisol (ng/ml)
- En plasma seminal
- 0,92
Tal como se muestra en la tabla 4, se detecto 0,92 ng/ml de cortisol en el plasma seminal. Ademas, tal como se indica por los clrculos en la figura 9, se detectaron MIF y serpina E1. En la membrana mostrada en la figura 9, 3 ubicaciones (izquierda superior, izquierda inferior y derecha superior) siempre emiten luz, y un total de 36 tipos de anticuerpos anti-citocina especlficos estan dispuestos en otras ubicaciones, en cada una de las cuales uno de los anticuerpos se representa en 2 posiciones. En los casos en que existe una citocina reactiva especlficamente con un anticuerpo anti-citocina representado, la ubicacion en la que el anticuerpo estaba representado emite luz.
A partir de los resultados anteriores, se identifico que el plasma seminal contiene el factor inmunosupresors cortisol, MIF y serpina E1. Se cree que la inclusion de estos factores en un diluyente puede dar lugar a la mejora de la tasa de implantacion.
(Ejemplo 2)
Se preparo un semen artificial anadiendo esperma congelado de cerdo a un diluyente de esperma que contiene cortisol, EDTA y EGTA y se uso para realizar la inseminacion artificial de cerdos.
En primer lugar, se anadieron cortisol y EGTA a la disolucion de Modena para preparar un diluyente de esperma. La concentracion de cortisol fue de 100 ng/ml; la concentracion de EDTA fue de 6,3 mM; y la concentracion de EGTA fue de 6 mM. Como en el ejemplo 1, se anadio NaOH al diluyente para ajustar el pH de 7,0 a 7,1.
Se descongelo el esperma congelado a 60°C durante 8 segundos y se anadio al diluyente de esperma inmediatamente a continuacion, para preparar semen artificial (a continuacion en el presente documento denominado semen artificial A2). La concentracion de espermatozoides fue de 1x108 espermatozoides/ml.
Usando el diluyente de esperma preparado se llevo a cabo la inseminacion artificial. El metodo fue igual que el del ejemplo 1 excepto en que no se administro PMSG al cerdo hembra.
Ademas, de la misma manera que en el ejemplo 1, la inseminacion artificial se llevo a cabo usando el semen artificial A1 preparado diluyendo el esperma congelado con un diluyente de esperma al cual se anadieron EDTA y EGTA.
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La tasa de concepcion y la tasa de implantacion se muestran en la tabla 5. La tasa de concepcion se calculo contando el numero de individuos de cerdos hembra con el que se llevo a cabo la inseminacion artificial y el numero de individuos de cerdos hembra en los que hubo gestacion. Ademas, la tasa de implantacion se calculo contando el numero total de fetos en el utero y el numero total de cuerpos luteos en 4 individuos de cerdos hembra, seguido por dividir los valores entre el numero de individuos.
[TABLA 5]
- Tasa de concepcion (%) Numero de fetos en el utero (/individuos) Tasa de implantacion (%)
- Semen artificial A1
- 90 11,0 51
- Semen artificial A2
- 92 12,5 * CO CO
La tasa de concepcion en el caso de la inseminacion artificial usando el diluyente de esperma que contiene cortisol fue del 92%, que fue mayor que la tasa obtenida con el diluyente de esperma libre de cortisol, y ademas, la tasa de implantacion fue del 83%, que fue mucho mayor que la tasa del 51% obtenida con el diluyente de esperma libre de cortisol.
Ademas, la medicion del recuento de leucocitos en el utero tras la inseminacion artificial revelo que, tal como se indica por los valores relativos del recuento de leucocitos en el utero en la figura 10, el recuento de leucocitos en el utero en el caso del semen artificial A2 fue mucho mas pequeno que en el caso del semen artificial A1, y ademas, incluso mas pequeno que en el caso del semen artificial B1 en el ejemplo 1, en el que se uso plasma seminal. Por tanto, puede observarse que la accion inmunosupresora del cortisol suprimio la fagocitosis de los embriones tras la fecundacion, dando como resultado la tasa de implantacion mejorada.
Aunque la hormona cortisuprarrenal (una hormona esteroidea tal como cortisol) se inyecta habitualmente a una dosis de 5 a 50 mg por individuo para terapia de ganado, solo se inyectaron 5 mg en el utero en la inseminacion artificial del presente ejemplo. Por tanto, puesto que esta dosis es aproximadamente de 1.000 a 10.000 veces mas pequena que la dosis en los casos del uso terapeutico, se cree que la carne del cerdo madre y de los fetos en el utero no resulta afectada. Realmente, en lo que se refiere a los cerdos madre en los que se llevo a cabo la inseminacion artificial usando el diluyente de esperma, 4 individuos estan en el segundo mes de gestacion y 6 individuos estan en el primer mes de gestacion en la actualidad, sin experimentar ningun estado patologico de los cerdos madre ni aborto. Ademas, incluso tras el parto, no se encontraron lechones con deformaciones, y por tanto no hubo influencia perjudicial de la adicion de cortisol.
Tal como se ha indicado por los resultados experimentales anteriores, se realizo la preparacion de un diluyente de esperma libre de plasma seminal.
La presente solicitud se basa en la solicitud de la patente japonesa n.° 2009-144703, presentada el 17 de junio de 2009, como referencia.
Aplicabilidad industrial
Tal como se describio anteriormente, el diluyente de esperma contiene un agente de quelacion que forma un complejo con un ion calcio. Ademas, el diluyente de esperma contiene un factor inmunosupresor que suprime la migracion de leucocitos. Anadiendo esperma congelado a este diluyente de esperma seguido por la realizacion de inseminacion artificial, el esperma puede alcanzar los ovulos sin secarse, y el esperma y los embriones no se fagocitan por los leucocitos, dando como resultado una alta tasa de concepcion y una alta tasa de implantacion. El diluyente de esperma puede emplearse de manera adecuada en industrias tales como la industria de ganado en la que se crlan mamlferos no humanos, y especialmente se emplea eficazmente para la crla de animales multlparos tales como cerdos mediante inseminacion artificial.
Claims (5)
- REIVINDICACIONES1. Diluyente de esperma que comprende un agente de quelacion que forma un complejo con un ion calcio, en el que dicho agente de quelacion comprende EGTA y EDTA; y un factor inmunosupresor que suprime la migracion de leucocitos, en el que dicho factor inmunosupresor comprende cortisol.5 2. Uso de un diluyente de esperma segun la reivindicacion 1 para diluir esperma congelado preparado retirando elplasma seminal y congelando.
- 3. Uso segun la reivindicacion 2, en el que dicho esperma congelado es esperma congelado de un mamlfero no humano.
- 4. Uso segun la reivindicacion 3, en el que dicho mamlfero no humano es un animal multlparo.10 5. Uso segun la reivindicacion 4, en el que dicho animal multlparo es un cerdo.
- 6. Metodo para inseminacion artificial en el queesperma congelado preparado retirando plasma seminal del semen recogido de un mamlfero no humano y congelando se diluye con el diluyente de esperma segun la reivindicacion 1, para preparar semen artificial; ydicho semen artificial se inyecta en el utero de dicho mamlfero no humano, para llevar a cabo inseminacion artificial.15 7. Metodo para inseminacion artificial segun la reivindicacion 6, en el que se usa un animal multlparo como dichomamlfero no humano.
- 8. Metodo para inseminacion artificial segun la reivindicacion 7, en el que se usa un cerdo como dicho animal multlparo.
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