JP4783883B2

JP4783883B2 - 受胎率および産子数向上凍結精子およびその製法

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Publication number: JP4783883B2
Application number: JP2007325313A
Authority: JP
Inventors: 昌之島田; 哲司岡崎
Original assignee: Hiroshima University NUC; Oita Prefectural Government
Current assignee: Hiroshima University NUC; Oita Prefectural Government
Priority date: 2007-12-17
Filing date: 2007-12-17
Publication date: 2011-09-28
Anticipated expiration: 2027-12-17
Also published as: JP2009142237A

Description

本件発明は、哺乳動物、特にブタなどの家畜の人工授精用精子として用いるための凍結精子、およびその調製法に関する。

人工授精法は畜産分野において、産業上の利用可能性からみて重要な技術である。家畜の人工授精は、ウシを中心に行われている。しかしながら、その受胎率には、未だ改善の余地があり、また、ウシ以外の家畜については、人工授精技術が十分に確立していない。また凍結を行わず液状精液を使用する方法においても、季節や品種などの要因によって受胎率が変動し、常法による人工授精では安定した供給が困難である。

例えば、日本の養豚業では、人工授精技術が確立しておらず自然交配が主に用いられているため、各事業者は種雄ブタを飼育する必要があり、これにかかる経費は増大である。さらに雄種豚は体重が３００ｋｇ以上になり、作業にも危険が生じている。また、自然交配に多大な労力を必要とすることから、交配による優良種の育成（例えば、肉質、産子数に優れる品種の改良）の効率的な進展が妨げられている。

現在、人工授精法を行う例はあるものの、現在の体制では、注文後、液状精液を発送するため、種雌ブタの急な発情に対しては、時間差が生じ、発情を逃してしまうこともある。そのため、各事業者において凍結精液を保管し、急な発情にも適応可能な技術の開発が望まれている。しかしながら、ブタにおける凍結精液を用いた人工授精は、凍結融解後の精液の運動性が著しく低く、その受精能も低く、さらに、季節や品種などの要因によって受胎率が変動し、受胎率、一腹産子数が低いため（非特許文献１および２）に、産業水準では全く行われていないに等しい。一部の品種については、凍結融解精子を用いた人工授精により、充分な受胎率と産子数が得られる凍結精子を作出する事が可能となったものの（非特許文献１）、この方法においても、その作出の成功は、ブタの品種、個体、季節環境に大きく依存している。

例えば、品種間においては、ランドレース種＞＞大ヨークシャー種＝デュロック種
の順で精子の凍結は困難となり、ランドレース種においても２〜３割の個体では、凍結精子を作出できない。さらに、夏期における高温条件が精子の性状を悪化させ、その影響が秋にまでおよび、猛暑の年では、７割以上のブタにおいて凍結精子を調製することが不可能となる。したがって、凍結精液を作出し、それを用いた人工授精を普及させるためには、全ての品種において安定的に凍結精液を作出できる技術の開発が必要である。

この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、次のものがある。
岡崎哲司外２名、「ブタ凍結融解精子の運動性・着床率に及ぼす希釈液の浸透圧とGlycerol濃度の影響」、日本畜産学会第107回大会一般講演V29-29 豚凍結精液利用技術マニュアル（丹羽太左衛門監修１９８９）、社団法人日本家畜人工授精師協会

凍結精液を作出し、それを用いた人工授精を普及させるために、耐凍性の低い品種・個体において安定的に凍結精液を作出できる技術を提供することを、本発明の課題とする。

本発明者らは、精漿を採精後即座に除去して凍結した精子が融解後に高い運動性を維持すること、精漿を除去して凍結した精子を融解した場合に融解直後に受精可能な精子へと変化するために受胎効率が低下すること、および、精漿を除去して凍結し融解の際に精子に精漿を添加すると受精能獲得及び先体反応が抑制されその結果受胎率が上昇することを見出して、本発明を完成させた。

従って、本発明は、以下を提供する。
（項目１）精漿を除去し、凍結した哺乳動物の精液。
（項目２）前記哺乳動物が非ヒト哺乳動物である、項目１に記載の精液。
（項目３）前記非ヒト哺乳動物が家畜である、項目２に記載の精液。
（項目４）前記家畜がブタである、項目３に記載の精液。

（項目５）精漿を除去し、凍結した哺乳動物の精液を含有する、人工授精のための組成物。
（項目６）前記哺乳動物が非ヒト哺乳動物である、項目５に記載の組成物。
（項目７）前記非ヒト哺乳動物が家畜である、項目６に記載の組成物。
（項目８）前記家畜がブタである、項目７に記載の組成物。
（項目９）０．５％〜１０％グリセロールを含有する、項目５に記載の組成物。
（項目１０）哺乳動物の精漿を含有する、該哺乳動物の精子の受精能獲得及び先体反応抑制剤。
（項目１１）前記哺乳動物が非ヒト哺乳動物である、項目１０に記載の受精能獲得及び先体反応抑制剤。
（項目１２）前記非ヒト哺乳動物が家畜である、項目１１に記載の受精能獲得及び先体反応抑制剤。
（項目１３）前記家畜がブタである、項目１２に記載の受精能獲得及び先体反応抑制剤。
（項目１４）前記精子が、精液から精漿を除去して調製された精子である、項目１０に記載の受精能獲得及び先体反応抑制剤。
（項目１５）前記精子が、精液から精漿を除去して調製され、凍結後に融解した精子である、項目１０に記載の受精能獲得及び先体反応抑制剤。
（項目１６）人工授精のための、哺乳動物の人工授精用精子の調製法であって、以下：
ａ）採精する工程；
ｂ）採精した精液から精漿を除去して精子を調製する工程；および、
ｇ）該精子を凍結する工程、
を包含する、方法。
（項目１７）さらに、
ｃ）前記工程（ｂ）において精液から精漿を除去することにより調製した精子を、０．３３Ｍグルコース、１２．８ｍＭクエン酸ナトリウム、１４．３ｍＭ炭酸水素ナトリウム、および９．９ｍＭＥＤＴＡ−２Ｎａを含有する溶液中で維持する工程、
を包含する、項目１６に記載の方法。
（項目１８）さらに、以下：
ｄ）前記工程（ｃ）で維持した精子を遠心処理する工程；
ｅ）上澄みを除去し、精子を浸透圧が１００〜１０００ｍＯｓｍ／ｋｇの溶液中に維持する工程、
を包含する、項目１７に記載の方法。
（項目１９）さらに、以下：
ｆ）前記工程（ｅ）で調製した精子を含む溶液に、０．５％〜１０％グリセロールを添加する工程、
を包含する、項目１８に記載の方法。
（項目２０）前記哺乳動物が非ヒト哺乳動物である、項目１６に記載の方法。
（項目２１）前記非ヒト哺乳動物が家畜である、項目２０に記載の方法。
（項目２２）前記家畜がブタである、項目２１に記載の方法。

（項目２３）哺乳動物の人工授精のための精子の調製法であって、以下：
ｈ）項目１６に記載の方法で調製した凍結精子を融解する工程；および、
ｉ）該融解した精子に、哺乳動物の精漿を添加する工程、
を包含する方法。
（項目２４）哺乳動物の人工授精法であって、以下：
ｈ）項目１６に記載の方法で調製した凍結精子を融解する工程；
ｉ）該融解した精子に、哺乳動物の精漿を添加して、精子溶液を調製する工程；および、
ｊ）工程（ｉ）で調製した精子溶液を用いて、該哺乳動物に人工授精する工程、
を包含する方法。

本発明に従って、耐凍性の低い品種・個体においても安定的に凍結精液を作出できる技術が提供される。その結果、凍結精液を用いた人工授精を哺乳動物種や家畜の品種に拘らず適用することが可能となる。

以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。

以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。

本明細書において使用する場合、用語「精漿」とは、精液の液体成分をいう。

本明細書において使用する場合、用語「精子」とは、精液の細胞成分をいう。

本明細書において使用する場合、用語「精漿の除去」とは、精液から、液体成分の少なくとも一部を除去する工程をいう。

本明細書において使用する場合、用語「家畜」とは、家畜（かちく）とは、人間が利用するために飼育する動物をいう。家畜としては、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギが挙げられるが、これに限定されない。

本明細書において使用する場合、用語「先体反応」とは、精子が卵表面に達した時に生じる精子の頭部先端での反応をいう。哺乳動物の精子の先体反応としては、ヒアルロニダーゼの放出、タンパク質分解酵素の放出が挙げられるが、これに限定されない。

本明細書において使用する場合、用語「先体反応抑制剤」とは、哺乳動物の先体反応の少なくとも１つを抑制する作用を有する物質をいう。従って、哺乳動物の精子の先体反応としてのヒアルロニダーゼの放出およびタンパク質分解酵素の放出の少なくとも１つを抑制する物質は、本発明の先体反応抑制剤である。

本発明の一つの局面においては、凍結した精子を用いる高効率人工授精が提供される。本発明において、限定されることはないが、採精後精液から精漿を即座に除去し凍結させた凍結精子が提供される。本発明において、精漿を除去した凍結精子を融解すると、直ちに受精能を獲得し、先体反応を生じるために、人工授精の効率が低くなることを見出した。さらに、本発明において、凍結した精子を融解することによって生じる受精能獲得と先体反応を、精漿によって抑制可能であることを見出した。このように受精能獲得と先体反応が抑制された精子は、人工授精効率を高めることが見出された。従って、本発明の一つの局面においては、精漿を採精後即座に除去し凍結した精子の融解時、又は融解後直ちに精漿を添加する、人工授精用精子の調製法が提供される。

理論に拘束されることは望まないが、上記発明は、以下のように理解できる。精子の受精能獲得は雌生殖器道内で誘起され、その後、卵子近傍において先体反応を起こし、卵膜を溶かし精子が卵子内に侵入する。受精能獲得精子は運動性が著しく増加し寿命が短い。そのため，受精能獲得および先体反応というこれら２つの現象は雌生殖器道内で誘起されることが望ましく、高効率の人工授精を成功させるためには両方を抑制した条件が必要であると考えられる。

精子を凍結する際には、０．５％〜１０％（終濃度）グリセロールを含有すると人工授精効率が向上するため、必要に応じて、凍結前精子に、グリセロールを添加する。

精液から精漿を採精後即座に除去して調製した精子を、維持するのに好ましい緩衝液は、限定されることはないが、代表的には、０．３３Ｍグルコース、１２．８ｍＭクエン酸ナトリウム、１４．３ｍＭ炭酸水素ナトリウム、および９．９ｍＭＥＤＴＡ−２Ｎａを含む緩衝液である。また、この緩衝液に維持した後、精子を浸透圧が１００〜１０００ｍＯｓｍ／ｋｇの溶液中に維持することによって、人工授精効率を向上することも可能である。

（方法と材料）
例示としてブタを用いる代表的な方法と材料は、以下のとおりであるが、本発明はこれらに限定されない。

（１．使用するブタの体重）
使用するブタの体重は、限定されることはないが、約３５０ｋｇ前後を目安とする。

（２．採精前の動物の管理条件）
採精に使用する雄ブタを、それぞれ個々の豚房で別々に飼育し、朝、夕の２回、計２．５ｋｇの種ブタ用飼料を給餌する。ブタには、日本脳炎・豚パルボウイルス感染症ワクチンの接種を行う。本検討には、豚繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）、オーエスキー病に対して抗体陰性のブタを選択する。採精は、1週間間隔をあけて行う。採精前は、餌食い、病気の兆候等を確認し、良好なブタであることを確認し、ブタを興奮させないように採精を行う。

（３．採精法）
擬牝台を雄ブタの豚房に入れ、雄ブタを台に乗せる。ペニスおよび包皮内を生理食塩水で洗浄し、尿を除去する。採精は、手圧法で行い、あらかじめ滅菌したカップにガーゼをかぶせ、精液と共に出るゼリー状の物質である膠様物を除去しながら、精液をカップに入れる。精液は、始めの５０〜１００ｍＬの濃厚部（全精液量の約８割の精子が存在する）のみを採取する。

（４．精漿の除去法）
採精後遠心分離によって精漿を精液から即座に除去する。遠心分離の条件は限定されないが、代表的には、採取した精液をすぐに実験室に運び、遠心分離機を用いて（２，０００ｒｐｍ、３分間）精子と精漿を分離し、上澄み精漿を除去する。その後すぐに前処理液（０．３３Ｍグルコース、１２．８ｍＭクエン酸ナトリウム、１４．３ｍＭ炭酸水素ナトリウム、９．９ｍＭＥＤＴＡ−２Ｎａ、1，０００（ＩＵ／ｍｌ）のペニシリン、および１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有する溶液）を用い沈殿精子を懸濁し、上記と同様に遠心分離し、上澄みを除去して完全に精漿を除去する。その後、前処理液を用い精子を希釈し、２〜３時間かけて１５℃にする。

（５．精漿を除去した精子の凍結法）
精漿を除去した精子を数時間（例えば、２〜３時間）かけて、室温から１５℃程度にし、遠心による上清除去後、浸透圧が１００〜１０００ｍＯｓｍ／ｋｇ（好ましくは、４００ｍＯｓｍ／ｋｇ）の溶液中（好ましくは、0.31Mラクトース液（４００ｍOsm/ｋｇに調整）８０％，卵黄２０％，1,000IU/mlペニシリン，1mg/mlストレプトマイシンの溶液）に約１〜２時間維持しながら、４〜５℃まで冷却する。次に耐凍剤（例えば、１〜２０％程度のグリセロール（好ましくは、添加後の終濃度２％）と0.15%（添加後の終濃度）のOEP（ＯｒｖｕｓＥｓＰａｓｔｅ界面活性剤））を添加する。この場合の精子濃度を１×１０^７細胞／ｍｌ〜１×１０^１０細胞／ｍｌ、好ましくは、１×１０^９細胞／ｍｌにする。（凍結時は精子はこの濃度で，融解時融解液の中では１×１０^８細胞／ｍｌである．）耐凍剤の添加後、３０分程度、４〜５℃に保ち、その後、凍結する。凍結には、液体窒素またはプログラムフリーザーを用いることができる。液体窒素を用いる凍結法は、ストローに精漿を除去した精子を充填後、液体窒素表面から数センチ（例えば、４ｃｍ程度）離したところで液体窒素蒸気中で10分間凍結し、その後、液体窒素中で保存する方法である。

（６．精漿の調製法）
精漿としては、遠心分離によって精液から精子を除去した後、さらに、遠心分離によって、その上清から固体の混入物を除去することによって、調製することが可能である。好ましくは、そのようにして調製した精漿に、モデナ液（０．１５Ｍグルコース、２６．７ｍＭクエン酸ナトリウム、１１．９ｍＭ炭酸水素ナトリウム、１５．１ｍＭクエン酸、６．３ｍＭＥＤＴＡ−２Ｎａ、４６．６ｍＭトリスおよび１，０００ＩＵ／ｍｌペニシリン）のような液体を添加して、希釈する。

（７．精子運動率の測定）
精子運動性を、運動性解析装置：Ａｃｏｍｐｕｔｅｒ-ａｓｓｉｓｔｅｄｓｐｅｒｍｍｏｔｉｌｉｔｙａｎａｌｙｓｉｓ（ＣＡＳＡ）ｓｙｓｔｅｍ (ＨａｍｉｌｔｏｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ)を使用して測定する。凍結後融解した精子を、３７℃のモデナ液中にてインキュベーションした後、３７℃に温まったプレートの上に５μｌの精液を載せて、コンピューターにより動いている精子の割合を解析する。

（８．先体反応の評価方法）
精子先体の正常率は、ＦＩＴＣでラベルしたｐｅａｎｕｔａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＦＩＴＣ−ＰＮＡ（Ｓｉｇｍａ））およびｐｒｏｐｉｄｉｕｍｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）での二重蛍光染色法により測定する。凍結後融解した精子を、モデナ液で１：１０（ｖ／ｖ）に希釈し、その後、この混合物をスライド上に引き延ばし、そして室温で空気乾燥する。上記混合物を、室温で１０分間、無水メタノールで固定する。ＰＢＳ中の３０μＬのＦＩＴＣ−ＰＮＡ溶液（１００μＬ／ｍｌ）を、それぞれのスライド上に広げる。スライドをその後、３８℃で２０分間、インキュベーター内（３８℃，５％CO₂）でインキュベートし、続いて、ＰＩ染色溶液の添加、そしてさらに１０分間のインキュベーションを行う。上記混合物を、その後ＰＢＳで十分に洗浄し、空気乾燥し、そしてその後、１０μｌのアンチフェード溶液（グリセロール：ＰＢＳ，１：１）にのせ、蛍光を保たせる。カバーグラスをその後あてがい、端を無色のマニキュア液で封をする。

ＦＩＴＣ−ＰＮＡは、精子先体にある糖鎖を認識し結合する。ＦＩＴＣは緑色の蛍光を発色する。先体は、先体反応を誘起していなければきれいに染色され、先体反応を誘起していれば緑色が欠けたり、発色しない。ＰＩは細胞の核を赤色に染色する。以上から、先体反応を、誘起していない精子は赤色プラス緑色を示し、誘起している精子は赤プラス若干の緑または赤のみを呈す。

（９．受精能獲得の測定法）
精子が卵子に侵入する能力を獲得することを受精能獲得とよぶ。受精能獲得の生化学的現象の１つにタンパクのチロシンリン酸化がある。このリン酸化は精子受精能獲得の指標となっておりウェスタンブロット法で確認される。ウェスタンブロット法の代表的方法を、以下に説明する。

−８０℃で保存した精子にＳＤＳサンプル緩衝液１７μｌを添加し、ピペッティングする。１０，０００ｒｐｍ２分間遠心し、超音波処理を２分行ない、その後、１００℃で５分加熱し、１００Ｖで２時間程度泳動する。メンブランに転写し、５％ＢＳＡ添加ＴＢＳでのブロッキング後、０．５％ＢＳＡおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を添加したＴＢＳ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１５ＭＮａＣｌ）に１：２，０００希釈した抗リン酸化チロシン抗体（一次抗体、マウスＩｇＧ）を添加し、メンブランに１２時間４℃で反応させる。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を添加したＴＢＳで２時間洗浄後、０．５％ＢＳＡおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を添加したＴＢＳに１：２，０００希釈した抗マウスＩｇＧ抗体（二次抗体）を１時間反応させる。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を添加したＴＢＳで１時間洗浄する。発色基質を添加し、５分間反応させ、フィルムに感光させる。

（１０．発情期同期方法）
発情期同期を、Ｋｉｋｕｃｈｉｅｔａｌ．（１９９９）の方法により行う。繁殖に使用する雌ブタの発情期同期化は：（１）離乳後２４時間で、１０００ＩＵのPMSG（pregnant mare serum gonadotropin）（ＶＥＴＥＲＩＮＡＲＹＰＥＡＭＥＸ，Ｓａｎｋｙｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）の注射、続いて７２時間後、５００ＩＵのｈＣＧ(Humanchorionic gonadotropin)の注射により誘導；（２）ＰＭＳＧ投与開始２日後に、発情期検出を日に２回（０９：００および１６：００）実行する；（３）ｈＣＧ投与から４０時間後、雌ブタをランダムに各群に分けることにより行った。

（１１．統計分析）
各検討のデータは、平均±標準誤差で示す。データは、Ｅｘｃｅｌ（登録商標）統計を使用して分析する。データは一元配置分散分析で検定後，Fisherの最小有意差法を用いた。

（１２．凍結した精子の融解）
凍結した精子の融解は、限定されることはないが、代表的には、５ｍｌストローの場合は37℃で６０秒、0.5mlストローの場合には３５℃で２０秒、好ましくは３７℃で２０秒、より好ましくは７０℃で８秒、最も好ましくは６０℃の温水中８秒間で行う。あるいは、凍結した精子に直接、精漿を添加してもよい。

（１３．精漿の添加）
凍結した精子の融解後即座に、または、融解時に、精漿を添加する。精漿は、精子を提供した個体と異なる個体由来であっても、同一の個体由来であってもよい。添加する精漿の量は、融解液好ましくはモデナ液（組成は技術説明に記載）に精子の終濃度が、１×１０^６細胞／ｍｌ〜１×１０^９細胞／ｍｌ、好ましくは、１×１０^８細胞／ｍｌになるよう添加する．
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例にも限定されるものではなく、請求の範囲によってのみ限定される。

（実施例１：精子凍結における精漿除去の影響）
ランドレース種雄性ブタ（２４ヶ月齢、体重およそ３５０ｋｇ前後）７頭から、精液を採取し、それぞれの精液を半分づつ、精漿除去を行わない常法群および精漿除去法を実施する群に分けた。これらの常法群と精漿除去法群それぞれにおいて（インキュベーション時間は１および３時間）、凍結後に融解した精子の運動性（精子運動率：泳いでいる精子の割合）を、運動性解析装置（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−ａｓｓｉｓｔｅｄｓｐｅｒｍｍｏｔｉｌｉｔｙａｎａｌｙｓｉｓ（ＣＡＳＡ）ｓｙｓｔｅｍを用いて測定した。

その結果、図１に示すように、上記７頭中５頭においては、それぞれの手法群間において精子運動率の差が認められなかったが、図２に示すように、残りの２頭においては、常法群において融解後の運動率が低く、精漿除去法群において有意に高い運動性が認められた。

一般的に、凍結融解後の精子の受精能力、すなわち凍結能、が低いことが知られている、大ヨークシャー種における精漿除去の影響を検討した結果、いずれの個体においても（ｎ＝５）、常法による凍結では融解後の精子運動性は低く、精漿除去の有効性が認められた(図３）。

以上の結果から、耐凍性の低い個体および耐凍性の低い品種において、採精後、直ちに精漿を除去し、続いて凍結する方法が有効的である事が明らかとなった。

（実施例２：常法と精漿除去法により作出した凍結精液を用いた人工授精）
ランドレース種雄性ブタにおいて、常法および精漿除去法により作出した凍結精液の人工授精に対する影響を検討した。採精後、精液を、Ａ処理区：液状精液、Ｂ処理区：常法により作出し、融解後の精子運動性が高かった精液、Ｃ処理区：常法により作出し、融解後の精子運動性が低かった精液、Ｄ処理区：Ｃ処理区から採取した精液を精漿除去法により凍結した精液、の各群に分けた。これらの各群の精液を、それぞれ発情同期化させた雌性ブタ（ｎ＝５頭×４処理区）に人工授精し、受胎率を検討した。発情同期化は、発情４日前に血清性性腺刺激ホルモン（ＰＭＳＧ）１，０００ＩＵ／頭を注射し、そして、ＰＭＳＧ後７２時間後にヒト胎盤性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）７５０ＩＵ／頭を投与し、過排卵処理を施すことで行い、人工授精は、ｈＣＧ投与後４０時間後に行った。

人工授精後，21日目に超音波妊娠鑑定にて胎児をモニターで確認する（ブタは21日周期で発情がくるため，受精後21日目に妊娠鑑定をする際，授精していない，もしくは受精卵が退行した等があれば，陰部は発情の兆候を示している）。また、同時に21日目にノンリターン法にて再発情（リターン）がきているかもどうかも確認し、妊娠を決定する。

その結果、Ｃ群の精子運動性が低い精液、およびＤ群の精漿除去法により精子運動性が回復した精液の両群において、雌性ブタの受胎を全く確認できなかった（図４）。

以上から、精液の凍結過程においては、精漿の除去が精子の正常性を維持させるが、精子の本来の受精機能を果たす条件下（例えば、常温下および体内などが挙げられる）においては、精漿の存在が精子の機能に必要であることが明らかとなった。

（実施例３：精漿除去法により作出した凍結精子の融解後の機能性）
精漿除去法による凍結精子が、融解後、負の影響を示す原因を明らかにするため、常法による凍結法においても高い運動性を示す精子を含む精液を用いて以下の実験を行った。

精子の受精能獲得（受精前に精子の運動性が著しく向上する現象）の指標として、精子タンパク質のチロシン残基のリン酸化検出（図５）、および精子が卵子に進入する際に誘起させる先体反応（精子が卵子に進入し受精するため、精子が卵表面に到達したときに精子頭部の先体内の酵素を分泌し、先体膜が破れ変化する現象）を糖鎖検出試薬による検出（図６）を行った。

その結果、精漿除去区において、チロシンリン酸化バンドが検出され、そのリン酸化は４倍以上に上昇していた（図７）。また、先体反応を誘起させている精子の割合も精漿除去によって増加した（図８）。以上の結果から、精漿除去法により調製した凍結精子は融解直後に受精可能な精子へと変化するため、人工授精により雌個体に注入しても、卵子が存在する卵管まで到達しないために、体内で受精が認められないことが明らかとなった。

（実施例４：融解液への精漿添加が精子に及ぼす影響）
精漿除去法により作出した凍結精子は、融解後に自発的に受精可能な状態へと変化することにより、体内において受精が認められないことが明らかとなった、そこで、この精子の自発的な受精状態への変化を抑制することを目指して、凍結過程で除去した精漿に精子を融解時に速やかに暴露する影響を検討した。

精子は、常法において凍結融解後の著しく運動性が低い個体から採取し、精漿除去法により凍結を行い、その凍結精液を、精漿を０、５、１０、２０％添加した融解液を用いて融解し、その後のチロシンリン酸化、先体反応への影響を検討した（培養時間は、１、３、および６時間）。

その結果、融解後の自発的なチロシンリン酸化が１０％の精漿添加により抑制され（図９）、先体反応誘起率も有意に低下していた（図１０）。

以上の結果から、融解液への精漿添加により、受精能獲得及び先体反応誘起率を抑制することが確認された。

（実施例５：新規凍結精液作製、融解法を用いて作製した凍結融解精液の人工授精）
凍結融解後の運動性が低い個体、品種において（ｎ＝３）（個々のデータを（表１）に示す）、精液採取後、直ちに精漿を除去して凍結し、融解時に精漿に暴露するという本研究による新手法が、人工授精時における受胎率および一腹産子数に及ぼす影響を検討した。

その結果、（Ａ）液状精液および（Ｂ）常法で作出した凍結融解後運動性の高い精子を用いた人工授精では高い受胎率および一腹産子数が得られたが、（Ｃ）耐凍性の低い個体の精液を精漿除去法で凍結した精子、は図４と同様に受胎が全く認めれなかった。しかし、（Ｄ）新手法で凍結・融解した精子、において、（Ａ）と（Ｂ）と同等の高い受胎率と一腹産子数が得られた（図１１および図１２）。

（表：凍結融解後の運動性が低い個体の精漿除去凍結人工授精）

Ｌ＝ランドレース、Ｗ＝大ヨークシャー、Ｄ＝デュロック、ＬＷ＝交雑種。

（実施例６：開発した精子凍結、融解、人工授精法）
（採精〜凍結の方法）
採精後、１０分以内に遠心分離（２，０００ｒｐｍ、３分）で精子と精漿を分離、上澄み精漿を除去し、前処理液（０．３３Ｍグルコース、１２．８ｍＭクエン酸ナトリウム、１４．３ｍＭ炭酸水素ナトリウム、９．９ｍＭＥＤＴＡ−２Ｎａ、1，０００（ＩＵ／ｍｌ）のペニシリン、および１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有する溶液）中で希釈し、続いて室温放置し、２〜３時間かけて１５℃にする。その後、遠心処理（２、０００ｒｐｍ、５分）し、上澄みを除去する。１次希釈液である、修正Ｎｉｗａａｎｄｓａｓａｋｉｆｒｅｅｚｉｎｇｅｘｔｅｎｄｅｒ（ＮＳＦ）１（０．３１Ｍラクトース液（４００ｍＯｓｍ／ｋｇに調製）（８０％）および卵黄（２０％）に１，０００（ＩＵ／ｍｌ）のペニシリンおよび１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加）で希釈し、１．５時間かけて徐々に低下させ５℃に保持する。その後、２次希釈液である、修正ＮＦＳ２（ＮＳＦ１に１．５％ＯＥＰ（ＯｒｖｕｓＥｓＰａｓｔｅ界面活性剤）、４％グリセロールを添加）で希釈し、最終精子濃度を１０億／ｍｌに調製し、この最終調製精子を、０．５ｍｌストローに充填する。続いて、上記最終調製されたストローを液体窒素蒸気中で１０分間放置する。その後、液体窒素中で保管を行う。２次希釈液での希釈から、液体窒素蒸気中への放置までの時間は３０分間で行う。凍結に用いたＮＳＦは、３０年来用いられている、公知の処理液であり、本発明者らは、この処理液の最適浸透圧、グリセロールの濃度の組み合わせを探索し、浸透圧４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、グリセロール濃度４％（終濃度２％）へと改良した。

（融解〜人工授精の方法）
凍結精液を液窒素より取り出し、６０℃の温水中で８秒間で融解し、即座に、モデナ液（０．１５Ｍグルコース、２６．７ｍＭクエン酸ナトリウム、１１．９ｍＭ炭酸水素ナトリウム、１５．１ｍＭクエン酸、６．３ｍＭＥＤＴＡ−２Ｎａ、４６．６ｍＭトリスおよび１，０００（ＩＵ／ｍｌ）のペニシリン）に１０％（ｖ／ｖ）精漿を添加した融解液中に入れる（精子濃度１億／ｍｌ）。

（精漿の作製・保存方法）
通常の液状精液で受胎率８０％以上・産子数１０頭以上の高い繁殖能力を持った雄ブタから、採精し、３，０００ｒｐｍ、２０分、遠心し、精子を除去後、上澄みの精漿をさらに１０，０００回転で３０分遠心し、この上澄みのみをモデナ液で１：１で希釈し、−２０℃以下で保存する。この上澄み液を、１０％添加する精漿として使用する。

人工授精する際、添加する精漿は精子に対して別の個体・品種のものであってもよい（保存精漿には精子は入っていない）。人工授精用ボトルに５０ｍｌ（総精子数５０億）入るようにする。

（雌ブタ発情同期化方法）
人工授精に用いた雌ブタは、発情４日前に血清性性腺刺激ホルモン（ＰＭＳＧ）１，０００ＩＵ／頭を注射し、そして、ＰＭＳＧ後７２時間後にヒト胎盤性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）７５０ＩＵ／頭を投与し、過排卵処理を施し、発情同期化させ、ｈＣＧ投与後４０時間後に人工授精を行った。分娩は、人工授精後１１４日後である。

以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。

従来法よりも優れた凍結精子の調製を可能とすることにより、ブタなどの品種においても、安定的かつ高効率に人工受精を行うことが可能になった。

図１は、ランドレース種雄性ブタ（７頭のうちの５頭）における、凍結・融解後１時間または３時間での、常法または精漿除去法により作製した精液それぞれでの精子運動率を表している。図２は、ランドレース種雄性ブタ（７頭のうちの２頭）における、凍結・融解後１時間または３時間での、常法または精漿除去法により作製した精液それぞれでの精子運動率を表している。図３は、大ヨークシャー種雄性ブタ（５頭）における、凍結・融解後１時間または３時間での、常法または精漿除去法により作製した精液それぞれでの精子運動率を表している。図４は、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤのそれぞれの群（ｎ＝５×４）でのランドレース種雄性ブタおける、液状精液、常法での精液および精漿除去法での精液それぞれでの受胎率を表している（Ａ群：液状精液、Ｂ群：常法により作製し、融解後の運動性が高い精子を含む精液、Ｃ群：常法により作製し、融解後の運動性が低い精子を含む精液、Ｄ群：Ｃ群から採取した精液（常法により作製すると融解後、運動性が低い精子を含む精液）を、精漿除去法により凍結した精液）。図５は、常法および精漿除去法それぞれにおける、精子タンパク質チロシン残基のリン酸化検出の結果を表している。図６は、常法および精漿除去法それぞれにおける、先体反応の糖鎖検出試薬による検出の結果を示している。図７は、常法および精漿除去法それぞれにおける、精子タンパク質チロシン残基のリン酸化割合を表している。図８は、常法および精漿除去法それぞれにおける、先体反応の誘起率（％）を表している。図９は、融解液への精漿添加が精子のチロシンリン酸化におよぼす影響について、精漿を０、５、１０、２０％添加した融解液を用いた検討結果を表している。図１０は、融解液への精漿添加が精子の先体反応におよぼす影響について、精漿を０、５、１０、２０％添加した融解液を用いた検討結果を表している。図１１は、Ａ：液状精液、Ｂ：常法で作出した凍結融解後運動性の高い精子、Ｃ：耐凍性の低い個体の精液を精漿除去法で凍結した精子、Ｄ：新手法で凍結・融解した精子のそれぞれを用いた人工授精における受胎率（％）を表している。図１２は、Ａ：液状精液、Ｂ：常法で作出した凍結融解後運動性の高い精子、Ｃ：耐凍性の低い個体の精液を精漿除去法で凍結した精子、Ｄ：新手法で凍結・融解した精子のそれぞれを用いた人工授精後の子宮内胎児数を表している。

Claims

非ヒト哺乳動物の人工授精法であって、以下：
１）以下の工程を包含する方法で調製した凍結精子を融解する工程；
ａ）採精する工程；
ｂ）採精した精液から直ちに精漿を除去して精子を調製する工程；および、
ｃ）該精子を凍結する工程、
２）該融解した精子に、哺乳動物の精漿を添加して、精子溶液を調製する工程；および、
３）工程（２）で調製した精子溶液を用いて、該非ヒト哺乳動物に人工授精する工程、
を包含する方法。
前記非ヒト哺乳動物が家畜である、請求項１に記載の方法。
前記家畜がブタである、請求項２に記載の方法。
非ヒト哺乳動物の人工授精法であって、以下：
ａ）採精する工程；
ｂ）採精した精液から直ちに精漿を除去して精子を調製する工程；
ｃ）該精子を凍結する工程、
ｄ）該凍結精子を融解する工程；
ｅ）該融解した精子に、哺乳動物の精漿を添加して、精子溶液を調製する工程；および、
ｆ）工程（ｅ）で調製した精子溶液を用いて、該非ヒト哺乳動物に人工授精する工程、
を包含する方法。
前記非ヒト哺乳動物が家畜である、請求項４に記載の方法。
前記家畜がブタである、請求項５に記載の方法。