JP5422848B2 - 受胎率および産子数向上凍結精子およびその製法 - Google Patents
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Description
精子、およびその調製法に関する。
の人工授精は、ウシを中心に行われている。しかしながら、その受胎率には、未だ改善の
余地があり、また、ウシ以外の家畜については、人工授精技術が十分に確立していない。
また凍結を行わず液状精液を使用する方法においても、季節や品種などの要因によって受
胎率が変動し、常法による人工授精では安定した供給が困難である。
いるため、各事業者は種雄ブタを飼育する必要があり、これにかかる経費は増大である。
さらに雄種豚は体重が300kg以上になり、作業にも危険が生じている。また、自然交
配に多大な労力を必要とすることから、交配による優良種の育成(例えば、肉質、産子数
に優れる品種の改良)の効率的な進展が妨げられている。
るため、種雌ブタの急な発情に対しては、時間差が生じ、発情を逃してしまうこともある
。そのため、各事業者において凍結精液を保管し、急な発情にも適応可能な技術の開発が
望まれている。しかしながら、ブタにおける凍結精液を用いた人工授精は、凍結融解後の
精液の運動性が著しく低く、その受精能も低く、さらに、季節や品種などの要因によって
受胎率が変動し、受胎率、一腹産子数が低いため(非特許文献1および2)に、産業水準
では全く行われていないに等しい。一部の品種については、凍結融解精子を用いた人工授
精により、充分な受胎率と産子数が得られる凍結精子を作出する事が可能となったものの
(非特許文献1)、この方法においても、その作出の成功は、ブタの品種、個体、季節環
境に大きく依存している。
の順で精子の凍結は困難となり、ランドレース種においても2〜3割の個体では、凍結精
子を作出できない。さらに、夏期における高温条件が精子の性状を悪化させ、その影響が
秋にまでおよび、猛暑の年では、7割以上のブタにおいて凍結精子を調製することが不可
能となる。したがって、凍結精液を作出し、それを用いた人工授精を普及させるためには
、全ての品種において安定的に凍結精液を作出できる技術の開発が必要である。
体において安定的に凍結精液を作出できる技術を提供することを、本発明の課題とする。
すること、精漿を除去して凍結した精子を融解した場合に融解直後に受精可能な精子へと
変化するために受胎効率が低下すること、および、精漿を除去して凍結し融解の際に精子
に精漿を添加すると受精能獲得及び先体反応が抑制されその結果受胎率が上昇することを
見出して、本発明を完成させた。
(項目1) 精漿を除去し、凍結した哺乳動物の精液。
(項目2) 前記哺乳動物が非ヒト哺乳動物である、項目1に記載の精液。
(項目3) 前記非ヒト哺乳動物が家畜である、項目2に記載の精液。
(項目4) 前記家畜がブタである、項目3に記載の精液。
(項目5) 精漿を除去し、凍結した哺乳動物の精液を含有する、人工授精のための組成
物。
(項目6) 前記哺乳動物が非ヒト哺乳動物である、項目5に記載の組成物。
(項目7) 前記非ヒト哺乳動物が家畜である、項目6に記載の組成物。
(項目8) 前記家畜がブタである、項目7に記載の組成物。
(項目9) 0.5%〜10%グリセロールを含有する、項目5に記載の組成物。
(項目10) 哺乳動物の精漿を含有する、該哺乳動物の精子の受精能獲得及び先体反応
抑制剤。
(項目11) 前記哺乳動物が非ヒト哺乳動物である、項目10に記載の受精能獲得及び
先体反応抑制剤。
(項目12) 前記非ヒト哺乳動物が家畜である、項目11に記載の受精能獲得及び先体
反応抑制剤。
(項目13) 前記家畜がブタである、項目12に記載の受精能獲得及び先体反応抑制剤
。
(項目14) 前記精子が、精液から精漿を除去して調製された精子である、項目10に
記載の受精能獲得及び先体反応抑制剤。
(項目15) 前記精子が、精液から精漿を除去して調製され、凍結後に融解した精子で
ある、項目10に記載の受精能獲得及び先体反応抑制剤。
(項目16) 人工授精のための、哺乳動物の人工授精用精子の調製法であって、以下:
a)採精する工程;
b)採精した精液から精漿を除去して精子を調製する工程;および、
g)該精子を凍結する工程、
を包含する、方法。
(項目17) さらに、
c)前記工程(b)において精液から精漿を除去することにより調製した精子を、0.
33M グルコース、12.8mM クエン酸ナトリウム、14.3mM 炭酸水素ナト
リウム、および9.9mM EDTA−2Naを含有する溶液中で維持する工程、
を包含する、項目16に記載の方法。
(項目18) さらに、以下:
d)前記工程(c)で維持した精子を遠心処理する工程;
e)上澄みを除去し、精子を浸透圧が100〜1000mOsm/kgの溶液中に維持
する工程、
を包含する、項目17に記載の方法。
(項目19) さらに、以下:
f)前記工程(e)で調製した精子を含む溶液に、0.5%〜10%グリセロールを添
加する工程、
を包含する、項目18に記載の方法。
(項目20) 前記哺乳動物が非ヒト哺乳動物である、項目16に記載の方法。
(項目21) 前記非ヒト哺乳動物が家畜である、項目20に記載の方法。
(項目22) 前記家畜がブタである、項目21に記載の方法。
(項目23) 哺乳動物の人工授精のための精子の調製法であって、以下:
h)項目16に記載の方法で調製した凍結精子を融解する工程;および、
i)該融解した精子に、哺乳動物の精漿を添加する工程、
を包含する方法。
(項目24) 哺乳動物の人工授精法であって、以下:
h)項目16に記載の方法で調製した凍結精子を融解する工程;
i)該融解した精子に、哺乳動物の精漿を添加して、精子溶液を調製する工程;および
、
j)工程(i)で調製した精子溶液を用いて、該哺乳動物に人工授精する工程、
を包含する方法。
術が提供される。その結果、凍結精液を用いた人工授精を哺乳動物種や家畜の品種に拘ら
ず適用することが可能となる。
限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において
使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられるこ
とが理解されるべきである。
くとも一部を除去する工程をいう。
するために飼育する動物をいう。家畜としては、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギが挙げられる
が、これに限定されない。
じる精子の頭部先端での反応をいう。哺乳動物の精子の先体反応としては、ヒアルロニダ
ーゼの放出、タンパク質分解酵素の放出が挙げられるが、これに限定されない。
少なくとも1つを抑制する作用を有する物質をいう。従って、哺乳動物の精子の先体反応
としてのヒアルロニダーゼの放出およびタンパク質分解酵素の放出の少なくとも1つを抑
制する物質は、本発明の先体反応抑制剤である。
本発明において、限定されることはないが、採精後精液から精漿を即座に除去し凍結させ
た凍結精子が提供される。本発明において、精漿を除去した凍結精子を融解すると、直ち
に受精能を獲得し、先体反応を生じるために、人工授精の効率が低くなることを見出した
。さらに、本発明において、凍結した精子を融解することによって生じる受精能獲得と先
体反応を、精漿によって抑制可能であることを見出した。このように受精能獲得と先体反
応が抑制された精子は、人工授精効率を高めることが見出された。従って、本発明の一つ
の局面においては、精漿を採精後即座に除去し凍結した精子の融解時、又は融解後直ちに
精漿を添加する、人工授精用精子の調製法が提供される。
精能獲得は雌生殖器道内で誘起され、その後、卵子近傍において先体反応を起こし、卵膜
を溶かし精子が卵子内に侵入する。受精能獲得精子は運動性が著しく増加し寿命が短い。
そのため,受精能獲得および先体反応というこれら2つの現象は雌生殖器道内で誘起され
ることが望ましく、高効率の人工授精を成功させるためには両方を抑制した条件が必要で
あると考えられる。
精効率が向上するため、必要に応じて、凍結前精子に、グリセロールを添加する。
、限定されることはないが、代表的には、0.33M グルコース、12.8mM クエ
ン酸ナトリウム、14.3mM 炭酸水素ナトリウム、および9.9mM EDTA−2
Naを含む緩衝液である。また、この緩衝液に維持した後、精子を浸透圧が100〜10
00mOsm/kgの溶液中に維持することによって、人工授精効率を向上することも可
能である。
例示としてブタを用いる代表的な方法と材料は、以下のとおりであるが、本発明はこれ
らに限定されない。
使用するブタの体重は、限定されることはないが、約350kg前後を目安とする。
採精に使用する雄ブタを、それぞれ個々の豚房で別々に飼育し、朝、夕の2回、計2.
5kgの種ブタ用飼料を給餌する。ブタには、日本脳炎・豚パルボウイルス感染症ワクチ
ンの接種を行う。本検討には、豚繁殖・呼吸障害症候群(PRRS)、オーエスキー病に
対して抗体陰性のブタを選択する。採精は、1週間間隔をあけて行う。採精前は、餌食い
、病気の兆候等を確認し、良好なブタであることを確認し、ブタを興奮させないように採
精を行う。
擬牝台を雄ブタの豚房に入れ、雄ブタを台に乗せる。ペニスおよび包皮内を生理食塩水
で洗浄し、尿を除去する。採精は、手圧法で行い、あらかじめ滅菌したカップにガーゼを
かぶせ、精液と共に出るゼリー状の物質である膠様物を除去しながら、精液をカップに入
れる。精液は、始めの50〜100mLの濃厚部(全精液量の約8割の精子が存在する)
のみを採取する。
採精後遠心分離によって精漿を精液から即座に除去する。遠心分離の条件は限定されな
いが、代表的には、採取した精液をすぐに実験室に運び、遠心分離機を用いて(2,00
0rpm、3分間)精子と精漿を分離し、上澄み精漿を除去する。その後すぐに前処理液
(0.33Mグルコース、12.8mMクエン酸ナトリウム、14.3mM炭酸水素ナト
リウム、9.9mM EDTA−2Na、1,000(IU/ml)のペニシリン、およ
び1mg/mlストレプトマイシンを含有する溶液)を用い沈殿精子を懸濁し、上記と同
様に遠心分離し、上澄みを除去して完全に精漿を除去する。その後、前処理液を用い精子
を希釈し、2〜3時間かけて15℃にする。
精漿を除去した精子を数時間(例えば、2〜3時間)かけて、室温から15℃程度にし
、遠心による上清除去後、浸透圧が100〜1000mOsm/kg(好ましくは、40
0mOsm/kg)の溶液中(好ましくは、0.31Mラクトース液(400mOsm/kgに調
整)80%,卵黄20%,1,000IU/mlペニシリン,1mg/mlストレプトマイシンの溶液)に
約1〜2時間維持しながら、4〜5℃まで冷却する。次に耐凍剤(例えば、1〜20%程
度のグリセロール(好ましくは、添加後の終濃度2%)と0.15%(添加後の終濃度)のOEP
(Orvus Es Paste界面活性剤))を添加する。この場合の精子濃度を1×
107細胞/ml〜1×1010細胞/ml、好ましくは、1×109細胞/mlにする
。(凍結時は精子はこの濃度で,融解時融解液の中では1×108細胞/mlである.)
耐凍剤の添加後、30分程度、4〜5℃に保ち、その後、凍結する。凍結には、液体窒素
またはプログラムフリーザーを用いることができる。液体窒素を用いる凍結法は、ストロ
ーに精漿を除去した精子を充填後、液体窒素表面から数センチ(例えば、4cm程度)離
したところで液体窒素蒸気中で10分間凍結し、その後、液体窒素中で保存する方法である
。
精漿としては、遠心分離によって精液から精子を除去した後、さらに、遠心分離によっ
て、その上清から固体の混入物を除去することによって、調製することが可能である。好
ましくは、そのようにして調製した精漿に、モデナ液(0.15Mグルコース、26.7
mMクエン酸ナトリウム、11.9mM炭酸水素ナトリウム、15.1mMクエン酸、6
.3mM EDTA−2Na、46.6mMトリスおよび1,000IU/mlペニシリ
ン)のような液体を添加して、希釈する。
精子運動性を、運動性解析装置:A computer-assisted sper
m motility analysis(CASA)system (Hamilton
Biosciences,Beverly,MA,USA)を使用して測定する。凍結
後融解した精子を、37℃のモデナ液中にてインキュベーションした後、37℃に温まっ
たプレートの上に5μlの精液を載せて、コンピューターにより動いている精子の割合を
解析する。
精子先体の正常率は、FITCでラベルしたpeanut agglutinin(F
ITC−PNA(Sigma))およびpropidium iodide(PI)での
二重蛍光染色法により測定する。凍結後融解した精子を、モデナ液で1:10(v/v)
に希釈し、その後、この混合物をスライド上に引き延ばし、そして室温で空気乾燥する。
上記混合物を、室温で10分間、無水メタノールで固定する。PBS中の30μLのFI
TC−PNA溶液(100μL/ml)を、それぞれのスライド上に広げる。スライドを
その後、38℃で20分間、インキュベーター内(38℃,5%CO2)でインキュベート
し、続いて、PI染色溶液の添加、そしてさらに10分間のインキュベーションを行う。
上記混合物を、その後PBSで十分に洗浄し、空気乾燥し、そしてその後、10μlのア
ンチフェード溶液(グリセロール:PBS,1:1)にのせ、蛍光を保たせる。カバーグ
ラスをその後あてがい、端を無色のマニキュア液で封をする。
発色する。先体は、先体反応を誘起していなければきれいに染色され、先体反応を誘起し
ていれば緑色が欠けたり、発色しない。PIは細胞の核を赤色に染色する。以上から、先
体反応を、誘起していない精子は赤色プラス緑色を示し、誘起している精子は赤プラス若
干の緑または赤のみを呈す。
精子が卵子に侵入する能力を獲得することを受精能獲得とよぶ。受精能獲得の生化学的
現象の1つにタンパクのチロシンリン酸化がある。このリン酸化は精子受精能獲得の指標
となっておりウェスタンブロット法で確認される。ウェスタンブロット法の代表的方法を
、以下に説明する。
グする。10,000rpm 2分間遠心し、超音波処理を2分行ない、その後、100
℃で5分加熱し、100Vで2時間程度泳動する。メンブランに転写し、5%BSA添加
TBSでのブロッキング後、0.5%BSAおよび0.1%Tween20を添加したT
BS(20mM Tris−HCl、pH7.5、0.15M NaCl)に1:2,0
00希釈した抗リン酸化チロシン抗体(一次抗体、マウスIgG)を添加し、メンブラン
に12時間4℃で反応させる。0.1%Tween20を添加したTBSで2時間洗浄後
、0.5%BSAおよび0.1%Tween20を添加したTBSに1:2,000希釈
した抗マウスIgG抗体(二次抗体)を1時間反応させる。0.1%Tween20を添
加したTBSで1時間洗浄する。発色基質を添加し、5分間反応させ、フィルムに感光さ
せる。
発情期同期を、Kikuchi et al.(1999)の方法により行う。繁殖に使
用する雌ブタの発情期同期化は:(1)離乳後24時間で、1000 IUのPMSG(preg
nant mare serumgonadotropin)(VETERINARY PEAMEX,Sankyo
,Tokyo,Japan)の注射、続いて72時間後、500 IUのhCG(Humanch
orionicgonadotropin)の注射により誘導;(2)PMSG投与開始2日後に、発情期検
出を日に2回(09:00および16:00)実行する;(3)hCG投与から40時間
後、雌ブタをランダムに各群に分けることにより行った。
各検討のデータは、平均±標準誤差で示す。データは、Excel(登録商標)統計を
使用して分析する。データは一元配置分散分析で検定後,Fisherの最小有意差法を用いた
。
凍結した精子の融解は、限定されることはないが、代表的には、5mlストローの場合
は37℃で60秒、0.5mlストローの場合には35℃で20秒、好ましくは37℃で20秒
、より好ましくは70℃で8秒、最も好ましくは60℃の温水中8秒間で行う。あるいは
、凍結した精子に直接、精漿を添加してもよい。
凍結した精子の融解後即座に、または、融解時に、精漿を添加する。精漿は、精子を提
供した個体と異なる個体由来であっても、同一の個体由来であってもよい。添加する精漿
の量は、融解液好ましくはモデナ液(組成は技術説明に記載)に精子の終濃度が、1×1
06細胞/ml〜1×109細胞/ml、好ましくは、1×108細胞/mlになるよう
添加する.
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提
供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例にも限定され
るものではなく、請求の範囲によってのみ限定される。
ランドレース種雄性ブタ(24ヶ月齢、体重およそ350kg前後)7頭から、精液を
採取し、それぞれの精液を半分づつ、精漿除去を行わない常法群および精漿除去法を実施
する群に分けた。これらの常法群と精漿除去法群それぞれにおいて(インキュベーション
時間は1および3時間)、凍結後に融解した精子の運動性(精子運動率:泳いでいる精子
の割合)を、運動性解析装置(Computer−assisted sperm mo
tility analysis(CASA)systemを用いて測定した。
て精子運動率の差が認められなかったが、図2に示すように、残りの2頭においては、常
法群において融解後の運動率が低く、精漿除去法群において有意に高い運動性が認められ
た。
、大ヨークシャー種における精漿除去の影響を検討した結果、いずれの個体においても(
n=5)、常法による凍結では融解後の精子運動性は低く、精漿除去の有効性が認められ
た(図3)。
精漿を除去し、続いて凍結する方法が有効的である事が明らかとなった。
ランドレース種雄性ブタにおいて、常法および精漿除去法により作出した凍結精液の人
工授精に対する影響を検討した。採精後、精液を、A処理区:液状精液、B処理区:常法
により作出し、融解後の精子運動性が高かった精液、C処理区:常法により作出し、融解
後の精子運動性が低かった精液、D処理区:C処理区から採取した精液を精漿除去法によ
り凍結した精液、の各群に分けた。これらの各群の精液を、それぞれ発情同期化させた雌
性ブタ(n=5頭×4処理区)に人工授精し、受胎率を検討した。発情同期化は、発情4
日前に血清性性腺刺激ホルモン(PMSG)1,000IU/頭を注射し、そして、PM
SG後72時間後にヒト胎盤性性腺刺激ホルモン(hCG)750IU/頭を投与し、過
排卵処理を施すことで行い、人工授精は、hCG投与後40時間後に行った。
で発情がくるため,受精後21日目に妊娠鑑定をする際,授精していない,もしくは受精卵
が退行した等があれば,陰部は発情の兆候を示している)。また、同時に21日目にノンリ
ターン法にて再発情(リターン)がきているかもどうかも確認し、妊娠を決定する。
回復した精液の両群において、雌性ブタの受胎を全く確認できなかった(図4)。
子の本来の受精機能を果たす条件下(例えば、常温下および体内などが挙げられる)にお
いては、精漿の存在が精子の機能に必要であることが明らかとなった。
精漿除去法による凍結精子が、融解後、負の影響を示す原因を明らかにするため、常法
による凍結法においても高い運動性を示す精子を含む精液を用いて以下の実験を行った。
タンパク質のチロシン残基のリン酸化検出(図5)、および精子が卵子に進入する際に誘
起させる先体反応(精子が卵子に進入し受精するため、精子が卵表面に到達したときに精
子頭部の先体内の酵素を分泌し、先体膜が破れ変化する現象)を糖鎖検出試薬による検出
(図6)を行った。
4倍以上に上昇していた(図7)。また、先体反応を誘起させている精子の割合も精漿除
去によって増加した(図8)。以上の結果から、精漿除去法により調製した凍結精子は融
解直後に受精可能な精子へと変化するため、人工授精により雌個体に注入しても、卵子が
存在する卵管まで到達しないために、体内で受精が認められないことが明らかとなった。
精漿除去法により作出した凍結精子は、融解後に自発的に受精可能な状態へと変化する
ことにより、体内において受精が認められないことが明らかとなった、そこで、この精子
の自発的な受精状態への変化を抑制することを目指して、凍結過程で除去した精漿に精子
を融解時に速やかに暴露する影響を検討した。
より凍結を行い、その凍結精液を、精漿を0、5、10、20%添加した融解液を用いて
融解し、その後のチロシンリン酸化、先体反応への影響を検討した(培養時間は、1、3
、および6時間)。
9)、先体反応誘起率も有意に低下していた(図10)。
ることが確認された。
凍結融解後の運動性が低い個体、品種において(n=3)(個々のデータを(表1)に
示す)、精液採取後、直ちに精漿を除去して凍結し、融解時に精漿に暴露するという本研
究による新手法が、人工授精時における受胎率および一腹産子数に及ぼす影響を検討した
。
用いた人工授精では高い受胎率および一腹産子数が得られたが、(C)耐凍性の低い個体
の精液を精漿除去法で凍結した精子、は図4と同様に受胎が全く認めれなかった。しかし
、(D)新手法で凍結・融解した精子、において、(A)と(B)と同等の高い受胎率と
一腹産子数が得られた(図11および図12)。
(採精〜凍結の方法)
採精後、10分以内に遠心分離(2,000rpm、3分)で精子と精漿を分離、上澄
み精漿を除去し、前処理液(0.33Mグルコース、12.8mMクエン酸ナトリウム、
14.3mM炭酸水素ナトリウム、9.9mM EDTA−2Na、1,000(IU/
ml)のペニシリン、および1mg/mlストレプトマイシンを含有する溶液)中で希釈
し、続いて室温放置し、2〜3時間かけて15℃にする。その後、遠心処理(2、000
rpm、5分)し、上澄みを除去する。1次希釈液である、修正Niwa and sa
saki freezing extender(NSF)1(0.31Mラクトース液
(400mOsm/kgに調製)(80%)および卵黄(20%)に1,000(IU/
ml)のペニシリンおよび1mg/mlストレプトマイシンを添加)で希釈し、1.5時
間かけて徐々に低下させ5℃に保持する。その後、2次希釈液である、修正NFS2(N
SF1に1.5%OEP(Orvus Es Paste界面活性剤)、4%グリセロー
ルを添加)で希釈し、最終精子濃度を10億/mlに調製し、この最終調製精子を、0.
5mlストローに充填する。続いて、上記最終調製されたストローを液体窒素蒸気中で1
0分間放置する。その後、液体窒素中で保管を行う。2次希釈液での希釈から、液体窒素
蒸気中への放置までの時間は30分間で行う。凍結に用いたNSFは、30年来用いられ
ている、公知の処理液であり、本発明者らは、この処理液の最適浸透圧、グリセロールの
濃度の組み合わせを探索し、浸透圧400mOsm/kg、グリセロール濃度4%(終濃
度2%)へと改良した。
凍結精液を液窒素より取り出し、60℃の温水中で8秒間で融解し、即座に、モデナ液
(0.15Mグルコース、26.7mMクエン酸ナトリウム、11.9mM炭酸水素ナト
リウム、15.1mMクエン酸、6.3mM EDTA−2Na、46.6mMトリスお
よび1,000(IU/ml)のペニシリン)に10%(v/v)精漿を添加した融解液
中に入れる(精子濃度1億/ml)。
通常の液状精液で受胎率80%以上・産子数10頭以上の高い繁殖能力を持った雄ブタか
ら、採精し、3,000rpm、20分、遠心し、精子を除去後、上澄みの精漿をさらに
10,000回転で30分遠心し、この上澄みのみをモデナ液で1:1で希釈し、−20
℃以下で保存する。この上澄み液を、10%添加する精漿として使用する。
保存精漿には精子は入っていない)。人工授精用ボトルに50ml(総精子数50億)入
るようにする。
人工授精に用いた雌ブタは、発情4日前に血清性性腺刺激ホルモン(PMSG)1,0
00IU/頭を注射し、そして、PMSG後72時間後にヒト胎盤性性腺刺激ホルモン(
hCG)750IU/頭を投与し、過排卵処理を施し、発情同期化させ、hCG投与後4
0時間後に人工授精を行った。分娩は、人工授精後114日後である。
、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によ
ってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的
な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実
施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および
文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細
書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
も、安定的かつ高効率に人工受精を行うことが可能になった。
Claims (13)
- 非ヒト哺乳動物の凍結精子であって、以下の工程:
a)採精する工程;
b)該採精した精液から直ちに精漿を除去する工程;
c)該精漿を除去した精子を100〜1000mOsm/kgの浸透圧に維持する工程;
d)工程(c)で得られた精子溶液にグリセロール溶液を添加して、グリセロール終濃度を0.5%〜10%とする工程;および、
e)工程(d)で得られた精子溶液を凍結する工程、
を包含する方法によって得られた、凍結精子。 - 前記非ヒト哺乳動物が家畜である、請求項1に記載の凍結精子。
- 前記家畜がブタである、請求項2に記載の凍結精子。
- 請求項1に記載の凍結精子であって、ここで、前記工程(c)の浸透圧が400mOsm/kgである、凍結精子。
- 請求項1に記載の凍結精子であって、ここで、前記工程(c)の溶液がグルコース又はラクトースを含む、凍結精子。
- 請求項1に記載の凍結精子であって、ここで、前記工程(c)の溶液が卵黄を含む、凍結精子。
- 請求項1に記載の凍結精子であって、ここで、前記工程(d)のグリセロール終濃度が2%である、凍結精子。
- 非ヒト哺乳動物の人工授精法であって、以下:
1)以下の工程を包含する方法で調製した凍結精子を融解する工程;
a)採精する工程;
b)該採精した精液から直ちに精漿を除去する工程;
c)該精漿を除去した精子に対して、精子を100〜1000mOsm/kgの浸透圧に維持するための溶液を添加して、該精子を100〜1000mOsm/kgの浸透圧に維持する工程;
d)工程(c)で得られた精子溶液にグリセロール溶液を添加して、グリセロール終濃度を0.5%〜10%とする工程;および、
e)工程(d)で得られた精子溶液を凍結する工程、
2)該融解した精子に、哺乳動物の精漿を添加して、精子溶液を調製する工程;ならびに、
3)工程(2)で調製した精子溶液を用いて、該非ヒト哺乳動物に人工授精する工程、を包含する方法。 - 請求項8に記載の方法であって、ここで、前記工程(c)の後に、該溶液を4〜5℃まで冷却することを特徴とする、方法。
- 請求項8に記載の方法であって、ここで、前記工程(c)の浸透圧が400mOsm/kgである、方法。
- 請求項8に記載の方法であって、ここで、前記工程(c)の溶液がグルコース又はラクトースを含む、方法。
- 請求項8に記載の方法であって、ここで、前記工程(c)の溶液が卵黄を含む、方法。
- 請求項8に記載の方法であって、ここで、前記工程(d)のグリセロール終濃度が2%である、方法。
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