WO2010147194A1 - 精子用希釈液、及び、これを用いた人工授精方法 - Google Patents

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frozen
egta
artificial insemination
edta
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昌之 島田
哲司 岡崎
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国立大学法人広島大学
大分県
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    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
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    • A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A01K67/02—Breeding vertebrates
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    • C12N2517/00—Cells related to new breeds of animals
    • C12N2517/10—Conditioning of cells for in vitro fecondation or nuclear transfer

Definitions

  • the present invention relates to a dilution solution for sperm used for diluting frozen sperm for artificial insemination such as non-human mammals, particularly pigs, and an artificial insemination method using the same.
  • Non-Patent Document 1 and Non-Patent Document 2 it is equivalent to nothing in the pig farming industry.
  • the present inventors have proposed an artificial insemination method using frozen sperm obtained by removing seminal plasma from collected sperm (Japanese Patent Application No. 2007-325313).
  • the fertilization rate is improved by artificially inseminating frozen sperm in a diluted solution containing seminal plasma.
  • the seminal plasma added to the diluent tends to be unstable in conception rate and implantation rate because its components vary from individual to individual and from season to season.
  • the present invention has been made in view of the above-described matters, and the object thereof is to obtain a conception rate equal to or higher than that of a dilute solution containing seminal plasma, even if it is a dilute solution containing seminal plasma. It is providing the dilution liquid for sperms, and the artificial insemination method using the same.
  • the dilution for sperm according to the first aspect of the present invention is It contains a chelating agent that forms a complex with calcium ions.
  • the chelating agent is EGTA.
  • the chelating agent is preferably EGTA or EDTA.
  • an immunosuppressive factor that suppresses leukocyte migration.
  • the immunosuppressive factor is preferably one or more selected from steroid hormones and cytokines.
  • the steroid hormone is at least one selected from cortisol and cortisol derivatives.
  • the cortisol derivative is preferably at least one selected from dexamethasone, prednisone, and hydrocortisone.
  • cytokine is preferably one or more selected from macrophage migration inhibitory factor and Serpin E1.
  • the frozen sperm is preferably a non-human mammal frozen sperm.
  • the non-human mammal is a multiple animal.
  • the multiple animal is a pig.
  • the artificial insemination method comprises: Frozen spermatozoa frozen by removing seminal plasma from semen collected from non-human mammals, and preparing artificial semen by diluting with the above sperm diluent, The artificial semen is injected into the uterus of the non-human mammal to perform artificial insemination.
  • a pig as the multiple animal.
  • the sperm dilution according to the present invention does not contain any seminal plasma, there is no problem of bacterial infection and it can be used for production of specific disease-free SPF pigs.
  • FIG. 1 It is a figure which shows the measurement result of the sperm motility in Experimental example 2.
  • FIG. It is a figure which shows the detection result of the cytokine in the seminal plasma in Experimental example 3. It is a figure which shows the relative value of the intrauterine white blood cell count in Example 2.
  • the sperm diluent according to the present embodiment contains a chelating agent that forms a complex with calcium ions in the basic diluent described later.
  • a chelating agent that forms a complex with calcium ions in the basic diluent described later.
  • mitochondria are present in the middle part of the sperm, where energy (ATP) used for sperm movement is produced.
  • energy used for sperm movement
  • calcium ions act on mitochondria (more specifically, an enzyme that produces ATP)
  • ATP production is activated, so sperm moves violently, but when sperm is activated quickly, Sperm will die before reaching the fallopian tube.
  • a chelating agent is contained in the diluted solution, and this chelating agent forms a complex with calcium ions, thereby suppressing the calcium ions from acting on mitochondrial mitochondria. is doing.
  • the sperm diluent according to the present embodiment can be obtained by adding a chelating agent that forms a complex with calcium ions to the basic diluent.
  • the basic dilution liquid is a dilution liquid prepared so that the collected semen can be kept at room temperature for a certain period of time without deteriorating the function of the sperm in the semen, and glucose and citric acid. It is a liquid containing components such as sodium, sodium bicarbonate, EDTA-2Na, citric acid, tris, and potassium chloride.
  • Modena liquid (0.15M glucose, 26.7 mM sodium citrate, 11.9 mM sodium hydrogencarbonate, 15.1 mM citric acid, 6.3 mM EDTA-2Na, 46.6 mM Tris and 1,000 IU / ml penicillin).
  • the chelating agent is not particularly limited as long as it is a substance that specifically forms a complex with calcium ions.
  • Ethylene glycol tetraacetic acid ethyleneglycol Bis (2-aminoethyl) -N, N, N ′, N′— (tetraacetic acid)
  • EGTA ethyleneglycol Bis (2-aminoethyl) -N, N, N ′, N′— (tetraacetic acid)
  • EGTA ethyleneglycol Bis (2-aminoethyl) -N, N, N ′, N′— (tetraacetic acid)
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • EGTA ethylenediamineacetic acid
  • EDTA is a substance that forms complexes with various divalent ions such as magnesium ions and zinc ions in addition to calcium ions.
  • both EDTA and EGTA are added, calcium ions that could not be chelated with EDTA can be chelated with EGTA, and most calcium ions present in the basic diluent can be chelated.
  • the concentration of EDTA added to the base diluent must be increased.
  • the basic diluent contains various divalent ions such as magnesium ions and zinc ions other than calcium ions. If the EDTA concentration is too high, these divalent ions may be excessively chelated. Yes, it can affect sperm function (fertilization). For this reason, it is preferable to add both EDTA and EGTA.
  • the EDTA concentration in the sperm diluent is preferably about 3 to 9 mM / L and the EGTA concentration is about 3 to 9 mM / L from the experimental results described below.
  • the EDTA concentration is 6.3 mM and the EGTA concentration is 6 mM.
  • the sperm dilution solution contains an immunosuppressive factor so that sperm, embryos and the like are not phagocytosed by leukocytes in the uterus. Because sperm is a foreign body for females, when sperm enters the uterus, leukocytes such as neutrophils and macrophages migrate, and sperm and embryos are phagocytosed, affecting the implantation rate.
  • Implantation rate is the ratio of fetus in utero to the number of eggs.
  • multiple ovarian animals such as pigs ovulate 10 to 20 eggs, it is required to fertilize more eggs once and give birth to a large number of fetuses for production efficiency.
  • the above-described phagocytosis is unlikely to occur, so the seminal plasma in semen contains an immunosuppressive factor that suppresses leukocyte migration. This is thought to prevent attacks on the embryo.
  • the immunosuppressive factor capable of suppressing leukocyte migration is contained in the sperm dilution solution, phagocytosis of sperm and embryos can be suppressed, and an improvement in the implantation rate can be realized.
  • steroid hormones and cytokines are preferable.
  • cortisol which is a component contained in seminal plasma is preferable.
  • the cellular immune mechanism is prevented from functioning and migration of leukocytes and the like is blocked.
  • phagocytosis of sperm and embryo is suppressed, and an improvement in the implantation rate is realized.
  • the amount of cortisol added to the sperm diluent used in one artificial insemination is preferably about 100 ng to 10,000 ng. More preferably, it is 500 ng to 5,000 ng. This is approximately the same as the amount of cortisol contained in all seminal plasma ejected from boars in natural mating.
  • Cortisol is originally contained in seminal plasma, decomposed into the uterus within 1-2 days after injection, and discharged outside the body, and because it is injected locally, it does not spread throughout the body. There is no risk of adverse effects such as the birth of malformed piglets without adversely affecting the living body.
  • dexamethasone dexamethasone, prednisolone, hydrocortisone and the like, which are cortisol derivatives, are considered to be chemically changed to cortisol and have similar immunosuppressive effects. These may be used.
  • Macrophage migration factor and Serpin E1 are both substances contained in seminal plasma.
  • Macrophage migration inhibitory factor and cytokines such as Serpin E1 are signal transduction substances, and suppress the unnecessary accumulation of leukocytes such as neutrophils and macrophages in the uterus and exert an immunosuppressive action.
  • the frozen sperm may be added to the sperm diluent when the frozen sperm is thawed.
  • the thawing of frozen sperm is performed at 37 ° C. for 60 seconds when using a sperm filled in a 5 ml straw, and at 0.5 ° straw for 35 seconds at 35 ° C., preferably at 37 ° C.
  • the treatment may be performed for 20 seconds, more preferably at 70 ° C. for 8 seconds, and most preferably in warm water at 60 ° C. for 8 seconds.
  • the sperm dilution may be added directly to the frozen sperm.
  • the amount of artificial semen used for one artificial insemination of pig is about 50 ml, and the final concentration of sperm in the artificial semen is 1 ⁇ 10 6 cells / ml to 1 ⁇ 10 9 cells / ml, preferably 1 ⁇ 10 6. What is necessary is just to prepare so that it may become an order of 8 cells / ml.
  • artificial insemination can be performed by injecting the prepared artificial semen into the womb of a sow that has reached estrus.
  • sows after artificial insemination, they will deliver about 114 days of age. After parturition, the piglets are weaned after a 20 to 40-day-old lactation period, and estrus reappears in the sows 4 days after weaning. It is advisable to perform artificial insemination according to the recurrence of the sows in the same manner as described above. By performing artificial insemination in such a cycle, more piglets can be born in the lifetime of one sow.
  • the sperm dilution can be easily stored in a freezer. For this reason, it can be melted and used when necessary, and can be easily used in accordance with the timing of the estrous period such as a sow.
  • the frozen sperm diluted with the sperm diluent it is preferable to use a frozen sperm obtained by removing seminal plasma from the semen and freezing. Thereby, artificial insemination can be performed in a completely aseptic state, and for example, it can be used for production of a specific disease-free SPF pig.
  • artificial insemination may be difficult because seminal plasma has an adverse effect on freezing and cannot be frozen. Even in such a case, artificial insemination can be performed by removing seminal plasma, freezing sperm, and diluting the frozen sperm with the diluent for sperm according to the present embodiment.
  • the sperm dilution according to the present embodiment may be used for any artificial insemination of a non-human mammal.
  • the sperm diluent according to the present embodiment can be used for non-human mammals such as livestock, but can be particularly suitably used for artificial insemination of multiple fetuses. Since multiple implantation animals such as pigs have a high implantation rate, a large number of fetuses can be born at one time, and the production efficiency can be increased.
  • spermatozoa collected only from superior breeding male pigs are used to contribute to the improvement of breeding techniques such as breeding improvement such as meat quality improvement.
  • Example 1 Porcine sperm was cultured in a Ca 2+ -containing medium, and the effect of Ca 2+ on phosphorylation of tyrosine residues in sperm proteins was examined.
  • mTBM modified Tris-buffer medium
  • pig sperm was collected and frozen as follows. Boars used for semen collection were individually raised in individual pig buns and fed with 2.5 kg of seed pig feed twice in the morning and evening. Pigs were vaccinated with Japanese encephalitis / porcine parvovirus infection vaccine. For this study, pigs that were antibody-negative for porcine reproductive and respiratory disorder syndrome (PRRS) and Aujeszky's disease were selected. The semen collection was performed at an interval of one week. Prior to collection, prey was confirmed, signs of illness, etc. were confirmed, the pig was confirmed to be a good pig, and the pig was collected so as not to excite the pig.
  • PRRS porcine reproductive and respiratory disorder syndrome
  • the suspected female stand was placed in a boar's pig chamber, the male pig was placed on the stand, and the penis and foreskin were washed with physiological saline to remove urine.
  • the semen was collected by a manual pressure method, and gauze was put on a previously sterilized cup, and the semen was put into the cup while removing the glue-like substances that are jelly-like substances that come out with the semen.
  • For the semen only the first 50 to 100 mL thick portion (there was approximately 80% of the total semen amount) was collected, and the seminal plasma was immediately removed from the semen by centrifugation after collection.
  • the sperm is diluted with a pretreatment solution, brought to 15 ° C. over 2.5 hours, and after removal of the supernatant by centrifugation, the solution is maintained in a solution with an osmotic pressure of 400 mOsm / kg for about 1.5 hours, Cooled to 5 ° C.
  • the solution used was NSF (Niwa and Sasaki freezing extender; 80% (v / v), 0.31 mol Lactose monohydrate, 20% (v / v) sulfate; an osmotic pressure of 300 mOsm / kg) prepared with ultrapure water to an osmotic pressure of 400 mOsm / kg.
  • the porcine frozen sperm obtained as described above was thawed at 60 ° C. for 8 seconds, and the sperm was added to a Ca 2+ -containing medium (mTBM) to culture the sperm. The culture was performed for 3 hours.
  • mTBM Ca 2+ -containing medium
  • a seminal plasma-containing medium was used, and sperm was added and cultured in the same manner as described above.
  • the seminal plasma-containing medium was prepared by adding seminal plasma to the aforementioned Ca 2+ -containing medium (mTBM) so that the final concentration was 10% (v / v).
  • the seminal plasma was prepared and used by removing sperm from the collected semen by centrifugation and further removing solids from the supernatant by centrifugation.
  • a Ca 2+ -free medium was used, and sperm was added and cultured as described above.
  • the Ca 2+ -free medium was prepared by removing the Ca component (CaCl 2 .2H 2 O) from the above-described Ca 2+ -containing medium (mTBM).
  • Detection of phosphorylation of tyrosine residues by Western blotting is as follows. 17 ⁇ l of SDS sample buffer was added to sperm stored at ⁇ 80 ° C. and pipetted. Centrifugation was performed at 10,000 rpm for 2 minutes, sonication was performed for 2 minutes, then, heating was performed at 100 ° C. for 5 minutes, and electrophoresis was performed at 100 V for about 2 hours. Transfer to membrane, block with TBS with 5% BSA, and then add 1: 2, to TBS (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.15 M NaCl) with 0.5% BSA and 0.1% Tween20 added.
  • FIG. 1 shows the detection results of phosphorylation of sperm protein tyrosine residues in each cultured sperm.
  • EDTA 0 mM medium and EDTA 3 mM medium EDTA-2Na was removed from the modena solution, and EDTA concentrations were adjusted to 0 mM and 3 mM, respectively.
  • the EDTA 6.3 mM medium used the Modena solution as it was.
  • the EDTA 12 mM medium was prepared by adding EDTA-2Na to the Modena solution to a concentration of 12 mM.
  • Frozen sperm was thawed and added to each medium in the same manner as in Experimental Example 1, and the sperm was cultured.
  • the culture time was 1 hour, 3 hours, and 6 hours.
  • the sperm motility rate was calculated using a motility analyzer (computer-assisted perm analysis (CASA) system). 5 ⁇ l of the cultured medium was placed on a plate warmed to 38 ° C., and the proportion of sperm moving with a computer was analyzed.
  • a motility analyzer computer-assisted perm analysis (CASA) system
  • FIG. 2 shows the sperm motility of each cultured cell.
  • sperm cultured in EDTA 6.3 mM medium had the highest sperm motility rate.
  • sperm was cultured in a medium in which EGTA was further added to EDTA 6.3 mM medium (modena solution) having the highest sperm motility, and measurement of sperm motility after culturing was performed. Phosphorylation detection and sperm acrosome damage rate were measured.
  • EGTA 0 mM medium, EGTA 3 mM medium, EGTA 6 mM medium, and EGTA 9 mM medium were prepared. The modena solution was used as it was for the EGTA 0 mM medium. Further, EGTA 3 mM medium, EGTA 6 mM medium, and EGTA 9 mM medium were used by adding EGTA to the Modena solution and adjusting the EGTA concentration in the medium to 3 mM, 6 mM, and 9 mM, respectively. In addition, since pH in the culture medium became acidic when EGTA was added, NaOH was added to adjust the pH to 7.0 to 7.1.
  • sperm motility was measured, sperm protein tyrosine phosphorylation was detected, and sperm acrosome damage rate was measured.
  • sperm motility and detection of phosphorylation of sperm protein tyrosine residues were performed in the same manner as described above. Moreover, the measurement of the sperm acrosome damage rate was performed as follows. 5 ⁇ l of the medium was smeared on the slide glass, air-dried, and fixed with 99% methanol for 10 minutes. After the methanol was dried, it was marked with a liquid pen. FITC-peanect lectin was added to the smear sperm (approximately 30 ⁇ l per sample) and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. Thereafter, the plate was washed with PBS (5 minutes ⁇ 3 times), sealed with DAPI (VECTOR, VECTASHIELD with DAPI, H-1200), and observed after sealing with a manicure.
  • PBS 5 minutes ⁇ 3 times
  • DAPI VECTOR, VECTASHIELD with DAPI, H-1200
  • Fig. 3 shows the measurement results of the sperm motility rate
  • Fig. 4 shows the detection results of phosphorylation of sperm protein tyrosine residues after 3 hours of culture
  • Fig. 5 shows the measurement results of the sperm acrosome damage rate.
  • the sperm motility rate is higher and the sperm acrosome damage rate is lower than when EGTA is not contained.
  • sperm cultured in EGTA 6 mM medium has the highest sperm motility, and phosphorylation of tyrosine residues is most suppressed. And it turns out that the sperm acrosome damage rate is also low. From this result, it can be seen that the effect of the sperm dilution increases when EGTA is contained in addition to EDTA, and that the effect is greater when about 6 mM of EGTA is contained.
  • the frozen porcine sperm was thawed and added to the EDTA-containing medium and the EDTA / EGTA-containing medium.
  • Modena solution was used as the EDTA-containing medium.
  • the medium containing EDTA / EGTA was prepared by adding EGTA to the Modena solution to adjust the EGTA concentration to 6 mM.
  • FLUO3 is a substance that combines with calcium ions to emit fluorescence. When calcium ions present in the medium are taken up into the sperm cells, FLUO3 and calcium ions are combined in the cells, and fluorescent color is generated in green.
  • sperm cultured in an EDTA-containing medium at each culture time emits light more intensely than sperm cultured in an EDTA / EGTA-containing medium.
  • sperm cultured in EDTA-containing medium emits very intense light, but in sperm cultured in EDTA / EGTA-containing medium, the middle piece only emits light. . It can be seen that EGTA can suppress calcium ions in the medium from being taken into sperm.
  • porcine sperm was cultured in an EDTA-containing medium, an EDTA / EGTA-containing medium, and a seminal plasma-containing medium. For each cultured sperm, phosphorylation detection of tyrosine residues and measurement of sperm motility were performed. Went.
  • Modena liquid (EDTA 6.3 mM) was used as it was as the EDTA-containing medium.
  • the EDTA / EGTA-containing medium was prepared by adding EGTA to the Modena solution so that the EGTA concentration was 6 mM.
  • the seminal plasma-containing medium was prepared by adding seminal plasma to the Modena solution so that the final concentration was 10% (v / v).
  • the frozen sperm was thawed and added to each medium, and the sperm was cultured for 1 hour.
  • motility was recognized in the sperm cultured in the EDTA / EGTA-containing medium rather than the sperm cultured in the seminal plasma-containing medium.
  • a sperm-diluted solution without addition of seminal plasma can be prepared by containing a chelating agent that forms a complex with calcium ions such as EDTA / EGTA in the basic diluent.
  • Example 1 Artificial insemination of pigs was performed using artificial semen prepared by adding frozen porcine sperm to a sperm dilution containing EDTA and EGTA.
  • EGTA was added to the modena solution to prepare a sperm dilution.
  • concentration of EDTA is 6.3 mM
  • concentration of EGTA is 6 mM.
  • NaOH was added to adjust the pH to 7.0 to 7.1.
  • artificial semen A1 Frozen sperm was thawed at 60 ° C. for 8 seconds and immediately added to the sperm diluent to prepare artificial semen (hereinafter referred to as artificial semen A1).
  • the concentration of sperm is 1 ⁇ 10 8 sperm / ml.
  • the fetus was confirmed on the monitor by ultrasonic pregnancy test.
  • the 21st day since pigs estrus in a 21-day cycle, when performing pregnancy test on the 21st day after fertilization, if there is no fertilization or the fertilized egg has regressed, the genital area will be estrus. It is for showing the sign of.
  • artificial semen prepared by thawing frozen sperm hereinafter referred to as “serum 10% (v / v)
  • serum a seminal plasma-containing diluted solution prepared by adding seminal plasma to Modena solution
  • serum a seminal plasma-containing diluted solution prepared by adding seminal plasma to Modena solution
  • the conception rate is shown in Table 2, and the implantation rate is shown in Table 3.
  • the conception rate was calculated by counting the number of animals with artificial insemination and the number of conception.
  • the implantation rate was calculated by counting the total number of luteal bodies and the total number of fetuses in the uterus of 6 sows.
  • the artificial semen A1 to which EDTA / EGTA was added had a fertility rate as high as 90% and the same value as the artificial semen B1 to which 10% of seminal plasma was added.
  • the implantation rate was 51%, which was lower than 78% of artificial semen B1 to which 10% of seminal plasma was added, and many fetuses were phagocytosed.
  • artificial insemination using artificial semen A1 showed a total number of corpora lutea of 51, an intrauterine number of 42, and an in vitro fertilization rate of 82%. Therefore, if the fetus is not phagocytosed, it is thought that it was the same implantation rate as artificial semen B1.
  • artificial insemination is performed using artificial semen A1, it is considered that the fetus was phagocytosed due to the breakdown of the intrauterine immune function after fertilization.
  • Example 3 From the results of Example 1, it is considered that the presence of seminal plasma is necessary for sperm to perform its original fertilization function and further improve the implantation rate, and sperm phagocytosis can be suppressed in the seminal plasma. It is thought to contain immunosuppressive factors. Thus, an attempt was made to identify immunosuppressive factors in seminal plasma.
  • Seminal plasma was collected from 17 boars, and steroid hormones in seminal plasma were measured using the EIA method. Furthermore, cytokines in seminal plasma were detected using a membrane antibody array (Proteome Profiler TM Array, Human Cytokine Array Panel A, ARY005).
  • Table 4 shows the results of measurement of steroid hormones in seminal plasma
  • FIG. 9 shows the results of detection of cytokines in seminal plasma.
  • the seminal plasma contains immunosuppressive factors such as cortisol, MIF, and Serpin E1. If these factors are contained in the diluted solution, it is considered that the improvement of the implantation rate can be realized.
  • Example 2 Porcine artificial insemination was performed using artificial semen prepared by adding frozen porcine sperm to a sperm dilution containing cortisol, EDTA, and EGTA.
  • cortisol and EGTA were added to the modena solution to prepare a sperm dilution.
  • the concentration of cortisol is 100 ng / mL
  • the concentration of EDTA is 6.3 mM
  • the concentration of EGTA is 6 mM.
  • NaOH was added to adjust the pH to 7.0 to 7.1.
  • artificial semen A2 The frozen sperm was thawed at 60 ° C. for 8 seconds and immediately added to the sperm diluent to prepare artificial semen (hereinafter referred to as artificial semen A2).
  • the concentration of sperm is 1 ⁇ 10 8 sperm / mL.
  • the artificial insemination was performed using the sperm dilution solution thus prepared. About the method, it is the same as that of Example 1 except not having administered PMSG to the sow.
  • Example 2 artificial insemination was performed in the same manner using artificial semen A1 prepared by diluting frozen sperm with a sperm diluent added with EDTA and EGTA.
  • Table 5 shows the conception rate and the implantation rate.
  • the conception rate was calculated by counting the number of sows that had undergone artificial insemination and the number of sows that became conceived.
  • the implantation rate was calculated by counting the total number of fetuses in the uterus and the total number of corpus luteum of the four sows and averaging them by the number of heads.
  • the fertilization rate by artificial insemination using a sperm dilution containing cortisol is 92%, which is improved compared to the absence of cortisol, and the implantation rate is 83%, compared to 51% when no cortisol is added. Has improved significantly.
  • the number of leukocytes in the uterus after artificial insemination was measured, as shown in the relative value of the number of leukocytes in utero in FIG. 10, the number of leukocytes in uterus was significantly reduced in artificial semen A2 compared to artificial semen A1. Moreover, it is less than the artificial semen B1 using seminal plasma in Example 1. Therefore, it can be seen that the phagocytosis of the embryo after fertilization was suppressed and the implantation rate was improved by the immunosuppressive action of cortisol.
  • corticosteroids steroid hormones such as cortisol
  • cortisol corticosteroids
  • the mother pigs artificially inseminated using the sperm dilution solution had 4 mothers at the age of 2 months and 6 mothers at the age of 1 month, and there were no abnormal health or miscarriages at all.
  • the presence of malformation could not be confirmed, so there was no adverse effect due to the addition of cortisol.
  • the sperm dilution contains a chelating agent that forms a complex with calcium ions, and also contains an immunosuppressive factor that suppresses leukocyte migration.
  • an immunosuppressive factor that suppresses leukocyte migration.

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Abstract

　精子用希釈液は、基礎希釈液にカルシウムイオンと錯体を形成するＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ等のキレート剤が含有されている。更に、ステロイドホルモンやサイトカイン等の白血球の遊走を抑制する免疫抑制因子が含有されている。この精子用希釈液で凍結精子を希釈して人工授精を行うことで、精子が受精前に死滅することや、子宮内で精子や胚が白血球によって貪食されることが抑制され、受胎率及び着床率の向上をなしえる。

Description

精子用希釈液、及び、これを用いた人工授精方法
　本発明は、非ヒト哺乳動物、特にブタ等の人工授精用凍結精子の希釈に用いる精子用希釈液、及び、これを用いた人工授精方法に関する。
　人工授精法は畜産分野において、重要な技術である。これまで家畜の人工授精は、ウシを中心に進められてきた。しかしながら、その受胎率には未だ改善の余地があり、更に、ウシ以外の家畜については、人工授精技術が十分に確立していない状況である。
　例えば、日本の養豚産業では主に自然交配が行われており、種雄ブタを飼育する必要があるため経費がかかる。また、種雄ブタは体重が３００ｋｇ以上になり、作業にも危険が生じる。更に、自然交配には多大な労力を必要とすることから、交配による優良種の育成（例えば、肉質、産子数に優れる品種の改良）の効率的な進展が妨げられている。
　現在、日本の養豚産業において、人工授精法を行う例はあるものの、現在の体制では、事業者の注文後に液状精液を発送するため、種雌ブタの急な発情に対して時間差が生じ、発情を逃してしまうことがある。
　このため、各事業者において凍結精液を保管し、急な種雌ブタの発情にも対応可能な技術の開発が望まれている。しかしながら、ブタにおける凍結精液を用いた人工授精では、凍結融解後の精液の運動性が著しく低く、その受精能も低く、更に、季節や品種などの要因によって受胎率が変動し、受胎率、一腹総産子数が低いため（非特許文献１及び非特許文献２）、養豚産業分野では全く行われていないに等しい。
岡崎哲司　外２名、「ブタ凍結融解精子の運動性・着床率に及ぼす希釈液の浸透圧とＧｌｙｃｅｒｏｌ濃度の影響」、日本畜産学会第１０７回大会　一般講演Ｖ２９－２９ 豚凍結精液利用技術マニュアル（丹羽太左衛門　監修　１９８９）、社団法人　日本家畜人工授精師協会
　本発明者らは、採取した精子から精漿を除去して凍結した凍結精子を用いた人工授精法を提案している（特願２００７－３２５３１３）。精漿を含有する希釈液に融解した凍結精子を人工授精することで、受胎率の向上をなしえている。
　しかしながら、精漿には細菌等の病原体が含まれていることから、食の安全の観点から注目されている「特定疾病フリー　ＳＰＦ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｐａｔｈｏｇｅｎ　Ｆｒｅｅ）ブタ」の生産に利用できないという問題がある。
　また、希釈液に添加する精漿は、その成分が個体間や季節で変動するため、受胎率・着床率が不安定になりやすい。
　更に、精漿を確保するための種雄ブタを飼育する必要がある。
　本発明は上記事項に鑑みてなされたものであり、その目的は精漿を含まない精子用希釈液であっても、精漿を含む希釈液と同等若しくはそれ以上の受胎率を得ることができる精子用希釈液、及び、これを用いた人工授精方法を提供することにある。
　本発明の第一の態様に係る精子用希釈液は、
　カルシウムイオンと錯体を形成するキレート剤を含有することを特徴とする。
　また、前記キレート剤がＥＧＴＡであることが好ましい。
　また、前記キレート剤がＥＧＴＡ及びＥＤＴＡであることが好ましい。
　更に、白血球の遊走を抑制する免疫抑制因子を含有することが好ましい。
　また、前記免疫抑制因子がステロイドホルモン及びサイトカインから選択される一種以上であることが好ましい。
　前記ステロイドホルモンがコルチゾール、及び、コルチゾール誘導体から選択される一種以上であることが好ましい。
　また、前記コルチゾール誘導体が、デキサメタゾン、プレドニゾン、及びハイドロコルチゾンから選択される一種以上であることが好ましい。
　また、前記サイトカインがマクロファージ遊走阻止因子、及びＳｅｒｐｉｎ　Ｅ１から選択される一種以上であることが好ましい。
　また、精漿が除去されて凍結された凍結精子の希釈に用いられることが好ましい。
　また、前記凍結精子が非ヒト哺乳動物の凍結精子であることが好ましい。
　また、前記非ヒト哺乳動物が多胎動物であることが好ましい。
　また、前記多胎動物がブタであることが好ましい。
　本発明の第二の態様に係る人工授精方法は、
　非ヒト哺乳動物から採精した精液から精漿を除去して凍結した凍結精子を、上記の精子用希釈液で希釈して人工精液を調製し、
　前記人工精液を前記非ヒト哺乳動物の子宮内に注入して人工授精を行う、ことを特徴とする。
　また、前記非ヒト哺乳動物として多胎動物を用いることが好ましい。
　また、前記多胎動物としてブタを用いることが好ましい。
　本発明に係る精子用希釈液では、精漿を一切含有していないため、細菌感染の問題がなく、特定疾病フリー　ＳＰＦブタの生産に利用することができる。
　また、精漿を用いないため、季節や精漿を採取する個体差の影響がなく、安定した人工授精を実現できる。
　更に、精漿が不要であるので、精漿確保のために、多数の雄ブタを飼育する必要がないという利点がある。
実験例１における精子タンパク質チロシン残基のリン酸化検出結果を示す図である。 実験例２における精子運動率の測定結果を示す図である。 実験例２における精子運動率の測定結果を示す図である。 実験例２における精子タンパク質チロシン残基のリン酸化検出結果を示す図である。 実験例２における精子先体損傷率の測定結果を示す図である。 実験例２における精子に取り込まれたカルシウムイオンの観察結果を示す図である。 実験例２における精子タンパク質チロシン残基のリン酸化検出結果を示す図である。 実験例２における精子運動率の測定結果を示す図である。 実験例３における精漿中のサイトカインの検出結果を示す図である。 実施例２における子宮内白血球数の相対値を示す図である。
（精子用希釈液）
　凍結精子においては、融解後に精子の機能障害が生じることで精子が死滅し、人工授精における受精率が低いこと、そして、精漿が添加された希釈液を用いた場合に、この機能障害が抑制され、高い繁殖成績を示していることを本発明者らは見出した。そして、この機能障害に、カルシウムイオンの存在が精子の運動性とタンパク質のチロシン残基のリン酸化に影響を与えていることを見出し、本実施の形態に係る精子用希釈液を完成させた。
　本実施の形態に係る精子用希釈液は、後述する基礎希釈液にカルシウムイオンと錯体を形成するキレート剤が含有されている。精子用希釈液がキレート剤を含有していることにより、凍結精子を融解した際に、カルシウムイオンの関与によって生じる精子のタンパク質のリン酸化を抑制し、機能障害が抑制される。
　より詳細に説明すると、精子の中片部にはミトコンドリアが存在し、ここで精子の運動に用いられるエネルギー（ＡＴＰ）が生産されている。ミトコンドリア（より詳細にはＡＴＰを生産する酵素）に、カルシウムイオンが作用すると、ＡＴＰの生産が活性化されるので、精子が激しく運動することになるが、精子が早々に活性化されると、精子が卵管に辿り着く前に死滅してしまう。
　本実施の形態に係る精子用希釈液では、希釈液中にキレート剤が含有されており、このキレート剤がカルシウムイオンと錯体を形成することで、カルシウムイオンが精子のミトコンドリアに作用することを抑制している。
　本実施の形態に係る精子用希釈液は、基礎希釈液にカルシウムイオンと錯体を形成するキレート剤を添加することで得られる。
　ここで、基礎希釈液とは、採精された精液を室温下で一定時間、その精液中の精子の有する機能を低下させずに保持できるように調製された希釈液であり、グルコース、クエン酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、ＥＤＴＡ－２Ｎａ、クエン酸、トリス、塩化カリウム等の成分を含んでいる液体である。基礎希釈液として、この分野で通常用いられる液体であれば特に限定されないが、例えば、モデナ液（０．１５Ｍグルコース、２６．７ｍＭクエン酸ナトリウム、１１．９ｍＭ炭酸水素ナトリウム、１５．１ｍＭクエン酸、６．３ｍＭ　ＥＤＴＡ－２Ｎａ、４６．６ｍＭトリスおよび１，０００ＩＵ／ｍｌペニシリン）等が挙げられる。
　キレート剤として、カルシウムイオンと特異的に錯体を形成する物質であれば、特に限定されないが、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ　Ｂｉｓ（２－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ））を用いることが好ましい。ＥＧＴＡはカルシウムイオンと特異的に錯体を形成するので、精子のミトコンドリアにカルシウムイオンが作用することを効果的に抑制できる。
　また、ＥＧＴＡとともに、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ））を用いることが好ましい。ＥＤＴＡは、カルシウムイオンの他、マグネシウムイオンや亜鉛イオン等、種々の二価イオンと錯体を形成する物質である。
　ＥＤＴＡ及びＥＧＴＡ双方を添加すれば、ＥＤＴＡでキレート化できなかったカルシウムイオンをＥＧＴＡでキレート化することができ、基礎希釈液に存在するほとんどのカルシウムイオンをキレート化できることになる。例えば、キレート剤としてＥＤＴＡのみを用いる場合、全てのカルシウムイオンをＥＤＴＡでキレート化しようとすれば、基礎希釈液に添加するＥＤＴＡの濃度を高くしなければならない。基礎希釈液には、カルシウムイオン以外のマグネシウムイオンや亜鉛イオン等、種々の二価イオンが含まれており、ＥＤＴＡの濃度が高すぎると、これらの二価イオンまで過剰にキレート化されるおそれがあり、精子機能（受精）に影響を及ぼしかねない。このため、ＥＤＴＡ及びＥＧＴＡ双方を添加することが好ましい。
　ＥＤＴＡとＥＧＴＡの双方を添加する場合、後述の実験結果から、精子用希釈液中のＥＤＴＡの濃度が３～９ｍＭ／Ｌ程度、ＥＧＴＡの濃度が３～９ｍＭ／Ｌ程度であることが好ましく、より好ましくは、ＥＤＴＡの濃度が６．３ｍＭ、ＥＧＴＡの濃度が６ｍＭである。
　更に、精子用希釈液には、子宮内で精子や胚等が白血球によって貪食されないよう、免疫抑制因子が含有されていることが好ましい。精子は雌にとって異物であるので、精子が子宮内に侵入すると好中球やマクロファージなどの白血球が遊走され、精子や胚が貪食されて着床率に影響を与えるからである。
　着床率とは、卵子の数に対する子宮内胎子の割合である。特に、ブタ等の多胎動物では、１０～２０の卵子が排卵されるので、生産効率上、一度により多くの卵子を受精させ、多数の胎子を出産させることが要求される。
　自然交配においては、上述の貪食は生じにくいことから、精液中の精漿には白血球の遊走を抑制する免疫抑制因子が含まれており、この免疫抑制因子が過剰な白血球増加を抑制し、その後の胚への攻撃を防いでいるものと考えられる。
　したがって、精子用希釈液に、白血球の遊走を抑制し得る免疫抑制因子が含有されていれば、精子や胚が貪食されることを抑制でき、着床率の向上が実現できる。
　この免疫抑制因子として、ステロイドホルモンやサイトカインが好ましい。
　ステロイドホルモンとしては、精漿に含まれている成分であるコルチゾール（ｃｏｒｔｉｓｏｌ）が好ましい。希釈液にコルチゾールを含有させることによって、細胞性免疫機構が機能しないようにし、白血球等の遊走がブロックされる。これにより精子や胚の貪食が抑制され、着床率の向上が実現される。
　ブタの人工授精に用いる場合、１回の人工授精で用いる精子用希釈液中に添加するコルチゾール量は、１００ｎｇ～１０，０００ｎｇ程度であることが好ましい。より好ましくは、５００ｎｇ～５，０００ｎｇである。これは、自然交配における雄ブタから射出される全精漿中に含まれるコルチゾール量とおよそ同量である。
　なお、コルチゾールは元来精漿に含まれていること、子宮内に注入後１～２日間で分解されて体外へ排出されること、また、局所的に注入するので体全体に広がらないことから、生体に悪影響を及ぼすことがなく、奇形の子豚が出産される等の弊害が生じるおそれはない。
　また、他のステロイドホルモンとして、コルチゾール誘導体であるデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、プレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、或いはハイドロコルチゾン（ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）等についても、コルチゾールに化学変化し、同様の免疫抑制作用を奏すると考えられるので、これらを用いてもよい。
　サイトカインとしては、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｍｉｇｒａｔｉｏｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ））、Ｓｅｒｐｉｎ　Ｅ１等が好ましい。マクロファージ遊走因子、及び、Ｓｅｒｐｉｎ　Ｅ１は、いずれも精漿中に含まれている物質である。
　マクロファージ遊走阻止因子、及び、Ｓｅｒｐｉｎ　Ｅ１等のサイトカインは、シグナル伝達物質であり、子宮内に好中球やマクロファージなどの白血球が不必要に集積されることを抑え、免疫抑制作用を発揮する。
（人工授精方法）
　上述した精子用希釈液を用いた人工授精方法について説明する。例示として、以下にブタの人工授精方法について説明する。
　雄ブタの精液から精漿を除去して凍結しておいた凍結精子を融解し、融解後即座に精子用希釈液に添加して、人工精液を調製する。または、凍結精子の融解時に、凍結精子を精子用希釈液に添加しておいてもよい。
　より詳細には、凍結精子の融解は、精子を５ｍｌストローに充填して凍結したものを用いる場合、３７℃で６０秒間、０．５ｍｌストローの場合では３５℃で２０秒間、好ましくは３７℃で２０秒間、より好ましくは７０℃で８秒間、最も好ましくは６０℃の温水中で８秒間行うとよい。或いは、凍結精子に直接精子用希釈液を添加してもよい。
　一回のブタの人工授精に用いる人工精液の量は５０ｍｌ程度であり、人工精液中の精子の終濃度が、１×１０６細胞／ｍｌ～１×１０９細胞／ｍｌ、好ましくは１×１０８細胞／ｍｌのオーダーになるように調製すればよい。
　そして、発情期を迎えた雌ブタの子宮内に、調製した人工精液を注入することで、人工授精を行うことができる。
　雌ブタでは、人工授精後、凡そ１１４日齢で分娩に至る。分娩後、子ブタが２０～４０日齢のほ乳期間を経て離乳し、離乳して４日後程で雌ブタに発情が再来する。雌ブタの再発情に合わせて、上記と同様に人工授精を行うとよい。このようなサイクルで人工授精を行うことで、一頭の雌ブタの一生涯に、より多くの子ブタを出産させることができる。
　なお、精子用希釈液は、冷凍庫で簡易に保管可能である。このため、必要なときに融解して用いることができ、雌ブタ等の発情期のタイミングに合わせて容易に用いることができる。
　本実施の形態に係る精子用希釈液で希釈される凍結精子は、精液から精漿を除去して凍結した凍結精子を用いることが好ましい。これにより、完全な無菌状態での人工授精を行うことができ、例えば、特定疾病フリー　ＳＰＦブタの生産にも用いることができる。
　また、哺乳動物の種別によっては、精液を凍結する際に、精漿が凍結に悪影響を及ぼして凍結を行えないため、人工授精が困難な場合がある。このような場合にも、精漿を除去して精子を凍結し、この凍結精子を本実施の形態に係る精子用希釈液で希釈することにより、人工授精を行うことができる。
　また、本実施の形態に係る精子用希釈液は、非ヒト哺乳動物のいずれの人工授精に用いてもよい。
　また、本実施の形態に係る精子用希釈液は、家畜等の非ヒト哺乳動物に対して利用できるが、特に、多胎動物の人工授精に好適に用いることができる。ブタ等の多胎動物においても着床率が高いため、一度に多数の胎子を出産させることができ、生産効率を高めることができる。
　また、ブタ等においても、優れた血統の雄ブタのみから採精した精子を用い、肉質改善などの育種改良等の繁殖技術の向上にも資する。
　また、精漿を全く用いないため、多数の種雄ブタ等を飼育する必要がない。
（実験例１）
　Ｃａ２＋含有培地でブタの精子を培養し、Ｃａ２＋が精子のタンパク質のチロシン残基のリン酸化に及ぼす影響について検討した。
　Ｃａ２＋含有培地として、ｍＴＢＭ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｔｒｉｓ－ｂｕｆｆｅｒ　ｍｅｄｉｕｍ）を用いた。ｍＴＢＭの組成を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　また、ブタの精子は、以下のようにして採精、凍結したものを用いた。採精に使用する雄ブタを、それぞれ個々の豚房で別々に飼育し、朝、夕の２回、計２．５ｋｇの種ブタ用飼料を給餌した。ブタには、日本脳炎・ブタパルボウイルス感染症ワクチンの接種を行った。本検討には、ブタ繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）、オーエスキー病に対して抗体陰性のブタを選択した。採精は、１週間間隔をあけて行った。採精前は、餌食い、病気の兆候等を確認し、良好なブタであることを確認し、ブタを興奮させないように採精を行った。
　疑牝台を雄ブタの豚房に入れ、雄ブタを台にのせ、ペニス及び包皮内を生理食塩水で洗浄し、尿を除去した。採精は手圧法で行い、予め滅菌したカップにガーゼをかぶせ、精液と共に出るゼリー状の物質である膠様物を除去しながら、精液をカップに入れた。精液は、はじめの５０～１００ｍＬの濃厚部（全精液量の約８割の精子が存在する）のみを採取し、採精後遠心分離によって精漿を精液から即座に除去した。
　その後、前処理液を用いて精子を希釈し、２．５時間かけて１５℃にし、遠心による上清除去後、浸透圧４００ｍＯｓｍ／ｋｇの溶液中に約１．５時間維持しながら、４～５℃まで冷却した。なお、用いた溶液は、ＮＳＦ（Ｎｉｗａ　ａｎｄ　Ｓａｓａｋｉ　ｆｒｅｅｚｉｎｇ　ｅｘｔｅｎｄｅｒ；８０％（ｖ／ｖ），　０．３１ｍｏｌ　Ｌａｃｔｏｓｅ　ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ，　２０％（ｖ／ｖ）　ｅｇｇ　ｙｏｌｋ，　１０００Ｕ／ｍｌ　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　Ｇ　ｐｏｔａｓｓｉｕｍ，　１ｍｇ／ｍｌ　ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ　ｓｕｌｆａｔｅ；浸透圧３００ｍＯｓｍ／ｋｇ）を超純水にて、浸透圧４００ｍＯｓｍ／ｋｇに調製した溶液である。次に耐凍剤と０．１５％のＯＥＰ（Ｏｒｖｕｓ　Ｅｓ　Ｐａｓｔｅ界面活性剤）を添加した。また、二次希釈液を等量添加した。この場合の精子濃度を１×１０９細胞／ｍｌにした。耐凍剤の添加後、３０分程度、４～５℃に保ち、その後、凍結した。凍結には、液体窒素を用いた。ストローに精漿を除去した精子を充填後、液体窒素表面から４ｃｍ程度離したところで、液体窒素蒸気中で１０分間凍結し、その後、液体窒素中で保存しておいた。
　上述のようにして得られたブタの凍結精子を、６０℃で８秒間融解し、Ｃａ２＋含有培地（ｍＴＢＭ）に精子を添加して、精子の培養を行った。培養は３時間行った。
　また、参考例１として、精漿含有培地を用い、上記と同様に精子を添加して培養した。精漿含有培地は、上述のＣａ２＋含有培地（ｍＴＢＭ）に、終濃度が１０％（ｖ／ｖ）となるように精漿を添加して調製した。なお、精漿は、上述のように、採精した精液から遠心分離によって精子を除去した後、更に、遠心分離により、その上清から固形物を除去することによって調製して用いた。
　また、参考例２として、Ｃａ２＋不含培地を用い、上記と同様に精子を添加して培養した。Ｃａ２＋不含培地は、上述のＣａ２＋含有培地（ｍＴＢＭ）からＣａ成分（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）を除去して調製した。
　培養後、それぞれ精子を培養した培地を２０μｌずつ取り出して－８０℃に保存し、タンパク質のチロシン残基のリン酸化検出に用いた。チロシン残基のリン酸化検出は、ウェスタンブロット法により検出した。
　ウェスタンブロット法によるチロシン残基のリン酸化検出は以下の通りである。－８０℃で保存した精子にＳＤＳサンプル緩衝液１７μｌを添加し、ピペッティングした。１０，０００ｒｐｍで２分間遠心し、超音波処理を２分間行い、その後、１００℃で５分間加熱し、１００Ｖで２時間程度泳動した。メンブランに転写し、５％ＢＳＡ添加ＴＢＳでのブロッキング後、０．５％ＢＳＡ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を添加したＴＢＳ（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ）に１：２，０００希釈した抗リン酸化チロシン抗体（一次抗体、マウスＩｇＧ）を添加し、メンブランに１２時間４℃で反応させた。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を添加したＴＢＳで２時間洗浄後、０．５％ＢＳＡ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を添加したＴＢＳに１：２，０００に希釈した抗マウスＩｇＧ抗体（二次抗体）を１時間反応させた。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を添加したＴＢＳで１時間洗浄した。発色基質を添加し、５分間反応させ、フィルムに感光させた。
　培養したそれぞれの精子における、精子タンパク質チロシン残基のリン酸化検出結果を図１に示す。
　Ｃａ２＋含有培地で培養した精子では、図１中の矢印で示すバンド付近に、強いタンパク質リン酸化バンドが検出された。Ｃａ２＋含有培地では、リン酸化により、精子は正常な細胞膜を維持できなくなると考えられる。
　一方、参考例１における精漿含有培地で培養した精子では、同様の精子タンパク質チロシン残基のリン酸化バンドは検出されず、精漿が添加されたことにより、精子タンパク質チロシン残基のリン酸化が生じなかったものと考えられる。また、参考例２におけるＣａ２＋不含培地で培養した精子では、若干のタンパク質リン酸化バンドが検出された。これは、Ｃａ成分（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）を除去したものの、ｍＴＢＭには純水が用いられており、この純水中に存在する微量なＣａ２＋の影響と考えられる。
　上記の結果から、カルシウムイオンの存在が精子の機能障害に関与することがわかり、凍結精子の希釈液においては、Ｃａ２＋が精子に作用することを抑制することが、人工授精後の受胎率向上のため必須であることがわかった。
（実験例２）
　培地にキレート剤を添加してブタの精子を培養することにより、精子の運動性低下、精子先体損傷率、精子タンパク質チロシン残基のリン酸化が抑制されるか否かを検証した。
　まず、ＥＤＴＡ添加による影響について検証した。
　ＥＤＴＡの濃度がそれぞれ０ｍＭ、３ｍＭ、６．３ｍＭ、１２ｍＭの培地を調製した。ＥＤＴＡ０ｍＭ培地、ＥＤＴＡ３ｍＭ培地は、モデナ液からＥＤＴＡ－２Ｎａを除去し、ＥＤＴＡ濃度をそれぞれ０ｍＭ、３ｍＭに調製した。また、ＥＤＴＡ６．３ｍＭ培地は、モデナ液をそのまま用いた。また、ＥＤＴＡ１２ｍＭ培地は、モデナ液にＥＤＴＡ－２Ｎａを添加してＥＤＴＡ濃度を１２ｍＭに調製した。
　それぞれの培地に、実験例１と同様に凍結精子を融解して添加し、精子を培養した。培養時間は、１時間、３時間、６時間とした。
　培養後、運動性解析装置（ｃｏｍｐｕｔｅｒ－ａｓｓｉｓｔｅｄ　ｐｅｒｍ　ｍｏｔｉｌｉｔｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ（ＣＡＳＡ）ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、精子運動率を算出した。３８℃に温まったプレートの上に培養後の培地５μｌを載せて、コンピュータで動いている精子の割合を解析した。
　図２に、培養したそれぞれの精子運動率を示す。
　いずれの培養時間においても、ＥＤＴＡ６．３ｍＭ培地で培養した精子が、最も精子運動率が高い結果となった。
　続いて、ＥＧＴＡ添加による影響について検証した。本検証は、上記の精子運動率が最も高かったＥＤＴＡ６．３ｍＭ培地（モデナ液）に、更にＥＧＴＡを添加した培地で精子を培養し、培養後の精子運動率の測定、精子タンパク質チロシン残基のリン酸化検出、精子先体損傷率の測定を行った。
　まず、ＥＧＴＡ０ｍＭ培地、ＥＧＴＡ３ｍＭ培地、ＥＧＴＡ６ｍＭ培地、ＥＧＴＡ９ｍＭ培地を調製した。ＥＧＴＡ０ｍＭ培地はモデナ液をそのまま用いた。また、ＥＧＴＡ３ｍＭ培地、ＥＧＴＡ６ｍＭ培地、ＥＧＴＡ９ｍＭ培地は、モデナ液に、それぞれＥＧＴＡを添加して、培地中のＥＧＴＡ濃度をそれぞれ３ｍＭ、６ｍＭ、９ｍＭに調製して用いた。なお、ＥＧＴＡを添加すると培地中ｐＨが酸性に傾くため、ＮａＯＨを添加してｐＨ７．０～７．１に調製した。
　それぞれの培地に、実験例１と同様に、凍結精子を融解して添加し、精子を培養した。培養時間は、１時間、３時間、６時間とした。
　培養したそれぞれの精子について、精子運動率の測定、精子タンパク質チロシン残基のリン酸化検出、精子先体損傷率の測定を行った。
　精子運動率の測定、及び、精子タンパク質チロシン残基のリン酸化検出については、上記と同様に行った。また、精子先体損傷率の測定は、以下のように行った。スライドガラスに培地を５μｌ塗抹して風乾し、９９％メタノールにて１０分間固定した。メタノールの乾燥後、リキッドペンでマーキングした。ＦＩＴＣ－ｐｅａｎｕｔ　ｌｅｃｔｉｎを塗抹精子に添加（１サンプルにつき凡そ３０μｌ）し、３７℃湿潤条件で３０分間インキュベートした。その後ＰＢＳで洗浄（５分間×３回）し、ＤＡＰＩ（ＶＥＣＴＯＲ、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ　ｗｉｔｈ　ＤＡＰＩ，Ｈ－１２００）にて封入し、マネキュア封入した後に、観察した。
　精子運動率の測定結果を図３に、３時間培養後の精子タンパク質チロシン残基のリン酸化検出結果を図４に、精子先体損傷率の測定結果を図５にそれぞれ示す。
　精子希釈液にＥＧＴＡが含有されていると、ＥＧＴＡが含有されていない場合に比べて、精子運動率が高く、また、精子先体損傷率が低くなっている。そして、ＥＧＴＡ６ｍＭ培地にて培養した精子が、精子運動率が最も高く、また、チロシン残基のリン酸化が最も抑制されている。そして、精子先体損傷率も低いことがわかる。この結果から、精子用希釈液にはＥＤＴＡに加え、ＥＧＴＡが含有されていると効果が大きくなること、更に、ＥＧＴＡが６ｍＭ程度含有されているとより効果が大きいことがわかる。
　また、精子の細胞内に取り込まれたカルシウムイオンの観察を行った。
　ＥＤＴＡ含有培地、及びＥＤＴＡ・ＥＧＴＡ含有培地に、ブタの凍結精子を融解してそれぞれ添加した。ＥＤＴＡ含有培地として、モデナ液を用いた。ＥＤＴＡ・ＥＧＴＡ含有培地は、モデナ液にＥＧＴＡを添加し、ＥＧＴＡ濃度を６ｍＭに調製して用いた。
　それぞれの培地に５μＭのＦＬＵＯ３／ＡＭと０．０２％　Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ１２７を添加し、３７℃で、３０分間暗室で培養し、精子の細胞内にＦＬＵＯ３を取り込ませた。
　その後、遠心分離にて上澄みを除去し、新しいそれぞれの培地を精子に添加した。そして、それぞれの培地５μｌをスライドに取り出し、蛍光顕微鏡にて観察した。その結果を図６に示す。
　ＦＬＵＯ３は、カルシウムイオンと結合して蛍光を発する物質である。精子の細胞内に、培地中に存在するカルシウムイオンが取り込まれると、細胞内でＦＬＵＯ３とカルシウムイオンが結合し、緑色に蛍光発色する。図６を見ると、各培養時間において、ＥＤＴＡ含有培地で培養した精子では、ＥＤＴＡ・ＥＧＴＡ含有培地で培養した精子に比べ、強く発光している。特に、培養時間の増加につれて、ＥＤＴＡ含有培地で培養した精子では、非常に強く発光をしているが、ＥＤＴＡ・ＥＧＴＡ含有培地で培養した精子では、わずかに中片部が発光しているに留まる。ＥＧＴＡにより、培地中のカルシウムイオンが精子に取り込まれることを抑制できていることがわかる。
　続いて、ＥＤＴＡ含有培地、ＥＤＴＡ・ＥＧＴＡ含有培地、及び、精漿含有培地にてブタの精子を培養し、培養したそれぞれの精子について、チロシン残基のリン酸化検出、及び、精子運動率の測定を行った。
　ＥＤＴＡ含有培地として、モデナ液（ＥＤＴＡ６．３ｍＭ）をそのまま用いた。ＥＤＴＡ・ＥＧＴＡ含有培地は、モデナ液にＥＧＴＡを加え、ＥＧＴＡ濃度が６ｍＭになるように調製した。精漿含有培地は、モデナ液に終濃度が１０％（ｖ／ｖ）となるように精漿を添加して調製した。凍結精子を融解してそれぞれの培地に添加し、１時間精子を培養した。
　培養したそれぞれの精子について、精子タンパク質チロシン残基のリン酸化検出を行った。その結果を図７に示す。
　ＥＤＴＡ含有培地、及び、精漿含有培地で培養した精子では、矢印で示す位置に弱いタンパク質リン酸化バンドが検出されているが、ＥＤＴＡ・ＥＧＴＡ含有培地では、同様の位置にタンパク質リン酸化バンドが全く検出されず、タンパク質のリン酸化が完全に抑制されていることがわかる。
　更に、培養後のそれぞれの精子について、精子運動率を測定した。その結果を図８に示す。
　図８における精子運動率の結果から、精漿含有培地で培養した精子よりも、ＥＤＴＡ・ＥＧＴＡ含有培地で培養した精子の方に、高い運動性が認められた。
　このように、ＥＤＴＡ・ＥＧＴＡ含有培地で培養した精子では、タンパク質のチロシン残基のリン酸化が生じていないことから、融解後の精子の細胞膜が正常であり、更に、精子運動率の向上も認められた。したがって、基礎希釈液にＥＤＴＡ・ＥＧＴＡ等のカルシウムイオンと錯体を形成するキレート剤を含有させることにより、精漿不添加の精子用希釈液を調製できることがわかる。
　以上の実験結果より、凍結精子融解後のタンパク質チロシン残基のリン酸化が原因で起こる精子の活性化や先体の損傷にはカルシウムイオンが関与しており、希釈液にカルシウムイオンをキレートするＥＤＴＡ、ＥＧＴＡを添加することで、精子細胞内のカルシウムイオン増加と、それに伴う活性化や先体の損傷を抑制することができ、結果的に精子の運動性が持続することが裏付けられた。
（実施例１）
　ＥＤＴＡ及びＥＧＴＡを含有する精子用希釈液にブタの凍結精子を添加して調製した人工精液を用い、ブタの人工授精を行った。
　まず、ＥＧＴＡをモデナ液に添加し、精子用希釈液を調製した。ＥＤＴＡの濃度は６．３ｍＭ、ＥＧＴＡの濃度は６ｍＭである。そして、実験例２と同様に、ＮａＯＨを添加して、ｐＨ７．０～７．１に調節した。
　凍結精子を６０℃で８秒間融解し、即座に精子用希釈液に添加し、人工精液（以下、人工精液Ａ１と記す）を調製した。精子の濃度は１×１０８ｓｐｅｒｍ／ｍｌである。
　人工授精する雌ブタは、血清性性腺刺激ホルモン（ＰＭＳＧ）１，０００ＩＵ／頭を注射し、そして、ＰＭＳＧ注射７２時間後にヒト胎盤性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）７５０ＩＵ／頭を投与し、過排卵を誘起した。ｈＣＧを投与して４０時間後に、上述のように調製した人工精液Ａ１を５０ｍｌ（総精子数５０億）ほど雌ブタの子宮に注入し、人工授精を行った。
　人工授精後、２１日目に超音波妊娠鑑定にて胎子をモニターで確認した。２１日目に行うのは、ブタは２１日周期で発情がくるため、受精後２１日目に妊娠鑑定をする際、受精していない、若しくは受精卵が退行した等があれば、陰部は発情の兆候を示すためである。
　また、同時に２１日目にノンリターン法にて再発情（リターン）がきているかどうかも確認し、妊娠を決定した。
　また、参考例として、モデナ液に精漿を添加して調製した精漿含有希釈液（精漿１０％（ｖ／ｖ））に、上記同様、凍結精子を融解して調製した人工精液（以下、人工精液Ｂ１）を用い、上記と同様に人工授精を行った。
　そして、それぞれの受胎率と着床率を測定した。受胎率を表２に、着床率を表３にそれぞれ示す。なお、受胎率は、人工授精を行った頭数と受胎した頭数をカウントすることにより算出した。また、着床率は、６頭の雌ブタの総黄体数及び総子宮内胎子数をカウントすることにより算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ＥＤＴＡ・ＥＧＴＡが添加された人工精液Ａ１では、受胎率が９０％と精漿１０％添加された人工精液Ｂ１と同等の高い値であった。
　しかしながら、着床率は５１％であり、精漿を１０％添加した人工精液Ｂ１の７８％に比べて低く、多くの胎子は貪食されていた。また、３頭の雌ブタの卵管還流を行った結果、人工精液Ａ１を用いた人工授精では、総黄体数が５１、子宮内胚数が４２であり、卵管内受精率は８２％であったため、胎子が貪食されていなければ、人工精液Ｂ１と同様の着床率であったと考えられる。人工精液Ａ１を用いて人工授精を行った場合では、受精後に子宮内免疫機能の破綻によって、胎子が貪食されたと考えられる。
（実験例３）
　実施例１の結果から、精子が本来の受精機能を果たし、着床率を更に向上させるためには、精漿の存在が必要と考えられ、精漿中には、精子の貪食が抑制され得る免疫抑制因子が含まれていると考えられる。そこで、精漿中の免疫抑制因子の同定を試みた。
　１７頭の雄ブタから精漿を回収し、ＥＩＡ法を用いて、精漿中のステロイドホルモンの測定を行った。また、メンブラン抗体アレイ（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ　ＰｒｏｆｉｌｅｒＴＭ　Ａｒｒａｙ，Ｈｕｍａｎ　Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　Ａｒｒａｙ　Ｐａｎｅｌ　Ａ，ＡＲＹ００５）を用いて、精漿中のサイトカインの検出を行った。
　精漿中のステロイドホルモンの測定結果を表４に、精漿中のサイトカインの検出結果を図９にそれぞれ示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４に示すように、精漿中から０．９２ｎｇ／ｍｌのコルチゾールが検出された。また、図９中の丸印で示すように、ＭＩＦ、Ｓｅｒｐｉｎ　Ｅ１が検出された。なお、図９に示すメンブランでは、３箇所（左上、左下、右上）が必ず光る箇所であり、それ以外の部位に合計３６種類の特異的な抗サイトカイン抗体が並んで２箇所プロットされている。そして、プロットされた抗サイトカイン抗体に特異的に反応するサイトカインが存在すると、プロットされた箇所が光る仕組みである。
　上記の結果から、精漿には、コルチゾール、ＭＩＦ、Ｓｅｒｐｉｎ　Ｅ１の免疫抑制因子が含まれていることを同定した。希釈液中にこれらの因子が含有されていれば着床率の向上を実現し得ると考えられる。
（実施例２）
　コルチゾール、ＥＤＴＡ、及びＥＧＴＡを含有する精子用希釈液にブタの凍結精子を添加して調製した人工精液を用いて、ブタの人工授精を行った。
　まず、コルチゾール、及び、ＥＧＴＡをモデナ液に添加し、精子用希釈液を調製した。コルチゾールの濃度は１００ｎｇ／ｍＬ、ＥＤＴＡの濃度は６．３ｍＭ、ＥＧＴＡの濃度は６ｍＭである。そして、実施例１と同様にＮａＯＨを添加してｐＨ７．０～７．１に調整した。
　凍結精子を６０℃で８秒間融解し、即座に精子用希釈液に添加して、人工精液（以下、人工精液Ａ２と記す）を調製した。精子の濃度は１×１０８ｓｐｅｒｍ／ｍＬである。
　このようにして調製した精子用希釈液を用いて、人工授精を行った。その手法については、雌ブタにＰＭＳＧを投与しなかった以外、実施例１と同様である。
　また、実施例１と同様に、凍結精子をＥＤＴＡ、ＥＧＴＡを添加した精子用希釈液で希釈して調製した人工精液Ａ１を用いて、同様に人工授精を行った。
　受胎率及び着床率を表５に示す。受胎率は、人工授精を行った雌ブタの頭数、及び受胎した雌ブタの頭数をカウントすることによって算出した。また、着床率は、４頭の雌ブタの総子宮内胎子数及び総黄体数をカウントし、頭数で平均することによって算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　コルチゾールを含有する精子用希釈液を用いて人工授精した受胎率は９２％と、コルチゾール無添加に比べて向上し、更に、着床率は８３％と、コルチゾール無添加の場合の５１％に比べて、大幅に向上している。
　また、人工授精後の子宮内白血球数を計測したところ、図１０の子宮内白血球数の相対値に示すように、人工精液Ａ２では、人工精液Ａ１に比べて、子宮内白血球数が大幅に減少しており、また、実施例１における精漿を用いた人工精液Ｂ１に比べても少ない。したがって、コルチゾールの免疫抑制作用により、受精後の胚の貪食が抑えられ、着床率が向上したことがわかる。
　また、上記の副腎皮質ホルモン（コルチゾール等のステロイドホルモン）は通常家畜の治療として１頭あたり５～５０ｍｇ注射するが、本実施例における人工授精では子宮内にわずか５μｇ注入しただけであり、治療として用いる場合の１，０００～１０，０００分の１程度なので、母豚の肉あるいは子宮内胎子には影響はないと考えられる。実際、精子用希釈液を使用して人工授精した母豚は現在妊娠２ヶ月齢が４頭、１ヶ月齢が６頭と母豚の健康状態の異常や、流産などは全くなかった。また、出産後においても、奇形子の存在は確認できなかったことから、コルチゾールの添加による弊害はなかった。
　以上の実験結果より、精漿無添加の精子用希釈液の調製を実現した。
　本出願は、２００９年６月１７日に出願された日本国特許出願２００９－１４４７０３号に基づく。本明細書中に日本国特許出願２００９－１４４７０３号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。
　以上説明したように、精子用希釈液は、カルシウムイオンと錯体を形成するキレート剤が含有されており、また、白血球の遊走を抑制する免疫抑制因子が含有されている。この精子用希釈液に凍結精子を添加して人工授精を行うと、精子が死滅せずに卵子まで辿り着くことができ、また、精子や胚が白血球に貪食されることがなく、高い受胎率及び着床率を示す。畜産業界等、非ヒト哺乳動物の繁殖を行う業界で好適に利用でき、特に、ブタ等の多胎動物での人工授精法による繁殖に効果的に利用可能である。

Claims (15)

  1. 　カルシウムイオンと錯体を形成するキレート剤を含有することを特徴とする精子用希釈液。
  2. 　前記キレート剤がＥＧＴＡであることを特徴とする請求項１に記載の精子用希釈液。
  3. 　前記キレート剤がＥＧＴＡ及びＥＤＴＡであることを特徴とする請求項１に記載の精子用希釈液。
  4. 　更に、白血球の遊走を抑制する免疫抑制因子を含有することを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の精子用希釈液。
  5. 　前記免疫抑制因子がステロイドホルモン及びサイトカインから選択される一種以上であることを特徴とする請求項４に記載の精子用希釈液。
  6. 　前記ステロイドホルモンがコルチゾール、及び、コルチゾール誘導体から選択される一種以上であることを特徴とする請求項５に記載の精子用希釈液。
  7. 　前記コルチゾール誘導体が、デキサメタゾン、プレドニゾン、及びハイドロコルチゾンから選択される一種以上であることを特徴とする請求項６に記載の精子用希釈液。
  8. 　前記サイトカインがマクロファージ遊走阻止因子、及びＳｅｒｐｉｎ　Ｅ１から選択される一種以上であることを特徴とする請求項５に記載の精子用希釈液。
  9. 　精漿が除去されて凍結された凍結精子の希釈に用いられることを特徴とする請求項１乃至８のいずれか一項に記載の精子用希釈液。
  10. 　前記凍結精子が非ヒト哺乳動物の凍結精子であることを特徴とする請求項９に記載の精子用希釈液。
  11. 　前記非ヒト哺乳動物が多胎動物であることを特徴とする請求項１０に記載の精子用希釈液。
  12. 　前記多胎動物がブタであることを特徴とする請求項１１に記載の精子用希釈液。
  13. 　非ヒト哺乳動物から採精した精液から精漿を除去して凍結した凍結精子を、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の精子用希釈液で希釈して人工精液を調製し、
    　前記人工精液を前記非ヒト哺乳動物の子宮内に注入して人工授精を行う、ことを特徴とする人工授精方法。
  14. 　前記非ヒト哺乳動物として多胎動物を用いることを特徴とする請求項１３に記載の人工授精方法。
  15. 　前記多胎動物としてブタを用いることを特徴とする請求項１４に記載の人工授精方法。
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