CN102907377B - 刺参体内寄生性后口虫液体培养基制备及培养方法 - Google Patents

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Abstract

一种刺参体内寄生性后口虫液体培养基制备，属于海水养殖动物疾病防控领域，具体步骤如下：在海水中加入乙二胺四乙酸(EDTA)，EDTA的终浓度为10-7～10-5mol/L，再将添加过EDTA的海水煮沸灭菌15～30min，冷却至3℃～10℃后加入新鲜的刺参体腔液，体腔液和灭菌海水按体积配比为：1：500～1：1000。利用本发明的培养基对刺参体内寄生性后口虫进行体外培养时间可以达到60天，解决了后口虫体外存活时间短，难于研究其生活史和筛选防治药物的技术难题。

Description

刺参体内寄生性后口虫液体培养基制备及培养方法
技术领域
本发明属于海水养殖动物疾病防控领域，具体地涉及一种刺参体内寄生性后口虫液体培养基制备及培养方法。
背景技术
刺参(Apostichopus japonicus)是我国海参中经济价值最高的品种，其地理分布为我国辽东半岛和山东半岛、俄罗斯东部、日本和韩国沿海。2010年全国海参增养殖面积约15万公顷，产量13万吨，产值超过200亿元，成为我国海水养殖单品种产值最高的种类之一，在沿海渔业经济中的地位举足轻重。
然而，随着养殖规模的扩大，刺参病害发生频繁，每年造成30多亿元的经济损失，病害问题已经直接影响到养殖产业的健康发展。已经报道的刺参主要疾病有细菌病、病毒病和寄生虫病三大类。在寄生性疾病中，一种寄生在刺参体内呼吸树上的后口虫能够引起刺参的排脏反应，严重感染的刺参排脏后丧失摄食能力，参体消瘦，活力减弱，容易由其它病原引起继发性感染，该病被称为刺参后口虫病。
研究该后口虫的体外活体培养方法是筛选防治药物的前提。由于该虫在动物呼吸器官寄生的独特习性，采用常规的动物组织粉碎制备培养基方法难以实现虫体的体外长期活体培养。
在本发明形成之前，国内外关于刺参纤毛虫病的报道主要集中在流行病学、病原分类学和组织病理学等方面的研究上，但未检索到刺参体内寄生性后口虫体外液体培养基制备及培养方法的详细报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种刺参体内寄生性后口虫液体培养基制备及培养方法，从而解决其体外存活时间短，难于研究其生活史和筛选防治药物的技术难题。
本发明所采用的技术方案是：
一种刺参体内寄生性后口虫液体培养基制备方法，具体步骤如下：在海水中加入乙二胺四乙酸(EDTA)，EDTA的终浓度为10-7～10-5mol/L，再将添加过EDTA的海水煮沸灭菌15～30min，冷却至3℃～10℃后加入新鲜的刺参体腔液，体腔液和灭菌海水按体积配比为：1：500～1：1000。配置好的培养基可以在4℃条件下保存2天。
一种刺参体内寄生性后口虫培养方法，具体步骤如下：
(1)用冷却至3℃～10℃的灭菌海水冲洗带有刺参后口虫的组织至灭菌的玻璃培养皿中；
(2)在倒置显微镜下吸取50～100只后口虫虫体至装有20～50ml上述方法制备的刺参体内寄生性后口虫液体培养基的玻璃培养皿中，然后加入新鲜刺参呼吸树组织块，保持玻璃培养皿内液体培养基的温度在3℃～10℃，日温度变化小于等于5℃，盐度25～30；pH8～9；光照强度≤20μmol/m2/s；溶解氧≥4mg/L；
(3)每隔24h从上述培养寄生性后口虫的玻璃培养皿中吸出10～25ml上述加入的刺参体内寄生性后口虫液体培养基和上述加入的呼吸树组织块，吸出后的液体培养基和组织在倒置显微镜下观察是否有后口虫被吸出，如有则用吸管反吸回原培养皿中，然后加入10～25ml新的刺参体内寄生性后口虫液体培养基和新鲜的刺参呼吸树组织块。
本发明与现有技术相比的有益效果：
1、确定了适合刺参后口虫体外培养的条件，大大提高了后口虫体外的成活率和存活时间。
2、培养基的制备方法简单，成本低廉。
3、后口虫的体外培养时间可以达到60天，显著超过其他盾纤毛虫的30天体外培养时间的报道。
4、本培养基还可以扩展应用于刺参其他寄生性纤毛虫的培养。
具体实施方式
下面通过实施实例详细叙述本发明的技术内容，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。
实施例1：
一种刺参体内寄生性后口虫液体培养基制备，具体步骤如下：在海水中加入乙二胺四乙酸(EDTA)，EDTA的终浓度为10-7mol/L，再将添加过EDTA的海水煮沸灭菌15min，冷却至3℃后加入新鲜的刺参体腔液，体腔液和灭菌海水按体积配比为：1：500。配置好的培养基可以在4℃条件下保存2天备用。
2010年11月，山东胶南某刺参养殖场的刺参发生后口虫病，将患病的刺参放置于加冰的泡沫箱中运回中国水产科学研究院黄海水产研究所（青岛）进行虫体的体外培养。
用冷却至4℃的灭菌海水冲洗带有刺参后口虫的呼吸树组织至灭菌的玻璃培养皿中；在倒置显微镜下(20×物镜镜头，10×目镜镜头)吸取50只后口虫虫体至装有20ml上述方法制备的后口虫液体培养基的玻璃培养皿中，然后加入长度为12cm的新鲜刺参呼吸树组织块，保持盐度30；pH8；光照强度≤20μmol/m2/s；溶解氧≥4mg/L；每隔24h吸出10ml上述加入的后口虫液体培养基和上述添加的呼吸树组织块，在倒置显微镜下观察吸出后的液体培养基和组织块是否有后口虫被吸出，如有则用吸管反吸回原培养皿中，然后加入10ml新的后口虫液体培养基和长度为12cm新鲜的呼吸树组织块，每隔15天在倒置显微镜下计数一次，共进行了60天，计数结果见表1。
表1刺参后口虫的培养计数结果
Figure GDA0000394589460000041
实施例2：
一种刺参体内寄生性后口虫液体培养基制备方法，具体步骤如下：在海水中加入乙二胺四乙酸(EDTA)，EDTA的终浓度为10-5mol/L，再将添加过EDTA的海水煮沸灭菌30min，冷却至10℃后加入新鲜的刺参体腔液，体腔液和灭菌海水按体积配比为1：1000。配置好的培养基可以在4℃条件下保存2天备用。
2011年10月，山东蓬莱某刺参养殖场的刺参发生后口虫病，将患病的刺参放置于加冰的泡沫箱中运回中国水产科学研究院黄海水产研究所（青岛）进行虫体的体外培养。
用冷却至4℃的灭菌海水冲洗带有刺参后口虫的呼吸树组织至灭菌的玻璃培养皿中；在倒置显微镜下(20×物镜镜头，10×目镜镜头)吸取100只后口虫虫体至装有50ml上述方法制备的后口虫液体培养基的玻璃培养皿中，然后加入长度为2cm的新鲜刺参呼吸树组织块，保持盐度30；pH8～9；光照强度≤10μmol/m2/s；溶解氧≥4mg/L；每隔24h吸出25ml上述加入的后口虫液体培养基和上次添加的呼吸树组织，在倒置显微镜下观察吸出后的液体培养基和组织块是否有后口虫被吸出，如有则用吸管反吸回原培养皿中，然后加入25ml新的后口虫液体培养基和2cm新鲜的呼吸树组织，每隔15天在倒置显微镜下计数一次，共进行了75天，计数结果见表1。
表2刺参后口虫的培养计数结果
Figure GDA0000394589460000051
本发明形成了后口虫体外培养液体培养基的制备方法，确定了刺参后口虫的最佳培养方法，可以实现刺参后口虫在体外的长期活体保存，可为研制刺参后口虫病药物和寄生虫生活史提供技术支撑。

Claims (2)

1.一种刺参体内寄生性后口虫液体培养基制备方法，其特征在于具体步骤如下：在海水中加入EDTA，EDTA的终浓度为10-7～10-5mol/L，再将添加过EDTA的海水煮沸灭菌15～30min，冷却至3℃～10℃后加入新鲜的刺参体腔液，体腔液和灭菌海水按体积配比为：1：500～1：1000。
2.一种刺参体内寄生性后口虫培养方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)用冷却至3℃～10℃的灭菌海水冲洗带有刺参后口虫的组织至灭菌的玻璃培养皿中；
(2)在倒置显微镜下吸取50～100只后口虫虫体至装有20～50ml权利要求1所述方法制备的刺参体内寄生性后口虫液体培养基的玻璃培养皿中，然后加入新鲜刺参呼吸树组织块，保持玻璃培养皿内液体培养基的温度在3℃～10℃，日温度变化小于等于5℃，盐度25～30；pH8～9；光照强度≤20μmol/m2/s；溶解氧≥4mg/L；
(3)每隔24h从上述培养寄生性后口虫的玻璃培养皿中吸出10～25ml上述加入的刺参体内寄生性后口虫液体培养基和上述加入的呼吸树组织块，在倒置显微镜下观察吸出后的液体培养基和组织块是否有后口虫被吸出，如有则用吸管反吸回原培养皿中，然后加入10～25ml新的刺参体内寄生性后口虫液体培养基和新鲜的刺参呼吸树组织块。
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