CN102943045A

CN102943045A - 促进普通小球藻生长的培养基及用其培养小球藻的培养方法

Info

Publication number: CN102943045A
Application number: CN2012103883515A
Authority: CN
Inventors: 陈爱美; 施庆珊; 冯劲; 林万泉; 黄小茉; 欧阳友生; 陈仪本
Original assignee: Guangdong Institute of Microbiology
Current assignee: Guangdong Institute of Microbiology
Priority date: 2012-10-12
Filing date: 2012-10-12
Publication date: 2013-02-27

Abstract

本发明公开了一种促进普通小球藻生长的培养基及用其培养小球藻的培养方法。促进普通小球藻生长的培养基是在常规的OECD培养液中加入可溶性稀土化合物，稀土离子终浓度为10^-6～10^-2mM。促进普通小球藻生长的培养方法是以所述的促进普通小球藻生长的培养基对小球藻进行培养。本发明通过在OECD藻类培养液中加入可溶性稀土化合物，如硝酸铈或氯化铈，用其培养普通小球藻，所培养的普通小球藻细胞到达稳定期时，每升培养液可获得细胞干物质43～59mg，比未添加稀土化合物的OECD藻类培养液提高34～69%，有效的提高了小球藻的产量，具有广阔的应用前景。

Description

促进普通小球藻生长的培养基及用其培养小球藻的培养方法

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种促进普通小球藻生长的培养基及用其培养小球藻的培养方法。

背景技术：

小球藻（Chlorella）作为一种重要的微藻资源，具有极其丰富的营养成分和优良的医疗保健作用。其蛋白质含量50%-67%，其中含有人体所必需的20种氨基酸、多种维生素和微量元素，以及亚麻酸、亚油酸、胡萝卜素等成分。其中二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA），医学临床已经证明这两种成分具有多种重要的生理功能。其次，小球藻含有的多糖和蛋白质具有显著的抗瘤抗癌、增强免疫及抗病毒感染的活性。在水产养殖上，单细胞的小球藻可直接作为草食性鱼类和鱼苗的饵料，或者作为肉食性鱼类仔鱼开口期食用的丰年虫等动物的饵料。此外，小球藻在其生长时能消耗掉污水水体中的部分氮、磷，从而达到改善水质的目的，具有很高的经济价值。

目前，小球藻的培养方式可分为自养培养和异养培养。小球藻的自养培养既可利用自然光，也可利用人工光照，培养基主要由无机化合物组成，最适pH为6.5-7.5，最适光照强度为36-90μmol/(m²·s)，温度为20-30℃。目前，关于小球藻的自养培养技术已经成熟，但是随着细胞的不断增殖，进入培养物的光照被阻挡，导致光合作用减弱，从而限制了其生物量的进一步提高。

发明内容：

本发明的第一目的是提供一种促进普通小球藻生长的培养基。

本发明的促进普通小球藻生长的培养基，其特征在于，在常规的OECD培养液中加入可溶性稀土化合物，稀土离子终浓度为10^-6~10^-2mM。

所述的稀土化合物优选为硝酸铈或氯化铈。

本发明的第二个目的是提供一种促进普通小球藻生长的培养方法，其特征在于，以上述促进普通小球藻生长的培养基对小球藻进行培养。

优选，所述的培养方法具体为：将小球藻细胞接种到促进普通小球藻生长的培养基中，初始接种量为10⁵~10⁶cells/mL，在温度23~28℃，光照强度2200~2800lux，光暗比12h：12h，进行培养。

本发明通过在OECD藻类培养液中加入可溶性稀土化合物，如硝酸铈或氯化铈，用其培养普通小球藻，所培养的普通小球藻细胞到达稳定期时，每升培养液可获得细胞干物质43~59mg，比未添加稀土化合物的OECD藻类培养液提高34~69%，有效的提高了小球藻的产量，具有广阔的应用前景。

附图说明：

图1是用本发明的促进普通小球藻生长的培养基对普通小球藻进行培养后的生长曲线图。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

本发明的促进普通小球藻生长的培养方法的具体步骤如下：

配制OECD培养液：

表1：OECD培养液的配方

（1）按照储备液1的配方，取各化合物溶于去离子水中，121℃，15min灭菌，得到储备液1。按照储备液2的配方，取各化合物溶于去离子水中，0.22μm滤膜过滤除菌，得到储备液2。按照储备液3的配方，取各化合物溶于去离子水中，121℃，15min灭菌，得到储备液3。按照储备液4的配方，取各化合物溶于去离子水中，0.22μm滤膜过滤除菌，得到储备液4。再取储备液110mL、储备液21mL、储备液31mL和储备液41mL，混合后，用去离子水定容至1L，得到OECD培养液，该OECD培养液为藻类常规培养液。

（2）添加稀土化合物：将稀土化合物加入到步骤（1）获得的OECD培养液中，使稀土离子的终浓度为10^-6~10^-2mM，得到促进普通小球藻生长的培养基。

（3）步骤（2）所述的稀土化合物可选择硝酸铈或氯化铈。

（4）接种细胞：无菌条件下，将活化的普通小球藻细胞接种至含有步骤（2）获得的促进普通小球藻生长的培养基的培养瓶中，使细胞初始浓度为10⁵~10⁶cells/mL。

（5）培养条件：将步骤（4）中已接种小球藻细胞的培养瓶置于光照培养箱中静置培养，温度23~28℃，光照强度2200~2800lux，光暗比12h:12h，培养期间每天定时摇动培养瓶数次。

（6）小球藻细胞生长情况测定：培养期间，每天从培养瓶中取少量培养液用血球计数板对小球藻细胞计数或用分光光度计测定培养液在540nm处的光密度，确定藻细胞的生长阶段，当小球藻细胞数量或OD540稳定时即完成培养。

（7）收集藻细胞：取50mL完成培养的小球藻细胞培养液，用0.22μm滤膜通过真空抽滤器收集藻细胞进行细胞干重测定以及叶绿素含量测定。

（8）细胞干重测定：将步骤（7）获得的收集有藻细胞的滤膜，置于105℃烘箱中烘干4h，干燥冷却后称量并计算，获得单位体积培养液中细胞干物质含量（mg/L）。

（9）叶绿素含量测定：将步骤（7）获得的收集有藻细胞的滤膜，浸入10mL95%乙醇溶液中，75℃水浴15min后离心，用分光光度计测定上清液的OD665和OD649，获得单位体积培养液中叶绿素的含量（mg/L），计算公式：

叶绿素a的浓度C_a（mg/L）=13.95A₆₆₅-6.88A₆₄₉

叶绿素b的浓度C_b（mg/L）=24.96A₆₄₉-7.32A₆₆₅。

实施例1：

按照表1的配方，配制OECD培养液的4个储备液，高温高压（121℃，15min）灭菌储备液1和3，0.22μm滤膜过滤除菌储备液2和4，取10mL储备液1，储备液2、3和4各1mL，混合后用去离子水定容至1000mL，加入硝酸铈，使铈离子终浓度为10^-2mM，得到促进普通小球藻生长的培养基。接种普通小球藻细胞到含有促进普通小球藻生长的培养基的培养瓶中，细胞初始浓度为10⁵cells/mL；将培养瓶置于光照培养箱中静置培养，温度23℃，光照强度2200lux，光暗比12h:12h，培养期间每天摇动培养瓶两次。培养期间，每天从培养瓶中取少量培养液用血球计数板对小球藻细胞计数或用分光光度计测定培养液在540nm处的光密度，确定藻细胞的生长阶段，当细胞数量或OD540稳定时即完成培养。

培养结果：获得小球藻细胞干重47mg/L，比对照组（未添加硝酸铈的OECD培养液）按照同样条件培养的提高47%，见图1。

实施例2：

按照表1的配方，配制OECD培养液的4个储备液，高温高压（121℃，15min）灭菌储备液1和3，0.22μm滤膜过滤除菌储备液2和4，取10mL储备液1，储备液2、3和4各1mL，混合后用去离子水定容至1000mL，加入硝酸铈，使铈离子终浓度为10^-4mM，由此得到促进普通小球藻生长的培养基。接种普通小球藻细胞到含有促进普通小球藻生长的培养基的培养瓶中，细胞初始浓度为10⁶cells/mL；将培养瓶置于光照培养箱中静置培养，温度25℃，光照强度2500lux，光暗比12h:12h，培养期间每天摇动培养瓶两次。培养期间，每天从培养瓶中取少量培养液用血球计数板对小球藻细胞计数或用分光光度计测定培养液在540nm处的光密度，确定藻细胞的生长阶段，当细胞数量或OD540稳定时即完成培养。

培养结果：获得小球藻细胞干重43mg/L，比对照组（未添加硝酸铈的OECD培养液）按照同样条件下培养的提高34%，见图1。

实施例3：

按照表1的配方，配制OECD培养液的4个储备液，高温高压（121℃，15min）灭菌储备液1和3，0.22μm滤膜过滤除菌储备液2和4，取10mL储备液1，储备液2、3和4各1mL，混合后用去离子水定容至1000mL，加入硝酸铈，使铈离子终浓度为10^-6mM，得到促进普通小球藻生长的培养基。接种普通小球藻细胞到含有促进普通小球藻生长的培养基的培养瓶中，细胞初始浓度为10⁵cells/mL；将培养瓶置于光照培养箱中静置培养，温度28℃，光照强度2800lux，光暗比12h:12h，培养期间每天摇动培养瓶两次。培养期间，每天从培养瓶中取少量培养液用血球计数板对小球藻细胞计数或用分光光度计测定培养液在540nm处的光密度，确定藻细胞的生长阶段，当细胞数量或OD540稳定时即完成培养。

培养结果：获得小球藻细胞干重54mg/L，比对照组（未添加硝酸铈的OECD培养液）按照同样条件培养的提高69%，见图1。

实施例4：

按照表1的配方，配制OECD培养液的4个储备液，高温高压（121℃，15min）灭菌储备液1和3，0.22μm滤膜过滤除菌储备液2和4，取10mL储备液1，储备液2、3和4各1mL，混合后用去离子水定容至1000mL，加入氯化铈，使铈离子终浓度为10^-2mM，得到促进普通小球藻生长的培养基。接种普通小球藻细胞到含有促进普通小球藻生长的培养基的培养瓶中，细胞初始浓度为10⁵cells/mL；将培养瓶置于光照培养箱中静置培养，温度24℃，光照强度2300lux，光暗比12h:12h，培养期间每天摇动培养瓶两次。培养期间，每天从培养瓶中取少量培养液用血球计数板对小球藻细胞计数或用分光光度计测定培养液在540nm处的光密度，确定藻细胞的生长阶段，当细胞数量或OD540稳定时即完成培养。

培养结果：获得小球藻细胞干重49mg/L，比对照组（未添加氯化铈的OECD培养液）按照同样条件培养的提高45%。

实施例5：

按照表1的配方，配制OECD培养液的4个储备液，高温高压（121℃，15min）灭菌储备液1和3，0.22μm滤膜过滤除菌储备液2和4，取10mL储备液1，储备液2、3和4各1mL，混合后用去离子水定容至1000mL，加入氯化铈，使铈离子终浓度为10^-3mM，得到促进普通小球藻生长的培养基。接种普通小球藻细胞到含有促进普通小球藻生长的培养基的培养瓶中，细胞初始浓度为10⁵cells/mL；将培养瓶置于光照培养箱中静置培养，温度26℃，光照强度2400lux，光暗比12h:12h，培养期间每天摇动培养瓶两次。培养期间，每天从培养瓶中取少量培养液用血球计数板对小球藻细胞计数或用分光光度计测定培养液在540nm处的光密度，确定藻细胞的生长阶段，当细胞数量或OD540稳定时即完成培养。

培养结果：获得小球藻细胞干重46mg/L，比对照组（未添加氯化铈的OECD培养液）按照同样条件培养的提高38%。

实施例6：

按照表1的配方，配制OECD培养液的4个储备液，高温高压（121℃，15min）灭菌储备液1和3，0.22μm滤膜过滤除菌储备液2和4，取10mL储备液1，储备液2、3和4各1mL，混合后用去离子水定容至1000mL，加入氯化铈，使铈离子终浓度为10^-5mM，得到促进普通小球藻生长的培养基。接种普通小球藻细胞到含有促进普通小球藻生长的培养基的培养瓶中，细胞初始浓度为10⁶cells/mL；将培养瓶置于光照培养箱中静置培养，温度27℃，光照强度2600lux，光暗比12h:12h，培养期间每天摇动培养瓶两次。培养期间，每天从培养瓶中取少量培养液用血球计数板对小球藻细胞计数或用分光光度计测定培养液在540nm处的光密度，确定藻细胞的生长阶段，当细胞数量或OD540稳定时即完成培养。

培养结果：获得小球藻细胞干重59mg/L，比对照组（未添加氯化铈的OECD培养液）按照同样条件培养的提高66%。

Claims

1.一种促进普通小球藻生长的培养基，其特征在于，在常规的OECD培养液中加入可溶性稀土化合物，稀土离子终浓度为10^-6~10^-2mM。

2.根据权利要求1所述的促进普通小球藻生长的培养基，其特征在于，所述的稀土化合物为硝酸铈或氯化铈。

3.一种促进普通小球藻生长的培养方法，其特征在于，以权利要求1或2所述的促进普通小球藻生长的培养基对小球藻进行培养。

4.根据权利要求3所述的促进普通小球藻生长的培养方法，其特征在于，所述的培养方法具体为：将小球藻细胞接种到权利要求1或2所述的促进普通小球藻生长的培养基中，初始接种量为10⁵~10⁶cells/mL，在温度23~28℃，光照强度2200~2800lux，光暗比12h：12h，进行培养。