CN103695539A - 一种用家蚕生殖腺的体外培养来检测壬基酚毒性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用家蚕生殖腺的体外培养来检测壬基酚毒性的方法，包括以下步骤：首先是家蚕血清的制备，然后是含有壬基酚一系列浓度的目的培养液配制，接着是家蚕生殖腺在目的培养液中体外悬滴培养，进一步进行组织病理切片观察，家蚕生殖腺脂质过氧化产物和抗氧化保护酶活性的测定,紧接着进行生殖发育相关基因SoxE的mRNA转录水平分析，最后进行数据处理。通过对暴露组毒性终点的观察及与对照组的比较，确定壬基酚对家蚕生殖腺的毒性。采用本发明的家蚕生殖腺体外培养在壬基酚毒性测试中具有研究样本单一、研究条件可以人为控制，便于观察，数据处理方便、直观等优点。

Description

一种用家蚕生殖腺的体外培养来检测壬基酚毒性的方法

技术领域

本发明涉及生物领域，具体涉及一种用家蚕生殖腺的体外培养来检测壬基酚毒性的方法。

背景技术

   壬基酚(Nonylphenol, NP)是一种重要的精细化工原料和中间体，主要用于生产表面活性剂，也用于抗氧剂、印染助剂、润滑油添加剂、农药乳化剂、树脂改性剂、树脂及橡胶稳定剂等领域。作为一种高效、经济的非离子表面活性剂，在工农业生产过程中得到广泛应用，其工业来源主要包括采矿、造纸、皮毛加工等废水排放、自来水管材合成材料中油溶性酚树脂的溶出；农业主要源于化肥或农药随农田地表径流的排放、污水处理厂污泥在农田的使用、农作物的防护化学。欧美等工业发达国家从20世纪80年代就开始对NP的浓度分布和环境行为进行了较为广泛的研究，我国在此方面研究起步较晚, 只有少数关于我国主要河流及其入海口临近海域NP污染状况的报道。NP在水环境中分布广泛，但不同水体环境中浓度有所差别，浓度范围一般在μg L^-1～mg L^-1之间。污染地区农田土壤干沉积物中NP浓度高达22～4 000 mg kg^-1。NP具有高度脂溶性，易在水体淤泥中浓集，且相当稳定。另外，它还广泛存在于其它介质中，如饮用水、沉积物、空气以及人类的食品中。 研究人员发现NP可以从牛奶加工过程中的PVC管以及包装食品的塑料中渗出。大量研究表明，由于NP的脂溶性和难降解的特点，具有在生物体内累积的效应，其生物富集系数在350到数千之间。太湖水域及产于太湖的鱼、虾、贝类中均检出NP，表明NP已通过水体进入食物链。

    由于NP在环境中含量较低，检测难度较大，因此对其检测方法的探讨也就成为当前研究的重点之一。关于NP的监测还主要集中在利用化学方法检测，但分析操作步骤的复杂使得其推广普及受到一定限制，往往是在环境中产生很大危害时才引起人们的重视，这也促进了一些简便、快速、有效的生物学替代检测方法的产生。而敏感生物指标可以在生物体发生严重损伤之前就可以反映出环境的污染状况，并且具有反应迅速、测定方便、方法简单易行、易于推广等优点。因而，致力于寻求灵敏而有效的监测指示生物和生物检测指标来预警环境中或生物体内NP的污染和危害有一定的现实意义。

    近年来， NP对动物体生殖和发育的影响，尤其是长期低水平暴露后对动物体的毒性效应越来越受到关注。NP生物毒性检测的方法很多，有宏观的、有微观的，有的可产生特异性反应，而更多的对生物体的伤害特异性并不明显且不易短期检测到，并且也主要侧重于对脊椎动物的研究。其中NP被发现能够作用于生殖过程的不同方面并在不同阶段表现出生殖毒性，会造成雄性动物个体生精功能下降、精巢损伤，对雌性动物个体的卵巢、子宫等生殖组织细胞也存在着不同程度的伤害，严重危害动物的繁殖。无脊椎动物虽然占生物种类的95%，在生物系统中起重要的作用，但有关NP对无脊椎动物的影响特别是对生殖毒性的影响并没有得到充分的重视。

家蚕是国际无脊椎动物协会确认的模式昆虫，在基础物质代谢、能量代谢和遗传方式上与人类有很大的相似性，其全基因组精细图谱的工作完成和功能基因组研究进展，为毒理学研究替代动物研究创造了良好的条件。家蚕作为环境毒理学的研究和毒物评价实验动物，相比于常用的果蝇和哺乳动物模式生物具有独特的优势，主要表现在：（1）实验成本很低：1条家蚕的饲养成本不到普通实验小鼠的万分之一，而且由于家蚕个体小、世代周期短，初试化合物用量少，批量实验成本低，数据量大，适合于高通量药物初筛。（2）实验条件可控性强、实验迅速简便：家蚕在实验室完全可用人工饲料无菌饲养，器具消毒简单，环境条件简单可控；相比果蝇，家蚕活动不活泼，实验操作方便；家蚕个体大小适中，解剖方便，病理样本直观。（3）减少了动物伦理争议：采用家蚕等无脊椎模式生物实验手段代替高等脊椎动物，减轻或减少给高等动物造成的疼痛和不安，也是国际动物伦理福利3R原则的核心所在。（4）生物安全性好：作为唯一驯化的昆虫，家蚕离开人类已经无法单独生存和繁衍后代，实验中不易逃逸。

外源污染物对家蚕都有一定的毒性作用。日本学者增井博之利用无菌饲养的不同发育阶段家蚕进行重金属毒性检测，测定指标包括半致死剂量，蚕的变态发育过程以及蚕的结茧和羽化过程，分析了单一或混合重金属对家蚕所起的毒性反应，并检测了家蚕遗传后代体内重金属残留量。家蚕对毒物很敏感，能检出对人致死量十万分之一的任何毒物，饮用水、土壤等环境中对人类有毒害作用的病原菌，食物中的病原菌等等都可利用家蚕来检测出。

 当前，国内外尚未有利用家蚕的生殖腺离体培养开展污染物的毒性检测研究。生物体内毒性试验是传统经典的污染物测试模型，但耗时相对较长。而家蚕生殖腺体外培养可以提供大量在同一时期、条件相同、性状相似的实验样本，同时具有周期短、占用空间小等优点，因此用家蚕生殖腺进行体外毒理研究具有灵敏、迅速、经济等优势。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的问题，提供一种用家蚕生殖腺的体外培养来检测壬基酚毒性的方法。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

一种用家蚕生殖腺的体外培养来检测壬基酚毒性的方法，包括以下步骤：   

步骤1）家蚕血清的制备：取5龄第6日的家蚕血液至预先冰冻的10 mL离心管内，60℃下静置15-20 min，再用自来水冷却后进行离心(4 000 r min^-1，15 min，4℃)，用0.22 μM微孔滤膜将离心后的上清液过滤灭菌，接着分装至1.5mL的灭菌离心管中在-20℃下保存备用，临用时在水中将其溶解； 

步骤2）含有壬基酚一系列浓度的目的培养液配制：将适量壬基酚溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，获得质量浓度为100 mg L^-1的壬基酚溶液，将此溶液用0.22 μm微孔滤膜过滤后，作为壬基酚原液4℃下保存，基础Grace昆虫培养液中添加1%双抗，10%家蚕血清，分别添加不同体积的壬基酚于基础培养液中，使各目的培养液中壬基酚的最终浓度分别为0，7，14，28 mg L^-1，4℃下保存；

步骤3）家蚕生殖腺体外悬滴培养：选取大小基本一致的家蚕5龄第6日幼虫，用棉或丝线结扎头尾，置于预冷的75%乙醇中浸泡5 min，无菌水漂洗3次，每次30 s，在超净台内用解剖刀剖开蚕体腹部，用弯头镊子分别取出一对生殖腺；解剖镜下用弯头镊子快速除去脂肪后，依次用预冷灭菌的0.86%氯化钠在无菌细胞培养皿中漂洗生殖腺2次，每次30 s；添加1%双抗的基础Grace 昆虫培养液漂洗2次，每次30 s；再用添加1%双抗及含10%家蚕血清的Grace昆虫培养液漂洗30 s；将生殖腺分别轻置于300 uL含不同壬基酚浓度的目的培养液的培养皿内悬滴培养；以上暴露液和对照液均设置３组平行；在每个装有暴露液和对照液的培养皿内放入4个生殖腺，然后将培养皿用封口膜封口后倒置，25℃光照培养箱中培养，每72 h 换液一次，于0、72、120 h置于倒置显微镜下拍照观察生殖腺生长发育情况；

步骤4）家蚕生殖腺组织病理切片观察：按所述步骤（3）的家蚕生殖腺离体培养120 h后取出，快速浸在4%多聚甲醛中固定24 h，对生殖腺进行石蜡组织切片和HE染色，置于显微镜下拍照观察生殖腺组织病理情况；

步骤5）家蚕生殖腺脂质过氧化产物和抗氧化保护酶活性的测定：具体步骤按照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书操作；

步骤6）家蚕生殖发育相关基因SoxE的mRNA转录水平分析：先用TRIzol试剂提取生殖腺组织RNA，以家蚕生殖腺RNA反转录合成的cDNA为模板，家蚕Rp49基因为内参，采用实时荧光定量PCR （Real-Time PCR）方法（实验仪器为7300 Real Time PCR systems，ABI产品）检测组织中SoxE基因的mRNA转录水平，具体步骤按照TaKaRa公司反转录试剂盒及荧光定量SYBR Prime Script TM RT-PCR 试剂盒说明书操作；

步骤7）数据处理：试验数据采用one way ANVOA和Student’s-Newman-Keuls post hoc tests（SPSS16.0 for Windows软件）进行统计学分析，暴露组与对照组之间的差异采用Duncan检验进行比较。

本发明的有益效果: 

采用本发明的家蚕生殖腺体外培养能对环境激素壬基酚产生多种效应终点；在壬基酚毒性测试中具有研究样本单一、研究条件可以人为控制，便于观察，数据处理方便、直观等优点。

附图说明

图1是本发明的不同浓度壬基酚暴露的家蚕生殖腺离体培养120 h示意图；

图2是本发明的不同浓度壬基酚暴露的家蚕生殖腺离体培养120 h后的横切面组织结构示意图；

图3（a）是本发明的不同浓度壬基酚暴露的家蚕生殖腺离体培养120 h后的脂质过氧化产物丙二醛（Malondialdehyde, MDA）含量的变化示意图；

图3（b）是本发明的不同浓度壬基酚暴露的家蚕生殖腺离体培养120 h后的抗氧化酶超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）活性的变化示意图；

图3（c）是本发明的不同浓度壬基酚暴露的家蚕生殖腺离体培养120 h后的抗氧化酶过氧化氢酶（Catalase, CAT）活性的变化示意图；

图4是本发明的不同浓度壬基酚暴露的家蚕生殖腺离体培养120 h后SoxE mRNA的表达量示意图。

具体实施方式

下面将参考附图并结合实施例，来详细说明本发明。

一种用家蚕生殖腺的体外培养来检测壬基酚毒性的方法，包括以下步骤：   

步骤1）家蚕血清的制备：取5龄第6日的家蚕血液至预先冰冻的10 mL离心管内，60℃下静置15-20 min，再用自来水冷却后进行离心(4 000 r min^-1，15 min，4℃)，用0.22 μM微孔滤膜将离心后的上清液过滤灭菌，接着分装至1.5mL的灭菌离心管中在-20℃下保存备用，临用时在水中将其溶解； 

步骤2）含有壬基酚一系列浓度的目的培养液配制：将适量壬基酚溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，获得质量浓度为100 mg L^-1的壬基酚溶液，将此溶液用0.22 μm微孔滤膜过滤后，作为壬基酚原液4℃下保存，基础Grace昆虫培养液中添加1%双抗，10%家蚕血清，分别添加不同体积的壬基酚于基础培养液中，使各目的培养液中壬基酚的最终浓度分别为0，7，14，28 mg L^-1，4℃下保存；

步骤3）家蚕生殖腺体外悬滴培养：选取大小基本一致的家蚕5龄第6日幼虫，用棉或丝线结扎头尾，置于预冷的75%乙醇中浸泡5 min，无菌水漂洗3次，每次30 s，在超净台内用解剖刀剖开蚕体腹部，用弯头镊子分别取出一对生殖腺；解剖镜下用弯头镊子快速除去脂肪后，依次用预冷灭菌的0.86%氯化钠在无菌细胞培养皿中漂洗生殖腺2次，每次30 s；添加1%双抗的基础Grace 昆虫培养液漂洗2次，每次30 s；再用添加1%双抗及含10%家蚕血清的Grace昆虫培养液漂洗30 s；将生殖腺分别轻置于300 uL含不同壬基酚浓度的目的培养液的培养皿内悬滴培养；以上暴露液和对照液均设置３组平行；在每个装有暴露液和对照液的培养皿内放入4个生殖腺，然后将培养皿用封口膜封口后倒置，25℃光照培养箱中培养，每72 h 换液一次，于0、72、120 h置于倒置显微镜下拍照观察生殖腺生长发育情况；

步骤4）家蚕生殖腺组织病理切片观察：按所述步骤（3）的家蚕生殖腺离体培养120 h后取出，快速浸在4%多聚甲醛中固定24 h，对生殖腺进行石蜡组织切片和HE染色，置于显微镜下拍照观察生殖腺组织病理情况；

步骤5）家蚕生殖腺脂质过氧化产物和抗氧化保护酶活性的测定：具体步骤按照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书操作；

步骤6）家蚕生殖发育相关基因SoxE的mRNA转录水平分析：先用TRIzol试剂提取生殖腺组织RNA，以家蚕生殖腺RNA反转录合成的cDNA为模板，家蚕Rp49基因为内参，采用实时荧光定量PCR （Real-Time PCR）方法（实验仪器为7300 Real Time PCR systems，ABI产品）检测组织中SoxE基因的mRNA转录水平，具体步骤按照TaKaRa公司反转录试剂盒及荧光定量SYBR Prime Script TM RT-PCR 试剂盒说明书操作；

步骤7）数据处理：试验数据采用one way ANVOA和Student’s-Newman-Keuls post hoc tests（SPSS16.0 for Windows软件）进行统计学分析，暴露组与对照组之间的差异采用Duncan检验进行比较。

本发明的实施例：

1、家蚕离体生殖腺培养观察

精巢是雄性家蚕的内部生殖器官。精巢位于雄蚕第5腹节背血管两侧星状纹下，紧贴体腔背侧内表皮，左右一对，呈肾形。凹侧向内，是产生精子的器官。家蚕精巢表面有众多气管丛的分布。家蚕精巢在不同浓度壬基酚暴露下离体培养120 h后，在外部形态结构上没有显著的生长发育变化，也没有出现黑化现象，表明生殖腺的体外培养是成功的。精巢直接暴露于壬基酚，没有对生殖腺形态结构造成损伤如图1所示。

2、家蚕生殖腺组织病理学的观察

正常雄蚕生殖腺是由精原细胞（Spermatogonium）、精母细胞（Spermatooyte）、精子束（Sperm bumdle）、端细胞（Trophocyte）等组成如图2所示。生殖腺的最外面包有一层精巢外膜；外膜内是一层多细胞排列的结缔组织；最内层是一层扁平细胞组成的内膜，内膜内陷成三片隔膜，将生殖腺分成了4个小室。在每个小室底部是漏斗状的精巢基室，顶端有一个大型具大核的端细胞，在端细胞的周围有很多精原细胞。这些精原细胞由端细胞供给营养，精原细胞随着家蚕的生长而通过有丝分裂快速的增殖，逐步发育经过生精囊，初级精母细胞，次级精母细胞，精细胞,有尾的精子。与对照组相比，经壬基酚（7, 14和28 mg L^-1）处理后的家蚕雄性生殖腺组织主要症状是: 精子束数量与对照组相比略有减少，并且在高浓度组（28 mg L^-1），主要观察到精母细胞，精子束的数量很少。

3、家蚕生殖腺脂质过氧化产物和抗氧化酶活性的诱导

随着壬基酚暴露浓度的增加，家蚕生殖腺的抗氧化防御系统（MDA，SOD，CAT）发生明显变化如图3（a）-图3（c）所示。 MDA含量随壬基酚暴露浓度的增加呈现逐步升高的趋势，最高比对照上升了206％，可见精巢直接接触壬基酚后细胞内膜脂过氧化作用强度增加，如3（a）所示。随壬基酚暴露浓度的增加，在14 mg L^-1壬基酚暴露组SOD酶活性最高（P<0.05），随后又急剧下降。总的来说，壬基酚在低浓度时诱导SOD酶活性的升高，但随着精巢细胞MDA含量的增加，其酶活性受到抑制, 如图3（b）所示。CAT酶活性表现出与SOD酶相似的变化趋势。如图3（c）所示，与对照组相比，在7～28 mgL^-1 壬基酚暴露后CAT活性显著升高（P<0.05），随后又急剧下降（P<0.05）。

4、壬基酚暴露家蚕生殖腺中SoxE mRNA转录水平的变化

从家蚕的幼虫期到成虫期，SoxE基因的表达维持在较高水平，SoxE基因与家蚕生殖腺发育及后代育性调节有关。我们调查了培养家蚕生殖腺接触壬基酚后SoxE mRNA的表达水平，由图4可见，在最高浓度28 mg L^-1壬基酚暴露时SoxE的转录水平略有下调，但与对照组差异不显著（P＞0.05）。结果表明离体生殖腺暴露壬基酚对生殖发育特异基因SoxE没有影响。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种用家蚕生殖腺的体外培养来检测壬基酚毒性的方法，其特征在于，包括以下步骤：   

步骤1）家蚕血清的制备：取5龄第6日的家蚕血液至预先冰冻的10 mL离心管内，60℃下静置15-20 min，再用自来水冷却后进行离心(4 000 r min^-1，15 min，4℃)，用0.22 μM微孔滤膜将离心后的上清液过滤灭菌，接着分装至1.5mL的灭菌离心管中在-20℃下保存备用，临用时在水中将其溶解； 

步骤2）含有壬基酚一系列浓度的目的培养液配制：将适量壬基酚溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，获得质量浓度为100 mg L^-1的壬基酚溶液，将此溶液用0.22 μm微孔滤膜过滤后，作为壬基酚原液4℃下保存，基础Grace昆虫培养液中添加1%双抗，10%家蚕血清，分别添加不同体积的壬基酚于基础培养液中，使各目的培养液中壬基酚的最终浓度分别为0，7，14，28 mg L^-1，4℃下保存；

步骤3）家蚕生殖腺体外悬滴培养：选取大小基本一致的家蚕5龄第6日幼虫，用棉或丝线结扎头尾，置于预冷的75%乙醇中浸泡5 min，无菌水漂洗3次，每次30 s，在超净台内用解剖刀剖开蚕体腹部，用弯头镊子分别取出一对生殖腺；解剖镜下用弯头镊子快速除去脂肪后，依次用预冷灭菌的0.86%氯化钠在无菌细胞培养皿中漂洗生殖腺2次，每次30 s；添加1%双抗的基础Grace 昆虫培养液漂洗2次，每次30 s；再用添加1%双抗及含10%家蚕血清的Grace昆虫培养液漂洗30 s；将生殖腺分别轻置于300 uL含不同壬基酚浓度的目的培养液的培养皿内悬滴培养；以上暴露液和对照液均设置３组平行；在每个装有暴露液和对照液的培养皿内放入4个生殖腺，然后将培养皿用封口膜封口后倒置，25℃光照培养箱中培养，每72 h 换液一次，于0、72、120 h置于倒置显微镜下拍照观察生殖腺生长发育情况；

步骤4）家蚕生殖腺组织病理切片观察：按所述步骤（3）的家蚕生殖腺离体培养120 h后取出，快速浸在4%多聚甲醛中固定24 h，对生殖腺进行石蜡组织切片和HE染色，置于显微镜下拍照观察生殖腺组织病理情况；

步骤5）家蚕生殖腺脂质过氧化产物和抗氧化保护酶活性的测定：具体步骤按照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书操作；

步骤6）家蚕生殖发育相关基因SoxE的mRNA转录水平分析：先用TRIzol试剂提取生殖腺组织RNA，以家蚕生殖腺RNA反转录合成的cDNA为模板，家蚕Rp49基因为内参，采用实时荧光定量PCR （Real-Time PCR）方法（实验仪器为7300 Real Time PCR systems，ABI产品）检测组织中SoxE基因的mRNA转录水平，具体步骤按照TaKaRa公司反转录试剂盒及荧光定量SYBR Prime Script TM RT-PCR 试剂盒说明书操作；

步骤7）数据处理：试验数据采用one way ANVOA和Student’s-Newman-Keuls post hoc tests（SPSS16.0 for Windows软件）进行统计学分析，暴露组与对照组之间的差异采用Duncan检验进行比较。

Images