CN105319343A - 一种利用斑马鱼胚胎致畸率进行低剂量伽马辐射生物预警的方法 - Google Patents
一种利用斑马鱼胚胎致畸率进行低剂量伽马辐射生物预警的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种利用斑马鱼胚胎致畸率进行低剂量伽马辐射生物预警的方法。利用斑马鱼胚胎对低剂量伽马辐射敏感的特性，根据斑马鱼胚胎接受的辐射剂量与致畸率之间的剂量-效应关系，通过计算不同低剂量伽马辐射剂量条件下斑马鱼胚胎的致畸率，来评估低剂量伽马辐射对斑马鱼胚胎的综合毒性作用，建立生物预警方法。该方法具有操作简便快速、成本低廉、灵敏度高、准确性好、环境风险小等多重优点。
Description
技术领域
本发明属于低剂量伽马辐射生物预警的技术领域，具体涉及一种利用斑马鱼胚胎致畸率进行低剂量伽马辐射生物预警的方法。
背景技术
铀尾矿和废矿石中的放射性核素既可以素释放出的各种射线通过电离和激发作用，对生物引起辐射损伤，也可进入生物体可造成内照射损伤，对周边环境中的生物，包括微生物、动植物、人类造成长期的潜在低剂量辐射危害。放射性核素被动物和人体吸收富集后，其电离辐射会引起生物组织内分子和原子电离，破坏组织中的大分子结构，威胁健康。电离辐射造成的损伤方式可以是急性的，但多数情况下表现为慢性和隐性，具有远期效应和遗传效应，往往不易察觉，所以必须进行辐射预警，防患于未然。而传统的低剂量辐射检测手段无法快速、有效、全面地应对各种复杂的辐射污染状况，对低剂量辐射综合毒理进行评估和预警，迫切需要一种快速、灵敏、低成本检测环境毒性的生物检测和预警方法。生物预警技术能更真实地反映环境污染的客观状况，具有时效性和综合性，是其他监测手段无法比拟的。因此，建立一套快速、高效、准确的低剂量辐射检测方法，并建立生物预警体系，实现对铀尾矿库及周边环境低剂量辐射实时的连续监测和评估，是我国铀矿冶工业可持续发展的最紧迫的任务之一。
斑马鱼（Daniorerio）作为一种新型模式生物，具有产卵周期短、产卵量大、体外受精、体外发育及胚胎发育初期透明易于观察等特点，近年来已被广泛应用于化学混合物的急性慢性毒性检测、药物筛选以及生态毒理学检测等。利用斑马鱼胚胎来研究水溶性污染物的毒理效应是当今最常用的方法之一。在德国,斑马鱼胚胎已经作为水质检测的标准模式生物,取代了传统上用成鱼进行的毒理学试验。在辐射损伤与辐射防护研究领域，斑马鱼及其胚胎也已经被用于辐射防护药物的筛选及机理研究。本发明专利利用斑马鱼胚胎对伽马辐射敏感的特性，且斑马鱼胚胎的致畸率与伽马辐射强度存在着剂量-效应关系，采用斑马鱼胚胎致畸率对低剂量伽马辐射的危害进行检测和综合评价，并进行生物预警。
发明内容
针对上述情况，本发明提供一种用斑马鱼胚胎致畸率对低剂量辐射进行生物预警的方法。本发明利用斑马鱼胚胎对低剂量伽马辐射敏感的特性，根据斑马鱼胚胎接受的辐射剂量与致畸率之间的剂量-效应关系，通过计算斑马鱼胚胎致畸率，评估低剂量辐射对斑马鱼胚胎的综合毒性作用，建立生物预警方法。该方法具有操作简便快速、成本低廉、灵敏度高、准确性好、环境风险小等多重优点。
具体步骤是：
（1）受精卵的采集；
（2）受精卵的培养；
（3）伽马射线辐照；
（4）受精卵的孵化；
（5）计算致畸率；
（6）综合评价，并进行生物预警。
其进一步的措施是：
所述的受精卵的采集的方法是：
采用5~6月龄的斑马鱼进行繁殖产卵。在交配前2d将斑马鱼雌雄分群养在不同的饲养缸中，繁殖产卵的前夜，将雌雄亲鱼按照1∶2的比例放入同一交配装置中，雌雄鱼之间用挡板隔开。控制光照周期为14∶10（光照14h，黑暗10h），黑暗10h后，将雌雄亲鱼之间的隔板拿开，雄鱼会追逐雌鱼，并用身体冲撞雌鱼的腹部，此时雄鱼排精，雌鱼开始产卵。等产卵结束后，将亲鱼放回各自的饲养缸内，用吸管轻轻地将产卵装置中的粪便及呈白色的死卵除尽，并用孵化液及时冲洗盒内的受精卵，在孵化液中加入几滴1‰的亚甲基蓝溶液预防鱼卵被细菌感染。孵化液主要配方是10L蒸馏水、0.127gKCl、2.867gNaCl、0.817gMgSO4·7H2O、0.365g无水CaCl2。
所述的受精卵的培养的方法是：
收集的斑马鱼受精卵冲洗干净后，放入细胞培养板12孔板中培养，每孔5枚受精卵，每板放10孔共计50个胚胎。采用2mL的吸管对受精卵进行移动,移动时对受精卵的震动不能太大。在12孔板中倒入10mL的孵化液,在28℃±0.5℃的温度条件下进行培养。
所述的伽马射线辐照的方法是：
待斑马鱼受精卵培养至5.5h，此时受精卵处于原肠胚初期，将斑马鱼受精卵接受辐照剂量为0.01-10Gy伽马射线辐射，采用转动12孔板和移动辐照源相结合的方式保证斑马鱼受精卵均匀辐照。
所述的受精卵的孵化的方法是：
将辐照后的斑马鱼胚胎放入28℃的恒温培养箱中培养，控制培养箱的光照周期为14∶10。每5～6h换1/2的孵化液，定期观察，随时剔除死卵。待斑马鱼受精卵培养至36h时，斑马鱼幼体开始破膜孵出。
所述的计算致畸率的方法是：
斑马鱼幼体开始破膜孵出时，采用显微镜观察斑马鱼幼体，记录斑马鱼幼体畸形数，畸形主要表现为脊柱弯曲、胸腔发育不良和心包囊水肿，直至斑马鱼受精卵培养至72h时，斑马鱼幼体畸形数统计结束。按照公式（1）计算致畸率。
（1）
所述的综合评价，并进行生物预警的方法是：
按照公式（1）计算斑马鱼胚胎的致畸率，来评估低剂量伽马辐照对斑马鱼胚胎的综合毒性，当斑马鱼胚胎致畸率大于1%而小于5%时，此时的低剂量伽马辐射的危害等级Ⅰ级；当斑马鱼胚胎的致畸率大于5%而小于10%时，此时的低剂量伽马辐射的危害等级Ⅱ级；当斑马鱼胚胎的致畸率大于10%而小于20%时，此时的低剂量伽马辐射的危害等级Ⅲ级；当斑马鱼胚胎的致畸率大于20%而小于30%时，此时的低剂量伽马辐射的危害等级Ⅳ级；当斑马鱼胚胎的致畸率大于30%时，此时的低剂量伽马辐射的危害等级Ⅴ级。最后，根据低剂量辐射的危害等级进行生物预警。
本发明利用斑马鱼胚胎对低剂量伽马辐射敏感的特性，根据斑马鱼胚胎接受的辐射剂量与致畸率之间的剂量-效应关系，通过计算斑马鱼胚胎致畸率，评估低剂量伽马辐射对斑马鱼胚胎的综合毒性作用，建立生物预警方法。该方法具有操作简便快速、成本低廉、灵敏度高、准确性好、环境风险小等多重优点。解决了现有的评估低剂量伽马辐射效应方法，所需周期长、操作复杂、成本高、特异性不强等难题。
本专利发明的一种用斑马鱼胚胎致畸率对低剂量伽马辐射进行生物预警的方法，与现有技术方法相比，具有以下技术优势：
（1）所选用的斑马鱼取材方便，价格便宜。
（2）该方法所需时间短，72h内即可得低剂量伽马辐射的综合毒性效应评估结果。
（3）该方法操作简便、成本低、所需仪器设备简单。
（4）该方法灵敏度高、准确性好、环境风险小。
具体实施方法
下面将对本发明作进一步说明。
Ⅰ材料组成
成年的斑马鱼雌雄鱼，玻璃鱼缸，12孔板，孵化液，1‰的亚甲基蓝溶液，显微镜，伽马辐照源。
Ⅱ实施方法
采用5~6月龄的斑马鱼进行繁殖产卵。在交配前2d将斑马鱼雌雄分群养在不同的饲养缸中，繁殖产卵的前夜，将雌雄亲鱼按照1∶2的比例放入同一交配装置中，雌雄鱼之间用挡板隔开。控制光照周期为14∶10（光照14h，黑暗10h），黑暗10h后，将雌雄亲鱼之间的隔板拿开，雄鱼会追逐雌鱼，并用身体冲撞雌鱼的腹部，此时雄鱼排精，雌鱼开始产卵。收集的斑马鱼受精卵冲洗干净后，放入细胞培养板12孔板中培养，每孔5枚受精卵，每板放10孔共计50个胚胎。在12孔板中倒入10mL的孵化液,在28℃±0.5℃的温度条件下进行培养。待斑马鱼受精卵培养至5.5h，此时受精卵处于原肠胚初期，将斑马鱼受精卵接受辐照剂量为0.01-10Gy伽马射线辐射，采用转动12孔板和移动辐照源相结合的方式保证斑马鱼受精卵均匀辐照。将辐照后的斑马鱼胚胎放入28℃的恒温培养箱中培养，控制培养箱的光照周期为14∶10。每5～6h换1/2的孵化液，定期观察，随时剔除死卵。待斑马鱼受精卵培养至36h时，斑马鱼幼体开始破膜孵出。斑马鱼幼体开始破膜孵出时，采用显微镜观察斑马鱼幼体，记录斑马鱼幼体畸形数，直至斑马鱼受精卵培养至72h时，斑马鱼幼体畸形数统计结束。按照公式（1）计算致畸率。
（1）
根据斑马鱼胚胎的畸形率来评估低剂量伽马辐照对斑马鱼胚胎的综合毒性，当斑马鱼胚胎致畸率大于1%而小于5%时，此时的低剂量伽马辐射的危害等级Ⅰ级；当斑马鱼胚胎的致畸率大于5%而小于10%时，此时的低剂量伽马辐射的危害等级Ⅱ级；当斑马鱼胚胎的致畸率大于10%而小于20%时，此时的低剂量伽马辐射的危害等级Ⅲ级；当斑马鱼胚胎的致畸率大于20%而小于30%时，此时的低剂量伽马辐射的危害等级Ⅳ级；当斑马鱼胚胎的致畸率大于30%时，此时的低剂量伽马辐射的危害等级Ⅴ级。最后，根据低剂量辐射的危害等级进行生物预警。
Ⅲ实施例
实施例1
采用6月龄的斑马鱼进行繁殖产卵。在交配前2d将斑马鱼雌雄分群养在不同的饲养缸中，繁殖产卵的前夜，将雌雄亲鱼按照1∶2的比例放入同一交配装置中，雌雄鱼之间用挡板隔开。控制光照周期为14∶10（光照14h，黑暗10h），黑暗10h后，将雌雄亲鱼之间的隔板拿开，雄鱼会追逐雌鱼，并用身体冲撞雌鱼的腹部，此时雄鱼排精，雌鱼开始产卵。收集的斑马鱼受精卵冲洗干净后，放入细胞培养板12孔板中培养，每孔5枚受精卵，每板放10孔共计50个胚胎。在12孔板中倒入10mL的孵化液,在28℃±0.5℃的温度条件下进行培养。待斑马鱼受精卵培养至5.5h，此时受精卵处于原肠胚初期，将斑马鱼受精卵接受辐照剂量为0.01Gy伽马射线辐射，采用转动12孔板和移动辐照源相结合的方式保证斑马鱼受精卵均匀辐照。将辐照后的斑马鱼胚胎放入28℃的恒温培养箱中培养，控制培养箱的光照周期为14∶10。每6h换1/2的孵化液，定期观察，随时剔除死卵。待斑马鱼受精卵培养至36h时，斑马鱼幼体开始破膜孵出。斑马鱼幼体开始破膜孵出时，采用显微镜观察斑马鱼幼体，记录斑马鱼幼体畸形数，直至斑马鱼受精卵培养至72h时，斑马鱼幼体畸形数统计结束。按照公式（1）计算致畸率，此时，计算出致畸率为2%，低剂量伽马辐射的危害等级级，可以进行低剂量伽马辐射危害级生物预警。
（1）
实施例2
采用6月龄的斑马鱼进行繁殖产卵。在交配前2d将斑马鱼雌雄分群养在不同的饲养缸中，繁殖产卵的前夜，将雌雄亲鱼按照1∶2的比例放入同一交配装置中，雌雄鱼之间用挡板隔开。控制光照周期为14∶10（光照14h，黑暗10h），黑暗10h后，将雌雄亲鱼之间的隔板拿开，雄鱼会追逐雌鱼，并用身体冲撞雌鱼的腹部，此时雄鱼排精，雌鱼开始产卵。收集的斑马鱼受精卵冲洗干净后，放入细胞培养板12孔板中培养，每孔5枚受精卵，每板放10孔共计50个胚胎。在12孔板中倒入10mL的孵化液,在28℃±0.5℃的温度条件下进行培养。待斑马鱼受精卵培养至5.5h，此时受精卵处于原肠胚初期，将斑马鱼受精卵接受辐照剂量为0.2Gy伽马射线辐射，采用转动12孔板和移动辐照源相结合的方式保证斑马鱼受精卵均匀辐照。将辐照后的斑马鱼胚胎放入28℃的恒温培养箱中培养，控制培养箱的光照周期为14∶10。每6h换1/2的孵化液，定期观察，随时剔除死卵。待斑马鱼受精卵培养至36h时，斑马鱼幼体开始破膜孵出。斑马鱼幼体开始破膜孵出时，采用显微镜观察斑马鱼幼体，记录斑马鱼幼体畸形数，直至斑马鱼受精卵培养至72h时，斑马鱼幼体畸形数统计结束。按照公式（1）计算致畸率，此时，计算出致畸率为8%，低剂量伽马辐射的危害等级Ⅱ级，可以进行低剂量伽马辐射危害Ⅱ级生物预警。
（1）
实施例3
采用6月龄的斑马鱼进行繁殖产卵。在交配前2d将斑马鱼雌雄分群养在不同的饲养缸中，繁殖产卵的前夜，将雌雄亲鱼按照1∶2的比例放入同一交配装置中，雌雄鱼之间用挡板隔开。控制光照周期为14∶10（光照14h，黑暗10h），黑暗10h后，将雌雄亲鱼之间的隔板拿开，雄鱼会追逐雌鱼，并用身体冲撞雌鱼的腹部，此时雄鱼排精，雌鱼开始产卵。收集的斑马鱼受精卵冲洗干净后，放入细胞培养板12孔板中培养，每孔5枚受精卵，每板放10孔共计50个胚胎。在12孔板中倒入10mL的孵化液,在28℃±0.5℃的温度条件下进行培养。待斑马鱼受精卵培养至5.5h，此时受精卵处于原肠胚初期，将斑马鱼受精卵接受辐照剂量为1.0Gy伽马射线辐射，采用转动12孔板和移动辐照源相结合的方式保证斑马鱼受精卵均匀辐照。将辐照后的斑马鱼胚胎放入28℃的恒温培养箱中培养，控制培养箱的光照周期为14∶10。每6h换1/2的孵化液，定期观察，随时剔除死卵。待斑马鱼受精卵培养至36h时，斑马鱼幼体开始破膜孵出。斑马鱼幼体开始破膜孵出时，采用显微镜观察斑马鱼幼体，记录斑马鱼幼体畸形数，直至斑马鱼受精卵培养至72h时，斑马鱼幼体畸形数统计结束。按照公式（1）计算致畸率，此时，计算出致畸率为16%，低剂量伽马辐射的危害等级Ⅲ级，可以进行低剂量伽马辐射危害Ⅲ级生物预警。
（1）
实施例4
采用6月龄的斑马鱼进行繁殖产卵。在交配前2d将斑马鱼雌雄分群养在不同的饲养缸中，繁殖产卵的前夜，将雌雄亲鱼按照1∶2的比例放入同一交配装置中，雌雄鱼之间用挡板隔开。控制光照周期为14∶10（光照14h，黑暗10h），黑暗10h后，将雌雄亲鱼之间的隔板拿开，雄鱼会追逐雌鱼，并用身体冲撞雌鱼的腹部，此时雄鱼排精，雌鱼开始产卵。收集的斑马鱼受精卵冲洗干净后，放入细胞培养板12孔板中培养，每孔5枚受精卵，每板放10孔共计50个胚胎。在12孔板中倒入10mL的孵化液,在28℃±0.5℃的温度条件下进行培养。待斑马鱼受精卵培养至5.5h，此时受精卵处于原肠胚初期，将斑马鱼受精卵接受辐照剂量为1.8Gy伽马射线辐射，采用转动12孔板和移动辐照源相结合的方式保证斑马鱼受精卵均匀辐照。将辐照后的斑马鱼胚胎放入28℃的恒温培养箱中培养，控制培养箱的光照周期为14∶10。每6h换1/2的孵化液，定期观察，随时剔除死卵。待斑马鱼受精卵培养至36h时，斑马鱼幼体开始破膜孵出。斑马鱼幼体开始破膜孵出时，采用显微镜观察斑马鱼幼体，记录斑马鱼幼体畸形数，直至斑马鱼受精卵培养至72h时，斑马鱼幼体畸形数统计结束。按照公式（1）计算致畸率，此时，计算出致畸率为24%，低剂量伽马辐射的危害等级Ⅳ级，可以进行低剂量伽马辐射危害Ⅳ级生物预警。
（1）
实施例5
采用6月龄的斑马鱼进行繁殖产卵。在交配前2d将斑马鱼雌雄分群养在不同的饲养缸中，繁殖产卵的前夜，将雌雄亲鱼按照1∶2的比例放入同一交配装置中，雌雄鱼之间用挡板隔开。控制光照周期为14∶10（光照14h，黑暗10h），黑暗10h后，将雌雄亲鱼之间的隔板拿开，雄鱼会追逐雌鱼，并用身体冲撞雌鱼的腹部，此时雄鱼排精，雌鱼开始产卵。收集的斑马鱼受精卵冲洗干净后，放入细胞培养板12孔板中培养，每孔5枚受精卵，每板放10孔共计50个胚胎。在12孔板中倒入10mL的孵化液,在28℃±0.5℃的温度条件下进行培养。待斑马鱼受精卵培养至5.5h，此时受精卵处于原肠胚初期，将斑马鱼受精卵接受辐照剂量为10Gy伽马射线辐射，采用转动12孔板和移动辐照源相结合的方式保证斑马鱼受精卵均匀辐照。将辐照后的斑马鱼胚胎放入28℃的恒温培养箱中培养，控制培养箱的光照周期为14∶10。每6h换1/2的孵化液，定期观察，随时剔除死卵。待斑马鱼受精卵培养至36h时，斑马鱼幼体开始破膜孵出。斑马鱼幼体开始破膜孵出时，采用显微镜观察斑马鱼幼体，记录斑马鱼幼体畸形数，直至斑马鱼受精卵培养至72h时，斑马鱼幼体畸形数统计结束。按照公式（1）计算致畸率，此时，计算出致畸率为100%，低剂量伽马辐射的危害等级级，可以进行低剂量伽马辐射危害Ⅴ级生物预警。
（1）
以上仅仅是本发明的较佳实施方式，根据本发明的上述构思，本领域的熟练人员还可对此作出各种修改和变换。例如，变换辐射射线的类型、变换斑马鱼的种类、斑马鱼胚胎的培养时间和孵化时间、调整辐射剂量率、采用不同辐射时间和辐射剂量、变换综合毒性评价体系等等。然而，类似的这种变换和修改均属于本发明的实质。
Claims (1)
1.一种利用斑马鱼胚胎致畸率进行低剂量伽马辐射生物预警的方法，利用斑马鱼胚胎对低剂量伽马辐射敏感的特性，根据斑马鱼胚胎接受的辐射剂量与致畸率之间的剂量-效应关系，通过计算斑马鱼胚胎致畸率，评估低剂量辐射对斑马鱼胚胎的综合毒性作用，建立生物预警，其特征在于，
具体步骤是：
（1）受精卵的采集；
（2）受精卵的培养；
（3）伽马射线辐照；
（4）受精卵的孵化；
（5）计算致畸率；
（6）综合评价，并进行生物预警；
所述的受精卵的采集的具体是：
采用5~6月龄的斑马鱼进行繁殖产卵，在交配前2d将斑马鱼雌雄分群养在不同的饲养缸中，繁殖产卵的前夜，将雌雄亲鱼按照1∶2的比例放入同一交配装置中，雌雄鱼之间用挡板隔开，控制光照周期为14∶10，光照14h，黑暗10h，黑暗10h后，将雌雄亲鱼之间的隔板拿开，雄鱼会追逐雌鱼，并用身体冲撞雌鱼的腹部，此时雄鱼排精，雌鱼开始产卵，等产卵结束后，将亲鱼放回各自的饲养缸内，用吸管轻轻地将产卵装置中的粪便及呈白色的死卵除尽，并用孵化液及时冲洗盒内的受精卵，在孵化液中加入几滴1‰的亚甲基蓝溶液预防鱼卵被细菌感染，孵化液主要配方是10L蒸馏水、0.127gKCl、2.867gNaCl、0.817gMgSO4·7H2O、0.365g无水CaCl2；
所述的受精卵的培养的方法是：
收集的斑马鱼受精卵冲洗干净后，放入细胞培养板12孔板中培养，每孔5枚受精卵，每板放10孔共计50个胚胎，采用2mL的吸管对受精卵进行移动,移动时对受精卵的震动不能太大，在12孔板中倒入10mL的孵化液,在28℃±0.5℃的温度条件下进行培养，
所述的伽马射线辐照的方法是：
待斑马鱼受精卵培养至5.5h，此时受精卵处于原肠胚初期，将斑马鱼受精卵接受辐照剂量为0.01-10Gy伽马射线辐射，采用转动12孔板和移动辐照源相结合的方式保证斑马鱼受精卵均匀辐照；
所述的受精卵的孵化的方法是：
将辐照后的斑马鱼胚胎放入28℃的恒温培养箱中培养，控制培养箱的光照周期为14∶10，每5～6h换1/2的孵化液，定期观察，随时剔除死卵，待斑马鱼受精卵培养至36h时，斑马鱼幼体开始破膜孵出；
所述的计算致畸率的方法是：
斑马鱼幼体开始破膜孵出时，采用显微镜观察斑马鱼幼体，记录斑马鱼幼体畸形数，畸形主要表现为脊柱弯曲、胸腔发育不良和心包囊水肿，直至斑马鱼受精卵培养至72h时，斑马鱼幼体畸形数统计结束，按照公式（1）计算致畸率，
（1）
所述的综合评价，并进行生物预警的方法是：
按照公式（1）计算斑马鱼胚胎的致畸率，来评估低剂量伽马辐照对斑马鱼胚胎的综合毒性，当斑马鱼胚胎致畸率大于1%而小于5%时，此时的低剂量伽马辐射的危害等级级；当斑马鱼胚胎的致畸率大于5%而小于10%时，此时的低剂量伽马辐射的危害等级级；当斑马鱼胚胎的致畸率大于10%而小于20%时，此时的低剂量伽马辐射的危害等级级；当斑马鱼胚胎的致畸率大于20%而小于30%时，此时的低剂量伽马辐射的危害等级级；当斑马鱼胚胎的致畸率大于30%时，此时的低剂量伽马辐射的危害等级级，
最后，根据低剂量辐射的危害等级进行生物预警。
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| CN110196320A (zh) * | 2019-06-27 | 2019-09-03 | 南华大学 | 一种利用异柠檬酸脱氢酶2评价低剂量伽马射线辐照生物损伤的方法 |
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| CN105319343B (zh) | 2018-06-19 |
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