CN109022346B - 一种海洋无脊椎动物细胞培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种海洋无脊椎动物细胞培养基，该培养基包括基础培养基和天然培养基，所述的天然培养基为海参体腔液。海参体腔液来自于海洋无脊椎动物，能够为海洋无脊椎动物细胞系营造与机体更为相似的生长环境，从而海洋无脊椎动物细胞系能够充分利用海参体腔液中所含的丰富营养物质，实现快速增长、稳定传代的目的。本申请开发经济水产动物海参的加工副产物体腔液生物质资源，制备了可替代血清应用的海参体腔液，适用于海洋无脊椎动物细胞的长期培养，不仅为海洋无脊椎动物细胞培养提供支持，而且还实现了废物利用，海参体腔液的制备成本远远低于牛血清的制备成本，从而也大大降低了海洋无脊椎动物细胞培养基的制备成本。

Description

一种海洋无脊椎动物细胞培养基
技术领域
本发明属于海洋无脊椎动物细胞培养技术领域，具体涉及一种海洋无脊椎动物细胞培养基。
背景技术
目前动物细胞培养基的组成成分主要包括基础培养基、天然培养基(一般是血清)以及细胞因子等其他调控成分，其中血清是细胞培养中必不可少的营养及细胞调控因子来源。目前用于培养陆地哺乳动物、昆虫等细胞的培养基已经比较成熟，但海洋无脊椎动物细胞与陆地动物细胞之间存在物种差异，并且海洋无脊椎动物所生存的海水环境也会导致细胞对生存环境的要求有较大差异，因此导致海洋无脊椎动物细胞的培养条件与目前成熟的陆地哺乳动物、昆虫等细胞的培养条件差异较大，而目前尚未形成稳定有效、可用于长期传代培养操作的培养基配方，传统陆地动物细胞培养基中的血清成分无法较好地应用于海洋无脊椎动物细胞的培养。
申请号为CN201510808386.3的中国发明专利申请公开了一种培养单环刺螠担轮幼虫细胞系的培养基，以1L计量，该培养基由以下组分组成：13.7g L-15培养基干粉，20.2g/l NaCl、0.54g/l KCl、0.60g/l CaCl2、1g/l MgSO4、3.9g/l MgCl2、2.92g/l L-谷氨酰胺，以及总体积5％的胎牛血清、2％的单环刺螠体腔液、1％的单环刺螠卵黄提取液，终浓度100IU/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素。
该培养基中虽然使用了单环刺螠体腔液作为营养及细胞调控因子，使得该培养基比传统动物细胞培养基更加适用于培养单环刺螠担轮幼虫细胞系，但该培养基仍存在以下缺陷：(1)培养基中仍旧需要使用胎牛血清，且胎牛血清的使用量比单环刺螠体腔液还要大得多，表明该培养基虽然不能很好地利用胎牛血清但仍对胎牛血清具有较大依赖性，没有真正地获得适用于海洋无脊椎动物的稳定有效培养基；同时，胎牛血清价格昂贵，但却没有得到充分利用，造成了较大浪费；(2)该培养基只能用于培养单环刺螠担轮幼虫细胞系，对其他海洋无脊椎动物不适用，适用面窄；(3)其中的单环刺螠体腔液经收集后仅经过离心和滤膜过滤处理，而没有除去其中含有的免疫分子，而免疫分子如果直接加入培养基中极有可能会对培养对象造成损伤。
发明内容
本申请的发明目的是提供一种稳定有效、可用于长期传代培养操作的海洋无脊椎动物细胞培养基。
为实现上述发明目的，本申请的技术方案如下：
一种海洋无脊椎动物细胞培养基，包括基础培养基和天然培养基，所述的天然培养基为海参体腔液。
本申请针对海洋无脊椎动物细胞与陆地生物细胞之间的巨大差异性，不再选择牛血清作为天然培养基，而是采用海参体腔液作为天然培养基。与牛血清相比，海参体腔液来自于海洋无脊椎动物，能够为海洋无脊椎动物细胞系营造与机体(即离体细胞系来源)更为相似的生长环境，从而海洋无脊椎动物细胞系能够充分利用海参体腔液中所含的丰富营养物质，实现快速增长、稳定传代的目的。
本申请开发经济水产动物海参的加工副产物体腔液生物质资源，通过一系列加工处理，制备了用于培养海洋无脊椎动物细胞的天然培养基，可替代血清应用，并且适用于海洋无脊椎动物细胞的长期培养，不仅为海洋无脊椎动物细胞培养提供支持，具有很高的科学价值和经济价值；而且还实现了废物利用，海参体腔液的制备成本远远低于牛血清的制备成本，从而也大大降低了海洋无脊椎动物细胞培养基的制备成本。
在上述的海洋无脊椎动物细胞培养基中，所述的海参体腔液由以下方法制备而成：
(1)选取健康的海参，收集体腔原液；
所述的海参可以是刺参或梅花参，这两种海参都是经济类产品，易于获取，能够将海参体腔液的制作成本控制在较低的水平。
(2)去除所述的体腔原液中的免疫分子、细胞和微生物，获得体腔液预处理液；
首选，去除体腔原液中天然存在的免疫分子是为了确保海参体腔液中不含具有杀伤性的免疫因子，对后期培养细胞无伤害。
本申请中，所述的免疫分子主要是指补体和凝集素；作为优选，免疫分子的去除方式为：将所述的体腔原液置于40-50℃水浴中，孵育20-40min，获得补体失活的体腔原液；将补体失活的体腔原液快递冷却至20℃，向体腔原液中加入外源性红细胞，静置1.5-2.5h，获得已去除凝集素的体腔原液。
孵育温度不宜过高，以防止对体腔原液中的功能活性成分造成破坏；孵育时间不宜过长，以防止细菌等病原生物滋生繁衍。
作为进一步优选，所述的外源性红细胞的终浓度为0.1-5.0％(质量百分数)。
所述的外源性红细胞可以选择绵羊红细胞。其次，体腔原液中仍含有一些内源性细胞以及外源性细胞(包括上述为了去除凝集素添加的外源性红细胞)，这部分细胞也要去除。作为优选，将已去除免疫分子的体腔原液在1500-4000r/min下离心2-8min，去沉淀，获得已去除细胞的体腔原液。离心速度不宜过高，以防止细胞成分破损导致胞内成分溢出，对培养基成分造成影响。
离心处理去除细胞的同时，也会去除体腔原液中含有的固体颗粒。
最后，体腔原液中还含有一些本身携带的微生物(包括细菌、支原体、衣原体等)，在解剖采集、去除免疫分子和细胞的过程中也有沾染微生物的风险，因此本申请在最后去除体腔原液中的微生物。
作为优选，采用超滤膜去除体腔原液中的微生物。超滤膜不仅具有良好的微生物去除效果，而且不会对体腔原液本身的培养基功能造成任何影响。所选择的超滤膜的膜孔径应足够过滤支原体、衣原体等微小的病原体成分，但不会或较少对体腔原液中的功能性蛋白成分产生较大的滤除作用。
作为进一步优选，将已去除细胞的体腔原液依次采用孔径为0.22μm的无菌超细膜、孔径为0.1μm的无菌超细膜过滤，获得所述的体腔液预处理液。
(3)将所述的体腔液预处理液的盐度调整至与基础培养基相一致，获得所述的海参体腔液。
本申请的培养基用于培养海洋无脊椎动物细胞，因此海参体腔液与基础培养基在使用前均需要调整渗透压和盐度水平，以与待培养对象的生长环境要求相一致。
在上述的海洋无脊椎动物细胞培养基中，海参体腔液与基础培养基的体积比为(0.1-2.0)：1；作为优选，海洋无脊椎动物细胞培养基中海参体腔液的体积分数为30-50％。与胎牛血清相比，海洋无脊椎动物细胞对海参体腔液的适应性更强，添加海参体腔液的培养基能够获得比添加胎牛血清的培养基更好的培养细胞状态。海参体腔液本身的营养物质虽较为丰富但并不全面，需要与基础培养基搭配使用；海洋无脊椎动物细胞培养基中，海参体腔液和基础培养基的占比过高或过低均不能获得营养元素配比均衡的海洋无脊椎动物细胞培养基。
在上述的海洋无脊椎动物细胞培养基中，所述的基础培养基中至少含有碳源、氨基酸、无机离子和维生素；
以1L基础培养基计，所述的基础培养基中含有0.5-10.0g碳源，所述的氨基酸至少包括L-谷氨酰胺、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸，所述的无机离子至少包括钠、钾、镁和钙；所述的维生素至少包括维生素B、维生素E。
在上述的海洋无脊椎动物细胞培养基中，所述的基础培养基中还含有抗生素、激素和细胞因子；
以1L基础培养基计，所述的抗生素至少包括氨苄青霉素，所述的激素至少包括胰岛素，所述的细胞因子至少包括生长因子。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本申请针对海洋无脊椎动物细胞与陆地生物细胞之间的巨大差异性，不再选择牛血清作为天然培养基，而是采用海参体腔液作为天然培养基。与牛血清相比，海参体腔液来自于海洋无脊椎动物，能够为海洋无脊椎动物细胞系营造与机体(即离体细胞系来源)更为相似的生长环境，从而海洋无脊椎动物细胞系能够充分利用海参体腔液中所含的丰富营养物质，实现快速增长、稳定传代的目的。
(2)本申请开发经济水产动物海参的加工副产物体腔液生物质资源，通过一系列加工处理，制备了用于培养海洋无脊椎动物细胞的天然培养基，可替代血清应用，并且适用于海洋无脊椎动物细胞的长期培养，不仅为海洋无脊椎动物细胞培养提供支持，具有很高的科学价值和经济价值；而且还实现了废物利用，海参体腔液的制备成本远远低于牛血清的制备成本，从而也大大降低了海洋无脊椎动物细胞培养基的制备成本。
附图说明
图1为采用本发明的海洋无脊椎动物细胞培养基培养刺参肠道细胞的显微观察图；
图2为采用本发明的海洋无脊椎动物细胞培养基培养曼氏无针乌贼肝脏细胞的显微观察图；
图3为采用本发明的海参体腔液培养刺参肠道细胞的显微观察图；
图4为采用含胎牛血清的培养基培养刺参肠道细胞的显微观察图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案做进一步详细说明。
实施例1
本实施例一种海参体腔液，其制备方法包括以下步骤：
(1)收集：于洁净无菌条件下，取正常生长状态的成体刺参(湿重85-105g)，解剖并收集刺参体腔原液1L，存于无菌玻璃烧瓶中；
(2)补体灭活：将存有刺参体腔原液的无菌玻璃烧瓶置于45℃水浴锅中，静置孵育30min，获得补体灭活的刺参体腔原液；
(3)凝集素去除：快速冷却孵育后的刺参体腔原液，恢复温度至20℃后，添加50％浓度绵羊红细胞溶液(生理盐水溶剂)，调节至绵羊红细胞的终浓度为1％，常温静置2h，获得已去除凝集素的刺参体腔原液；
(4)去除细胞：使用离心机2000rpm离心5min，取上清溶液，存于新的无菌玻璃烧瓶，获得已去除细胞的刺参体腔原液；
(5)去除微生物：先采用0.22μm孔径无菌超细膜过滤去除细菌及衣原体，再采用0.1μm孔径无菌超细膜过滤去除支原体及其他细微颗粒，获得刺参体腔预处理液；
(6)盐度调整：通过添加无菌并经0.1μm过滤除菌的20％高浓度NaCL溶液调整体腔预处理液的盐度至30‰，获得刺参体腔液；将刺参体腔液灌装至无菌瓶中密封包装，4℃冷藏保存备用。
通过对刺参体腔预处理液进行不同程度的盐度调整，获得具有不同盐度的刺参体腔液，可以适用于不同的海洋无脊椎动物细胞的培养；本实施例获得的刺参体腔液可用于培养刺参或曼氏无针乌贼细胞。
实施例2
本实施例一种海洋无脊椎动物细胞培养基，包括基础培养基和实施例1制备的海参体腔液，其中，基础培养基和海参体腔液的体积比为1:1。其配方为：
氨基酸：甘氨酸0.40g，L-丙氨酸0.50g，L-精氨酸1.1g，L-天门冬酰胺0.5g，L-半胱氨酸0.30g，L-谷氨酰胺0.80g，L-组氨酸盐0.50g，L-异亮氨酸0.50g，L-亮氨酸0.25g，L-赖氨酸盐酸盐0.20g，L-蛋氨酸0.15g，L-苯丙氨酸0.25g，L-丝氨酸0.4g，L-苏氨酸1.00g，L-色氨酸0.05g，L-酪氨酸0.60g，L-缬氨酸0.40g，L-甲硫氨酸0.30g；
维生素：叶酸2.0mg，维生素E 2.5μg，D-泛酸钙2.0mg，氯化胆碱2.0mg，内消旋肌醇4.0mg，盐酸吡哆辛2.0mg，核黄素磷酸钠0.2mg，单磷酸硫胺2.0mg，牛磺酸15.0mg；
碳源：D-葡萄糖1.80g，丙酸钠1.0g；
无机盐：CaCl2 0.50g，KC1 0.75g，KH2PO4 60.0mg，Na2HPO4 0.20g，MgCl2 2.50g，NaCl 20.00g，Na2SO4 0.60g；
激素及细胞因子：胰岛素14.4mg，硫酸软骨素80.0mg，类胰岛素生长因子IGF 20.0μg，成纤维细胞生长因子FGF 80.0μg；
抗生素：青霉素200KU，链霉素0.20g，庆大霉素50.0mg；
超纯水1.0L；
刺参体腔液1.0L；
0.1μm滤膜过滤后，调整溶液pH至7.6，冷藏备用。
实施例3
本实施例一种海洋无脊椎动物细胞培养基，包括基础培养基和实施例1制备的海参体腔液，其中，基础培养基和海参体腔液的体积比为1:1。其配方为：
碳源：葡萄糖3.50g；
氨基酸：L-谷氨酰胺0.80g，L-组氨酸盐0.50g，L-异亮氨酸0.50g，L-亮氨酸0.25g，L-赖氨酸盐酸盐0.20g，L-蛋氨酸0.15g，L-苯丙氨酸0.25g，L-丝氨酸0.4g，L-苏氨酸1.00g，L-色氨酸0.05g，L-酪氨酸0.60g，L-缬氨酸0.40g；
无机离子：CaCl2 0.50g，KC1 0.75g，KH2PO4 300.0mg，MgCl2 2.50g，NaCl 21.00g；
维生素：叶酸2.0mg，维生素E 2.5μg，牛磺酸15.0mg；
超纯水1.0L；
刺参体腔液1.0L；
0.1μm滤膜过滤后，调整溶液pH至7.6，冷藏备用。
实施例4
本实施例一种海洋无脊椎动物细胞培养基，包括基础培养基和实施例1制备的海参体腔液，其中，基础培养基的配方与实施例2相同，但海参体腔液和基础培养基的体积比为3:7。
实施例5
本实施例一种海洋无脊椎动物细胞培养基，包括基础培养基和实施例1制备的海参体腔液，其中，基础培养基的配方与实施例2相同，但海参体腔液和基础培养基的体积比为2：1。
实施例6
本实施例一种海洋无脊椎动物细胞培养基，包括基础培养基和实施例1制备的海参体腔液，其中，基础培养基的配方与实施例2相同，但海参体腔液和基础培养基的体积比为0.1：1。
实施例6
在18℃、湿度恒定的培养箱中分别利用实施例2-6的海洋无脊椎动物细胞培养基培养刺参肠道细胞，培养至细胞密度达60％时，收集培养后的细胞，经稀释后转移至新的培养皿，按1:3稀释传代培养。
在实施例2-6的海洋无脊椎动物细胞培养基的培养下，刺参肠道细胞均能够正常分裂并可供传代培养。图1所示的为采用实施例2的海洋无脊椎动物细胞培养基培养刺参肠道细胞至第57天呈现较好的增殖生长状态。
其中，在实施例2的海洋无脊椎动物细胞培养基的培养下，刺参肠道细胞可传代183天、共传代17代。
在实施例3的海洋无脊椎动物细胞培养基的培养下，刺参肠道细胞可传代132天、共传代9代。
在实施例4的海洋无脊椎动物细胞培养基的培养下，刺参肠道细胞可传代173天、共传代16代。
在实施例5的海洋无脊椎动物细胞培养基的培养下，刺参肠道细胞可传代157天、共传代14代。
在实施例6的海洋无脊椎动物细胞培养基的培养下，刺参肠道细胞可传代65天、共传代5代。
实施例7
在23℃、湿度恒定的培养箱中分别利用实施例2-6的海洋无脊椎动物细胞培养基培养曼氏无针乌贼肝脏细胞，培养至细胞密度达60％时，收集培养后的细胞，经稀释后转移至新的培养皿，按1:3稀释传代培养。
在实施例2-6的海洋无脊椎动物细胞培养基的培养下，均能够正常分裂并可供传代培养。如图2所示，采用实施例2的海洋无脊椎动物细胞培养基培养曼氏无针乌贼肝脏细胞，培养第62天仍呈现较好的增殖生长状态。
其中，在实施例2的海洋无脊椎动物细胞培养基的培养下，曼氏无针乌贼肝脏细胞可传代143天、共传代13代。
在实施例3的海洋无脊椎动物细胞培养基的培养下，曼氏无针乌贼肝脏细胞可传代79天、共传代8代。
在实施例4的海洋无脊椎动物细胞培养基的培养下，曼氏无针乌贼肝脏细胞可传代122天、共传代11代。
在实施例5的海洋无脊椎动物细胞培养基的培养下，曼氏无针乌贼肝脏细胞可传代98天、共传代9代。
在实施例6的海洋无脊椎动物细胞培养基的培养下，曼氏无针乌贼肝脏细胞可传代51天、共传代4代。
对比例1
采用实施例1制备的海参体腔液直接培养刺参肠道细胞，培养方法和培养条件与实施例6相同，培养26天后，观察发现：刺参肠道细胞未出现明显分裂增殖，且两周后细胞呈现变暗，应为失去活力进入死亡(如图3所示)。
对比例2
本对比例一种海洋无脊椎动物细胞培养基，包括基础培养基和胎牛血清，其中，基础培养基的配方与实施例2相同，海洋无脊椎动物细胞培养基中胎牛血清的体积分数为5.0％。采用上述海洋无脊椎动物细胞培养基培养刺参肠道细胞，培养方法和培养条件与实施例6相同，培养17天后，观察发现：刺参肠道细胞未出现明显分裂，且十天后细胞呈现变暗，应为失去活力进入死亡(如图4所示)。

Claims (6)

1.一种海洋无脊椎动物细胞培养基在培养曼氏无针乌贼肝脏细胞中的应用，该海洋无脊椎动物细胞培养基由基础培养基和天然培养基组成，其特征在于，所述的天然培养基为海参体腔液，海参体腔液与基础培养基的体积比为3：（1.5-7）；所述的海参体腔液由以下方法制备而成：
（1）选取健康的海参，收集体腔原液；
（2）去除所述的体腔原液中的免疫分子、细胞和微生物，获得体腔液预处理液；
所述的免疫分子包括补体和凝集素，去除体腔原液中补体和凝集素的方法为：将所述的体腔原液置于40-50℃水浴中，孵育20-40min，获得补体失活的体腔原液；将补体失活的体腔原液快速冷却至20℃，向体腔原液中加入外源性红细胞，静置1.5-2.5h，获得已去除凝集素的体腔原液；
（3）将所述的体腔液预处理液的盐度调整至与基础培养基相一致，获得所述的海参体腔液。
2.如权利要求1所述的海洋无脊椎动物细胞培养基在培养曼氏无针乌贼肝脏细胞中的应用，其特征在于，按质量百分数计，所述的外源性红细胞的终浓度为0.1-5.0％。
3.如权利要求1所述的海洋无脊椎动物细胞培养基在培养曼氏无针乌贼肝脏细胞中的应用，其特征在于，步骤（2）中，将已去除免疫分子的体腔原液在1500-4000r/min下离心2-8min，去沉淀，获得已去除细胞的体腔原液。
4.如权利要求1所述的海洋无脊椎动物细胞培养基在培养曼氏无针乌贼肝脏细胞中的应用，其特征在于，步骤（2）中，将已去除细胞的体腔原液依次采用孔径为0.22μm的无菌超细膜、孔径为0.1μm的无菌超细膜过滤，获得所述的体腔液预处理液。
5.如权利要求1所述的海洋无脊椎动物细胞培养基在培养曼氏无针乌贼肝脏细胞中的应用，其特征在于，所述的基础培养基中至少含有碳源、氨基酸、无机离子和维生素；
以1L基础培养基计，所述的基础培养基中含有0.5-10.0g碳源，所述的氨基酸至少包括L-谷氨酰胺、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸，所述的无机离子至少包括钠、钾、镁和钙；所述的维生素至少包括维生素B、维生素E。
6.如权利要求5所述的海洋无脊椎动物细胞培养基在培养曼氏无针乌贼肝脏细胞中的应用，其特征在于，所述的基础培养基中还含有抗生素、激素和细胞因子；
以1L基础培养基计，所述的抗生素至少包括氨苄青霉素，所述的激素至少包括胰岛素，所述的细胞因子至少包括生长因子。
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