CN113767896B - 牛体外受精胚胎玻璃化冷冻方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及牛体外受精胚胎玻璃化冷冻方法。具体地说，本发明方法包括如下步骤：(1)提供玻璃化冷冻液、冷冻预处理液、解冻液、冷冻管；(2)通过冷冻管抽吸端施力，从冷冻管入口一端，依次向管内吸入：解冻液、空气、玻璃化冷冻液、空气、包含胚胎的玻璃化冷冻液、空气、解冻液；(3)分别在上端的解冻液上部、下端的解冻液下部封口，使步骤(2)吸入的七段密封于冷冻管内，接着将冷冻管置液氮中冷冻。本发明方法呈现如说明书所述优良效果。

Description

牛体外受精胚胎玻璃化冷冻方法

技术领域

本发明属于动物繁殖技术领域，涉及一种用于农业-畜牧兽医繁殖的技术，具体涉及一种牛体外受精的方法，另外，本发明还涉及牛体外受精中使用的相关工作试液在牛体外受精中的应用，尤其是，涉及一种具有优良效果的牛体外受精胚胎玻璃化冷冻方法。本发明牛体外受精胚胎玻璃化冷冻方法具有优异的技术效果。

背景技术

体外受精(In Vitro Fertilization)是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术，英文简称为IVF。由于它与胚胎移植技术(ET)密不可分，又简称为IVF-ET。在生物学中，把体外受精胚胎移植到母体后获得的动物称试管动物(test-tube animal)。这项技术成功于20世纪50年代，在最近20年发展迅速，现已日趋成熟而成为一项重要而常规的动物繁殖生物技术。

体外受精技术对动物生殖机理研究、畜牧生产、医学和濒危动物保护等具有重要意义。如用小鼠、大鼠或家兔等作实验材料，体外受精技术可用于研究哺乳动物配子发生、受精和胚胎早期发育机理。在家畜品种改良中，体外受精技术为胚胎生产提供了廉价而高效的手段，对充分利用优良品种资源，缩短家畜繁殖周期，加快品种改良速度等有重要价值。在人类，IVF-ET技术是治疗某些不孕症和克服性连锁病的重要措施之一。体外受精技术还是哺乳动物胚胎移植、克隆、转基因和性别控制等现代生物技术不可缺少的组成部分。

随着现代农业科技的发展，为了更充分利用良种母牛的繁殖潜力，加速遗传育种进程，在生产实践中应用高效的繁殖新技术成为必然。活体采卵(Ovum pick UP，OPU)和体外受精技术(In Vitro Fertilization，IVF)是二十世纪八十年代快速发展起来的胚胎工程新技术，二者相结合可获得大量遗传系谱明确的胚胎，从而缩短世代间隔。目前，这两种技术已经成为欧美和大洋洲等畜牧业发达国家的农场主为扩大良种母牛群而采用的重要繁殖技术。然而，采用常规的牛胚胎培养体系(CR1aa和SOF液)，牛体外受精的囊胚发育率较低，而且胚胎质量也远不及体内胚胎，导致胚胎移植受体后的妊娠率低，因此如何提高囊胚发育率及胚胎质量成为体外受精胚胎生产的重点和研究的焦点。

早在1878年，德国人Scnenk就以家兔和豚鼠为材料，开始探索哺乳动物的体外受精技术。但直到1951年，美籍华人张民觉和Austin分别发现精子体外获能现象后，体外受精技术才获得了突破性进展。牛体外受精技术受到卵母细胞的体外成熟、精子的体外获能、受精卵的体外培养环境等多个方面的影响。

胚胎的体外培养是IVF技术的一个关键环节，亦是卵母细胞体外成熟和体外受精技术最终效果的体现和检验。在体外受精后，受精卵在向囊胚发育过程中将需经历一系列重要的变化，包括合子的形成、第一次卵裂、胚胎基因组的激活、致密化以及形成囊胚。这一过程中，外界环境的变化会导致基因表达发生改变，从而影响胚胎的正常发育及质量。目前，哺乳动物早期胚胎的体外培养研究主要集中在改善培养液成分以满足不同发育阶段的胚胎营养需求。基于Rosenkrans等(Rosenkrans， C.F.，Jr. and N.L. First， Effect offree amino acids and vitamins on cleavage and developmental rate of bovinezygotes in vitro. J Anim Sci， 1994.72(2): p.434-7)开发的Charles Rosenkrans 1(CR1)培养液和Tervit等(Tervit， H.R.， D.G. Whittingham， and L.E. Rowson,Successful culture in vitro of sheep and cattle ova. J Reprod Fertil, 1972.30(3): p.493-7)开发的合成输卵管液(Synthetic Oviductal Fluid，SOF)，经多年不断改进逐步形成了两种培养体系。据Hakan Sagirkaya等(Sagirkaya, H., et al.,Developmental potential of bovine oocytes cultured in different maturationand culture conditions. Anim Reprod Sci, 2007.101(3-4): p.225-40)和Somfai等(Somfai,T., et al., Development of bovine embryos cultured in CR1aa andIVD101 media using different oxygen tensions and culture systems. Acta VetHung, 2010.58(4): p.465-74)研究成果表明，CR1aa培养液用于牛胚胎培养有较好的效果，可以广泛应用于牛的胚胎培养；Thompson,J.G.等(Thompson,J.G., et al., Effectof inhibitors and uncouplers of oxidative phosphorylation during compactionand blastulation of bovine embryos cultured in vitro. J Reprod Fertil,2000.118(1): p.47-55)和Jean M.Feugang等(Feugang, J.M., O. Camargo-Rodriguez,and E. Memili, Culture systems for bovine embryos. Livestock Science,2009.121(2-3): p.141-149)的研究结果显示，SOF培养液也是一种适合于牛胚胎培养的培养体系。张志平等(张志平, 安志兴, 张锈, 张涌, 牛胚胎培养体系的优化. 西北农林科技大学学报, 2006. 34)和桑国俊等(桑国俊, 牛卵母细胞及体外胚培养技术研究. 2008)研究结果也显示，经过优化的CR1aa和SOF培养液均适合于牛的体外胚胎培养，均取得良好的培养效果。哺乳动物早期胚胎发育是一个高度协调且精确调节的过程。在进化过程中，配子细胞逐步形成了一系列的分子级联网络，以保证胚胎发育周期系统地进行。在发育过程中，胚胎的内外活性氧自由基(Reactive Oxygen Species，ROS)与抗氧化剂的平衡对早期胚胎发育起着决定性作用。

大多生化反应均产生ROS，其在细胞内、外均有着重要的作用，一部分ROS起着信号分子的作用，但是大多数ROS对机体是有害的。Brooker, R.J.等(Brooker, R.J.,Genetics: analysis and principles (4th ed.). McGraw-Hill Science, 2011)报道，ROS可以引起细胞DNA损伤、不饱和脂肪酸的氧化、蛋白质中氨基酸的氧化甚至可以导致某些酶的失活。一般来说，ROS以四种形式存在，其中H2O2氧化作用较强，是引起氧化伤害的最主要因素。

大量研究表明，谷胱甘肽(GSH)是以非蛋白质形式存在的一种抗氧化剂，能够清除多种自由基：超氧阴离子自由基、羟基自由基、过氧化氢、次氯酸和脂氧自由基，并且能够维持细胞内外氧化还原平衡。细胞内外环境GSH和ROS水平是影响受精卵发育过程中的两个重要因素。早在2000年，de Matos等(de Matos, D.G. and C.C. Furnus, The importanceof having high glutathione(GSH) level after bovine in vitro maturation onembryo development effect of beta-mercaptoethanol, cysteine and cystine.Theriogenology, 2000.53(3): p.761-71)曾通过在体外胚胎培养过程中添加β-巯基乙醇、半胱氨酸和胱氨酸来提高囊胚率。

一般来说，哺乳动物卵子在受精后称孕卵或受精卵，接着开始分裂、发育，形成为胚胎。先形成的胚胎为桑椹胚（胚胎的形状像桑椹），然后形成囊胚（胚胎呈囊状），并且植入在子宫内膜中，吸取母体的营养，继续发育。囊胚壁为滋养层，囊中有内细胞群。胚胎继续发育，内细胞群的一部分发育成外胚层、内胚层和中胚层这三个胚层，再由这三个胚层分化发育成哺乳动物成体的所有组织和器官。

目前，卵子与精子的采集、卵子与精子的受精、受精卵生长发育成胚胎等操作均可实现人工操作，尤其是卵子与精子的受精、受精卵生长发育成胚胎等过程均可在体外进行人工操作，并进一步通过人工操作将发育的胚胎置入母体子宫内，在母体子宫环境中继续发育成幼体直至分娩。

在畜牧业例如牛的人工繁殖过程中，由于适宜接受胚胎的母牛不能随时可得，因此，人工采集卵子与精子、卵子与精子的人工受精、以及在体外条件下使受精卵生长发育成胚胎，这些过程可以事先执行，所得到的胚胎预先冷冻保存，待有适宜受孕的母牛时将冷冻胚胎取出、植入母体子宫内。

有关胚胎的冷冻保存在文献中已有详细记载，例如CN 109699636A（201910153676.7）所详细记载的，1972年Whittingham首次采用二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide：DMSO)为主体抗冻保护剂冷冻保存小鼠的2~8-细胞胚胎获得成功，并移植产下后代。他们所采用的冷冻液浓度为1.5Mol/L，使用程序化降温冷冻仪。冷冻解冻后胚胎成活率为50%~70%，胚胎妊娠率为65%，产仔率48%。这种程序化冷冻方法亦称为常规冷冻法，其基本程序为：-6℃植冰后，以-0.33℃/min的速率降至-30~-35℃，平衡后，再以-1.0℃/min的速度降至-80℃后投入液氮，整个过程约3个小时完成。常规冷冻的程序复杂、耗时长、效率低，更不适于边远牧区的胚胎冷冻保存和移植。为此，1985年Rall等发明胚胎玻璃化冷冻方法，使冷冻勿需借助冷冻仪，可在室温下进行操作。程序得到极大地简化。后经许多研究者的改进，目前胚胎的玻璃化冷冻方法仅需1分钟左右即可完成一个程序。胚胎冷冻解冻后存活率95%以上，移植妊娠率达60%~70%，产仔率平均为56%。产仔率比传统的程序化冷冻方法更高。

但是，如CN109699636A所记载的由于玻璃化冷冻液浓度非常高(6Mol/L以上)，胚胎在玻璃化冷冻液中的平衡时间一般不宜超过2分钟，即投入液氮中冷冻保存。因此，对于玻璃化冷冻保存的胚胎，移植前必须将胚胎由冷冻细管中推出，置于一定浓度(0.3~1.0mol/L)的蔗糖溶液中5分钟左右，以脱除抗冻保护剂，并在显微镜下回收胚胎，将胚胎重新装管后再行移植。为此CN109699636A提出了一种玻璃化胚胎冷冻方法以及适用于该方法的装管方案，尽管该文献在某些方面呈现优良效果，然而本发明人在借鉴该方法执行牛体外受精胚胎玻璃化冷冻时仍然遇到新的困难，例如牛受精卵体外发育培养后所得胚胎在经历冷冻和解冻后的存活率较低的缺陷。

因此，本领域技术人员仍然期待有适用于牛体外受精胚胎玻璃化冷冻的方法并解决现有不曾解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种牛受精卵体外发育培养后所得胚胎在经历冷冻和解冻后的存活率的方法。更具体的，本发明为达成上述目的而提供一种专用于牛受精卵体外发育培养后所得胚胎的冷冻液和在经历冷冻后的解冻液，以提高胚胎在经历冷冻和解冻后的存活率。本发明人已经出人意料的发现，本发明方法和相关工作试液呈现优异的技术效果，本发明因此发现而得以完成。

为此，本发明第一方面提供了一种牛体外受精胚胎玻璃化冷冻方法，其包括如下步骤：

(1)提供玻璃化冷冻液、冷冻预处理液、解冻液、冷冻管；

(2)通过冷冻管抽吸端施力，从冷冻管入口一端，依次向管内吸入：解冻液6~8cm、空气0.5~1cm、玻璃化冷冻液0.4~0.6cm、空气0.5~1cm、包含胚胎的玻璃化冷冻液0.4~0.6cm、空气0.5~1cm、解冻液0.5~1cm；

(3)分别在上端的解冻液上部、下端的解冻液下部封口，使步骤(2)吸入的七段密封于冷冻管内，接着将冷冻管置液氮中冷冻。

根据本发明第一方面的方法，其中冷冻管两端封口后，解冻液总长度与冷冻液总长度之比大于5；例如解冻液总长度与冷冻液总长度之比为5~10，例如5~8，例如6。

根据本发明第一方面的方法，其中所述冷冻管为聚丙烯材质的冷冻管。

根据本发明第一方面的方法，其中所述冷冻管为聚丙烯材质的冷冻管，其具有1~5mm的内径，例如具有1~4mm的内径，例如具有1~3mm的内径，例如具有2mm的内径。

根据本发明第一方面的方法，其中所述冷冻管的抽吸端膨大。膨大后通过挤压该膨大部挤出其中的空气，便于吸取各液体。

根据本发明第一方面的方法，其中所述玻璃化冷冻液为EFS30。该EFS30是一种商品化的胚胎玻璃化冷冻液，其是添加乙二醇(Ethylene glycol，EG，抗冻保护剂)、聚蔗糖(Ficoll)和蔗糖(Sucrose)制成的玻璃化溶液。该EFS30可以容易地从市场上购得，例如本发明使用的EFS30若未另外说明是购自爱页生物公司的产品。

根据本发明第一方面的方法，其中所述解冻液是用Dulbecco’s磷酸盐缓冲液为基础液配制成0.5mol/L的蔗糖溶液。所述Dulbecco’s磷酸盐缓冲液容易的从市场上购得，例如本发明使用的Dulbecco’s磷酸盐缓冲液购自Sigma-Aldrich。

根据本发明第一方面的方法，其中所述包含胚胎的玻璃化冷冻液是如下方式制备的：挑选体外培养合格的胚胎，置10%乙二醇溶液中预处理5~10秒后，转移至玻璃化冷冻液中，即得。

根据本发明第一方面的方法，其中所述玻璃化冷冻液中还增补添加了油酸钠和酒石酸钠。例如，其中油酸钠的浓度为0.02~0.05mg/ml，例如浓度为0.02~0.04mg/ml，例如浓度为0.02~0.03mg/ml，例如浓度为0.025mg/ml。例如，其中酒石酸钠的浓度为0.1~0.25mg/ml，例如浓度为0.1~0.2mg/ml，例如浓度为0.1~0.15mg/ml，例如浓度为0.125mg/ml。已经出人意料地发现，当向冷冻液中同时添加适量油酸钠和酒石酸钠时，可以显著减小冷冻之前冷冻液段与解冻液段之间的融合的问题。

因此，本发明第二方面提供了一种玻璃化冷冻液，其是增补添加了油酸钠和酒石酸钠的EFS30液。

根据本发明第二方面的玻璃化冷冻液，其中油酸钠的浓度为0.02~0.05mg/ml，例如浓度为0.02~0.04mg/ml，例如浓度为0.02~0.03mg/ml，例如浓度为0.025mg/ml。例如，其中酒石酸钠的浓度为0.1~0.25mg/ml，例如浓度为0.1~0.2mg/ml，例如浓度为0.1~0.15mg/ml，例如浓度为0.125mg/ml。

本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾，当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

本发明牛体外受精胚胎玻璃化冷冻方法呈现如说明书所述优良技术效果。

附图说明

图1是本发明胚胎玻璃化冷冻法装管模式示意图。

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

本发明所用的牛胚胎，是按照CN113151160A之实施例1所记载的方法，由其中“步骤(3)、胚胎体外培养、保存和解冻”得到经质量鉴定合格的囊胚。本发明若未明确说明，使用中国黄牛的相关材料进行试验。

实施例1、牛体外受精胚胎玻璃化冷冻

本实施例方法包括如下步骤：

(1)提供玻璃化冷冻液、冷冻预处理液、解冻液、冷冻管；

(2)通过冷冻管抽吸端施力，从冷冻管入口一端，依次向管内吸入：解冻液7cm、空气0.75cm、玻璃化冷冻液0.5cm、空气0.75cm、包含胚胎的玻璃化冷冻液0.5cm、空气0.75cm、解冻液0.75cm；

(3)分别在上端的解冻液上部、下端的解冻液下部封口，使步骤(2)吸入的七段密封于冷冻管内，接着将冷冻管置液氮中冷冻。

在上述操作步骤中，

冷冻管两端封口后，解冻液总长度与冷冻液总长度之比大于5；

冷冻管为市售聚丙烯材质的冷冻管，内径2mm，抽吸端膨大、另一端开口；

玻璃化冷冻液为使用乙二醇、聚蔗糖和蔗糖配制成的EFS30，其中还添加0.025mg/ml油酸钠和0.125mg/ml酒石酸钠；

解冻液是用Dulbecco’s磷酸盐缓冲液为基础液配制成0.5mol/L的蔗糖溶液；

包含胚胎的玻璃化冷冻液是如下方式制备的：挑选体外培养合格的胚胎(囊胚)，置10%乙二醇溶液(即冷冻预处理液)中预处理5~10秒后，转移至玻璃化冷冻液中，即得封装胚胎冷冻管。

本实施例胚胎玻璃化冷冻装管模式示意图如图1所示，将冷冻管上端的膨大部挤出一定量空气，吸取解冻液，接着再依次吸取规定量的空气、玻璃化冷冻液、空气、包含胚胎的玻璃化冷冻液、空气、解冻液，接着在顶站和底端解冻液处密封(例如通过热融密封)。吸取包含胚胎的玻璃化冷冻液时每管吸入1~10个胚胎(根据不同需求和适用场合确定胚胎数)。

实施例2、牛体外受精胚胎玻璃化冷冻

本实施例方法包括如下步骤：

(1)提供玻璃化冷冻液、冷冻预处理液、解冻液、冷冻管；

(2)通过冷冻管抽吸端施力，从冷冻管入口一端，依次向管内吸入：解冻液8cm、空气1cm、玻璃化冷冻液0.4cm、空气0.5cm、包含胚胎的玻璃化冷冻液0.6cm、空气0.5cm、解冻液1cm；

(3)分别在上端的解冻液上部、下端的解冻液下部封口，使步骤(2)吸入的七段密封于冷冻管内，接着将冷冻管置液氮中冷冻。

在上述操作步骤中，

冷冻管两端封口后，解冻液总长度与冷冻液总长度之比大于5；

冷冻管为市售聚丙烯材质的冷冻管，内径2mm，抽吸端膨大、另一端开口；

玻璃化冷冻液为使用乙二醇、聚蔗糖和蔗糖配制成的EFS30，其中还添加0.02mg/ml油酸钠和0.2mg/ml酒石酸钠；

解冻液是用Dulbecco’s磷酸盐缓冲液为基础液配制成0.5mol/L的蔗糖溶液；

包含胚胎的玻璃化冷冻液是如下方式制备的：挑选体外培养合格的胚胎(囊胚)，置10%乙二醇溶液(即冷冻预处理液)中预处理5~10秒后，转移至玻璃化冷冻液中，即得封装胚胎冷冻管。

实施例3、牛体外受精胚胎玻璃化冷冻

本实施例方法包括如下步骤：

(1)提供玻璃化冷冻液、冷冻预处理液、解冻液、冷冻管；

(2)通过冷冻管抽吸端施力，从冷冻管入口一端，依次向管内吸入：解冻液6cm、空气0.5cm、玻璃化冷冻液0.6cm、空气1cm、包含胚胎的玻璃化冷冻液0.4cm、空气1cm、解冻液0.5cm；

(3)分别在上端的解冻液上部、下端的解冻液下部封口，使步骤(2)吸入的七段密封于冷冻管内，接着将冷冻管置液氮中冷冻。

在上述操作步骤中，

冷冻管两端封口后，解冻液总长度与冷冻液总长度之比大于5；

冷冻管为市售聚丙烯材质的冷冻管，内径2mm，抽吸端膨大、另一端开口；

玻璃化冷冻液为使用乙二醇、聚蔗糖和蔗糖配制成的EFS30，其中还添加0.04mg/ml油酸钠和0.1mg/ml酒石酸钠；

解冻液是用Dulbecco’s磷酸盐缓冲液为基础液配制成0.5mol/L的蔗糖溶液；

包含胚胎的玻璃化冷冻液是如下方式制备的：挑选体外培养合格的胚胎(囊胚)，置10%乙二醇溶液(即冷冻预处理液)中预处理5~10秒后，转移至玻璃化冷冻液中，即得封装胚胎冷冻管。

实施例4、牛体外受精胚胎玻璃化冷冻

分别参照实施例1~3的方法进行牛体外受精胚胎玻璃化冷冻，不同的仅是玻璃化冷冻液未添加油酸钠，得到三批封装胚胎冷冻管分别称为实施例41、实施例42、实施例43。

实施例5、牛体外受精胚胎玻璃化冷冻

分别参照实施例1~3的方法进行牛体外受精胚胎玻璃化冷冻，不同的仅是玻璃化冷冻液未添加酒石酸钠，得到三批封装胚胎冷冻管分别称为实施例51、实施例52、实施例53。

实施例6、牛体外受精胚胎玻璃化冷冻

分别参照实施例1~3的方法进行牛体外受精胚胎玻璃化冷冻，不同的仅是玻璃化冷冻液未添加油酸钠也未添加酒石酸钠，得到三批封装胚胎冷冻管分别称为实施例61、实施例62、实施例63。本实施例这种油酸钠和酒石酸钠均未添加的方案基本上等同于CN109699636A所记载的方案。

试验例1：考察冷冻液段与解冻液段的融合

由于实验操作的限制，在大批量处理时，实施例1~6操作得到的封装胚胎冷冻管不能立即投入到液氮中冷冻，例如通常是封装若干支管后再一起将它们投入液氮中冷冻，因此有必要考察投入液氮前这段时间是否会存在冷冻液段与解冻液段的融合。

在15~20°C的操作环境下，将实施例1~6所得封装胚胎冷冻管(每批至少20支)竖立(吸头站朝上)放置2分钟、接着水平面放置2分钟以完成一个循环，如此完成5个循环过程。然后观察每批封装胚胎冷冻管中的两段冷冻液各自的两邻端是否存在与其相邻解冻液或冷冻液段之间发生融合，每管内2段冷冻液总共包括4个邻端点，每个邻端点发生融合则记为一次融合事件，每批样品的融合事件总数除以总邻端点所得百分数称为融合事件率；例如某试验批20支封装胚胎冷冻管包括80个邻端点，若录得该批出现15次融合事件，则融合事件率=(15÷80)×100%=18.75%。

结果：实施例1~3三批封装胚胎冷冻管的融合事件率分别为0.67%、0.86%、0.53%；实施例4三批封装胚胎冷冻管的融合事件率在7.3~9.1%范围内，例如实施例4参照实施例1所得封装胚胎冷冻管的融合事件率为7.83%；实施例5三批封装胚胎冷冻管的融合事件率在8.8~11.5%范围内，例如实施例5参照实施例1所得封装胚胎冷冻管的融合事件率为10.27%；实施例6三批封装胚胎冷冻管的融合事件率在15.1~18.3%范围内，例如实施例6参照实施例1所得封装胚胎冷冻管的融合事件率为16.48%。

由上述结果可见，当在冷冻液中同时添加油酸钠和酒石酸钠二者时可以显著降低冷冻液段落与其相邻成分段发生融合的机率，有利于减轻操作人员任务压力，同时保证胚胎后续玻璃化冷冻的正常进行。

试验例2：考察冷冻后的胚胎存活率

将参照CN113151160A之实施例1所记载的方法获得的可用胚胎分别照本发明实施例1、实施例2、实施例3、实施例41、实施例51、实施例61方法进行玻璃化冷冻处理得到封装胚胎冷冻管(每管内分装4~5个胚胎)，接着立即将其置液氮中冷冻保存；冷冻保存60天后，液氮中取出细管(选取未见融合事件的细胞管进行)，空气浴4~6s，然后浸入20~25℃水浴中，待冰晶全部融化后，取出细管，来回颠倒甩动细管，使细管内的液体混合均匀后，剪开细管，将胚胎放入胚胎培养液小滴内培养，完成解冻过程，并于体外培养36h后统计解冻后的胚胎存活率。每种封装胚胎冷冻管参与试验的胚胎总数为30~40个，统计存活率时，存活标准为重新出现囊胚腔。

结果：实施例1方法进行玻璃化冷冻囊胚的存活率为66.3%，实施例2方法进行玻璃化冷冻囊胚的存活率为64.1%，实施例3方法进行玻璃化冷冻囊胚的存活率为67.3%，实施例41方法进行玻璃化冷冻囊胚的存活率为63.1%，实施例51方法进行玻璃化冷冻囊胚的存活率为66.3%，实施例61方法进行玻璃化冷冻囊胚的存活率为65.3%，这些结果表明，冷冻液中是否添加油酸钠和酒石酸钠对于胚胎冻存后的存活率无影响。

以上大于60%的存活率与CN109699636A所载95%以上的存活率的差异，可能是使用的不同动物种属造成的。

在一个补充试验中，将实施例1、实施例2、实施例3、实施例41、实施例51、实施例61方法进行玻璃化冷冻处理得到封装胚胎冷冻管(每管内分装4~5个胚胎)通过挤压使得包含胚胎的玻璃化冷冻液段与其下方的解冻液段穿过空气段发生细微融合，接着立即将其置液氮中冷冻保存；冷冻保存60天后，液氮中取出细管，空气浴4~6s，然后浸入20~25℃水浴中，待冰晶全部融化后，取出细管，来回颠倒甩动细管，使细管内的液体混合均匀后，剪开细管，将胚胎放入胚胎培养液小滴内培养，完成解冻过程，并于体外培养36h后统计解冻后的胚胎存活率；每种封装胚胎冷冻管参与试验的胚胎总数为30~40个，统计存活率时，存活标准为重新出现囊胚腔；

结果：实施例1至实施例61方法进行玻璃化冷冻但发生解冻液融合事件的囊胚存活率37~45%在范围内，例如实施例1方法进行玻璃化冷冻但发生解冻液融合事件的囊胚存活率为41.6%；这些结果表明，冷冻液若与解冻液发生融合则会显著降低胚胎冻存后的存活率。

本发明采用了独特的装管方法，尽量减少了细管内冷冻液节段的长度，增加了解冻液节段的长度，解冻时，待内容物溶解后，使管内的冷冻液和解冻液充分混合，达到稀释冷冻液、脱除抗冻保护剂的效果，所以如文献所记载的，本发明有如下优点：

(1)最大限度地简化了胚胎玻璃化冷冻保存方法的解冻程序。本发明采用细管法玻璃化冷冻保存胚胎，解冻时胚胎不需出管脱毒，而是直接在管内使冷冻液和解冻液相混合，以达到稀释冷冻液，同时在管内脱除胚胎内部具有化学毒性作用的抗冻保护剂，所以本解冻方法比传统的解冻方法简单、胚胎不丢失。利用该方法解冻后，胚胎存活率达60%以上，不仅时间上能完全保证完成一个移植过程，而且总体水平比常规冷冻法和其他玻璃化冷冻法效果好、效率高。

(2)解决了冷冻前管内冷冻液和解冻液的合理配置和解冻后管内直接混合，使胚胎脱除抗冻保护剂后即可移植。该方法实现了玻璃化冷冻胚胎在管内脱毒、直接移植，简易方便，可操作性强，有利于在生产中推广。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.牛体外受精胚胎玻璃化冷冻方法，其包括如下步骤：

(1)提供玻璃化冷冻液、冷冻预处理液、解冻液、冷冻管；

(2)通过冷冻管抽吸端施力，从冷冻管入口一端，依次向管内吸入：解冻液6~8cm、空气0.5~1cm、玻璃化冷冻液0.4~0.6cm、空气0.5~1cm、包含胚胎的玻璃化冷冻液0.4~0.6cm、空气0.5~1cm、解冻液0.5~1cm；

(3)分别在上端的解冻液上部、下端的解冻液下部封口，使步骤(2)吸入的七段密封于冷冻管内，接着将冷冻管置液氮中冷冻，

其特征是：

所述玻璃化冷冻液为增补添加了油酸钠和酒石酸钠的EFS30，其中油酸钠的浓度为0.02~0.04mg/ml，酒石酸钠的浓度为0.1~0.2mg/ml；

所述解冻液是用Dulbecco’s磷酸盐缓冲液为基础液配制成含0.5mol/L蔗糖的溶液；

冷冻管两端封口后，解冻液总长度与冷冻液总长度之比为5~10；

所述冷冻管为聚丙烯材质的冷冻管，其具有1~5mm的内径。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，冷冻管两端封口后，解冻液总长度与冷冻液总长度之比为5~8。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征是，冷冻管两端封口后，解冻液总长度与冷冻液总长度之比6。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述冷冻管具有1~4mm的内径。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述冷冻管具有1~3mm的内径。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述冷冻管具有2mm的内径。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述冷冻管的抽吸端膨大。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征是，油酸钠的浓度为0.02~0.03mg/ml，酒石酸钠的浓度为0.1~0.15mg/ml。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征是，油酸钠的浓度为0.025mg/ml，酒石酸钠的浓度为0.125mg/ml。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述包含胚胎的玻璃化冷冻液是如下方式制备的：挑选体外培养合格的胚胎，置10%乙二醇溶液中预处理5~10秒后，转移至玻璃化冷冻液中，即得。

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