CN106520675B - 一种包含Clusterin蛋白的体外胚胎培养液及其在胚胎冷冻保存中的应用 - Google Patents

一种包含Clusterin蛋白的体外胚胎培养液及其在胚胎冷冻保存中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于胚胎冷冻保存领域。具体地，本发明涉及一种用于提高胚胎解冻复苏率的体外胚胎培养液，该体外培养液包含Clusterin蛋白。本发明还涉及一种提高提高胚胎抗冻性和解冻复苏率的方法以及一种冷冻胚胎的方法。通过本发明可以显著地提高胚胎的抗冻性和解冻复苏率。

Description

一种包含Clusterin蛋白的体外胚胎培养液及其在胚胎冷冻 保存中的应用
技术领域
本发明属于胚胎冷冻保存领域。具体地，本发明涉及Clusterin蛋白在胚胎冷冻保存中的应用。
背景技术
在胚胎移植、体外受精、转基因和克隆等胚胎生物技术中，往往会涉及到胚胎的冷冻保存，而如何能更好地冷冻胚胎，使得胚胎在解冻之后能够依然能够正常发育，一直以来备受关注。
在当前的胚胎冷冻方法中经常采用抗冻保护剂。采用抗冻保护剂主要是为了防止细胞在冷冻过程中受到损伤。抗冻保护剂多为渗透性小分子物质，主要通过渗入细胞内部，发生水合作用，使细胞内溶液的黏性增加，从而保护细胞不受冷冻损伤。不同的抗冻保护剂由于其种类、浓度、分子大小、渗透能力、水活性及胞内作用机理等各不相同，对细胞冷冻保存效果亦有差异。随着抗冻液浓度的增加,渗入细胞内的抗冻保护剂会随之增多。通常，抗冻液本身具有毒性，浓度太高会在降温前杀死细胞，而浓度过低又起不到对细胞的保护作用。
同时，现有技术也有数据表明，经过冷冻的胚胎在移植时比鲜胚的产子率下降很多。这也说明冷冻或者冷冻保护剂的外在处理会使胚胎的后期发育受到或多或少的影响。
因此，本领域亟需一种新的胚胎冷冻方案，其能够提高胚胎的抗冻性以及解冻复苏率。另外地或可能地，该胚胎冷冻方案还可以降低抗冻保护剂的使用量，从而减少其对胚胎的毒副作用，实现有效的胚胎冷冻。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的胚胎冷冻方案，其能够提高胚胎的抗冻性以及解冻复苏率。另外地或可能地，该胚胎冷冻方案还可以降低抗冻保护剂的使用量，从而减少其对胚胎的毒副作用，实现有效的胚胎冷冻。
本发明人意外地发现，先将胚胎在含有Clusterin蛋白的体外胚胎培养液中培养一段时间，然后再对其进行冷冻例如程序化冷冻，可以显著地提高胚胎的抗冻性和解冻复苏率。基于此发现，本发明人得到了如下发明：
第一方面，本发明提供了一种体外胚胎培养液，所述体外胚胎培养液包含Clusterin蛋白。
第二方面，本发明提供了一种提高胚胎抗冻性和解冻复苏率的方法，包括在冷冻胚胎之前用根据本发明第一方面的体外胚胎培养液培养所述胚胎。
第三方面，本发明提供了一种冷冻胚胎的方法，包括以下步骤：用根据本发明第一方面所述的体外胚胎培养液培养胚胎；并将经培养的胚胎进行冷冻。
通过在体外胚胎培养基中添加Clusterin蛋白，并将待冷冻胚胎在该添加有Clusterin蛋白的体外胚胎培养基中培养一段时间，可以显著地提高胚胎的抗冻性和解冻复苏率。另外地或可能地，通过所述培养程序，可以减少在冷冻液中使用的抗冻保护剂的量，从而减少其对胚胎的毒副作用。
具体实施方式
下面对本发明的具体技术方案作进一步清楚和完整的描述。需要理解的是，本文中具体描述的技术方案仅用于示例目的，无意于以任何方式对本发明的保护范围进行限制。在不背离本发明的精神和宗旨的情况下，可以对本发明的技术方案进行修改。本发明的保护范围由随附的权利要求书来进行限定。
如上文所述，本发明的目的在于提供一种新的胚胎冷冻方案，其能够提高胚胎的抗冻性以及解冻复苏率；另外地或者可能地，还可以降低抗冻保护剂的使用量，从而减少其对胚胎的毒副作用，实现有效的胚胎冷冻。
通过将胚胎在含有Clusterin蛋白的体外胚胎培养液中培养一段时间，然后再对其进行冷冻，例如程序化冷冻，本发明人意外地发现，胚胎的抗冻性和解冻复苏率得到了显著提高。基于此发现，本发明人得到了如下发明：
第一方面，本发明提供了一种体外胚胎培养液，所述体外胚胎培养液包含Clusterin蛋白。
除了Clusterin蛋白之外，所述体外胚胎培养液还包含选自CZB培养基、MTF培养基、KSOM培养基、CR1培养基和CR2培养基中的任何一种培养基。
CZB培养基是一种可以使多种品系的小鼠受精后胚胎发育至囊胚期的培养基，现已广泛应用于胚胎操作和各种小鼠克隆实验中。
MTF培养基是一种以Krebs-Ring碳酸盐溶液为基础的着床前胚胎培养基，其成分相当简单，主要包括提供能量的丙酮酸钠、乳酸钠和葡萄糖，并且还包括血清白蛋白。
KSOM培养基是一种主要用于培养体外授精(IVF)的小鼠胚胎以及去核和电融合后重构的B6C3F1小鼠卵子的培养基。
CR1培养基和CR2培养基是用于猪、牛、羊等物种后期胚胎的培养基，根据胚胎所处具体阶段不同，具体配方略有调整。
在本发明中使用的Clusterin蛋白可以来源于任何物种，例如可以来源于哺乳动物如小鼠、大鼠、猪、牛、羊、或者灵长类动物例如人。
在本发明中使用的Clusterin蛋白可以通过任何方式获得，例如可以通过分离提纯获得或者通过重组或者合成方式生产。举例而言，由转染有小鼠Clusterin基因并可正常表达Clusterin蛋白的HEK293细胞系(重组蛋白体外细胞表达系统)来生产。从经济的角度上看，所述Clusterin蛋白优选通过重组方式生产来获得。
在一个实施方案中，所述Clusterin蛋白的浓度为10至30μg/μl。例如，所述Clusterin蛋白的浓度可以为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30μg/μl，或者由这些数值组成的任何浓度区间，例如12-28μg/μl、15-25μg/μl。优选地，所述Clusterin蛋白的浓度为20μg/μl。
在冷冻胚胎前将胚胎在本发明第一方面的包含Clusterin蛋白的体外胚胎培养液中培养一段时间，可以显著地提高胚胎的抗冻性和解冻复苏率，该解冻复苏率至少可以提高15％。
第二方面，本发明提供了一种提高胚胎抗冻性和解冻复苏率的方法，包括在冷冻胚胎之前用本发明第一方面的体外胚胎培养液培养所述胚胎。
所述培养在37℃、5％CO2和100％湿度条件下进行，可以持续适当长的一段时间，例如可以持续4-8小时，如4、5、6、7或8小时，优选地持续6小时。
所述胚胎可以是任何物种来源的胚胎。例如，所述胚胎可以是来源于哺乳动物例如小鼠、大鼠、猪、牛、羊、或者灵长类动物例如人的胚胎。
所述胚胎可以是处于任何适合冷冻时期的胚胎。例如，所述胚胎可以是处于4-细胞期至囊胚期的胚胎。
所述胚胎可以是通过任何方式例如体内法或体外法获得的胚胎。对于通过体内法获得的胚胎，可以示例的是，在非人哺乳动物本交或人工输精后在母体中发育到例如4-细胞期至囊胚期时通过手术或非手术法从该母体中获取的已受精胚胎。所述非人哺乳动物可以为例如小鼠、大鼠、猪、牛、羊或者不包括人在内的灵长类动物。对于通过体外法获得的胚胎，可以示例的是，对成熟卵母细胞采取体外授精方式例如孤雌激活或单精子注射等方式获得的受精胚胎。所述成熟卵母细胞可以来源于任何物种，例如哺乳动物如小鼠、大鼠、猪、牛、羊、或者灵长类动物如人。
所述胚胎的物种来源与所述Clusterin蛋白的物种来源可以相同，也可以相同。优选地，所述胚胎的物种来源与所述Clusterin蛋白的物种来源是相同的。在物种来源不相同的情况下，两个物种产生的Clusterin蛋白之间应该具有相同或者相似的功能。
第三方面，本发明提供了一种冷冻胚胎的方法，包括以下步骤：用本发明第一方面的体外胚胎培养液培养胚胎；并将该经培养的胚胎进行冷冻。
所述培养在37℃、5％CO2和100％湿度条件下进行，可以持续适当长的一段时间，例如可以持续4-8小时，如4、5、6、7或8小时，优选地持续6小时。
所述胚胎可以是任何物种来源的胚胎。例如，所述胚胎可以是来源于哺乳动物例如小鼠、大鼠、猪、牛、羊、或者灵长类动物例如人的胚胎。
所述胚胎可以是处于任何适合冷冻时期的胚胎。例如，所述胚胎可以是处于4-细胞期至囊胚期的胚胎。
所述胚胎可以是通过任何方式例如体内法或体外法获得的胚胎。对于通过体内法获得的胚胎，可以示例的是，在非人哺乳动物本交或人工输精后在母体中发育到例如4-细胞期至囊胚期时通过手术或非手术法从该母体中获取的已受精胚胎。所述非人哺乳动物可以为，例如，小鼠、大鼠、猪、牛、羊或者不包括人在内的灵长类动物。对于通过体外法获得的胚胎，可以示例的是，对成熟卵母细胞采取体外授精方式例如孤雌激活或单精子注射等方式获得的受精胚胎。所述成熟卵母细胞可以来源于任何物种，例如哺乳动物如小鼠、大鼠、猪、牛、羊、或者灵长类动物如人。
所述胚胎的物种来源与所述Clusterin蛋白的物种来源可以相同，也可以相同。优选地，所述胚胎的物种来源与所述Clusterin蛋白的物种来源是相同的。在物种来源不相同的情况下，两个物种产生的Clusterin蛋白之间应该具有相同或者相似的功能。
可以以任何合适的方式将经培养的胚胎进行冷冻。本领域中采用的胚胎冷冻方法包括例如程序化冷冻法、快速冷冻法、玻璃化冷冻法等。
程序化冷冻法主要采用低浓度冻结保存剂梯度脱水，经程序冷冻仪缓慢降温。主要操作步骤包括：将胚胎顺序放入一系列逐渐增加保存剂浓度的溶液中梯度脱水，再置入程序冷冻仪快速降温至-5℃至-7℃植冰(人工诱导冰晶形成)，然后使程序冷冻仪缓慢降温至-30℃至-80℃，之后如果需要的话进行液氮贮存。
玻璃化冷冻法是Rall和Fahy于1985年提出来的胚胎冷冻方法。玻璃化冷冻技术的基本原理就是用高浓度的冷冻保护剂溶液将细胞内水分置换出来，经急速降温由液态转化为外形似玻璃状的非晶体化固体状态。玻璃化冷冻法的主要操作步骤简单，包括：高浓度的冷冻保护剂置换细胞内外的溶液，快速降温，使溶液黏稠度极度提高并固化，放置液氮保存。
一步冷冻法利用高浓度的抗冻剂使胚胎在冷冻前脱水，从而减少冷冻过程中细胞内冰晶的形成。该方法的特点是胚胎在室温脱水后不需要特殊的降温程序，能在很短的时间内完成冷冻过程，具有重要的实用价值。
在本发明中采用了程序化冷冻法，但是其他方法也可以使用。在本发明中采用的程序化冷冻法大体程序如下：在保护剂浓度递增的溶液中梯度脱水，快速降温(例如1℃/min)至-5℃至-7℃植冰，缓慢降温(例如0.3℃/min)至-30℃至-80℃。如果需要长期冷冻，随后可以将胚胎放入液氮中。
通过在体外胚胎培养基中添加Clusterin蛋白，并将待冷冻胚胎在该添加有Clusterin蛋白的体外胚胎培养液中培养一段时间，可以显著地提高胚胎的抗冻性和解冻复苏率。另外地或可能地，通过所述培养程序，可以减少在冷冻液中使用的抗冻保护剂的量，从而减少其对胚胎的毒副作用。
实施例
1材料
1.1主要仪器和设备
Figure BDA0001147456450000061
1.2主要试剂
1.2.1鼠源体外重组Clusterin蛋白，购自Abcam公司(货号：ab194035)，其氨基酸序列如下：
EQEVSDNELQELSTQGSRYINKEIQNAVQGVKHIKTLIEKTNAERKSLLNSLEEAKKKKEDALEDTRDSEMKLKAFPEVCNETMMALWEECKPCLKHTCMKFYARVCRSGSGLVGQQLEEFLNQSSPFYFWMNGDRIDSLLESDRQQSQVLDAMQDSFARASGIIDTLFQDRFFARELHDPHYFSPIGFPHKRPHFLYPKSRLVRSLMSPSHYGPPSFHNMFQPFFEMIHQAQQAMDVQLHSPAFQFPDVDFLREGEDDRTVCKEIRRNSTGCLKMKGQCEKCQEILSVDCSTNNPAQANLRQELNDSLQVAERLTEQYKELLQSFQSKMLNTSSLLEQLNDQFNWVSQLANLTQGEDKYYLRVSTVTTHSSDSEVPSRVTEVVVKLFDSDPITVVLPEEVSKDNPKFMDTVAEKALQEYRRKSRAEVDHHHHHH
1.2.2 CZB培养基
(1)CZB储液100mL配方
Figure BDA0001147456450000071
配制方法：将A液和B液混合，再用高压后超纯水定容至100mL。
(2)CZB工作液5mL配方
Figure BDA0001147456450000072
Figure BDA0001147456450000081
1.2.3含有Clusterin重组蛋白的体外胚胎培养液
将Clusterin重组蛋白添加至CZB工作液中，使其达到所需的终浓度例如10、20、30μg/μl。将该体外培养液保存于4℃。
1.3试验材料
本实验选用8～12周龄性成熟、体重为28g左右的ICR系小鼠，该小鼠购自北京维通利华实验动物科技有限公司。
2方法
2.1小鼠休眠囊胚和正常孵化囊胚的获取与收集
选择阴门淡粉色的雌性小鼠，腹腔注射孕马血清促性腺激素(PMSG)，10IU/只。48小时后，再注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)，10IU/只。之后立即使该雌性小鼠与成年公鼠1:1合笼过夜交配，次日早8点检查交配情况。见阴道栓后注射抗孕马血清(A-PMSG)，10IU/只。
(a)休眠囊胚的获取与收集
于见栓的第四天上午9～10点摘除小鼠的双侧卵巢，之后连续三天在其颈部皮下注射0.2mg/mL的孕酮，每次0.1mL。术后第四天9点处死小鼠，取下小鼠两侧子宫，用PBS工作液正反冲洗两次，即可获得休眠胚胎。
(b)正常孵化囊胚的获取和收集
于见栓的第五天上午9点处死小鼠，取下小鼠两侧子宫，用PBS工作液冲出子宫中的正常孵化囊胚，即可获得正常孵化囊胚。
2.2小鼠休眠囊胚和正常孵化囊胚的冷冻
将获取的小鼠休眠囊胚和正常孵化囊胚(各100枚左右)用100μl PBS液滴清洗3遍，再用100μl CZB工作液清洗3遍，之后移入含20μg/μlClusterin重组蛋白的覆油CZB工作液液滴中，培养箱37℃、5％CO2空气和100％湿度条件下体外培养6小时。
将培养后的胚胎用PBS工作液洗涤2遍，然后三步法脱去PBS，再放到冷冻液(Bioniche，ViGROTM，ETHYLENE GLYCOL FREEZE(with Sucrose)，Lot：150206-2P)中平衡5分钟，用0.25ml塑料麦管装取胚胎。将装好的麦管置于冷冻仪中，以1℃/分钟的速度降到-5℃，平衡10分钟，期间用预冷的镊子夹住装有胚胎的麦管上端冷冻液处3-5秒出现冰晶即植冰完成，随后再平衡10分钟，以0.3℃/分钟的速度降至-35℃。随后，将冷冻麦管放入液氮中。
解冻时，把冷冻麦管从液氮中取出，室温下轻轻晃动5-10秒后，投入35℃水中10-15秒取出。剪掉麦管两端栓部，将细管里的胚胎置于表面皿中，按三步法脱去冷冻液，解冻复苏后再放到平衡过的新CZB液滴中进行24小时的复苏。24小时后统计胚胎的解冻复苏率。
上文所述脱去PBS的三步法具体程序如下：在将胚胎浸入完全冷冻液中并装管冷冻前，将胚胎依次在100μl的下述溶液的液滴中洗涤(每种溶液中分别洗涤3-5分钟)：1/3冷冻液+2/3PBS、1/2冷冻液+1/2PBS、2/3冷冻液+1/3PBS。
上文所述脱去冷冻液的三步法具体程序如下：将胚胎依次在100μl的下述溶液的液滴中洗涤(每种溶液中分别洗涤3-5分钟)：2/3冷冻液+1/3PBS、1/2冷冻液+1/2PBS、1/3冷冻液+2/3PBS。
3数据分析
所有实验数据用SAS 9.0统计软件进行卡方分析。
数据分析图为GraphPad软件制作。
4结果
4.1培养基中添加Clusterin重组蛋白对小鼠正常孵化囊胚及休眠胚胎的解冻复苏率的影响
表1添加Clusterin重组蛋白培养后的囊胚的解冻复苏率(％)
Figure BDA0001147456450000091
Figure BDA0001147456450000101
注：数值表示为平均值±标准差。不同大写字母之间显示为差异极其显著(P<0.01)；不同小写字母之间表示为差异显著(P<0.05)；无标注为差异不显著(P>0.05)。实验重复三次。
6讨论
在低温条件下，Clusterin蛋白通过影响细胞膜的稳定性来保护细胞，但是其具体机制尚不清楚。已有研究发现，Clusterin蛋白是一种细胞外的伴侣分子，与热休克蛋白相似。在多种应激状态下其表达出现增加，并能作用于此环境中的不稳定蛋白，进而形成稳定的水溶性高分子复合物，组织自身沉淀并促使蛋白正确折叠。此外，之前的研究还发现Clusterin蛋白产生伴侣蛋白作用时不需要ATP提供能量，这暗示Clusterin蛋白可通过伴侣分子的作用来提高细胞膜的稳定性，从而保护细胞。
在本研究中，对小鼠正常孵化囊胚和休眠囊胚体外添加一定浓度的Clusterin重组蛋白并进行培养，藉此探索Clusterin蛋白能否提高小鼠胚胎的抗冻性，进而实现该蛋白作为一种新型胚胎冷冻保护剂规模化应用于胚胎冷冻技术。
本研究的结果表明，与在没有添加Clusterin重组蛋白的体外胚胎培养基中培养过的对照相比较，在添加有Clusterin重组蛋白的体外胚胎培养基中培养过的小鼠囊胚的解冻复苏率有着不同程度的升高，但是该升高程度在正常孵化囊胚和休眠囊胚之间存在一定的差异。具体地，小鼠正常孵化囊胚相对于其对照解冻复苏率显著提高(P<0.05)，而休眠囊胚相对于其对照解冻复苏率略有升高但不显著(P>0.05)。
以上结果说明，Clusterin蛋白对胚胎的抗冻性和解冻复苏率有着显著的影响。与常规的仅仅在冷冻液中添加抗冻保护剂的处理方式不同，本试验比较特殊的地方在于：先将Clusterin蛋白添加到体外培养基例如CZB培养基中，然后将胚胎在该体外培养基中培养一段时间，之后对该培养过的胚胎进行冷冻。结果证明，经Clusterin蛋白培养处理可以提高胚胎的抗冻性和解冻复苏率，并且该提高效应对于正常孵化囊胚而言是显著的。
7结论
添加Clusterin蛋白能提高胚胎的抗冻性和解冻复苏率，并且该提高效应对于正常孵化囊胚而言是显著的。
对于本领域技术人员而言显而易见的是，本发明并不限于上述示例的细节，在不背离本发明的精神和宗旨的情况下，本领域技术人员能够想到本文所描述技术方案的变化方案，并且该变化方案也在本发明的保护范围内。本发明的保护范围由随附权利要求所限定。
另外，应当理解，虽然本说明书通过实施方式来对本发明进行了描述，但是并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案。本说明书的这种叙述方案仅为清楚起见，本领域技术人员应当将本说明书当作一个整体，各个实施方式中的技术方案可以适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其它实施方式。

Claims (25)

1.一种提高胚胎抗冻性和解冻复苏率的方法，包括在冷冻胚胎之前用体外胚胎培养液培养所述胚胎，其中所述体外胚胎培养液包含Clusterin蛋白，其中所述胚胎不包括人类胚胎。
2.根据权利要求1所述的提高胚胎抗冻性和解冻复苏率的方法，其中，用所述体外胚胎培养液培养所述胚胎4-8小时。
3.根据权利要求2所述的提高胚胎抗冻性和解冻复苏率的方法，其中，用所述体外胚胎培养液培养所述胚胎6小时。
4.根据权利要求1所述的提高胚胎抗冻性和解冻复苏率的方法，其中所述胚胎是来源于哺乳动物的胚胎。
5.根据权利要求4所述的提高胚胎抗冻性和解冻复苏率的方法，其中，提供所述胚胎的所述哺乳动物为小鼠、大鼠、猪、牛、羊或者非人灵长类动物。
6.根据权利要求1-5任一项所述的提高胚胎抗冻性和解冻复苏率的方法，其中所述胚胎和所述Clusterin蛋白来源于同一物种。
7.根据权利要求1-5任一项所述的提高胚胎抗冻性和解冻复苏率的方法，其中，所述Clusterin蛋白的浓度为10至30μg/μl。
8.根据权利要求7所述的提高胚胎抗冻性和解冻复苏率的方法，其中，所述Clusterin蛋白的浓度为20μg/μl。
9.根据权利要求1-5任一项所述的提高胚胎抗冻性和解冻复苏率的方法，其中，所述体外胚胎培养液还包含选自CZB培养基、MTF培养基、KSOM培养基、CR1培养基和CR2培养基中的任何一种培养基。
10.根据权利要求1-5任一项所述的提高胚胎抗冻性和解冻复苏率的方法，其中，所述Clusterin蛋白来源于哺乳动物。
11.根据权利要求10所述的提高胚胎抗冻性和解冻复苏率的方法，其中，所述Clusterin蛋白来源于小鼠、大鼠、猪、牛、羊或灵长类动物。
12.根据权利要求11所述的提高胚胎抗冻性和解冻复苏率的方法，其中，所述Clusterin蛋白来源于人。
13.一种冷冻胚胎的方法，包括以下步骤：
a)用体外胚胎培养液培养胚胎，其中所述体外胚胎培养液包含Clusterin蛋白；
b)将步骤a)中经培养的胚胎进行冷冻；
其中所述胚胎不包括人类胚胎。
14.根据权利要求13所述的冷冻胚胎的方法，其中，在步骤b)中，所述冷冻为程序化冷冻。
15.根据权利要求13所述的冷冻胚胎的方法，其中，用所述体外胚胎培养液培养所述胚胎4-8小时。
16.根据权利要求15所述的冷冻胚胎的方法，其中，用所述体外胚胎培养液培养所述胚胎6小时。
17.根据权利要求13所述的冷冻胚胎的方法，其中所述胚胎是来源于哺乳动物的胚胎。
18.根据权利要求17所述的冷冻胚胎的方法，其中，提供所述胚胎的所述哺乳动物为小鼠、大鼠、猪、牛、羊或者非人灵长类动物。
19.根据权利要求13-18任一项所述的冷冻胚胎的方法，其中所述胚胎和所述Clusterin蛋白来自于同一物种。
20.根据权利要求13-18任一项所述的冷冻胚胎的方法，其中，所述Clusterin蛋白的浓度为10至30μg/μl。
21.根据权利要求20所述的冷冻胚胎的方法，其中，所述Clusterin蛋白的浓度为20μg/μl。
22.根据权利要求13-18任一项所述的冷冻胚胎的方法，其中，所述体外胚胎培养液还包含选自CZB培养基、MTF培养基、KSOM培养基、CR1培养基和CR2培养基中的任何一种培养基。
23.根据权利要求13-18任一项所述的冷冻胚胎的方法，其中，所述Clusterin蛋白来源于哺乳动物。
24.根据权利要求23所述的冷冻胚胎的方法，其中，所述Clusterin蛋白来源于小鼠、大鼠、猪、牛、羊或灵长类动物。
25.根据权利要求24所述的冷冻胚胎的方法，其中，所述Clusterin蛋白来源于人。
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