KR20030018069A

KR20030018069A - 정자의 동결 보존

Info

Publication number: KR20030018069A
Application number: KR10-2003-7001748A
Authority: KR
Inventors: 가빈윌리엄에이; 블라쉬스테펜엠; 카무소크리스틴에이; 멜리칸데이비드티
Original assignee: 지티씨바이오쎄라퓨틱스,인크.
Priority date: 2000-08-10
Filing date: 2001-08-10
Publication date: 2003-03-04
Also published as: BR0113216A; CA2417595A1; EP1315418A2; WO2002012441A3; US20020131957A1; IL154226A0; WO2002012441A2; CN1450857A; US20040121303A1; JP2004505624A; AU2001286445A1; MXPA03001069A; NZ523911A; EP1315418A4

Abstract

본 발명은 정자를 동결 보존하는 방법을 특징으로 한다. 본 발명의 방법은 정자 샘플을 제공하는 단계; 정자 샘플을 제1 온도로 냉각시키는 단계; 제1 온도에서 정자 샘플을 유지시키는 단계; 정자를 제2 온도로 냉각시키는 단계; 제2 온도에서 정자를 유지시키는 단계; 및 제3 온도에서 정자를 저장하는 단계를 포함한다. 본 발명의 방법은 포유동물(예컨대, 형질전환 포유동물)로부터 유래한 정자를 동결 보존하는데 사용할 수 있으며, 연속 인공 수정 또는 체외 수정을 위해 정자를 보존하는데 사용할 수 있다.

Description

정자의 동결 보존{CRYOPRESERVATION OF SPERM}

형질전환 기술을 통하여 동물 게놈을 변형시킬 수 있게 됨으로써, 의료 분야의 응용에 대한 새로운 장이 열렸다. 현재, 가축(farm animal)의 유선(mammary gland)에 생의약용(biomedical) 단백질의 발현을 표적화함으로써, 고가의 치료용 단백질을 저비용으로 대량 생산할 수 있게 되었다([Houdebine(1995), Reprod. Natr. Dev. 35:609-617]; Maga 등(1995), Bio/Technology, 13:1452-1457]; Echelard(1996), Curr. Op. Biotechnol. 7:536-540]; 및 [Young 등(1997), BioPharm. 10:34-38] 참조). 1996년에 상위 15개 생물의약제제(biopharmaceutical)의 총 판매액이 75억 달러이었지만, 장래에도 상기 생물의약제제의 판매량이 계속하여 증가할 것으로 기대된다([Med. Ad News 16:30] 참조). 형질전환 기술은 고단위 용량의 필요성, 잦은 투여 횟수, 또는 많은 환자 집단 때문에 대량으로 필요한 단백질; 및 세포 배양법을 사용하여 생존가능한 상태로 대량 생산하기 곤란한 복합(complex) 단백질에 유용하고 매력적인 것이다. 또한, 형질전환 가축의 유즙(milk)에서의 인간용 약제의 생산은 미생물 생물반응기(bioreactor)와 관련된 다수의 문제점[예컨대, 번역 후 변형의 결핍, 부적당한 접힘(folding) 및 높은 정제 비용 등] 또는 동물 세포 생물반응기와 관련된 다수의 문제점[예컨대, 높은 자본 비용, 고가의 배양 배지 및 낮은 수득율 등]을 해결한다.

그러나, 창시자(founder) 형질전환 동물의 생산에 고비용이 소요될 수 있다. 종종 예상외로 귀중한 유전정보(genetics)를 보유하는 수컷 동물이 소실될 수 있다. 이러한 예상외의 사멸은 소유자에게 커다란 재정적 손실을 가져다 줄 수 있으며, 보다 치명적으로는 자손이 생산되지 않거나 정액(semen)이 종결 보존되지 않는 경우 동물의 유전정보의 손실을 가져다 줄 수 있다는 것이다. 형질전환 생산 환경(setting)에 있어서, 창시자 수컷의 손실은 유의적인 경제적 영향을 미칠 수 있고, 프로젝트(project)의 타임 프레임(time frame)을 붕괴시킨다.

다수의 종(種)으로부터 유래한 유전 물질은 인공 수정 및 시험관내 수정 기법을 사용하여 보존하거나 다음 세대에 물려준다. 정충(spermatozoa)을 동결시키는 방법은 세포에 대한 열 충격, 삼투압 충격 및/또는 기계적 충격; 및 세포 구조[특히, 원형질막(plasma membrane)]를 손상시킬 수 있는 결정(crystal)의 형성으로 인하여 까다로울 수 있다. 또한, 동결(freezing) 및 해동(thawing) 방법은 세포 손상에 대한 가능성과 함께 세포의 탈수를 야기시킬 수 있다. 이러한 장애를 극복하는 방법은 수많은 임의의 용도(예컨대, 의료업, 공업 및 농업 용도)를 위해 정자를 보존하는데 유용하다.

본 발명은 정자를 동결 보존하는 방법에 관한 것이다.

발명의 개요

본 발명은 정자의 대사 속도가 감소될 정도로 충분히 늦은 속도에서 제1 온도로 정자 샘플을 냉각시킨 후, 정자 샘플을 예컨대 액체 질소 중에 저장하기 전에 제2 온도에서 정자 샘플을 동결시킴으로써, 생존가능한 정자를 보존할 수 있다는 발견에 부분적으로 기초한다. 상기 배우자(gamete)의 저온 보존은 나중에 상기 배우자를 사용하는 것을 가능하게 한다. 또한, 본 발명자들은 글리세롤의 첨가 이전에 정자를 제1 온도로 냉각시킴으로써, 글리세롤 독성으로부터 정자를 보호할 수 있다는 것을 발견하였다. 상기 발명은 농업, 제약, 천연 자원 보존, 및 수의용 및 인간용 의약 분야에서 광범위한 용도를 갖는다. 특히, 본 발명의 방법은 개체의 유전 조성물(genetic composition)의 보존을 촉진시킨다.

따라서, 일 실시양태에 있어서, 본 발명은 정자를 제공하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 정자의 대사 속도가 감소될 정도로 충분히 낮은 속도에서 글레세롤 첨가로부터 정자를 보호하기에 충분한 제1 온도로 정자를 포함하는 샘플을 냉각시킴으로써, 냉각된 정자 샘플을 제공하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 글리세롤을 포함하는 용액을 첨가하는 단계; 및 글리세롤과 정자를 평형시키기에 충분한 기간 동안 제2 온도로 정자 샘플을 동결시킴으로써, 동결된 정자 샘플을 제공하여, 정자가 보존될 수 있도록 하는 단계를 더 포함한다.

일 구체예에 있어서, 본 발명의 방법은 정액(예컨대, 살아있는 동물로부터 수득된 정액) 샘플을 제공하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에 있어서, 예컨대 부검(necropsy)시에 정소상체(epididymis)로부터의 추출에 의해 정자 샘플을 수득한다. 상기 방법은 제공된 샘플로부터 유래한 정자를 예컨대 원심분리에 의해 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 냉각 단계 이전의 정자 샘플의온도는 약 27 ℃ 내지 약 38 ℃, 바람직하게는 약 37 ℃이다. 포유 동물[예컨대, 염소(goat), 소(cow), 양(sheep), 토끼(rabbit), 돼지(pig) 또는 쥐(mouse), 바람직하게는 염소 또는 토끼]로부터 정자 샘플을 수득할 수 있다. 바람직한 구체예에 있어서, 포유 동물은 형질전환 포유 동물, 예컨대 폴리펩티드를 암호화하는 형질전환 유전자(transgene)를 함유하는 포유 동물이다. 폴리펩티드는 형질전환 포유 동물 내에서의 발현이 바람직한 임의의 단백질일 수 있는데, 그 예로는 α-1 프로테이나제 저해제(α-1 proteinase inhibitor), 알칼리성 포스파타제(alkaline phosphatase), 안지오제닌(angiogenin), 항체, 세포외 수퍼옥사이드 디스뮤타제 (superoxide dismutase), 피브리노겐(fibrinogen), 글루코세레브로시다제 (glucocerebrosidase), 글루타메이트 탈탄산효소(glutamate decarboxylase), 인간 혈청 알부민(human serum albumin), 마이엘린 염기성 단백질(myelin basic protein), 프로인슐린(proinsulin), 가용성 CD4, 락토페린(lactoferrin), 락토글로불린(lactoglobulin), 라이소자임(lysozyme), 락트알부민(lactalbumin), 에리트로포이에틴(erythropoietin), 조직 플라스미노겐 활성화 인자(tissue plasminogen activator), 인간 성장 인자(haman growth factor), 항트롬빈 III(antithrombin III), 인슐린(insulin), 프로락틴(prolactin) 및 α1-항트립신(α1-antitrypsin) 등을 들 수 있다. 형질전환 유전자는 프로모터(promotor), 예컨대 유즙 특이성 프로모터를 더 포함할 수 있다. 유즙 특이성 프로모터는 카세인(casein), 유청 산 단백질(whey acid protein), α-락트알부민, β-락토글로빈(β-lactoglobin), 또는 락토페린 프로모터 중 어느 하나일 수 있다.

일 구체예에 있어서, 본 발명의 방법은 동결보호제 완충액(cryoprotectant buffer) 중에 냉각시킬 샘플을 제공하는 단계를 포함한다. 바람직한 구체예에 있어서, 동결보호제 완충액은 글리세롤이 결핍되어 있다. 상기 동결보호제 완충액은 난황(예컨대, 약 10% 내지 약 30%의 난황, 바람직하게는 약 15% 내지 약 25%의 난황, 보다 바람직하게는 약 20%의 난황)을 포함할 수 있다. 상기 동결보호제 완충액은 프룩토오스(fructose)[예컨대, 약 1 w/v % 농도의 프룩토오스]; 시트르산[예컨대, 약 1.5 w/v % 농도의 시트르산]; 트리스 완충액(Tris buffer); 및 항생물질 화합물[예컨대, 타이로신(tylosin), 겐타마이신(gentamicin), 린코스펙틴 (lincospectin) 및/또는 스펙티노마이신(spectinomycin)] 중 하나 이상을 더 포함할 수 있다.

일 구체예에 있어서, 제1 온도는 약 0 ℃ 내지 약 10 ℃, 바람직하게는 약 1 ℃ 내지 약 8 ℃, 보다 바람직하게는 약 5 ℃이다. 바람직한 구체예에 있어서, 분 당 약 0.2 ℃ 내지 약 0.5 ℃, 바람직하게는 분 당 약 0.5 ℃의 속도에서 제1 온도로 정자 샘플을 냉각시킨다. 다른 구체예에 있어서, 약 1.5시간 내지 약 4시간, 바람직하게는 약 1.5시간 이상 정자 샘플을 냉각시킨다. 다른 구체예에 있어서, 일정한 시간(예컨대, 약 4시간 내지 약 21시간, 바람직하게는 약 4시간) 동안 정자 샘플을 제1 온도로 유지시킨다.

일 구체예에 있어서, 글리세롤을 함유하는 용액의 글리세롤 농도는 약 5% 내지 약 10% 글리세롤, 바람직하게는 약 7% 글리세롤이다. 상기 용액은 글리세롤을 더 포함하는 냉각 단계 이전에 사용되는 동결보호제 완충액일 수 있다. 상기 동결보호제 완충액은 난황(예컨대, 약 10% 내지 약 30%의 난황, 바람직하게는 약 15% 내지 약 25%의 난황, 보다 바람직하게는 약 20%의 난황)을 포함할 수 있다. 상기 동결보호제 완충액은 프룩토오스[예컨대, 약 1 w/v % 농도의 프룩토오스]; 시트르산[예컨대, 약 1.5 w/v % 농도의 시트르산]; 트리스 완충액; 및 항생물질 화합물[예컨대, 타이로신, 겐타마이신, 린코스펙틴 및/또는 스펙티노마이신] 중 하나 이상을 더 포함할 수 있다.

바람직한 구체예에 있어서, 제2 온도는 약 -40 ℃ 내지 약 -100 ℃, 예컨대 약 -60 ℃ 내지 약 -90 ℃, 바람직하게는 약 -80 ℃일 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 동결된 정자 샘플을 약 7분 내지 약 20분, 바람직하게는 약 10분 내지 약 18분, 보다 바람직하게는 약 15분 동안 제2 온도로 유지시킨다.

일 구체예에 있어서, 본 발명의 방법은 동결된 정자 샘플을 -180 ℃ 내지 약 -200 ℃(예컨대, 약 -196 ℃)의 제3 온도에서 예컨대 액체 질소 중에 배치시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 다시 사용할 때까지 정자 샘플을 제3 온도로 유지시킬 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 동결된 정자 샘플은 제3 온도에서부터 해동된다. 상기 샘플은 약 1분 내지 약 5분, 바람직하게는 약 1.5분 동안 약 27 ℃ 내지 약 38 ℃에서 해동되는 것이 바람직하다. 일 구체예에 있어서, 해동 후의 생존가능한 정자 샘플의 백분율은 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100%이다.

본 발명의 다른 실시양태는 정자를 보존하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 정자의 대사 속도를 감소시킬 정도의 충분히 낮은 속도에서 약 2 ℃ 내지 약 10 ℃의 제1 온도로 정자 샘플을 냉각시킴으로써, 냉각된 정자를 생산하는 단계; 및 상기 냉각된 정자를 약 -60 ℃ 내지 약 -90 ℃의 제2 온도에서 동결시키는 단계; 및 상기 동결된 정자를 -180 ℃ 내지 약 -220 ℃, 바람직하게는 약 -196 ℃의 온도에서 저장하는 단계를 포함한다.

일 구체예에 있어서, 본 발명의 방법은 정액(예컨대, 살아있는 동물로부터 수득한 정액)의 샘플을 제공하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에 있어서, 예컨대 부검시에 정소상체로부터의 추출에 의해 정자 샘플을 수득한다. 상기 방법은 제공된 샘플로부터 유래한 정자를 예컨대 원심분리에 의해 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 냉각 단계 이전의 정자 샘플의 온도는 약 27 ℃ 내지 약 38 ℃, 바람직하게는 약 37 ℃이다. 포유 동물[예컨대, 염소, 소, 양, 토끼, 돼지 또는 쥐, 바람직하게는 염소 또는 토끼]로부터 정자 샘플을 수득할 수 있다. 바람직한 구체예에 있어서, 포유 동물은 형질전환 포유 동물, 예컨대 폴리펩티드를 암호화하는 형질전환 유전자를 함유하는 포유 동물이다. 폴리펩티드는 형질전환 포유 동물 내에서의 발현이 바람직한 임의의 단백질일 수 있는데, 그 예로는 α-1 프로테이나제 저해제, 알칼리성 포스파타제, 안지오제닌, 세포외 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 피브리노겐, 글루코세레브로시다제, 글루타메이트 탈탄산효소, 인간 혈청 알부민, 마이엘린 염기성 단백질, 프로인슐린, 가용성 CD4, 락토페린, 락토글로불린, 라이소자임, 락트알부민, 에리트로포이에틴, 조직 플라스미노겐 활성화 인자, 인간 성장 인자, 항트롬빈 III, 인슐린, 프로락틴 및 α1-항트립신 등을 들 수 있다. 형질전환 유전자는 프로모터, 예컨대 유즙 특이성 프로모터를 더 포함할 수 있다. 유즙 특이성 프로모터는 카세인, 유청 산 단백질, α-락트알부민, β-락토글로빈, 또는 락토페린 프로모터 중 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 방법은 동결보호제 완충액 중에 냉각시킬 샘플을 제공하는 단계를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 상기 동결보호제 완충액은 글리세롤, 예컨대. 약 5% 내지 약 10%의 글리세롤, 바람직하게는 약 7%의 글리세롤을 포함한다. 다른 바람직한 구체예에 있어서, 상기 동결보호제 완충액은 글리세롤이 결핍되어 있다. 상기 동결보호제 완충액은 난황(예컨대, 약 10% 내지 약 30%의 난황, 바람직하게는 약 15% 내지 약 25%의 난황, 보다 바람직하게는 약 20%의 난황)을 포함할 수 있다. 제1 동결보호제 완충액은 프룩토오스[예컨대, 약 1 w/v % 농도의 프룩토오스]; 시트르산[예컨대, 약 1.5 w/v % 농도의 시트르산]; 트리스 완충액; 및 항생물질 화합물[예컨대, 타이로신, 겐타마이신, 린코스펙틴 및/또는 스펙티노마이신] 중 하나 이상을 더 포함할 수 있다.

일 구체예에 있어서, 정자 샘플을 약 1 ℃ 내지 약 8 ℃, 보다 바람직하게는 약 5 ℃의 제1 온도로 냉각시킨다. 바람직한 구체예에 있어서, 분 당 약 0.2 ℃ 내지 약 0.5 ℃, 바람직하게는 분 당 약 0.5 ℃의 속도에서 제1 온도로 정자 샘플을 냉각시킨다. 다른 구체예에 있어서, 약 1.5시간 내지 약 4시간, 바람직하게는 약 1.5시간 이상 정자 샘플을 냉각시킨다. 일정한 시간(예컨대, 약 4시간 내지 약 21시간, 바람직하게는 약 4시간) 동안 정자 샘플을 제1 온도로 유지시킨다.

바람직한 구체예에 있어서, 냉각 단계 이전에 글리세롤이 결핍된 동결보호제완충액을 첨가하는 경우, 제1 온도에서 존재하는 동안 냉각된 정자 샘플에 제2 동결보호제 완충액을 첨가할 수 있다. 제2 동결보호제 완충액은 샘플에의 첨가 후 샘플의 글리세롤의 농도가 약 5% 내지 약 10%의 글리세롤, 바람직하게는 약 7%의 글리세롤이 되도록 글리세롤을 포함한다. 제2 동결보호제 완충액은 난황(예컨대, 약 10% 내지 약 30%의 난황, 바람직하게는 약 15% 내지 약 25%의 난황, 보다 바람직하게는 약 20%의 난황)을 포함할 수 있다. 제2 동결보호제 완충액은 프룩토오스[예컨대, 약 1 w/v % 농도의 프룩토오스]; 시트르산[예컨대, 약 1.5 w/v % 농도의 시트르산]; 트리스 완충액; 및 항생물질 화합물[예컨대, 타이로신, 겐타마이신, 린코스펙틴 및/또는 스펙티노마이신] 중 하나 이상을 더 포함할 수 있다.

일 구체예에 있어서, 냉각된 정자 샘플을 약 -80 ℃의 제2 온도에서 동결시킨다. 다른 바람직한 구체예에 있어서, 동결된 정자 샘플을 약 7분 내지 약 20분, 바람직하게는 약 10분 내지 약 18분, 보다 바람직하게는 약 15분 동안 제2 온도로 유지시킨다.

일 구체예에 있어서, 본 발명의 방법은 동결된 정자 샘플을 -180 ℃ 내지 약 -200 ℃(예컨대, 약 -196 ℃)의 제3 온도에서 예컨대 액체 질소 중에 배치시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 다시 사용할 때까지 정자 샘플을 제3 온도로 유지시킬 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 동결된 정자 샘플은 제3 온도에서부터 해동된다. 상기 샘플은 약 1분 내지 약 5분, 바람직하게는 약 1.5분 동안 약 27 ℃ 내지 약 38 ℃에서 해동되는 것이 바람직하다. 일 구체예에 있어서, 해동 후의 생존가능한 정자 샘플의 백분율은 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%,약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100%이다.

본 발명의 다른 실시양태는 정자를 제공하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 정자를 포함하는 샘플을 제공하는 단계; 상기 샘플로부터 정자를 분리하는 단계; 상기 분리된 정자를 제1 동결보호제 완충액과 배합하는 단계; 분 당 약 0.2 ℃ 내지 약 0.5 ℃, 바람직하게는 분 당 약 0.5 ℃의 속도에서 약 2 ℃ 내지 약 8 ℃, (예컨대 5 ℃)의 제1 온도로 정자를 냉각시킴으로써, 냉각된 정자를 생산하는 단계; 제2 동결보호제 완충액을 첨가하는 단계; 상기 냉각된 정자를 약 4시간 내지 약 21시간, 바람직하게는 약 4시간 동안 제1 온도로 유지시키는 단계; 약 10분 내지 약 15분(예컨대, 약 15분) 동안 제2 온도에서 상기 냉각된 정자를 동결시키는 단계; 및 상기 동결된 정자를 -180 ℃ 내지 약 -220 ℃, 바람직하게는 약 -196 ℃의 제3 온도에서 예컨대 액체 질소 중에 저장하는 단계를 포함한다. 다시 사용할 때까지 상기 샘플을 제3 온도로 유지시킬 수 있다.

일 구체예에 있어서, 본 발명의 방법은 정액(예컨대, 살아있는 동물로부터 수득한 정액)의 샘플을 제공하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에 있어서, 예컨대 부검시에 정소상체로부터의 추출에 의해 정자 샘플을 수득한다. 상기 방법은 제공된 샘플로부터 유래한 정자를 예컨대 원심분리에 의해 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 냉각 단계 이전의 정자 샘플의 온도는 약 27 ℃ 내지 약 38 ℃, 바람직하게는 약 37 ℃이다. 포유 동물[예컨대, 염소, 소, 양, 토끼, 돼지 또는 쥐, 바람직하게는 염소 또는 토끼]로부터 정자 샘플을 수득할 수 있다.바람직한 구체예에 있어서, 포유 동물은 형질전환 포유 동물, 예컨대 폴리펩티드를 암호화하는 형질전환 유전자를 함유하는 포유 동물이다. 폴리펩티드는 형질전환 포유 동물 내에서의 발현이 바람직한 임의의 단백질일 수 있는데, 그 예로는 α-1 프로테이나제 저해제, 알칼리성 포스파타제, 안지오제닌, 세포외 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 피브리노겐, 글루코세레브로시다제, 글루타메이트 탈탄산효소, 인간 혈청 알부민, 마이엘린 염기성 단백질, 프로인슐린, 가용성 CD4, 락토페린, 락토글로불린, 라이소자임, 락트알부민, 에리트로포이에틴, 조직 플라스미노겐 활성화 인자, 인간 성장 인자, 항트롬빈 III, 인슐린, 프로락틴 및 α1-항트립신 등을 들 수 있다. 형질전환 유전자는 프로모터, 예컨대 유즙 특이성 프로모터를 더 포함할 수 있다. 유즙 특이성 프로모터는 카세인, 유청 산 단백질, α-락트알부민, β-락토글로빈, 또는 락토페린 프로모터 중 어느 하나일 수 있다.

바람직한 구체예에 있어서, 제1 동결보호제 완충액은 글리세롤이 결핍되어 있다. 바람직한 구체예에 있어서, 냉각시킬 정자는 난황(예컨대, 약 10% 내지 약 30%의 난황, 바람직하게는 약 15% 내지 약 25%의 난황, 보다 바람직하게는 약 20%의 난황)을 포함하는 동결보호제 완충액과 배합한다. 상기 동결보호제 완충액은 프룩토오스[예컨대, 약 1 w/v % 농도의 프룩토오스]; 시트르산[예컨대, 약 1.5 w/v % 농도의 시트르산]; 트리스 완충액; 및 항생물질 화합물[예컨대, 타이로신, 겐타마이신, 린코스펙틴 및/또는 스펙티노마이신] 중 하나 이상을 더 포함할 수 있다.

바람직한 구체예에 있어서, 제2 동결보호제 완충액은 글리세롤(예컨대, 약 5% 내지 약 10%의 글리세롤, 바람직하게는 약 7%의 글리세롤)을 포함한다. 상기 동결보호제 완충액은 난황(예컨대, 약 10% 내지 약 30%의 난황, 바람직하게는 약 15% 내지 약 25%의 난황, 보다 바람직하게는 약 20%의 난황)을 더 포함하는 것이 바람직하다. 상기 동결보호제 완충액은 프룩토오스[예컨대, 약 1 w/v % 농도의 프룩토오스]; 시트르산[예컨대, 약 1.5 w/v % 농도의 시트르산]; 트리스 완충액; 및 항생물질 화합물[예컨대, 타이로신, 겐타마이신, 린코스펙틴 및/또는 스펙티노마이신] 중 하나 이상을 더 포함할 수 있다.

일 구체예에 있어서, 정자 샘플을 약 1.5시간 내지 약 4시간, 바람직하게는 약 1.5 시간 이상 제1 온도로 냉각시킨다.

바람직한 구체예에 있어서, 동결된 정자 샘플을 약 1분 내지 약 5분, 바람직하게는 약 1.5분 동안 약 27 ℃ 내지 약 38 ℃에서 해동시킨다. 일 구체예에 있어서, 해동 후의 생존가능한 정자 샘플의 백분율은 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100%이다.

본 발명의 다른 실시양태는 동물, 예컨대 포유 동물을 생산하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 전술한 임의의 방법에 의해 제공되는 정자와 난자를 수정시키는 단계를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 시험관 내에서 난자를 수정시킨다. 예컨대, 해동된 정자는 자궁경부내에서(intra-cervically) 또는 자궁(utero)에서 착상된다. 다른 구체예에 있어서, 난자는 시험관 내에서 수정된다. 바람직한 구체예에 있어서, 시험관내 수정에 사용되는 난자는 시험관 내에서 또는 생체내에서 성숙될 수 있다.

일 구체예에 있어서, 본 발명의 방법은 포유 동물로부터 수득한 정자와 난자를 수정시키는 단계를 포함한다. 상기 포유 동물은 염소, 소, 양, 토끼, 돼지 또는 쥐일 수 있다. 상기 포유 동물은 염소 또는 토끼임이 바람직하다. 바람직한 구체예에 있어서, 포유 동물은 형질전환 포유 동물, 예컨대 폴리펩티드를 암호화하는 형질전환 유전자를 함유하는 형질전환 포유 동물이다. 상기 폴리펩티드는 형질전환 포유 동물 내에서의 발현이 바람직한 임의의 단백질일 수 있는데, 그 예로는 α-1 프로테이나제 저해제, 알칼리성 포스파타제, 안지오제닌, 세포외 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 피브리노겐, 글루코세레브로시다제, 글루타메이트 탈탄산효소, 인간 혈청 알부민, 마이엘린 염기성 단백질, 프로인슐린, 가용성 CD4, 락토페린, 락토글로불린, 라이소자임, 락트알부민, 에리트로포이에틴, 조직 플라스미노겐 활성화 인자, 인간 성장 인자, 항트롬빈 III, 인슐린, 프로락틴 및 α1-항트립신 등을 들 수 있다. 형질전환 유전자는 프로모터, 예컨대 유즙 특이성 프로모터를 더 포함할 수 있다. 유즙 특이성 프로모터는 카세인, 유청 산 단백질, α-락트알부민, β-락토글로빈, 또는 락토페린 프로모터 중 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 다른 실시양태는 동물, 예컨대 전술한 임의의 방법에 의해 생산된 정자에 의해 수정된 난자로부터 유래한 동물을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 실시양태는 본 발명의 임의의 방법에 의해 처리된 보존된 정자의 샘플을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 실시양태는 동결보호제 완충액을 포함하는 정자의 동결보호용 키트(kit)를 특징으로 한다. 상기 키트는 정자를 보존하는 방법에 대한 설명서(instructions)를 포함한다.

바람직한 구체예에 있어서, 동결보호제 완충액은 글리세롤(예컨대, 약 5% 내지 약 10%의 글리세롤, 바람직하게는 약 7%의 글리세롤)을 포함할 수 있다. 다른 바람직한 구체예에 있어서, 동결보호제 완충액은 글리세롤이 결핍되어 있을 수 있다. 동결보호제 완충액은 난황(예컨대, 약 10% 내지 약 30%의 난황, 바람직하게는 약 15% 내지 약 25%의 난황, 보다 바람직하게는 약 20%의 난황)을 포함할 수 있다. 동결보호제 완충액은 프룩토오스[예컨대, 약 1 w/v % 농도의 프룩토오스]; 시트르산[예컨대, 약 1.5 w/v % 농도의 시트르산]; 트리스 완충액; 및 항생물질 화합물[예컨대, 타이로신, 겐타마이신, 린코스펙틴 및/또는 스펙티노마이신] 중 하나 이상을 더 포함할 수 있다.

바람직한 구체예에 있어서, 상기 설명서는 전술한 임의의 방법에 대해 상술되어 있는 프로토콜(protocol)을 포함한다. 바람직한 구체예에 있어서, 상기 키트는 무균 플라스틱 스트로(straw); 및 스트로 꽂이(rack)를 더 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에 있어서, 상기 키트는 정자의 생존도 분석용 염색제(stain)를 더 포함할 수 있고, 바람직하게는 상기 염색제의 사용법에 대한 설명서를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 실시양태는 동물(예컨대, 포유 동물) 생산용 키트를 특징으로 한다. 상기 키트는 동결보호제 완충액, 본 명세서에 기술되어 있는 임의의 방법에 의해 정자를 보존하는 방법에 대한 설명서, 및 보존된 정자와 난자를 수정시키는 방법에 대한 설명서를 포함한다.

본 발명의 다른 실시양태는 동물 생산용 키트를 특징으로 한다. 상기 키트는 본 명세서에 기술되어 있는 방법에 의해 보존된 정자, 및 보존된 정자와 난자를 수정시키는 방법에 대한 설명서를 포함한다.

일 구체예에 있어서, 본 발명의 방법은 포유 동물로부터 수득한 정자와 난자를 수정시키는 단계를 포함한다. 포유 동물은 염소, 소, 양, 토끼, 돼지 또는 쥐일 수 있다. 포유 동물은 염소 또는 토끼임이 바람직하다. 바람직한 구체예에 있어서, 포유 동물은 형질전환 포유 동물, 예컨대 폴리펩티드를 암호화하는 형질전환 유전자를 함유하는 형질전환 포유 동물이다. 상기 폴리펩티드는 형질전환 포유 동물 내에서의 발현이 바람직한 임의의 단백질일 수 있는데, 그 예로는 α-1 프로테이나제 저해제, 알칼리성 포스파타제, 안지오제닌, 세포외 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 피브리노겐, 글루코세레브로시다제, 글루타메이트 탈탄산효소, 인간 혈청 알부민, 마이엘린 염기성 단백질, 프로인슐린, 가용성 CD4, 락토페린, 락토글로불린, 라이소자임, 락트알부민, 에리트로포이에틴, 조직 플라스미노겐 활성화 인자, 인간 성장 인자, 항트롬빈 III, 인슐린, 프로락틴 및 α1-항트립신 등을 들 수 있다. 형질전환 유전자는 프로모터, 예컨대 유즙 특이성 프로모터를 더 포함할 수 있다. 유즙 특이성 프로모터는 카세인, 유청 산 단백질, α-락트알부민, β-락토글로빈, 또는 락토페린 프로모터 중 어느 하나일 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "형질전환 서열(transgenic sequence)"이란 인위적인 조작(artifice)에 의해 세포 내에 삽입되는 핵산 서열(예컨대, 하나 이상의 인간 단백질을 암호화하는 핵산 서열)을 의미한다. 본 명세서에서 형질전환 유전자라고도 칭하는 형질전환 서열은 동물 세포로부터 전부 또는 일부 발육하는 동물 게놈의 일부가 된다. 본 발명의 구체예에 있어서, 형질전환 서열은 염색체 게놈 내에 통합된다. 형질전환 서열이 게놈 내에 통합되는 경우, 단지 상기 형질전환 서열의 삽입에 의해서, 상기 형질전환 서열이 삽입되는 게놈의 핵산 서열에 있어서의 변화가 초래된다. 형질전환 서열은 일부 또는 전부가 이종성(species-heterologous)일 수 있다. 즉, 형질전환 서열 또는 이의 부분은 그것이 도입되는 세포와 상이한 종으로부터 유래할 수 있다. 형질전환 서열은 일부 또는 전부가 동종성(species-homologous)일 수 있다. 즉, 형질전환 서열 또는 이의 부분은 그것이 도입되는 세포와 동일한 종으로부터 유래할 수 있다. 형질전환 서열이 그것이 도입되는 세포의 내인성 유전자에 대하여 상동성인 경우[서열 센스(sense) 또는 종-상동성 센스에 있어서], 형질전환 서열은 하기 특성 중 하나 이상을 보유하는 것이바람직하다: (i) 형질전환 서열은 그것이 삽입되는 세포의 게놈의 서열을 변경시키는 방법으로 세포의 게놈 내에 삽입되거나 삽입되도록 설계된다(예컨대, 형질전환 서열은 내인성 유전자의 위치와 상이한 위치에 삽입되거나 형질전환 서열의 삽입으로 인하여 내인성 유전자의 서열에 있어서의 변화가 초래되도록 삽입된다).; (ii) 형질전환 서열은 돌연변이[즉, 형질전환 서열의 오발현(誤發現; misexpression)을 야기시키는 돌연변이]를 포함한다; 그리고, (iii) 형질전환 서열의 삽입에 의해, 형질전환 서열은 그것이 삽입되는 유전자의 오발현을 야기시킨다. 예컨대, 형질전환 서열의 삽입은 형질전환 유전자가 삽입되는 유전자의 녹아웃(knockout)을 야기시킬 수 있다. 형질전환 서열은 하나 이상의 전사 조절 유전자; 및 선택된 핵산의 발현의 원하는 레벨(level) 또는 패턴(pattern)에 필요할 수 있고, 선택된 핵산에 모두 작동가능하게 연결된 임의의 다른 핵산 서열(예컨대, 인트론)을 포함할 수 있다. 형질전환 서열은 엔헨서(enhancer) 서열, 및/또는 분비를 가능하게 하는 서열을 포함할 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "형질전환 세포"란 형질전환 유전자를 포함하는 함유하는 세포를 의미한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "형질전환 동물"은 동물 세포 중 하나 이상, 바람직하게는 본질적으로 전부가 인간의 개입에 의해(예컨대, 당업계에 공지된 형질전환 기법에 의해) 도입된 비상동성 핵산을 함유하는 비인간(non-human) 동물을 의미한다. 형질전환 유전자는 신중한 유전적 조작에 의한(예컨대, 미량주사, 또는 재조합 바이러스와의 감염에 의한) 세포 전구체 내에의 도입에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 세포 내에 도입될 수 있다.

본 명세서에 기술되어 있는 바와 같이, 포유 동물은 유선을 보유하고 유즙을 생산하는 모든 동물(인간을 제외함)을 의미한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "정액(semen)은 정자를 함유하는, 수컷 동물의 사정액(ejaculate)을 의미한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "정소상체의 정자(epididymal sperm)는 정소의 정소상체의 외과적 해부에 의해 수득되는 정자를 의미한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "동결보호제(cryoprotectant)"는 빙점 미만의 온도에서의 동결, 해동 및/또는 저장의 영향을 감소시킬 수 있는 제제를 의미한다. 동결보호제의 예로는 글리세롤 및 에틸렌 글리콜 등을 들 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "증량 완충액(extending buffer)"이란 증량 완충액없이 항온배양, 동결, 저장 및/또는 해동하는 기간 동안의 정자의 생존도, 운동성 및/또는 수정 능력에 비하여 항온배양, 동결, 저장 및/또는 해동하는 기간 동안의 정자의 생존도, 운동성 및/또는 수정 능력을 향상시키는 제제를 함유하는 용액을 의미한다.

"인공 수정(artificial insemination)"이란 정자의 수동(manual) 주입 또는 적용(application)에 의해 암컷 동물을 수정시키는 방법을 의미한다. 상기 방법에 있어서, 수컷 동물로부터 정자를 미리 수득하기 때문에, 수정시에 수컷 동물을 필요로 하지 않는다.

동일한 샘플 내에서 관찰되는 생존가능한 정자의 수를 동일한 샘플 내에서관찰되는 전체 정자의 수로 나눔으로써, 생존가능한 정자의 백분율을 측정할 수 있다. 또한, 생존가능한 정자의 백분율은 살아있는 정자/죽은 정자의 비율로 정의하기도 한다.

본 발명은 희귀하고 귀중한 유전적 계통(genetic stock)[예컨대, 멸종 위기에 처한 종(endangered species), 형질전환 동물, 및 개체(individual)]으로부터 획득할 수 있는 가임 수컷 배우자의 유지 및 보존을 비롯한 몇몇 편익을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 예컨대 예상외로 사멸되거나 또는 안락사될 필요가 있는 수컷 동물로부터 유래한 정자의 보존 방법을 제공한다. 이 방법은 멸종 위기에 처한 종을 보존하는데 유용하지만, 상기 멸종 위기에 처한 종의 생물 다양성에 대한 기여도에 대하여는 아직 평가할 수 없다. 또한, 정자의 보존은 당해 종(種)이 제한된 번식 주기(breeding cycle) 또는 계절성 번식 주기를 갖을 때에도 유용하다. 일반적으로, 이 발명은 일정 시간 경과 후에도 일관성있는 유전 조성물을 보유하는 동물의 팽창 및 유지를 촉진시킨다.

또한, 본 발명은 형질전환 동물에 대한 몇가지 편익을 제공한다. 형질전환 동물은 때때로 산출하기 곤란하고 산출하는데 고비용이 소요되므로 대규모의 상업적 투자를 요한다. 예를 들어, 게놈 내에의 형질전환 유전자의 삽입의 고유한 무작위성 및 낮은 빈도 때문에, 개체 창시자 형질전환 동물은 세포의 분획물 내에서만 형질전환 유전자를 운반할 수 있다. 즉, 개체 창시자 형질전환 동물은 모자이크(mosaic)이다. 또한, 개체 창시자 형질전환 동물은 다양한 농도에서 유즙 내의 형질전환 단백질을 발현시킬 수 있다. 따라서, 고발현성 개체로부터 유래한정충의 선택 및 보존은 형질전환 동물을 생성시키는데 투여된 초기 투자에 대한 장기간의 안전성 뿐만 아니라, 자손(progeny)을 스크리닝(screening)하고 컬링(culling)할 필요성의 회피에 의한 비용 절감을 제공한다.

본 발명의 다른 특징 및 장점은 하기 상세한 설명 및 첨부된 특허청구범위로부터 자명할 것이다.

상세한 설명

정자를 동결보존하는 방법에 대한 자세한 사항은 상세한 설명 및 하기 "실시예"라고 표제된 섹션에 기술되어 있다.

본 발명은 정자[예컨대, 나중에 동물(예컨대, 형질전환 동물)을 생산하는데 사용될 수 있는 형질전환 포유동물로부터 유래한 정자]를 보존하는 방법을 제공한다. 전술한 방법에 사용될 수 있는 몇가지 단계로는 다음과 같은 것들을 들 수 있다: 정자를 함유하는 샘플을 수득하는 단계, 정자의 생존도를 검정하는 단계, 정자를 분리하는 단계, 정자 샘플을 동결보존하는 단계, 수용자(recipient) 동물을 인공 수정하는 단계, 또는 시험관내 또는 생체내의 성숙된 난자의 시험관내 수정을 포함하는 시험관내 공정에 의해 배아(embryo)를 제공하는 단계.

본 발명은 하기 실시예에 추가로 예시되어 있는데, 하기 실시예에 의해 본 발명의 범주가 제한되는 것으로 해석되어서는 아니된다. 본원 명세서 전반에 걸쳐 참고로 인용된 모든 문헌(참고 문헌, 특허공보, 공개특허공보, 동시에 계류 중인 특허출원 등을 포함함)의 내용의 전부를 본 명세서에 참고로 인용한다.

정자 샘플의 수득

몇가지 방법에 의해, 보존될 정자를 포함하는 샘플을 수득할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "정자(sperm)"란 성숙한 수컷 배우자를 의미한다. 본 명세서에서 "정자(sperm)"와 정충(spermatozoa)"은 호환적으로 사용된다. 정자 샘플을 수득하는 방법은 수컷 동물로부터 또는 정소상체로부터 유래한 정자의 추출에 의해 정액을 수득하는 단계를 포함할 수 있다.

인공 질(膣; vagina)을 사용한 자극에 의해 동물로부터 정액을 수득할 수 있다. 예를 들어, 하기와 같이 인공 질을 사용할 수 있다.

샘플 수집 이전에, 수조(water bath)를 37 ℃로 평형시키고, 7% 글리세롤, 2.42% 트리스 완충액, 1.38% 시트르산, 1% 프룩토오스, 항생물질(100 ml 당, 5.5 mg의 타이로신, 27.5 mg의 겐타마이신, 16.5 mg의 린코스펙틴 및 33.0 mg의 스펙티노마이신), 및 20 v/v% 난황(특이성 병원체가 없음, 미국 커넥티컷주 노르위치 소재 SPAFAS)을 함유하는 증량제 용액(extender solution)(미국 위스콘신주 델라반 소재 Continental plastis Corp.)을 상기 온도로 평형시킨다. 갓 수집된 샘플을 수용하고 수송하기 위해, 온도계가 구비된 보온병에 35-39 ℃의 물을 공급한다. 또한, 인공 질을 준비한다. 인공 질을 사용하기 전에 인공 질을 분해하여, 구성 부품을 열수(hot water) 및 10% 놀바산(Nolvasan) 용액으로 완전히 세척한다. 이어서, 모든 부품을 역삼투압수/탈이온수(RO/DI water)로 헹구고 건조시킨다. 사용가능한 유형의 인공 질은 길이가 약 6-10 인치인 단단한 고무(firm rubber)의 외부 고리 및 팽창성 내부 고무 라이닝(lining)으로 구성된다. 상기 내부 라이닝에 온수를 채운 후, 공기로 팽창시켜 충분한 압력을 제공한다. 한쪽에 테이퍼된 원추형개구부(tapered conical open)를 구비한 다른 내부 라이닝을 인공 질 장치 내에 배치시킨다. 한쪽 끝에 적당량의 부인과용 무균 윤활제를 도포하고, 다른쪽에 15 ml의 원추형 무균 튜브를 삽입한다.

수컷(buck)이 건강한 상태에 있는지 확인하기 위하여, 수컷을 검사할 수 있다. 적당한 시정모(試精牡; teaser)를 선택한다. 시정모는 내인성 에스트로겐으로 약 24시간 전에 프라이밍(priming)된 난소 절제된 암컷(ovariectomized doe), 수집하는 날에 가열 상태로 존재하는 시정모, 또는 충분한 자극을 제공할 수 있는 임의의 동물(즉, 다른 수컷)일 수 있다. 인공 질, 및 수컷을 자극하는 시정모 암컷을 사용하여 정액을 수집한다. 7% 글리세롤, 2.42% 트리스 완충액, 1.38% 시트르산, 1% 프룩토오스, 항생물질(100 ml 당, 5.5 mg의 타이로신, 27.5 mg의 겐타마이신, 16.5 mg의 린코스펙틴 및 33.0 mg의 스펙티노마이신), 및 20 v/v% 난황(특이성 병원체가 없음, 미국 커넥티컷주 노르위치 소재 SPAFAS)을 함유하는 평형된 증량제(미국 위스콘신주 델라반 소재 Continental plastis Corp.)와 샘플을 즉시 혼합한다. 분석 및 보존을 위해 샘플을 즉시 실험실로 다시 수송한다.

동물의 정소상체로부터 직접 정자(예컨대, 정소상체의 정자)를 수득할 수 있다. 이 방법은 살아있는 동물 및 죽은 동물로부터 정자를 수득하는데 사용할 수 있다. 정소상체로부터 정자를 추출하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며(예컨대 문헌[Sharma 등(1997), Fertile Steril. 68:626-631]을 참조하라), 하기 실시예에 보다 상세히 설명되어 있다.

정자의 생존도의 검정

이어서, 수득된 정자 샘플을 분석하여, 예컨대 파동 운동 분석, 운동성 검정 및 생존도 계측에 의해 정자의 상태를 측정할 수 있다.

예를 들어, 저배율(10×) 하에서 파동 운동을 분석하고, 운동에 대한 점수를 0에서 5까지 매김으로써(0은 파동 운동이 없는 것이고, 5는 소용동이와 함께 빠른 파동 운동이 있는 것임), 정자의 육안(gross) 및 현미경 분석을 수행한다. 둘째, 고배율(40×) 하에서, 운동성 정자의 수를 계측하고, 전체 정자의 백분율로서 점수화할 수 있다. 이 백분율을 농도/수(concentration/count)와 곱하여, 육안으로 관찰시 생존가능한 정자의 수를 측정한다. 샘플은 동결보존하기에 충분할 정도로 고품질인 것이 바람직하다. 예를 들어, 약 40% 이상의 운동성을 갖는 정자를 사용할 수 있다. 다양한 방법에 의해 정자의 농도를 측정할 수 있다: 0.9% 식염수를 사용하여 1:10으로 희석된 정액을 함유하는 마이크로큐베트(microcuvette)를 Spermacue 광도계로 검정하거나; 또는 정자의 일련의 희석액(1;1000)을 제조하고, 혈구계수기(hemocytometer)로 계측한다.

15 ㎕의 방울(drop)의 생(生; Live)/사(死; Dead) 염색제[미국 콜로라도주 덴버 소재 Lane Manufacturing, Inc.의 Morphology Stain]가 있는 현미경 슬라이드 상에 15 ㎕의 방울의 증량된 샘플(extended sample)을 배치시킴으로써, 생존가능한 정자의 비율의 백분율을 측정할 수 있다. 2개의 방울을 혼합한 후, 얇은 도포 표본(smear)를 준비한다. 샘플을 공기 건조시킨 후, 100×유침(oil immersion) 렌즈가 구비된 현미경 하에서 생염료(vital dye)로 염색함으로써, 200개의 개별 정자의 수를 계측한다.

마지막으로, Spermac 염색제를 사용하여 정자의 아크로솜(acrosome)의 캡(cap) 및 꼬리의 형태를 관찰함으로써, 정자의 무결성(integrity)를 검정할 수 있다. 다른 현미경 슬라이드에 15 ㎕의 방울(drop)의 정자를 제공하고, 공기 건조시킨 후, 제조업체의 설명서에 따라 Spermac으로 염색한다. 아크로솜 캡을 손상되지 아니한 것과 손상된 것으로 나누어 점수화하고, 200개의 개별 정자 당 정상적인 꼬리의 수를 계측함으로써, 샘플의 전체적인 품질 및 형태를 측정한다.

정자의 분리

제공된 샘플로부터 정자를 임의로 분리할 수 있다. 예를 들어, 10 ml 부피의 샘플에의 증량제 완충액(extender buffer)의 첨가 후, 약 1500 rpm(500-600×g)에서 15분 동안, 또는 정자가 충분히 분리될 때까지 샘플을 원심분리할 수 있다. 상청액을 기울여 따른다. 이어서, 스트로 당 필요로 하는 적당한 양의 정자가 될 때까지 증량제 완충액으로 충분한 품질의 샘플을 희석시킨다. 통상 0.5 ml의 스트로가 사용되지만, 필요한 경우 0.25 ml의 스트로를 사용할 수 있다. 첨가하는 증량제의 양은 샘플에 따라 다양하게 변화시킬 수 있다. 증량제의 양을 조절하여, 스트로 당 1억개 내지 1억 5천만개, 바람직하게는 1억 5천만개의 생존가능한 정자의 정자 수를 보장할 수 있다.

2가지 유형의 증량제 용액을 사용할 수 있다. 1단계형 증량제 용액을 사용하는 경우, 이 단계에서 총 부피의 증량제를 첨가할 수 있다. 1단계형 증량제는 글리세롤을 함유한다. 2단계형 증량제 용액을 사용하는 경우, 이 시점에서 증량제의 최종 부피의 일부(예컨대, 약 절반의 부피)를 첨가할 수 있다. 2개의 파트(part)로구성된 증량제의 제1 파트, 즉 파트 A는 글리세롤이 결핍되어 있다. 제2 파트, 즉 파트 B는 글리세롤을 함유하고, 정자가 제1 온도로 냉각된 후에 첨가되는 것이 바람직하다. 파트 A 증량제는 난황, 파트 A 완충액의 농축물, 및/또는 항생물질의 농축물을 포함할 수 있다. 파트 B 증량제는 난황, 파트 B 완충액의 농축물 및/또는 2종의 항생물질의 농축물을 포함할 수 있다.

예를 들어, 다음과 같이 파트 A 증량제 및 파트 B 증량제를 제조할 수 있다. 사용하기 전에, 파트 A 증량제 및 파트 B 증량제 내에 항생물질 및 난황을 보충한다. 클로르헥시딘 용액 중에서 난(卵; egg)을 세척함으로써 일정한 부피의 난을 제조하고, 종이 타올(paper towel)로 건조시킬 수 있다. 난황낭(yolk sac)을 파열시키지 않도록 주의하면서, 각각의 난을 까서 개방되도록 한다. 난각(egg shell)으로 난황과 난백 알부민을 분리시킴으로써, 난황으로부터 난백 알부민을 제거한다. 비이커 위에 놓여진 거즈 상에 난황낭을 혼석(混釋)한다. 난황을 천자(穿刺)하고,이로써 난황이 거즈를 통해 흐르도록 한다. 난황을 충분히 처리하여, 각각의 증량제, 즉 파트 A 및 파트 B 중의 20%(v/v)의 난황 용액을 제조한다. 각각의 파트를 분리하여 제조할 수 있다. 파트 A 및 파트 B 각각의 경우에, 눈금 실린더(graduated cylinder) 내에 각각의 파트를 혼석하고, 증량제에 난황 및 항생물질을 첨가하고, 무균수를 사용하여 용액을 제조하여 용액의 부피가 500 ml가 되도록 한다. 바람직하게는, 다음과 같은 부피로 농축물, 난황 및 항생물질을 첨가한다. 1 리터의 파트 A 증량제의 경우, 200 ml의 난황, 340 ml의 파트 A 농축물, 20 ml의 재구성된 항생물질 용액을 첨가한 후, 무균수를 첨가하여 최종 부피가 1 리터가 되도록 한다. 1리터의 파트 B 증량제의 경우, 200 ml의 난황, 340 ml의 파트 B 농축물, 2 ml의 재구성된 항생물질 용액을 첨가한 후, 무균수를 첨가하여 최종 부피가 1 리터가 되도록 한다. 이어서, 라벨을 붙일 수 있고, 날짜를 적을 수 있으며, -20 ℃에서 저장 및 동결할 수 있는 50 ml 무균 원심분리 튜브 내에 5분의 4 ml 분취량의 증량제를 혼석할 수 있다.

정자의 동결보존

정액을 적당한 희석액으로 증량하면, 동결보존을 준비가 된 것이다. 이 지점에 이를 때까지 약 37 ℃에서 샘플을 유지시키는 것이 바람직하다. 약 37 ℃에서 물을 함유하는 비이커 내에 증량된 정액을 함유하는 튜브를 배치시킴으로써, 동결보존 공정을 시작할 수 있다. 이러한 배열(configuration)은 냉장고 내에 배치된다. 바람직하게는, 이와 같은 초기 냉각으로 인하여, 샘플 온도는 1.5 시간 내에 5 ℃(+/- 2 ℃)로 낮추어 진다. 냉각 공정 기간 중, 샘플을 혼합할 수 있고, 온도를 모니터링(monitoring)할 수 있으며, 냉각 속도를 측정할 수 있다.

2단계형 증량제 용액을 사용하는 경우, 샘플의 온도가 약 5 ℃에 이를 때, 파트 B 증량제를 첨가할 수 있다.

샘플을 동결시키기 전에 최소 약 4시간 이상 및 약 21시간 이하의 시간 동안 약 0-5 ℃(+/- 2 ℃)에서 샘플을 유지시킬 수 있다. 바람직하게는, 약 4시간 동안 약 5 ℃(+/- 2 ℃)에서 유지된 냉장고 내부에 샘플을 저장한다.

이 평형 기간 후, 샘플을 플라스틱 스트로 내에 옮기고, 약 5 ℃(+/- 2 ℃)로 미리 냉각시킬 수 있다. 스트로를 채우고, 플라스틱 플러그로 봉합하거나 열 봉합하고, 이들 공정이 완성될 때까지 얼음 베드(bed) 내의 스트로 꽂이 상에 스트로를 배치시켰다. 이어서, -80 ℃의 동결 장치(freezer) 내부에 스트로 꽂이를 배치시킬 수 있다. 바람직하게는, 약 15-20분 동안 -80 ℃의 동결 장치 내에 스트로를 유지시킨다. 액체 질소 내에 배치하기 직전에, 케인(cane) 내부에 스트로를 배치시키고, 고블렛(goblet)을 -80 ℃로 미리 냉각시킨다.

액체 질소 내에 배치된 경우, 질소 탱크 내에 스트로를 저장할 수 있다. 동결보존 후 3일 내에, 각각의 정자 샘플로부터 유래한 하나의 스트로를 분석할 수 있다. 동결된 스트로를 37 ℃의 수중에서 90초 동안 해동한다. 이어서, 전술한 바와 같이, 생존가능한 정자의 백분율, 및 아크로솜의 캡 및 꼬리의 무결성을 측정할 수 있다.

수용자 동물의 인공 수정

본 발명의 일 구체예에 있어서, 동결보존된 정자를 사용하여, 암컷 수용자를 인공 수정할 수 있다. 6 mg의 노르게스토메트 귀 이식물(norgestomet ear implant) [미국 조지아주 아텐스 소재 Rhone-Meriuex의 Synchromate-B]에 의해, 수용자에 있어서의 발정기 동조화(estrus synchronization)를 유도할 수 있다. 이식물의 삽입 후 13일째 되는 날에, 동물에 임마 혈청성 성선자극호르몬(pregnant mare serum gonadotropin; PMSG)(미국 캘리포니아주 라 졸라 소재 Calbiochem-Novabiochem Corp.)의 1회용 비(非)과잉배란성 주사(400 I.U)를 투여한다. 정관 절제된 수컷에 수용자 암컷을 교미시켜, 발정기 동조성을 보장한다(Selgrath 등의 문헌[Theriogenology, 1990. pp. 1195-1205]를 참조하라). 이어서, 전술한 바와 같이 정자를 해동할 수 있고, 당업자가 통상 실시하는 방법에 따라 수용자 암컷을 수정하는데 정자를 사용할 수 있다.

배아의 제공

다른 구체예에 있어서, 동결보존된 정자와의 시험관내 수정을 위해, 암컷 동물로부터 난자를 수집할 수 있다. 전술한 바와 같이, 발정기를 동조화하는데 노르게스토메트 귀 이식물을 사용할 수 있다. 7일째 되는 날에 1회용 프로스타글란딘(PGF2α)(미국 소재 Upjohn) 주사를 투여한다. 12일째 되는 날부터 시작하여, 암컷에 FSH(캐나다 소재 Vetrepharm의 Folltropin-V)를 4일 연속 1일 2회 투여한다. 14일째 되는 날에 노르게스토메트 귀 이식물을 제거한다. 이식물을 제거한지 24시간 후에, 48시간 이상 정관 절제된 수컷에 암컷을 수회 교미시킨다. 최종 FSH 주사 후, 1회 용량의 GnRH(미국 조지아주 아텐스 소재 Rhone-Meriuex)를 암컷에 주사한다. 마지막 교미 후 18시간 내지 24시간 후에. 중복부의 개복술(mid-ventral laparotomy)에 의해 암컷 공여자로부터 난자를 회수한다. 37 ℃에서 미리 데워진, Ca⁺⁺/Mg⁺⁺가 없는 PBS(인산 완충 식염수)를 사용하여, 난관으로부터 난자를 씻어 낸다. 2 mL의 L-글루타민, 100 U/ml의 페니실린 및 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신이 보충된 10% FBS와 평형을 이룬 M199 내에서 회수된 난자를 배양한다.

이어서, 당업계에서 통상 실시하는 방법에 따라, 해동된 정자와 상기 회수된 난자를 결합시킬 수 있다. 90%-45%의 퍼콜(Percoll) 구배를 사용하여, 정자를 해동 및 정제하고, 오일 하에 20% FBS, 7.7 mM 칼슘 락테이트, 100 U/ml 페니실린 및100 ㎍/ml 스트렙토마이신이 보충된 50 ㎕ 방울의 B-O 배지 중에서 18시간 동안 수정을 수행하고, 38 ℃의 5% CO₂중에서 항온배양한다. 제1 염소 난관 상피 세포의 공동배양(co-culture)와 함께, M199 + 10% FBS 중에서 시험관내 배양을 수행한다. 최소 제1 절단(2-세포 단계) 단계 및 최대 배반포(blastocyst) 단계까지 배양액 중에 배아를 유지시킬 수 있다. 2-세포 또는 4-세포 단계에서 배아를 옮기는 것이 바람직하다. 수용자에게 배아를 옮기는 방법과 같이 배아 발육용 각종 배양 배지는 당업계에 공지되어 있는데, 예컨대 문헌[Ebert 등(1994) Bio/Technology 12:699]을 참조하라.

하기 실시예에 의해 본 발명을 추가로 예시하는데, 하기 실시예에 의해 본 발명의 범주가 제한되는 것으로 해석되어서는 아니된다.

실시예 1

연령 범위가 13일 내지 7년이고, 3가지 품종(알핀, 사넨 및 토겐버그)으로 이루어진 32개의 수컷을 사용하였다. 이들 동물의 처리는 동물 관리 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee; IACUC)가 승인한 프로토콜을 따랐으며, 동물복지법(Animal Welfare Act; AWA)에 정해진 규정에 따랐다. 과용량의 바비투레이트를 정맥내 투여하여, 동물을 안락사시켰다. 음낭(scrotal sac)으로부터 약 5분 내지 약 10분 내에 정소를 제거하고, 38 ℃의 항온배양기 내에 배치시켰다. 개별적으로 정소를 처리하였다. 무균 외과용 칼을 사용하여, 외측벽막(parietal tunic)을 제거함으로써, 정소상체의 꼬리를 노출시켰다. 정소상체의 꼬리를 따라 소규모 측면 절개를 하여, 세뇨관(convoluted tubule)을 개방시켰다. 꼬리에 약간의 압력을 가하고, 이로써 정자의 소적(small droplet)이 형성되도록 한다. 상기 소적을 피펫으로 계량하여, 20 v/v%의 난황(표준 병원체가 없음, 미국 커넥티컷주 노르위치 소재 SPAFAS), 100 ml 당 7% 글리세롤, 2.42% 트리스 완충액, 1% 프룩토오스, 1.38% 시트르산, 5.5 mg의 타이로신, 27.5 mg의 겐타마이신, 16.5 mg의 린코스펙틴 및 33 mg의 스펙티노마이신으로 이루어진 평형된 증량제(미국 위스콘신주 델라반 소재 Continental Plastic Corp.)에 옮기었다. 정소상체의 꼬리가 완전히 추출될 때까지 상기 공정을 반복하였다. 양쪽 정소로부터 정자를 풀링(pooling)하였다. 정소상체의 정자가 존재하는 25개의 수컷으로부터 유래한 정소상체의 정자를 성공적으로 수집하고 동결보존하였다. 정자를 생산하는 수컷의 연령 범위는 4개월 내지 7년이고, 평균 연령은 2.1년이었다. 정자가 없는 7 마리의 수컷은 모두 생후 4개월 이내의 것이었다.

정자의 운동성 및 파동 운동을 분석하는데 15 ㎕의 재료를 사용하였다. 각각의 샘플에 개별 정자에 대한 운동 점수를 0-5 범위 내에서 매겼다(0은 운동성이 없는 것이고, 5는 빠른 선형 운동성이 있는 것임). 슬라이드 상에 15 ㎕의 샘플 및 15 ㎕의 Morphology Stain(미국 네브라스카주 하스팅스 소재 Society for Theriogenology)를 배치시키고, 상기 샘플과 Morphology Stain를 함께 혼합하고, 얇은 도포 표본을 준비함으로써, 살아있는 정자/죽은 정자의 백분율을 측정하였다. 100×유침 렌즈 하에서, 각 샘플 내의 200개의 정자 중에서 무작위로 정자를 추출하여 그 수를 세었다. 마찬가지로, Spermac염색제(미국 위스콘신주 베로나 소재 Minitube of America)를 사용하여, 아크로솜의 무결성을 측정하였다. 추출된 정자의 수는 1.1 ×10⁹내지 12.3 ×10⁹범위이었고, 그 평균은 3.8 ×10⁹±2.0 ×10⁹이었다. 정소상체의 정자 중 살아있는 정자/죽은 정자의 비율은 63% 내지 97% 범위이었고, 그 평균은 92%이었다. 해동 후의 살아있는 정자/죽은 정자의 비율은 32% 내지 95% 범위이었고, 그 평균은 83%이었다. 또한, 84%의 샘플은 해동 후에 손상되지 않은 아크로솜을 보유하였다. 이들 데이타는 표 1에 나타나 있다.

정자의 운동성, 살아있는 정자/죽은 정자의 비율, 및 정소상체의 수집물 중의 정자 수의 분석

염소의 연령(개월)	N = 각 샘플 내의 200개의 정자 중 무작위로 추출된 정자의 수	정자의 운동성	생존 가능한 정자의 백분율	해동 후의 생존가능한 정자의 백분율	정자의 총 수(10⁹/ml)
4-6	1	5	92.0 ±	80.0 ±	1.3 ±
6-18	11	5	94.0 ±	87.0 ±	4.3 ±
18-	13	5	90.0 ±	79.0 ±	2.4 ±
4-84	25	5	92.0 ±	83.0 ±	3.7 ±

* 상기 데이타의 수치는 평균 ± 표준 편차로 나타낸 것이다.

배합된 정액 샘플을 원심분리하고, 갓 평형된 증량제로 재현탁시켜 1 ml 당 300 ×10⁶개의 정자를 생성시켰다. 샘플을 37 ℃의 수조 내에 배치시키고, 분 당 0.5 ℃의 속도에서 1.5 시간 이상 5 ℃로 냉장 및 냉각시켰다. 최소 4시간 및 최대 21시간 동안 이 온도에서 샘플을 유지시켰다. 이어서, 정자 샘플을 0.5 ml의 스트로 내에 적재시키고, 약 10분 내지 약 15분 동안 -80 ℃의 동결 장치 내에 배치시킨 후, 액체 질소 내에 집어넣었다. 3일 이상 동결 저장 후, 2분 동안 37 ℃에서 하나의 스트로를 해동시킴으로써, 전술한 바와 같이 해동 후의 살아있는 정자/죽은 정자의 백분율 및 아크로솜의 무결성을 측정하였다. 북반구의 금렵기에 부검시 암컷으로부터 수득한 난소로부터 난자를 흡인하고, 10% 송아지 혈정, 5.0 U/ml의 FSH, 5.0 U/ml의 LH, 1 ㎍/ml의 에스트라디올, 및 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 M199(GibcoBRL) 중에서 18시간 내지 24시간 동안 시험관내 성숙시켰다. 90%-45%의 퍼콜 구배를 사용하여 정자를 해동 및 정제하고, 오일 하에서 18시간 동안 20% FBS, 7.7 mM의 칼슘 락테이트, 100 U/ml의 페니실린 및 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신이 보충된 B-O 배지의 50 ㎕의 방울 중에서 수정을 수행하고, 38 ℃에서 5% CO₂중에서 항온배양하였다. 제1 염소 난관 상피 세포의 공동 배양과 함께, M199 + 10% FBS 중에서 시험관내 배양을 수행하였다.

동결 보존된 후 연이어 해동된 정소상체 정자를 사용하는 시험관내 수정으로 인하여, 40%의 난자가 절단(cleavage)되고, 6%의 난자가 배반포 단계로 발육되었다(표 2 참조). 이와 대조적으로, 사정된 정자를 사용하는 시험관내 수정으로 인하여, 37%의 난자가 절단되고, 4%의 난자가 배반포 단계로 발육되었다.

0일에 프로게스테론 이식물(미국 조지아주 아텐스 소재 Rhone Meriux의 Synchromate-B)를 사용함으로써, 인공 수정에 사용되는 동물을 동조화하였다. 7일째 되는 날에 5 mg의 PGF2(Pharmacia & Upjohn)를 투여한 후, 14일째 되는 날에 300-400 IU IM의 PMSG(Calbiochem-Novabiochem)를 투여하였다. 14일째 되는 날에프로게스테론 이식물을 제거하고, 15-16일째 되는 날에 정관 절제된 수컷에의 교배를 수행하였다. 암컷의 정관 절제된 수컷과의 열 신호에 대해 체크하였다. 열을 고정시킨 후 약 12시간 후에, 해동된 정자의 하나의 스트로로 암컷을 1회 수정하였다. 사용된 기법은 자궁경부내 또는 자궁내 착상법이었다. 21개의 암컷에 대하여 인공 수정을 수행하였다. 암컷에 열이 없을 때까지 12시간마다 이 공정을 반복하였다. 32-36일째 되는 날에 암컷을 초음파 처리하고, 55-60일째 되는 날에 다시 암컷을 초음파 처리하였다. 145일째 되는 날부터 매일 암컷을 모니터링하였다. 새끼를 그 출생시에 제거하고, 암컷이 정상적인 유즙 생산을 하도록 하였다. 21개의 암컷의 인공 수정시 1개의 암컷만이 임신하였고(4%), 임신한 암컷의 1개의 새끼는 건강한 상태로 출생하였다.

해동된 정자를 사용하는, 염소 난자의 시험관내 수정의 결과

정자 샘플	해동된정자의 수	난자의 수	절단된 난자의 수(%)	상실배(Morula) 단계로 발육된 난자의 수(%)	배반포 단계로 발육된 난자의 수(%)
정소상체 정자의 샘플	3	168	67/168(40%)	32/168(19%)	10/168(6%)
사정된 정자의 샘플	3	169	63/169(37%)	29/169(17%)	6/169(4%)

귀중한 동물의 정소로부터 유래한 정소상체 정자의 성공적인 동결 보존으로 인하여, 동물이 예상외로 사멸하거나 또는 안락사될 필요가 있는 경우에 상기 정자의 유전적 기여가 후손에 전해질 수 있다. 사멸 후 수 시간 후에 상기 방법을 수행할 수 있는 가능성이 있었다. 본 연구에 있어서, 정소상체의 정액이 추출된 25개의동물 중 25개 모두 동결 보존된 정자를 생성시켰다. 이는 다른 종에 있어서의 정소상체의 추출에 대해 공표된 연구 논문과 일치한다(예컨대, 문헌[Foote 및 Igboeli(1968), J. Diary Sci. 10:1703-1705]; 및 문헌[Pauffler 등(1968), J. Reproduction Fertil. 17:125-137]를 참조하라).

배반포의 절단 및 발육을 야기시키는 조절된 염소의 시험관내 배아 생산 시스템 내에 정소상체의 정자를 배치시켰다. 발유성 배아를 수용자에 옮기지 않았다. 인공 수정에 사용된 정자는 다른 종에 있어서도 보고된 임신을 야기시켰다(상기 문헌[Foote 및 Igboeli(1968), J. Diary Sci. 10:1703-1705]; 및 문헌[Pauffler 등(1968), J. Reproduction Fertil. 17:125-137]를 참조하라).

정소상체로부터 추출된 정자의 양 및 품질에 영향을 미칠 가능성이 잇는 몇가지 인자는 동물의 연령 및 년수를 포함할 수 있다. 염소는 계절성 번식 동물이고, 따라서 비번식 계절 중에 정소상체로부터 추출된 정자의 양은 번식 계절 중에 추출된 정자의 양보다 적을 수 있다. 번식 계절 중에 정자가 수집될 수 있는 최소 연령은 4 개월이다. 정자가 추출될 수 있는 연령을 감소시킬 수 있는 한가지 가능한 방법은 번식 계절 중에 발정기 암컷과 수컷을 상호작용시키는 것이다. 이는 재생산 시스템을 촉진시키고, 환경적 인자에 의하는 것보다 빨리 정자 생산을 개시하는 것을 보조할 수 있다.

따라서, 부검시에 염소로부터 유래한 정소상체의 정자를 양호한 양 및 품질로 동결 보존할 수 있다. 상기 정자를 시험관내 발육 및 인공 수정에 사용하여, 귀중한 유전 정보를 증식시킬 수 있다. 최적의 번식 계절 및 정액 생산에 대한 감소된 연령 등과 같은 인자들은 유리한 효과를 가져올 수 있다. 정소로부터 추출된 정액의 양을 증가시킴으로써, 정자의 수득율을 더 높일 수 있다. 추가의 연구는 인공 수정을 위해 정소상체의 정자의 사용을 최적화하는 것과 병행하여, 상기 이론에 대한 조사를 수행할 것을 필요로 한다.

실시예 2

인공 질을 사용하여, 형질전환 수컷 토끼로부터 유래한 정자를 수집하였다. 글리세롤이 결핍되어 있는 파트 A 증량제로 샘플을 희석시키고, 담아 상기 파트 A 증량제를 약 37 ℃ 온도의 보온병에 담아 실험실로 다시 수송하였다. 다음과 같은 사항을 제외하고는, 실시예 1에서와 마찬가지로 샘플을 처리하였다. 스트로 당 2천만개의 정자를 적재하였다. 샘플을 4 ℃로 냉각시킨 후, 글리세롤을 함유하는 파트 B 증량제를 첨가하였다. 이어서, 실시예 1에 기술되어 있는 바와 같이 샘플을 -80 ℃로 동결시키고, 1개월 동안 액체 질소 중에 샘플을 저장하였다. 4개의 더치종(Dutch) 토끼를 호르몬, 난포자극호르몬 및 인간 융모성 성선자극호르몬과 동조화시켰다. 90초 동안 37 ℃의 수조 중에 정자 샘플을 배치시킴으로써, 정자 샘플을 해동하였다. 이어서, 샘플을 사용하여, 동조화된 암컷을 인공 수정하였다. 샘플을 사용하여 수정된 2개의 어미로부터 11개의 자손이 출생하였다.

본 명세서에 참고로 인용된 모든 특허 및 참고 문헌의 내용 모두를 본 명세서에 참고로 인용한다.

다른 구체예는 하기 특허청구범위의 범주에 속한다.

Claims

정자의 제공 방법으로서,

a) 정자의 대사 속도가 감소될 정도로 충분히 느린 속도에서 글리세롤 독성으로부터 정자를 보호하기에 충분한 제1 온도로 정자를 포함하는 샘플을 냉각시킴으로써, 냉각된 정자 샘플을 제공하는 단계;

b) 상기 냉각된 정자 샘플에 글리세롤을 포함하는 용액을 첨가하는 단계; 및

c) 글리세롤과 정자를 평형시키기에 충분한 기간 동안 제2 온도로 상기 냉각된 정자 샘플을 동결(凍結)시킴으로써, 동결된 정자 샘플을 제공하는 단계를 포함함으로써, 정자를 보존하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 글리세롤이 결핍되어 있는 동결보호제(cryoprotectant) 완충액 중에서 냉각되는 정자 샘플을 제공하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 동결보호제 완충액은 약 10% 내지 약 30%의 난황(egg yolk)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 글리세롤 용액의 첨가 후의 샘플 중의 글리세롤의 농도는 약 5% 내지 약 10% 글리세롤인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 정자 샘플은 포유 동물로부터 수득되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 제1 온도는 약 0 ℃ 내지 약 10 ℃인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 정자 샘플은 약 4시간 내지 약 21시간 동안 제1 온도에서 유지되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 정자는 분 당 약 0.2 ℃ 내지 약 0.5 ℃의 속도에서 제1 온도로 냉각되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 정자는 약 1.5시간 내지 약 4시간 이상 제1 온도로 냉각되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 제2 온도는 약 -40 ℃ 내지 약 -100 ℃인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 샘플은 약 7분 내지 약 20분 동안 제2 온도에서 유지되는것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 약 -190 ℃ 내지 약 -200 ℃의 제3 온도에서 동결된 정자샘플을 저장하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
a) 제1 동결보호제 완충액과 정자를 배합하는 단계;

b) 정자의 대사 속도가 감소될 정도로 충분히 늦은 속도에서 약 2 ℃ 내지 약 10 ℃의 제1 온도로 상기 정자를 냉각시킴으로써, 냉각된 정자를 생산하는 단계;

c) -60 ℃ 내지 약 -90 ℃의 제2 온도에서 상기 냉각된 정자를 동결시키는 단계; 및

d) 액체 질소 중에 상기 동결된 정자를 저장하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 정자의 보존 방법.
제13항에 있어서, 제1 동결보호제 완충액은 약 5% 내지 약 10%의 글리세롤을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서, 제1 동결보호제 완충액은 글리세롤이 결핍되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서, 정자 샘플은 포유 동물로부터 수득되는 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서, 정자 샘플은 약 4시간 내지 약 21시간 동안 제1 온도에서 유지되는 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서, 정자는 분 당 약 0.2 ℃ 내지 약 0.5 ℃의 속도에서 제1 온도로 냉각되는 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서, 정자는 약 1.5시간 내지 약 4시간 이상 제1 온도로 냉각되는 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 제2 동결보호제 완충액은 정자가 제1 온도로 냉각된 후 정자가 제2 온도로 더 냉각되기 전에 샘플에 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
제20항에 있어서, 제2 동결보호제 완충액은 약 5% 내지 약 10%의 글리세롤을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서, 제2 온도는 약 -80 ℃인 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서, 샘플은 약 7분 내지 약 20분 동안 제2 온도에서 유지되는 것을 특징으로 하는 방법.
a) 정자를 포함하는 샘플을 제공하는 단계;

b) 샘플로부터 정자를 분리하는 단계;

c) 글리세롤이 결핍되어 있는 제1 동결보호제 완충액과 상기 분리된 정자를 배합하는 단계;

d) 분 당 약 0.2 ℃ 내지 약 0.5 ℃의 속도에서 약 2 ℃ 내지 약 8 ℃의 제1 온도로 상기 정자를 냉각시킴으로써, 냉각된 정자를 생산하는 단계;

e) 글리세롤을 함유하는 제2 동결보호제 완충액을 첨가하는 단계;

f) 약 4시간 내지 약 21시간 동안 제1 온도에서 상기 냉각된 정자를 유지시키는 단계;

g) 약 10분 내지 약 15분 동안 약 -60 ℃ 내지 약 -90 ℃의 제2 온도에서 상기 냉각된 정자를 동결시키는 단계;

h) 소정의 시간 동안 약 -180 ℃ 내지 약 -220 ℃의 온도에서 상기 동결된 정자를 저장하는 단계; 및

i) 상기 정자를 해동(解凍)함으로써, 정자를 제공하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 정자의 제공 방법.
제24항에 있어서, 정자는 약 37 ℃의 수조(water bath) 내에서 약 90초 동안해동되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항, 제13항 또는 제24항의 방법에 의해 보존된 정자와 난자를 수정(fertilization)하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 동물의 생산 방법.