CN101884322A

CN101884322A - 条斑星鲽精子冷冻保存方法

Info

Publication number: CN101884322A
Application number: CN2010102309295A
Authority: CN
Inventors: 柳学周; 徐永江; 刘新富; 陈超; 孙中之; 王妍妍; 曲建忠
Original assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2010-07-20
Filing date: 2010-07-20
Publication date: 2010-11-17

Abstract

一种简单实用的条斑星鲽精子冷冻保存的新方法，包括精液采集、基础液选择、抗冻剂选择、精子稀释与平衡、精子冷冻、精子复苏、精子复苏后受精效果检验。本发明是选取性成熟的亲鱼采集优质精液，选择适宜基础液及抗冻液，精液与基础液按照体积比1∶2混合后，冰上或者4℃平衡5min，按照三步降温法降温至-160℃后停留5min，直接投入液氮中保存；解冻时，将冷冻管在液氮蒸汽中停留3min，迅速投入28℃水浴解冻60s后置于室温下完全溶解，获得可用于规模化苗种繁育所需的大批量的高质量精液。本发明简单易行实用，精液保存解冻后活动率高、受精效果好，平均受精率可达到70％以上，孵化率达到50％以上，与新鲜精液的受精效果和孵化效果相同。为苗种繁育企业规模化育苗，提供了容易操作的精液长期或短期保存技术。

Description

条斑星鲽精子冷冻保存方法

技术领域：

本发明属于低温生物学精子冷冻保存技术，是一种在超低温环境中长期冷冻保存条斑星鲽精子的简单实用方法。

背景技术：

低温生物学是研究低温对生物所产生的影响及低温在与生物有关的各个领域中应用的科学，几乎所有在低于正常生物适于生存的温度下进行的与生物有关的实验研究或理论探索都属于低温生物学的范畴。在种质资源保护方面，用低温保存动物的精子和胚胎，不仅可以在生产实践中实现巨大的经济效益，还可以把优良品种的精子和胚胎长期保存起来，以防传染病等自然灾害造成优良品种灭绝。目前，人们正在利用低温冷冻保存的方法，建立各种生物的遗传种质库以用于各种生物的遗传学研究和生物多样性保护。

自1953年Blaxter首次报道冷冻保存大西洋鲱的精子以来，学者们已经对200多种鱼类精子的冷冻保存技术进行了研究(美国，Oxford出版社，Billard et al.，1995)。在鱼类精子冷冻保存中，所使用最频繁的是保护剂为二甲亚砜(Me₂SO)，占所有报道的98％，其次是甘油(GLY)(50％)、乙二醇(EG)(29％)、甲醇(MeOH)(16％)、1，2-丙二醇(PG)(5％)及二甲基乙酰胺占3％，但是蛋黄作为保护剂却较为少见，如张永忠等(2006)报道使用二甲亚砜和蛋黄组合获得了较好的牙鲆精子冷冻保存效果，使用蛋黄的优点在于获取方便，精子保护效果明显，精子经冷冻解冻后受精率高(中国海洋大学博士学位论文，青岛，中国)。人工养殖和温光调控条件下，条斑星鲽雄性亲鱼常常会表现出批次精液间质量的巨大差异，多数时候表现出粘稠度过高、精子活动率低(30％-40％)、精子寿命短(1-6min)等症状，严重影响了卵子受精率和批量受精卵的获取，阻碍了人工繁育技术的发展，因此在获取了质量较高的精液后，用冷冻保存的方法将高质量的精液保存下来，待获取高质量卵子后进行人工受精，可显著提高人工繁殖成功的几率，保证获取优质受精卵和苗种培育的顺利进行。

发明内容：

本发明的目的：提供一种简单、实用的条斑星鲽精子冷冻保存方法，以期为企业规模化苗种繁育提供可长期或短期精液保存的技术，同时为条斑星鲽遗传育种、生物多样性保护和雌核发育技术提供技术支持。

本发明按以下技术方案实现：

本方法内容包括：1、精液采集；2、基础液和抗冻保护剂的配制；3、精子的稀释与平衡；4、精子冷冻；5、精子复苏及受精效果检验。

1、精液采集：选择性腺发育成熟的雄性亲鱼，利用150mg/L的MS222麻醉后，采用腹部挤压法获取精液，以吸管和干燥的1.5ml离心管收集精液。采集精液时先用干净的毛巾或者吸水纸擦拭干净生殖孔周围粘液和水分，确保采集的精液无尿液和体表粘液的污染。精液采集后置于冰上保存，活动率85％以上的精液样品用于精子冷冻。

2、基础液和抗冻保护剂的配制：

基础液：选用Hank`s液作为基础液，配方为：CaCl₂·2H₂O 0.185g/L，无水MgSO₄0.09767g/L，KCl 0.4g/L，Na₂HPO₄ 0.06g/L，NaCl 8g/L，NaH₂PO₄0.04788g/L，D-葡萄糖1g/L，NaHCO₃0.35g/L，以1N HCL调节pH至7.6。

抗冻保护剂：以15％DMSO(以基础液的体积百分比)+10％蛋黄作为抗冻保护剂(以基础液的体积百分比)。

3、精子的稀释与平衡：将精液与预冷的(4℃)基础液按照体积比1∶2混合，然后按照要求(15％DMSO+10％蛋黄)的体积比加入抗冻保护剂，在冰上或4℃冰箱平衡4-6min。

4、精子冷冻：将平衡后的精液和稀释液混合液按照每管1.8ml分装入2ml冻存管中，按照三步降温法进行冷冻保存。即液氮罐颈部(约-15℃)停留2min；液氮面上约4cm处(约-160℃)停留5min；再直接投入液氮中保存。

5、精子复苏受精效果检验

精子复苏：解冻时，先将冻存管提至罐口，在液氮蒸汽中停留约3min，然后将冷冻管取出迅速置于28℃水浴中解冻60s至精液微融化，取出置于室温下至完全融化。在室温条件下，以自然海水激活精子，检查精子活力。

冻精复苏后的受精效果检验：人工采集成熟条斑星鲽卵子，以新鲜精液和解冻后复苏精液分别进行人工授精。将受精卵置于循环流水孵化系统进行孵化，统计受精率和孵化率。

本发明与已有技术对比其特点：

1、采用DMSO和蛋黄两种抗冻保护剂混合冷冻精液，毒性作用小，且使用蛋黄，成本低、来源广泛、取材方便。

2、采用三步降温法，可快速度过冷冻损伤易发区，操作简单。

3、精液保存解冻后活动率高、受精效果好，平均受精率可达到70％以上，孵化率达到50％以上，与新鲜精液的受精效果和孵化效果基本相同。

4、本发明的精子冷冻保存技术易于掌握，对于从事条斑星鲽苗种繁育的企业具有重要的实用价值，冷冻精液可在实际生产中大规模应用。同时对于条斑星鲽的种质保存、遗传育种和养殖业的可持续发展具有重要意义。

具体实施方式：

下面通过具体实施例叙述本发明的技术内容：

本研究在青岛忠海水产有限公司进行，研究内容包括：1、精液采集；2、基础液和抗冻剂的配制；3、精子的稀释与平衡；4、精子冷冻；5、精子复苏及冻精复苏后的受精效果检验。具体实旋过程如下：

1、精液采集：在繁殖季节挑选达到性成熟的雄性条斑星鲽亲鱼，利用150mg/L的MS222麻醉后，采用腹部挤压法获取精液，用手轻轻挤压腹部，可挤出乳白色精液，以吸管和干燥的1.5ml离心管收集精液。采集精液时先用干净的毛巾或者吸水纸擦拭干净生殖孔周围粘液和水分，精液采集过程中严禁尿液和体表粘液的污染。精液采集后置于冰上备用，镜检达到85％以上的样品用于冷冻保存。

2、基础液和抗冻保护剂的配制：

基础液：选用Hank`s液作为基础液，配方为：CaCl₂·2H₂O 0.185g/L，无水MgSO₄0.09767g/L，KCl 0.4g/L，Na₂HPO₄0.06g/L，NaCl 8g/L，NaH₂PO₄0.04788g/L，D-葡萄糖1g/L，NaHCO₃0.35g/L，以1N HCL调节pH至7.6，备用。

抗冻保护剂：以15％DMSO(以基础液的百分比)+10％蛋黄作为抗冻保护剂(以基础液的百分比)。

3、精子的稀释与平衡：精液与预冷的(4℃)基础液按照体积比1∶2进行混合，然后调节加入15％的DMSO(基础液的百分比)和10％的蛋黄，混合均匀后，置于冰上或者4℃冰箱平衡5min。

4、精子冷冻：将平衡后的精液和稀释液混合液按照每管1.8ml分装入2ml冻存管中，按照三步降温法进行冷冻保存。即液氮罐颈部(约-15℃)停留2min，液氮面上约4cm处(约-160℃)停留5min，再直接投入液氮中保存。

5、精子复苏受精效果检验

精子复苏：每20天抽取一管精液进行复苏检查精子活力，冻精活力基本与冷冻前鲜精一致。冷冻2-3个月后，取出数管冷冻精液解冻，在液氮罐口部蒸汽中停留3mi n后快速投入28℃水浴解冻60s至精液微融化，(管中冻精外层开始融化)，取出置于室温下完全融化。在室温条件下，取1μl解冻精液加50μl自然海水激活精子，检查精子活力，精子活力为75.8％±4.6。

冻精复苏后的受精效果检验：人工采集成熟条斑星鲽卵子，使用解冻后的精液与新鲜精液分别与刚采集的圆斑星鲽卵子进行人工受精，将受精卵置于循环流水孵化系统进行孵化，统计受精率和孵化率。其方法是：将解冻后的精液用海水激活后即刻对卵子授精，授精时间10min，用新鲜海水冲洗卵子并将沉卵和漂浮卵分离，将各组处理中的浮卵分别计数500粒，分别移入容积为10000ml的玻璃缸内，用控温仪控温11-12℃孵化，盐度30，连续微量充气流水孵化，3h后检查受精率，受精率为72.7％±3.9；249h后胚胎孵化出膜，统计孵化率为52.6％±4.5。

经过3次大规模(卵子量在500ml以上)受精检验，发现平均受精率均可达到70％以上，孵化率达到50％以上，与新鲜精液的受精效果和孵化效果基本相同，表明该种精子冷冻保存方法效果良好，可用于大规模苗种生产。

Claims

1.一种条斑星鲽精子冷冻保存方法，其特征在于它的方法内容包括：(1)、精液采集，(2)、基础液选择，(3)、抗冻剂选择，(4)、精子的稀释与平衡，(5)、精子冷冻，(6)、精子复苏，(7)、冻精复苏后的受精效果检验；

(1)、精液采集：选择性腺发育成熟的雄性亲鱼，利用150mg/L的MS222麻醉后，采用腹部挤压法获取精液，以吸管和干燥的1.5ml离心管收集精液，精液采集后置于冰上保存，活动率85％以上的精液样品用于精子冷冻；

(2)、基础液选择：选用Hank`s液作为基础液，配制方法：CaCl₂·2H₂O0.185g/L，无水MgSO₄0.09767g/L，KCl 0.4g/L，Na₂HPO₄0.06g/L，NaCl 8g/L，NaH₂PO₄ 0.04788g/L，D-葡萄糖1g/L，NaHCO₃0.35g/L，以1N HCL调节pH至7.6，备用；

(3)、抗冻剂选择：以基础液终浓度的百分比15％DMSO+10％蛋黄作为抗冻保护剂；

(4)、精子的稀释与平衡：将精液与预冷的4℃稀释液按照体积比1∶2混合，然后按照要求的体积比加入抗冻剂，在冰上或4℃冰箱平衡4-6min；

(5)、精子冷冻：将平衡后的精液和稀释液混合液按照每管1.8ml分装入2ml冻存管中，按照三步降温法进行冷冻保存；即液氮罐颈部约-15℃停留2min；液氮面上约4cm处约-160℃停留5min；再直接投入液氮中保存；

(6)、精子复苏：解冻时，先将冻存管提至罐口，在液氮蒸汽中停留约3min，然后将冷冻管取出迅速置于28℃水浴中解冻60s，管中冻精外层开始融化，取出置于室温下至完全融化；在室温条件下，以自然海水激活精子，检查精子活力；

(7)、冻精复苏后的受精效果检验：人工采集成熟条斑星鲽卵子，以新鲜精液和解冻后复苏精液分别进行人工授精；将受精卵置于循环流水孵化系统进行孵化，统计受精率和孵化率。