CN112352777A - 一种精子冻存液及其在中华乌塘鳢精子冷冻保存中的应用 - Google Patents
一种精子冻存液及其在中华乌塘鳢精子冷冻保存中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112352777A CN112352777A CN202011299933.7A CN202011299933A CN112352777A CN 112352777 A CN112352777 A CN 112352777A CN 202011299933 A CN202011299933 A CN 202011299933A CN 112352777 A CN112352777 A CN 112352777A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sperm
- cryopreservation
- sperms
- freezing
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 title claims abstract description 86
- 241001669697 Bostrychus sinensis Species 0.000 title claims abstract description 50
- 239000007788 liquid Substances 0.000 title claims abstract description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 33
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 66
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 53
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 52
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 32
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 27
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 claims description 18
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 18
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 18
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 claims description 17
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 15
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 15
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 14
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims description 13
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims description 13
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 13
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 13
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 claims description 13
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 claims description 12
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 claims description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 9
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 claims description 9
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims description 9
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims description 9
- LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L calcium chloride dihydrate Chemical compound O.O.[Cl-].[Cl-].[Ca+2] LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 9
- 229940052299 calcium chloride dihydrate Drugs 0.000 claims description 9
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 9
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 claims description 9
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 claims description 9
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 claims description 9
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 claims description 9
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 8
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 claims description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 3
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 claims description 3
- 229960002816 potassium chloride Drugs 0.000 claims description 3
- 230000002528 anti-freeze Effects 0.000 claims description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 2
- 238000010008 shearing Methods 0.000 claims description 2
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 abstract description 29
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 19
- 241001669656 Odontobutis obscura Species 0.000 abstract description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 11
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 10
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 10
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 9
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 8
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 7
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 7
- 230000009027 insemination Effects 0.000 description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 5
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 5
- 230000019100 sperm motility Effects 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 3
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 3
- 230000007045 gastrulation Effects 0.000 description 3
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 3
- 241000252344 Acipenser gueldenstaedtii Species 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 230000002338 cryopreservative effect Effects 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- OCKGFTQIICXDQW-ZEQRLZLVSA-N 5-[(1r)-1-hydroxy-2-[4-[(2r)-2-hydroxy-2-(4-methyl-1-oxo-3h-2-benzofuran-5-yl)ethyl]piperazin-1-yl]ethyl]-4-methyl-3h-2-benzofuran-1-one Chemical compound C1=C2C(=O)OCC2=C(C)C([C@@H](O)CN2CCN(CC2)C[C@H](O)C2=CC=C3C(=O)OCC3=C2C)=C1 OCKGFTQIICXDQW-ZEQRLZLVSA-N 0.000 description 1
- 241001108024 Odontobutis sinensis Species 0.000 description 1
- 241001327682 Oncorhynchus mykiss irideus Species 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 239000007798 antifreeze agent Substances 0.000 description 1
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 1
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000004017 vitrification Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physiology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种精子冻存液及其在中华乌塘鳢精子冷冻保存中的应用，本发明的精子冻存液包括精子稀释液和抗冻保护剂，所述精子稀释液包括氯化钠、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、氯化钾、二水氯化钙、D‑葡萄糖和七水硫酸镁，所述抗冻保护剂包括二甲亚砜、牛血清白蛋白和海藻糖，该精子冻存液用于冻存中华乌塘鳢精子，损伤小。同时，本发明还提供了一种中华乌塘鳢精子的冷冻保存方法，该方法简便快速，用于冻存中华乌塘鳢精子，复苏后精子活力高，体外受精率高，可用于中华乌塘鳢种质资源的保护以及大规模人工繁殖和生产中。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种精子冻存液及其在中华乌塘鳢精子冷冻保存中的应用。
背景技术
生殖细胞经过减数分裂产生单配体的精子和卵子，精子和卵子结合形成受精卵，从而产生新的个体。因此，生殖细胞是种群繁衍的基础，是重要的种质资源。生殖细胞冻存是一种长期有效保存种质资源的方法。鱼类成熟卵子含有大量的卵磷脂和蛋白等物质，导致卵子冻存异常困难；而鱼类精子体积小、数量多、内含物质相对简单，因此鱼类生殖细胞冻存的对象首选精子。精子冻存技术对于克服重要水产养殖育种的时间和地域限制，以及促进品种的改良具有重要意义。
低温冻存技术目前主要分为梯度降温冻存技术和快速低温冻存技术。其中，梯度降温冻存技术容易产生冰晶，从而对冻存细胞(包括精子)产生损伤。快速冻存技术通过高浓度非渗透生物保护剂让细胞脱水，同时渗透性保护剂进入细胞，然后经液氮快速冻存完成玻璃化，从而保护冻存细胞。由于大部分海水鱼类可耐受较高渗透压，因此，快速冻存技术在海水鱼类精子冻存中有较好的应用前景。目前，该技术已初步应用于冻存少数海水鱼类的精子，如虹鳟和俄罗斯鲟鱼等。然而，现有的海水鱼类精子冻存方法不具备普适性，不同海水鱼类的冻存方法和冻存效率存在非常明显的差异。
中华乌塘鳢是一种生活在潮间带的名贵鱼类。其人工繁殖受到以下3个难题的困扰：(1)其精巢易出现发育不良；(2)有近10％的个体形成同时具有精卵巢的败育性腺；(3)成熟雄鱼的精子难以通过人为轻轻挤压而排出。因此，收集和冻存中华乌塘鳢高质量的精子具有非常重要的经济价值。然而，现有的海水鱼类精子冻存方法应用于中华乌塘鳢的精子冻存时，效果较差，不利于中华乌塘鳢的大规模生产和繁殖。
因此，开发高效的精子低温冻存技术，并将其应用到保存高质量中华乌塘鳢的精子，进行大规模生产和繁殖，对其种质资源的保护和养殖品种的改良均具有重要的意义。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种精子冻存液及其应用，针对中华乌塘鳢精子的特性，本发明的精子冻存液中添加了多种生物保护剂，用于中华乌塘鳢精子的冷冻保存，损伤小，复苏后精子活力高，体外受精率高，能够用于人工授精。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明提供一种精子冻存液，所述精子冻存液包括精子稀释液和抗冻保护剂，所述精子稀释液包括氯化钠、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、氯化钾、二水氯化钙、D-葡萄糖和七水硫酸镁，所述抗冻保护剂包括二甲亚砜(DMSO)、牛血清白蛋白(BSA)和海藻糖。
本发明根据中华乌塘鳢精子的特性，配制了适合中华乌塘鳢精子活动的稀释液，并且在稀释液中添加了多种抗冻保护剂(DMSO、BSA和海藻糖)制备精子冻存液，将中华乌塘鳢精子和上述冻存液混合，在精子冻存液的高渗透压下，精子可以快速脱水，并且抗冻试剂能够较好的进入精子细胞中，精子在冻存液的短暂平衡下，经过快速低温冷冻可以有效防止冰晶的形成，从而减少精子的损伤，提高精子的冻存成活率以及体外受精率。
优选地，上述的精子稀释液包括以下质量浓度的成分：
(7.10-8.10)g/L氯化钠、(0.30-0.70)g/L磷酸二氢钠、(1.05-1.30)g/L碳酸氢钠、(0.20-0.60)g/L氯化钾、(0.15-0.45)g/L二水氯化钙、(0.50-1.50)g/L D-葡萄糖、(0.15-0.35)g/L七水硫酸镁。
进一步地，所述精子稀释液包括以下质量浓度的成分：
7.66g/L氯化钠、0.51g/L磷酸二氢钠、1.16g/L碳酸氢钠、0.38g/L氯化钾、0.31g/L二水氯化钙、1.00g/L D-葡萄糖、0.26g/L七水硫酸镁。
优选地，所述精子稀释液的pH为6.5-7.5，渗透压为(300-350)mOsmol/kg。进一步地，所述精子稀释液的pH为7.0、渗透压为320mOsmol/kg。
优选地，所述抗冻保护剂添加到精子稀释液中时，二甲亚砜(DMSO)的质量百分比浓度为5％-15％，牛血清白蛋白(BSA)的质量百分比浓度为1％-3％，海藻糖的质量浓度为(35.0-45.0)g/L。进一步地，DMSO的质量百分比浓度为10％，BSA的质量百分比浓度为10％，海藻糖的质量浓度为38.7g/L。
本发明还提供了上述的精子冻存液在中华乌塘鳢精子冷冻保存中的应用。
本发明还提供了一种中华乌塘鳢精子的冷冻保存方法，具体包括以下步骤：
S1、精液采集：在繁殖期，选择精巢发育成熟的健康雄性亲鱼，通过剪碎精巢收集精子；
S2、精液稀释：采用权利要求1-4任一项所述的精子冻存液对步骤S1中收集得到的精子进行稀释；
S3、精子冻存：先将步骤S2稀释后的精液置于室温进行避光平衡，然后置于液氮表面上方冷冻停留一段时间，紧接着没入液氮中进行快速冻存处理，最后转移到-150℃低温保存。
本发明的中华乌塘鳢精子冷冻保存方法方便快捷，无须特殊的冻存装备，冻存效率高。精子活性检测和体外授精结果表明，复苏后精子活力高，体外受精率高，冻存3个月的中华乌塘鳢精子存活率为97.27％，冻存18个月的中华乌塘鳢精子存活率为95.74％，体外平均受精率为55.23％。
优选地，步骤S2所述精子与精子冻存液的混合体积比为1:(2-4)。进一步地，所述精子与精子冻存液的混合体积比为1:(2-3)。
优选地，避光平衡后置于液氮表面上方(4-6)cm处停留(10-20)分钟。进一步地，避光平衡后置于液氮表面上方5cm处停留15分钟。
优选地，所述快速冻存处理的时间为(12-36)小时。进一步地，所述快速冻存处理的时间为24小时。
优选地，所述避光平衡的时间为8-12分钟。进一步地，所述避光平衡的时间为10分钟。
优选地，精子冻存后还包括精子复苏方法：即将步骤S3冻存的精子在37℃恒温水浴锅中轻轻摇晃迅速解冻后，于4度避光保存，使精子复苏。
精子冻存的最终目标是能应用于体外受精，复苏采用本发明方法冻存的中华乌塘鳢精子，将其与成熟卵子混合后进行体外受精，通过统计受精后原肠期胚胎的比例，计算得出冻存精子产生的受精卵的比例超过50％，与已报道的海水鱼类(除俄罗斯鲟鱼冻存精子受精率为90％之外)冻存精子的受精率(均不超过50％)相比，本发明方法可以大大提高冻存精子的体外受精率，有利于冻存精子的大规模生产和繁殖。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供一种精子冻存液，所述精子冻存液包括精子稀释液和抗冻保护剂，所述精子稀释液包括氯化钠、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、氯化钾、二水氯化钙、D-葡萄糖和七水硫酸镁，所述抗冻保护剂包括二甲亚砜、牛血清白蛋白和海藻糖，该精子冻存液用于冻存中华乌塘鳢精子，损伤小。同时，在上述精子冻存液的基础上，本发明还提供了一种中华乌塘鳢精子的冷冻保存方法，该方法简便快速，不仅无须特殊的冻存装备，而且所用的冻存溶液可以一次性配置，经0.22微米滤膜过滤便可得到无菌的冻存液，可以长期于4℃储备；采用本发明方法冻存中华乌塘鳢精子，复苏后精子活力高，体外受精率高；可见，本发明具有简便性、损伤小、精子活力和体外受精率高等优势。因此，本发明可应用于中华乌塘鳢种质的保护以及大规模人工繁殖和生产中，具有重要的经济价值。
附图说明
图1为台盼蓝染色中华乌塘鳢精子的图片。
图1中，A为新鲜精子；B为实施例4中冻存3个月的中华乌塘鳢精子；C为实施例4中冻存18个月的中华乌塘鳢精子；D为对比例1中冻存18个月的中华乌塘鳢精子；E为对比例2中冻存18个月的中华乌塘鳢精子；标尺，50微米。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到的。
实施例1一种精子冻存液
该精子冻存液包括精子稀释液和抗冻保护剂。其中，精子稀释液包括以下质量浓度的成分：
7.66g/L氯化钠、0.51g/L磷酸二氢钠、1.16g/L碳酸氢钠、0.38g/L氯化钾、0.31g/L二水氯化钙、1.00g/L D-葡萄糖、0.26g/L七水硫酸镁。
上述精子稀释液的pH为7.0、渗透压为320mOsmol/kg。
抗冻保护剂包括DMSO、BSA和海藻糖。
将抗冻保护剂添加到精子稀释液中时，DMSO的体积百分比浓度为10％，BSA的质量百分比浓度为10％，海藻糖的质量浓度为38.7g/L。
实施例2一种精子冻存液
该精子冻存液包括精子稀释液和抗冻保护剂。其中，精子稀释液包括以下质量浓度的成分：
7.10g/L氯化钠、0.30g/L磷酸二氢钠、1.05g/L碳酸氢钠、0.20g/L氯化钾、0.15g/L二水氯化钙、0.50g/L D-葡萄糖、0.15g/L七水硫酸镁。
上述精子稀释液的pH为6.5、渗透压为300mOsmol/kg。
抗冻保护剂包括DMSO、BSA和海藻糖。
将抗冻保护剂添加到精子稀释液中时，DMSO的质量百分比浓度为5％，BSA的质量百分比浓度为5％，海藻糖的质量浓度为35.0g/L。
实施例3一种精子冻存液
该精子冻存液包括精子稀释液和抗冻保护剂。其中，精子稀释液包括以下质量浓度的成分：
8.10g/L氯化钠、0.70g/L磷酸二氢钠、1.30g/L碳酸氢钠、0.60g/L氯化钾、0.45g/L二水氯化钙、1.50g/L D-葡萄糖、0.35g/L七水硫酸镁。
上述精子稀释液的pH为7.5、渗透压为350mOsmol/kg。
抗冻保护剂包括DMSO、BSA和海藻糖。
将抗冻保护剂添加到精子稀释液中时，DMSO的质量百分比浓度为15％，BSA的质量百分比浓度为15％，海藻糖的质量浓度为45.0g/L。
实施例4中华乌塘鳢精子的冻存方法
(1)精子的采集：在中华乌塘鳢繁殖季节(5-9月份)，选择精巢发育成熟的健康雄性亲鱼，取出精巢，剪碎，加入500微升生理盐水(0.9％氯化钠溶液)，将精巢组织块溶液收集至1.5mL，静置2分钟，收集精子悬浊液。经过细胞活力检测精子的活力为98.2％，细胞计数板计数精子浓度为3.2×108个/mL。
(2)精子的稀释：将步骤(1)采集的精子分别与实施例1的精子冻存液按照1:2的体积比混匀，稀释后的精子浓度为1.07×108个/mL。
(3)精子冻存：将步骤(2)中经精子冻存液稀释后的精子转移到冻存管中，室温避光平衡10分钟，在将冻存管置于液氮表面上方5cm处停留15min后，冻存管没入液氮中冻存24小时，最后转移到-150度冰箱保存。
(4)精子活性检测：在冻存3个月和18个月之后，将装有精子的冻存管取出立即于37℃水浴锅中迅速轻轻摇晃解冻至溶液完全融化后取出，于4度避光保存，使精子复苏。然后按照下述方法进行精子活性检测：
将复苏后的精子用精子稀释液溶液稀释10倍，用1％的台盼蓝染色液与稀释后的精子进行染色后放于显微镜下观察，评估精子的活性。台盼蓝染色结果如图1A所示，新鲜精子的存活率为97.68％(2866/2934，N＝5)；如图1B所示，冻存3个月的中华乌塘鳢精子存活率为97.27％(1531/1574，N＝5)；如图1C所示冻存18个月的中华乌塘鳢精子存活率为95.74％(3348/3497，N＝5)。
(5)复苏冻存精子的体外授精
在冻存3个月之后，将装有精子的冻存管取出立即于37℃水浴锅中迅速轻轻摇晃解冻至溶液完全融化后取出，于4度避光保存，使精子复苏，然后按照下述方法进行体外授精：
按照大约1000颗卵添加50微升复苏精子的比例将精子和卵子轻轻混合均匀30秒后，倒入27摄氏度1.5％的人工海水中进行授精。在授精8小时后，统计进入原肠期胚胎的比例。如表1的结果所示，新鲜精子(精子来源1)的平均受精率为85.5％；本实施例的精子冻存液冻存的中华乌塘鳢精子(精子来源2)，其平均受精率为55.23％。
实施例5中华乌塘鳢精子的冻存方法
(1)精子的采集：在中华乌塘鳢繁殖季节(5-9月份)，选择精巢发育成熟的健康雄性亲鱼，取出精巢，剪碎，加入500微升生理盐水(0.9％氯化钠溶液)，将精巢组织块溶液收集至1.5mL，静置2分钟，收集精子悬浊液。经过细胞活力检测精子的活力为98.2％，细胞计数板计数精子浓度为3.2×108个/mL。
(2)精子的稀释：将步骤(1)采集的精子分别与实施例1的精子冻存液按照1:3的体积比混匀，稀释后的精子浓度为7.54×107个/mL。
(3)精子冻存：将步骤(2)中经精子冻存液稀释后的精子转移到冻存管中，室温避光平衡8分钟，在将冻存管置于液氮表面上方4cm处停留10min后，冻存管没入液氮中冻存12小时，最后转移到-150度冰箱保存。
(4)精子活性检测：检测方法同实施例4，其中，冻存3个月的中华乌塘鳢精子存活率为91.52％(图略)；冻存18个月的中华乌塘鳢精子存活率为88.37％(图略)。
(5)复苏冻存精子的体外授精：方法同实施例4，其平均受精率为50.35％。
实施例6中华乌塘鳢精子的冻存方法
(1)精子的采集：在中华乌塘鳢繁殖季节(5-9月份)，选择精巢发育成熟的健康雄性亲鱼，取出精巢，剪碎，加入500微升生理盐水(0.9％氯化钠溶液)，将精巢组织块溶液收集至1.5mL，静置2分钟，收集精子悬浊液。经过细胞活力检测精子的活力为98.2％，细胞计数板计数精子浓度为3.2×108个/mL。
(2)精子的稀释：将步骤(1)采集的精子分别与实施例1的精子冻存液按照1:4的体积比混匀，稀释后的精子浓度为6.21×107个/mL。
(3)精子冻存：将步骤(2)中经精子冻存液稀释后的精子转移到冻存管中，室温避光平衡12分钟，在将冻存管置于液氮表面上方6cm处停留20min后，冻存管没入液氮中冻存36小时，最后转移到-150度冰箱保存。
(4)精子活性检测：检测方法同实施例4，其中，冻存3个月的中华乌塘鳢精子存活率为89.51％(图略)；冻存18个月的中华乌塘鳢精子存活率为84.43％(图略)。
(5)复苏冻存精子的体外授精：方法同实施例4，其平均受精率为48.61％。
对比例1中华乌塘鳢精子的冻存方法
(1)精子的采集：在中华乌塘鳢繁殖季节(5-9月份)，选择精巢发育成熟的健康雄性亲鱼，取出精巢，剪碎，加入500微升生理盐水(0.9％氯化钠溶液)，将精巢组织块溶液收集至1.5mL，静置2分钟，收集精子悬浊液。经过细胞活力检测精子的活力为93.2％，细胞计数板计数精子浓度为3.2×108个/mL。
(2)精子的稀释：将步骤(1)采集的精子分别与精子冻存液按照1:2的体积比混匀，稀释后的精子浓度为2.03×108个/mL。精子冻存液的成分为：实施例1的精子稀释液+其他常见的冻存保护剂：20％(质量浓度)乙二醇(EG)+20％(质量浓度)甘油。
(3)精子冻存：将步骤(2)中经精子冻存液稀释后的精子转移到冻存管中，室温避光平衡10分钟，再将冻存管置于液氮表面上方5cm处停留15min后，冻存管没入液氮中冻存24小时，最后转移到-150度冰箱保存。
(4)精子活性检测：在冻存18个月之后，将装有精子的冻存管取出立即于37℃水浴锅中迅速轻轻摇晃解冻至溶液完全融化后取出，于4度避光保存，使精子复苏。然后按照下述方法进行精子活性检测：
将复苏后的精子用精子稀释液溶液稀释10倍，用1％的台盼蓝染色液与稀释后的精子进行染色后放于显微镜下观察，评估精子的活性。台盼蓝染色结果如图1D所示，该方法冻存精子的存活率为50.00％(305/610，N＝5)。
(5)复苏冻存精子的体外受精
在冻存3个月之后，将装有精子的冻存管取出立即于37℃水浴锅中迅速轻轻摇晃解冻至溶液完全融化后取出，于4度避光保存，使精子复苏，然后按照下述方法进行体外授精：
按照大约1000颗卵添加50微升复苏精子的比例将精子和卵子轻轻混合均匀30秒后，倒入27摄氏度1.5％的人工海水中进行授精。在授精8小时后，统计进入原肠期胚胎的比例。如表1的结果所示，对比例的精子冻存液冻存的中华乌塘鳢精子(精子来源3)，其平均受精率为10.6％。
对比例2中华乌塘鳢精子的冻存方法
(1)精子的采集：在中华乌塘鳢繁殖季节(5-9月份)，选择精巢发育成熟的健康雄性亲鱼，取出精巢，剪碎，加入500微升生理盐水(0.9％氯化钠溶液)，将精巢组织块溶液收集至1.5mL，静置2分钟，收集精子悬浊液。经过细胞活力检测精子的活力为93.2％，细胞计数板计数精子浓度为3.2×108个/mL。
(2)精子的稀释：将步骤(1)采集的精子分别与精子冻存液按照1:2的体积比混匀，稀释后的精子浓度为2.03×108个/mL。精子冻存液的成分为：实施例1的精子稀释液+其他常见的冻存保护剂：10％(体积浓度)DMSO+20％(质量浓度)乙二醇(EG)+15％(质量浓度)甘油。
(3)精子冻存：将步骤(2)中经精子冻存液稀释后的精子转移到冻存管中，室温避光平衡10分钟，在将冻存管置于液氮表面上方5cm处停留15min后，冻存管没入液氮中冻存24小时，最后转移到-150度冰箱保存。
(4)精子活性检测：在冻存18个月之后，将装有精子的冻存管取出立即于37℃水浴锅中迅速轻轻摇晃解冻至溶液完全融化后取出，于4度避光保存，使精子复苏。然后按照下述方法进行精子活性检测：
将复苏后的精子用精子稀释液溶液稀释10倍，用1％的台盼蓝染色液与稀释后的精子进行染色后放于显微镜下观察，评估精子的活性。台盼蓝染色结果如图1E所示，该方法冻存精子的存活率为61.30％(854/1391，N＝5)。
(5)复苏冻存精子的体外受精
在冻存3个月之后，将装有精子的冻存管取出立即于37℃水浴锅中迅速轻轻摇晃解冻至溶液完全融化后取出，于4度避光保存，使精子复苏，然后按照下述方法进行体外授精：
按照大约1000颗卵添加50微升复苏精子的比例将精子和卵子轻轻混合均匀30秒后，倒入27摄氏度15％的人工海水中进行授精。在授精8小时后，统计进入原肠期胚胎的比例。如表1的结果所示，对比例的精子冻存液冻存的中华乌塘鳢精子(精子来源4)，其平均受精率为33.5％。
表1不同精子冻存液冻存中华乌塘鳢精子的受精率统计表
注：1、新鲜精子；2、本发明实施例4冻存的精子；3对比例1冻存的精子；4、对比例2冻存的精子。*表示后续90％以上的胚胎发育畸形。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种精子冻存液，其特征在于，所述精子冻存液包括精子稀释液和抗冻保护剂，所述精子稀释液包括氯化钠、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、氯化钾、二水氯化钙、D-葡萄糖和七水硫酸镁，所述抗冻保护剂包括二甲亚砜、牛血清白蛋白和海藻糖。
2.根据权利要求1所述的一种精子冻存液，其特征在于，所述精子稀释液包括以下质量浓度的成分：
(7.10-8.10)g/L氯化钠、(0.30-0.70)g/L磷酸二氢钠、(1.05-1.30)g/L碳酸氢钠、(0.20-0.60)g/L氯化钾、(0.15-0.45)g/L二水氯化钙、(0.50-1.50)g/L D-葡萄糖、(0.15-0.35)g/L七水硫酸镁。
3.根据权利要求2所述的一种精子冻存液，其特征在于，所述精子稀释液的pH为6.5-7.5，渗透压为(300-350)mOsmol/kg。
4.根据权利要求1所述的一种精子冻存液，其特征在于，所述抗冻保护剂添加到精子稀释液中时，二甲亚砜的质量百分比浓度为5％-15％，牛血清白蛋白的质量百分比浓度为1％-3％，海藻糖的质量浓度为(35.0-45.0)g/L。
5.权利要求1-4任一项所述的精子冻存液在中华乌塘鳢精子冷冻保存中的应用。
6.一种中华乌塘鳢精子的冷冻保存方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、精液采集：在繁殖期，选择精巢发育成熟的健康雄性亲鱼，通过剪碎精巢收集精子；
S2、精液稀释：采用权利要求1-4任一项所述的精子冻存液对步骤S1中收集得到的精子进行稀释；
S3、精子冻存：先将步骤S2稀释后的精液置于室温进行避光平衡，然后置于液氮表面上方冷冻停留一段时间，紧接着没入液氮中进行快速冻存处理，最后转移到-150℃低温保存。
7.根据权利要求6所述的一种中华乌塘鳢精子的冷冻保存方法，其特征在于，步骤S2所述精子与精子冻存液的混合体积比为1:(2-4)。
8.根据权利要求6所述的一种中华乌塘鳢精子的冷冻保存方法，其特征在于，避光平衡后置于液氮表面上方(4-6)cm处停留(10-20)分钟。
9.根据权利要求6所述的一种中华乌塘鳢精子的冷冻保存方法，其特征在于，所述快速冻存处理的时间为(12-36)小时。
10.根据权利要求6所述的一种中华乌塘鳢精子的冷冻保存方法，其特征在于，所述避光平衡的时间为8-12分钟。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011299933.7A CN112352777A (zh) | 2020-11-19 | 2020-11-19 | 一种精子冻存液及其在中华乌塘鳢精子冷冻保存中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011299933.7A CN112352777A (zh) | 2020-11-19 | 2020-11-19 | 一种精子冻存液及其在中华乌塘鳢精子冷冻保存中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112352777A true CN112352777A (zh) | 2021-02-12 |
Family
ID=74533121
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011299933.7A Pending CN112352777A (zh) | 2020-11-19 | 2020-11-19 | 一种精子冻存液及其在中华乌塘鳢精子冷冻保存中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112352777A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114258911A (zh) * | 2022-03-01 | 2022-04-01 | 中山大学 | 一种黄鳍鲷精子的冷冻保存溶液及冷冻保存方法 |
| CN114480262A (zh) * | 2022-03-10 | 2022-05-13 | 中山大学 | 一种3d体外培养中华乌塘鳢精原细胞产生功能精子的方法 |
Citations (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000119101A (ja) * | 1998-10-07 | 2000-04-25 | Yamanashi Prefecture | 豚精液保存用希釈液および豚精液の希釈保存法 |
| CN1596670A (zh) * | 2004-07-27 | 2005-03-23 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 鱼类精子冷冻保存的实用化方法 |
| CN101884322A (zh) * | 2010-07-20 | 2010-11-17 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 条斑星鲽精子冷冻保存方法 |
| CN102273439A (zh) * | 2011-09-06 | 2011-12-14 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 七带石斑鱼精子冷冻保存和应用方法 |
| CN103314949A (zh) * | 2013-05-31 | 2013-09-25 | 中国科学院海洋研究所 | 太平洋鳕鱼精子高效超低温冷冻保存方法 |
| CN103719071A (zh) * | 2012-10-11 | 2014-04-16 | 吴江市长漾渔业生态科技发展有限公司 | 一种大口黑鲈精子超低温冷冻保存及复苏方法 |
| CN104054697A (zh) * | 2014-07-07 | 2014-09-24 | 中国水产科学研究院长江水产研究所 | 一种达氏鲟精子冷冻保存液及制备方法和应用 |
| CN104304234A (zh) * | 2014-09-17 | 2015-01-28 | 中山大学 | 豹纹鳃棘鲈精子冷冻保护液及其保存方法 |
| CN104521943A (zh) * | 2014-12-09 | 2015-04-22 | 南京师范大学 | 一种云斑尖塘鳢精子超低温冷冻保存及复苏方法 |
| CN105052893A (zh) * | 2015-07-29 | 2015-11-18 | 上海市水产研究所 | 一种棘头梅童鱼精子超低温冷冻保存方法 |
| CN107183014A (zh) * | 2017-07-20 | 2017-09-22 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 一种高效石斑鱼精子冷冻保存液及其使用方法 |
| CN107624754A (zh) * | 2017-10-24 | 2018-01-26 | 浙江省淡水水产研究所 | 一种用于河川沙塘鳢精子保存的抗冻液及其使用方法 |
| CN109819976A (zh) * | 2019-03-06 | 2019-05-31 | 中国科学院海洋研究所 | 一种卵胎生鱼类许氏鲆鲉精子超低温保存及激活方法 |
| CN110250162A (zh) * | 2019-07-05 | 2019-09-20 | 北京太东生物科技有限公司 | 生物样品冷冻保护剂及其应用 |
| CN110326610A (zh) * | 2019-07-19 | 2019-10-15 | 大连海洋大学 | 海参精子超低温冷冻保存方法 |
-
2020
- 2020-11-19 CN CN202011299933.7A patent/CN112352777A/zh active Pending
Patent Citations (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000119101A (ja) * | 1998-10-07 | 2000-04-25 | Yamanashi Prefecture | 豚精液保存用希釈液および豚精液の希釈保存法 |
| CN1596670A (zh) * | 2004-07-27 | 2005-03-23 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 鱼类精子冷冻保存的实用化方法 |
| CN101884322A (zh) * | 2010-07-20 | 2010-11-17 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 条斑星鲽精子冷冻保存方法 |
| CN102273439A (zh) * | 2011-09-06 | 2011-12-14 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 七带石斑鱼精子冷冻保存和应用方法 |
| CN103719071A (zh) * | 2012-10-11 | 2014-04-16 | 吴江市长漾渔业生态科技发展有限公司 | 一种大口黑鲈精子超低温冷冻保存及复苏方法 |
| CN103314949A (zh) * | 2013-05-31 | 2013-09-25 | 中国科学院海洋研究所 | 太平洋鳕鱼精子高效超低温冷冻保存方法 |
| CN104054697A (zh) * | 2014-07-07 | 2014-09-24 | 中国水产科学研究院长江水产研究所 | 一种达氏鲟精子冷冻保存液及制备方法和应用 |
| CN104304234A (zh) * | 2014-09-17 | 2015-01-28 | 中山大学 | 豹纹鳃棘鲈精子冷冻保护液及其保存方法 |
| CN104521943A (zh) * | 2014-12-09 | 2015-04-22 | 南京师范大学 | 一种云斑尖塘鳢精子超低温冷冻保存及复苏方法 |
| CN105052893A (zh) * | 2015-07-29 | 2015-11-18 | 上海市水产研究所 | 一种棘头梅童鱼精子超低温冷冻保存方法 |
| CN107183014A (zh) * | 2017-07-20 | 2017-09-22 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 一种高效石斑鱼精子冷冻保存液及其使用方法 |
| CN107624754A (zh) * | 2017-10-24 | 2018-01-26 | 浙江省淡水水产研究所 | 一种用于河川沙塘鳢精子保存的抗冻液及其使用方法 |
| CN109819976A (zh) * | 2019-03-06 | 2019-05-31 | 中国科学院海洋研究所 | 一种卵胎生鱼类许氏鲆鲉精子超低温保存及激活方法 |
| CN110250162A (zh) * | 2019-07-05 | 2019-09-20 | 北京太东生物科技有限公司 | 生物样品冷冻保护剂及其应用 |
| CN110326610A (zh) * | 2019-07-19 | 2019-10-15 | 大连海洋大学 | 海参精子超低温冷冻保存方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| MARIA PINA ROSATO等: "Cryopreservation of rabbit semen: Comparing the effects of different cryoprotectants, cryoprotectant-free vitrification, and the use of albumin plus osmoprotectants on sperm survival and fertility after standard vapor freezing and vitrification", 《THERIOGENOLOGY》 * |
| 季维智等: "《遗传多样性研究的原理与方法》", 30 September 1999, 浙江科学技术出版社 * |
| 陈松林: "《鱼类精子和胚胎低温冷冻保存理论与技术》", 31 May 2007, 中国农业出版社 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114258911A (zh) * | 2022-03-01 | 2022-04-01 | 中山大学 | 一种黄鳍鲷精子的冷冻保存溶液及冷冻保存方法 |
| CN114258911B (zh) * | 2022-03-01 | 2022-06-14 | 中山大学 | 一种黄鳍鲷精子的冷冻保存溶液及冷冻保存方法 |
| CN114480262A (zh) * | 2022-03-10 | 2022-05-13 | 中山大学 | 一种3d体外培养中华乌塘鳢精原细胞产生功能精子的方法 |
| CN114480262B (zh) * | 2022-03-10 | 2022-07-05 | 中山大学 | 一种3d体外培养中华乌塘鳢精原细胞产生功能精子的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Harvey | Cryopreservation of Sarotherodon mossambicus spermatozoa | |
| Graham | Cryopreservation of stallion spermatozoa | |
| Amorim et al. | Vitrification as an alternative means of cryopreserving ovarian tissue | |
| CN1295956C (zh) | 鱼类精子冷冻保存的实用化方法 | |
| Sansone et al. | Effects of extender composition, cooling rate, and freezing on the motility of sea bass (Dicentrarchus labrax, L.) spermatozoa after thawing | |
| Mansour et al. | Motility and cryopreservation of spermatozoa of European common frog, Rana temporaria | |
| Withler et al. | Preliminary observations of chilled and deep-frozen storage of grouper (Epinephelus tauvina) sperm | |
| Gwo et al. | Semen cryopreservation of small abalone (Haliotis diversicolor supertexa) | |
| 郭金泉 et al. | Cryopreservation of spermatozoa from rainbow trout, common carp, and marine puffer. | |
| CN112352777A (zh) | 一种精子冻存液及其在中华乌塘鳢精子冷冻保存中的应用 | |
| Santana et al. | Step by step optimization of a sperm cryopreservation protocol for spotted wolffish (Anarhichas minor Olafsen, 1772) | |
| Liu et al. | Sperm cryopreservation in different grouper subspecies and application in interspecific hybridization | |
| NZ538902A (en) | Cryopreservation method for bivalve oocytes | |
| Luvoni et al. | Effects of slow and ultrarapid freezing on morphology and resumption of meiosis in immature cat oocytes | |
| KR101847707B1 (ko) | 전복 정액 냉동 보존을 이용한 전복 인공종묘 생산방법 | |
| Bozkurt et al. | Effect of freezing techniques, extenders and cryoprotectants on the fertilization rate of frozen rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) sperm | |
| Judith Betsy et al. | Cryopreservation and its application in aquaculture | |
| Hamaratogˇlu et al. | Cryopreservation of starfish oocytes | |
| Kása et al. | Development of sperm vitrification protocols for two endangered salmonid species: the Adriatic grayling, Thymallus thymallus, and the marble trout, Salmo marmoratus | |
| Li et al. | Cryopreservation of embryos of humpback grouper (Cromileptes altivelis) using combinations of non-permeating cryoprotectants | |
| CN116076485A (zh) | 一种葡萄牙牡蛎精子超低温冷冻保护液及超低温冷冻保存的方法 | |
| CN108552161A (zh) | 一种泥鳅精子的超低温冷冻保存液及其冷冻复苏方法和应用 | |
| Widyaningsih et al. | Effect of various concentrations of palm date (Phoenix dactylifera L.) on spermatozoa motility of giant grouper (Epinephelus lanceolatus) | |
| Dong et al. | Post-thaw amendment of cryopreserved sperm for use in artificial insemination of a viviparous fish, the green swordtail Xiphophorus helleri | |
| DE102004030285A1 (de) | Gefrierkonservierung von Eiern und Embryonen von Fischen |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |