CN109819976A - 一种卵胎生鱼类许氏鲆鲉精子超低温保存及激活方法 - Google Patents

一种卵胎生鱼类许氏鲆鲉精子超低温保存及激活方法 Download PDF

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Abstract

本发明属海洋生物技术领域，具体的说是一种卵胎生鱼类许氏鲆鲉精子超低温保存及激活方法。将许氏鲆鲉雄鱼精子成熟期获得精子与冷冻液按照1：4‑1：5的比例均匀混合，而后进行梯度降温冷冻，而后将冷冻后混合液移至液氮中，即实现精子的超低温的长期保存；所述梯度降温冷冻为混合液于0‑4℃预冷2‑5min，然后以10‑12℃/min的速度冷冻至‑80‑‑100℃，然后15‑18℃/min的速度冷冻至‑150℃。本发明建立了卵胎生鱼类精子超低温保存及其精子激活方法，为海水鱼类新品种的培育提供了新方法和新思路。

Description

一种卵胎生鱼类许氏鲆鲉精子超低温保存及激活方法
技术领域
本发明属海洋生物技术领域，具体的说是一种卵胎生鱼类许氏鲆鲉精子超低温保存及激活方法。
背景技术
许氏平鲉，Sebastes schlegelii(Hilgendorf,1880)，属鲉形目鲆鮋科，平鮋属一种暖温性底层卵胎生鱼类，是我国北方重要的经济养殖鱼种。许氏平鲉属于典型的卵胎生鱼类，体内受精、胚胎体内发育至仔鱼然后产出体外。许氏平鲉每年秋季交配，此时雄鱼精子成熟，次年春季受精，胚胎体内发育并受精。因为许氏平鲉精子特殊的发育、成熟以及受精方式，使得其精子冷冻保存方法以及激活方法与卵生鱼类差异极大，卵生鱼类的保存和激活方法完全不适用于卵胎生鱼类上。目前有关许氏平鲉精子成熟、激活体内受精以及精子保存研究仍属于空白。因此该技术建立了卵胎生鱼类精子超低温保存及激活方法，丰富了我国海水鱼类种植资源保存方法，并未卵胎生鱼类仍共授精奠定了基础。
发明内容
本发明目的在于提供一种卵胎生鱼类许氏鲆鲉精子超低温保存及激活方法。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案为：
一种卵胎生鱼类许氏鲆鲉精子超低温保存方法，其特征在于：将许氏鲆鲉雄鱼精子成熟期获得精子与冷冻液按照1：4-1：5的比例均匀混合，而后进行梯度降温冷冻，而后将冷冻后混合液移至液氮中，即实现精子的超低温的长期保存；所述梯度降温冷冻为混合液于0-4℃预冷2-5min，然后以10-12℃/min的速度冷冻至-80--100℃，然后15-18℃/min的速度冷冻至-150℃
所述许氏鲆鲉雄鱼精子成熟期获得精子为于11月-12月采集许氏鲆鲉雄鱼获得其集精巢，横切精巢，从性腺中央输精管中采集成熟精液。
所述冷冻液为稀释液与DMSO的混合液；其中，稀释液为0.7％的NaCl与雄鱼血清以体积比为1：5-1：6的比例混合；所述血清为将雄鱼尾静脉血经8000转/min离心8-10min收集的上清。
所述冷冻液向稀释液中加入DMSO，使得DMSO终浓度达到10-12％％(体积比)。
一种方法保存的精子的激活方法，将所述保存精子于37-40℃下水浴解冻，并采用血清激活精子，即实现对精子的激活。
所述解冻后，采用雄鱼血清与解冻精液以体积比为400：1的比例混合进行激活。
本发明所具有如下优点：
1.卵胎生鱼类精子发育成熟以及精子激活受精方式与卵生鱼类显著不同，本发明首次建立了卵胎生海水鱼类精子超低温冷冻的冷冻保存方法，丰富了我国海水鱼类种植资源保存方法，并未卵胎生鱼类仍共授精奠定了基础；
2.通过本发明的冷冻方法获得精子并建立了卵胎生鱼类精子激活方法，且鲜精激活后运动率95％以上，冻精激活后运动率85％以上；
3.所建立的精子冷冻保存和激活方法简单、稳定性好、易于操作。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
实施例1
冷冻保存：
1)2017年12月份，于烟台网箱采集交配期的许氏鲆鮋雄鱼2尾，获得其静脉血，将获得血经8000r/min,离心取上清获得血清，同时获得交配期精液0.5ml，保存于4℃冰箱。
2)取上述获得精液1ul并与上述获得400ul血清混合进行激活，显微镜下观察精子运动率，在95％以上，用于冷冻保存实验；
3)配置稀释液，0.7％NaCl与上述步骤1)获得血清按体积比为1：5的比例均匀混合作为稀释液，然后向稀释液中加入DMSO，使得DMSO终浓度达到10％(体积比)，获得抗冻液至于4℃冰箱保存；
4)将上述获得抗冻液与精液以体积比为4：1比列混合分装于0.5ml麦管中；而后将麦管置于程序降温仪器，4℃预冷2min，然后以10℃/min的速度冷冻至-80℃，然后15℃/min的速度冷冻至-150℃，最后转移至液氮中进行长期超低温冷冻保存；进而获得超低温冷冻保存的精液。
激活：
将上述经超低温冷冻的精液保存2周后，将麦管从液氮中取出，37℃水浴解冻，解冻后经雄鱼血清进行激活，雄鱼血清与上述麦管内溶液(精液和抗冻液)以体积比为400：1的比例混合，显微镜下观察精子运动率，活力高于85％。
实施例2
1)2018年12月份，于青岛市场购买性腺发育成熟许氏鲆鮋雄鱼4尾，获得其静脉血，将获得血经8000r/min,离心取上清获得血清，同时获得交配期精液0.8ml，分别保存于0-4℃冰箱。
2)取上述获得精液1ul并与上述获得400ul血清混合进行激活，显微镜下观察精子运动率，在95％以上，用于冷冻保存实验；
3)配置稀释液，0.7％NaCl与上述步骤1)获得血清按体积比为1：5的比例均匀混合作为稀释液，然后向稀释液中加入DMSO，使得DMSO终浓度达到12％(体积比)，获得抗冻液至于4℃冰箱保存；
4)将上述获得抗冻液与精液以体积比为4：1比列混合分装于0.5ml麦管中；而后将麦管置于程序降温仪器，4℃预冷2min，然后以10℃/min的速度冷冻至-80℃，然后15℃/min的速度冷冻至-150℃，最后转移至液氮中进行长期超低温冷冻保存；进而获得超低温冷冻保存的精液。
激活：
将上述经超低温冷冻的精液保1个月后，将麦管从液氮中取出，37℃水浴解冻，解冻后经雄鱼血清进行激活，雄鱼血清与上述麦管内溶液(精液和抗冻液)以体积比为400：1的比例混合，显微镜下观察精子运动率，活力高于85％。

Claims (5)

1.一种卵胎生鱼类许氏鲆鲉精子超低温保存方法，其特征在于：将许氏鲆鲉雄鱼精子成熟期获得精子与冷冻液按照1：4-1：5的比例均匀混合，而后进行梯度降温冷冻，而后将冷冻后混合液移至液氮中，即实现精子的超低温的长期保存；所述梯度降温冷冻为混合液于0-4℃预冷2-5min，然后以10-12℃/min的速度冷冻至-80--100℃，然后15-18℃/min的速度冷冻至-150℃。
2.按权利要求1所述的卵胎生鱼类许氏鲆鲉精子超低温保存方法，其特征在于：所述许氏鲆鲉雄鱼精子成熟期获得精子为于11月-12月采集许氏鲆鲉雄鱼获得其集精巢，横切精巢，从性腺中央输精管中采集成熟精液。
3.按权利要求1所述的卵胎生鱼类许氏鲆鲉精子超低温保存方法，其特征在于：所述冷冻液为稀释液与DMSO的混合液；其中，稀释液为0.7％的NaCl与雄鱼血清以体积比为1：5-1：6的比例混合；所述血清为将雄鱼尾静脉血经8000转/min离心8-10min收集的上清。
4.一种权利要求1所述的方法保存的精子的激活方法，其特征在于：将权利要求1保存精子于37-40℃下水浴解冻，并采用血清激活精子，即实现对精子的激活。
5.按权利要求4所述激活方法，其特征在于：所述解冻后，采用雄鱼血清与解冻精液以体积比为400：1的比例混合进行激活。
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