CN110226592A - 一种许氏平鲉精液超低温冷冻保存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种许氏平鲉精液超低温冷冻保存方法，包括许氏平鲉精液采集及活力检测、精液稀释液配制、冷冻保护液配制、精液与冷冻保护液混合、平衡和冷冻保存、解冻及精液活力检测。本发明的意义是可以将当年的成熟精液冷冻保存起来备用，或者从其他地方冷冻保存许氏平鲉的精液，运送到育苗场，减少生产成本；同时也为人工选育技术或与其他鱼类进行杂交受精提供技术支撑。

Description

一种许氏平鲉精液超低温冷冻保存方法
技术领域
本发明属于鱼类低温生物学技术领域，涉及一种在超低温状态下(-196℃)冷冻保存鱼类配子的方法。
背景技术
许氏平鲉(Sebastes schlegelii)隶属鲉形目(Scorpaeniformes)、平鲉科(Sebastidae)、平鲉属(Sebastes)，是一种营体内受精的卵胎生硬骨鱼类，其肉质鲜美，口感极佳，营养丰富，在国内有“黑石斑”的美称，在海外亦深受欢迎。国内主要见于黄渤海及东海海域，国外常见于朝鲜半岛、日本及鄂霍次克海海域。因海区采捕野生许氏平鲉数量有限，其人工繁殖技术需待进一步的发展，但在繁殖季节，由于其精液量少、粘稠，雌雄性腺发育不同步，交配后，精子储存在卵巢中数月后，才可进行受精等原因，使得同时获得成熟精子和成熟卵子较为困难，为许氏平鲉的人工育种工作带来很多困难，严重阻碍了其人工繁殖、苗种大量培育和养殖推广。
超低温冷冻保存技术具有良好的发展前景，越来越受到人们的重视，将其运用到鱼类精液保存上，不仅能保护其遗传多样性，在鱼类的雌核发育、人工繁殖、杂交育种等方面也具有重要的作用。自上世纪50年代Blaxter首次成功冷冻保存太平洋鲱鱼(Clupeaharengus)精巢起，已有近300种鱼类精液被成功冷冻保存，其中有200多种淡水鱼和40多种海水鱼。但主要是针对营卵生繁殖的鱼类，而对于营卵胎生繁殖鱼类精液冷冻保存的研究报道甚少，苏新有等(2007)对淡水观赏玛丽鱼(Poecilialatipinna)精子超低温冷冻保存进行了研究，孙春丽等(2007)对淡水观赏孔雀鱼(Poeciliareticulata)精子超低温冷冻保存进行了研究，但未见对海水养殖的许氏平鲉精液超低温冷冻保存研究的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种许氏平鲉精液超低温冷冻保存方法，解决了许氏平鲉人工繁殖过程中，由于雄鱼精液量少、粘稠及雌雄性腺发育不同步，使得同时获得成熟精子和成熟卵子较为困难等问题。
本发明的意义是可以将当年成熟的精液冷冻保存起来备用，或者从其他地方冷冻保存许氏平鲉的精液，运送到育苗场，减少生产成本；同时也为进行人工选育技术或与其他鱼类进行杂交受精提供技术支撑。
本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行：
1)许氏平鲉精液采集及活力检测：解剖性成熟的许氏平鲉雄鱼获得精巢，用镊子挤压精巢及输精管，沾取精液于激活液中激活后，立即在光学显微镜下观察精子活力，将精子活力达90％以上的精液用于超低温冷冻保存；
2)精液稀释液配制：在每升蒸馏水中加入氯化钠3.775g、葡萄糖10g、牛血清蛋白10g、土霉素5g，渗透压约为300mOsmol/kg；pH约为7.7；
3)冷冻保护液配制：在精液稀释液中加入10％的二甲基亚砜(DMSO)，并放入4℃备用；
4)精液与冷冻保护液混合：取精液5μL与冷冻保护液以1:20-1:25的比例混合装入冻存管中，漩涡震荡混匀；
5)平衡和冷冻保存：将装有混合液的冻存管在4℃平衡20min，置液氮面上方10cm，平衡12min，液氮面平衡6min后，投入液氮(-196℃)中冷冻保存；或采用程序降温仪降温冷冻保存：将装有混合液的冻存管在4℃平衡20min，以25℃/min的冷冻速率由4℃降温至-80℃，在-80℃平衡5min，以20℃/min的降温速率降至-180℃，由程序冷冻仪取出后直接投入液氮罐(-196℃)保存。
6)解冻及精液活力检测：冷冻保存的精液于37℃水浴中解冻20s，取5μL混合液用激活液激活置光学显微镜下观察精子活力。
进一步，激活液由每升蒸馏水中加入十二水合磷酸氢二钠3.08g、磷酸二氢钾0.19g、氯化钠8g、氯化钾0.2g配制而成，PH＝8，渗透压约为300mOsmol/kg。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
1、许氏平鲉精液采集及活力检测：
采集成熟的许氏平鲉雄鱼，解剖获得精巢，用镊子挤压精巢及输精管，沾取精液于激活液中激活后，立即在光学显微镜下观察精子活力，将精子活力达90％以上的精液用于超低温冷冻保存。
2、精液稀释液配方的筛选：
首先利用葡萄糖、氯化钠、牛血清蛋白、土霉素、氯化钾、碳酸氢钠等溶解在蒸馏水中，配置6种精液冷冻稀释液，H0、H1、H2、H3、H4、H5，配方如表1。分别在6种稀释液中加入体积比10％的二甲基亚砜(DMSO)配置成6种精液冷冻保存液，各取100μL放在4℃备用。将采集到的许氏平鲉精液加入6种冷冻保护液中，各约5μL，漩涡震荡混匀，在4℃平衡20min，置液氮面上方10cm，平衡12min，液氮面平衡6min后，投入液氮(-196℃)中冷冻保存3-4h。表1为精子稀释液配方。
表1
3、冷冻效果检测：
将液氮中冷冻保存的冷冻管取出，于37℃水浴中解冻20s，立刻用移液枪取5μL混合液于载玻片上，取100μL激活液激活，置光学显微镜下观察精子活力，并与冷冻前鲜精对比，精子活力为视野中运动精子占全部精子的百分数。
6种稀释液冻存许氏平鲉精液解冻后精子活力见表2。
表2利用6种稀释液冻存的许氏平鲉精液解冻后精子活力
(注：“+”的个数代表活力强弱，个数越多，精子活力越高；“/”代表精子几乎没有活力)
由表2可知，利用稀释液H4冻存的许氏平鲉精液解冻后精子活力最高，显著高于另外5种稀释液冻存的许氏平鲉精液解冻后的活力。
本发明的精液稀释液成分简单，冷冻成本低，冷冻保存方法简单，易于推广，可以在现场直接进行冷冻保存操作，达到了实用化水平。采用本发明的冷冻保存液及方法进行冷冻保存的精子，解冻复活后活力可达80％以上，为许氏平鲉的人工繁育和种质资源能够长期保存提供了可靠地技术保障。
以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims (2)

1.一种许氏平鲉精液超低温冷冻保存方法，其特征在于按照以下步骤进行：
1)许氏平鲉精液采集及活力检测：解剖性成熟的许氏平鲉雄鱼获得精巢，用镊子挤压精巢及输精管，沾取精液于激活液中激活后，立即在光学显微镜下观察精子活力，将精子活力达90％以上的精液用于超低温冷冻保存；
2)精液稀释液配制：在每升蒸馏水中加入氯化钠3.775g、葡萄糖10g、牛血清蛋白10g、土霉素5g，渗透压约为300mOsmol/kg；pH约为7.7；
3)冷冻保护液配制：在精液稀释液中加入10％的二甲基亚砜(DMSO)，并放入4℃备用；
4)精液与冷冻保护液混合：取精液5μL与冷冻保护液以1:20-1:25的比例混合装入冻存管中，漩涡震荡混匀；
5)平衡和冷冻保存：将装有混合液的冻存管在4℃平衡20min，置液氮面上方10cm，平衡12min，液氮面平衡6min后，投入液氮中冷冻保存；或采用程序降温仪降温冷冻保存：将装有混合液的冻存管在4℃平衡20min，以25℃/min的冷冻速率由4℃降温至-80℃，在-80℃平衡5min，以20℃/min的降温速率降至-180℃，由程序冷冻仪取出后直接投入液氮罐保存；
6)解冻及精液活力检测：冷冻保存的精液于37℃水浴中解冻20s，取5μL混合液用激活液激活置光学显微镜下观察精子活力。
2.按照权利要求1所述一种许氏平鲉精液超低温冷冻保存方法，其特征在于：所述激活液由每升蒸馏水中加入十二水合磷酸氢二钠3.08g、磷酸二氢钾0.19g、氯化钠8g、氯化钾0.2g配制而成，pH＝8，渗透压约为300mOsmol/kg。
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