CN105360109A - 一种黄颡鱼精子超低温冷冻保存方法 - Google Patents

Abstract

本发明属海洋生物技术领域，具体地说是一种黄颡鱼精子超低温冷冻保存方法。取发育成熟黄颡雄鱼的精巢，反复清洗研磨，用稀释液稀释过滤，收集精液；精液再与抗冻液混合，梯度降温、冷冻，投入液氮中进行长期保存；其中，稀释液的配置：90ml蒸馏水中加入NaCl？3.5g，定容至100ml；12％甲醇抗冻液配置：取70ml稀释液，加入12ml甲醇，加入3.5g葡萄糖，然后定容至100ml。本发明的黄颡精子超低温冷冻、保存、解冻方法对于黄颡人工授精、全雄苗种培育以及种质保资源存等方面有着重要意义。

Description

一种黄颡鱼精子超低温冷冻保存方法

技术领域

本发明属海洋生物技术领域，具体地说是一种黄颡鱼精子超低温冷冻保存方法。

背景技术

黄颡鱼Pelteobagrusfulvidraco(Richardson)]又名黄嘎,黄姑子,黄腊丁等,是我国重要的小型底层经济鱼类。在我国各大水系均有分布,特别是在长江中下游的湖泊广为分布。黄颡鱼肉质细嫩,味道鲜美,营养丰富,无肌间刺,可食部分大,不易死亡,可活鲜上市,已越来越受到广大消费者的喜爱和欢迎。为满足人民对优质鱼类的需求,黄颡鱼雄鱼生长速度明显快于雌鱼，因此生产中广大养殖户更喜欢养殖全雄苗种。近年来，由于黄颡全雄鱼养殖规模的不断扩大，企业往往通过雌核发育和激素诱等技术获得超雄鱼，作为种源，从而培育全雄苗种。因此如果通过超低温冷冷冻保存技术奖超雄鱼的精液进行保存，对于优化全雄苗种生产技术工艺，节约资源，提高苗种成活率具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种黄颡鱼精子超低温冷冻保存方法。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种黄颡鱼精子超低温冷冻保存方法,取发育成熟黄颡雄鱼的精巢，反复清洗研磨，用稀释液稀释过滤，收集精液；精液再与抗冻液混合，梯度降温、冷冻，投入液氮中进行长期保存；

其中，稀释液的配置：90ml蒸馏水中加入NaCl3.5g，定容至100ml；

12％甲醇抗冻液配置：取70ml稀释液，加入12ml甲醇，加入3.5g葡萄糖，然后定容至100ml。

所述液氮长期保存的精液，将存有精液的麦管直接放入35-37℃水浴中解冻5-7s，然后置于室温条件下完全融化，自来水激活，获得高质量的精子。

选取性腺发育成熟的黄颡鱼雄鱼，取两侧性腺置于培养皿中，将性腺周围的血管摘除，并用蒸馏水冲洗至无血污，冰浴条件下研磨精巢5-10min，研磨过程中加入同等体积稀释液。

将研磨后的精巢组织液，通过400目的筛绢过滤，去掉组织残渣，收集滤液，检测精子活力，活力高于85％，用于后续实验。

将收集到的精液加入至其5-10倍体积的抗冻液，置于0-4℃冰箱中，孵育10-15min；将孵育后的精液，分装至0.5ml麦管中，然后以-8－-10℃/min的降温速率至-80℃直接投入到液氮(-196℃)，分装保存。

上述，将分装保存于液氮中的黄颡鱼冻精进行解冻，具体方法为：将存有精液的麦管直接放入35-37℃水浴中解冻5-7s，然后置于室温(18-20℃)条件下完全融化，淡水激活。

本发明具有如下优点：

本发明所述黄颡鱼精子在体内呈树枝状，无法通过挤压腹部的方法采集到精液，因此该发明采用解剖取性腺，然后将性腺置于研钵种研钵，使精子释放到稀释液中，然后收集精液进行保存，具体：

1.本发明冷冻保存过程中采用高浓度的甲醇作抗冻剂，保持较好渗透性的同时又降低了毒性；

2.本发明抗冻液中加入了葡萄糖3.5g/L作为细胞外部保护剂，对精子的质膜起到很好的保护作用；

3.本发明冷冻保存过程中采用0.5ml麦管，由于黄颡鱼对低温比较敏感，较小体积的麦管可减少保存容积对冻精质量的影响；

4.同时精子与抗冻液的比例为1:10，对于精液量较小的黄颡鱼，小量的分装更有利于精液的高效利用，生产上具有重要应用价值。

5.本发明冷冻保存过程分段降温时，采用以-8－-10℃/min速度降温，适宜的速度是精子可以充分脱水同时又可使冷冻精子安全度过“危险温度区”，然后投入液氮，整个保存过程不超过15min；冷冻保存降温程序精密，重复性稳定性好，冻精解冻后复苏率高，激活后运动率高于80％，与鲜精活力状态差异不显著；

6.本发明冷冻精子从液氮中取出后，采用35-37℃解冻，可使精子快速度过重结晶区，同时又避免了局部温度过高导致的损伤。

具体实施方式

本发明将发育成熟黄颡雄鱼，解剖取性腺，剔除精巢上的血管网，蒸馏水冲洗、研磨、过滤，收集获得黄颡精液，然后与抗冻液混合，通过程序降温法，冷冻，投入液氮中进行长期保存，待用时通过水浴解冻、复苏，获得高质量的精子。本发明的黄颡精子超低温冷冻、保存、解冻方法对于黄颡人工授精、全雄苗种培育以及种质保资源存等方面有着重要意义。

实施例1

1)2015年4月份于武汉运回青岛黄颡雄性亲鱼40尾，在实验室进行暂养，选取性腺发育成熟的黄颡鱼雄鱼4尾，解剖，用镊子摘取两侧性腺置于培养皿中，将性腺周围的血管摘除，并用蒸馏水冲洗至无血污。冰浴条件下研磨精巢5min，研磨过程中加4ml稀释液；

2)磨后的精巢组织液，通过400目的筛绢过滤，并用稀释液冲洗3遍，收集滤液，检测精子活力，活力高于85％；

3)将收集到的(8ml)精液加入40ml的抗冻液(用稀释液配置的12％的甲醇)，置于0-4℃冰箱中，孵育10min；

4)将孵育后的精液，分装至0.5ml麦管中，共计24管，置于程序降温仪，然后以-8－-10℃/min降温至-80℃直接投入到液氮(-196℃)，分装保存。

5)1周后将分装保存于液氮中的黄颡鱼冻精进行解冻，具体方法为：将存有精液的麦管直接放入35℃水浴中解冻7s，然后置于室温(18-20℃)条件下完全融化，淡水激活，相对复活率高于80％。

其中，稀释液的配置：90ml蒸馏水中加入NaCl3.5g，定容至100ml；

12％甲醇抗冻液配置：取70ml稀释液，加入12ml甲醇，加入3.5g葡萄糖，然后定容至100ml。

实施例2

1)2015年5月选取性腺发育成熟的黄颡鱼雄鱼6尾，解剖，用镊子摘取两侧性腺置于培养皿中，将性腺周围的血管摘除，并用蒸馏水冲洗至无血污。冰浴条件下研磨精巢10min，研磨过程中加入5ml稀释液；

2)的精巢组织液，通过400目的筛绢过滤，并用稀释液冲洗3遍，收集滤液，检测精子活力，活力高于85％；

3)集到的精液加入50ml的抗冻液，置于0-4℃冰箱中，孵育10min；

4)育后的精液，分装至0.5ml麦管中，共计30管，置于程序降温仪，然后以-8－-10℃/min降温至-80℃直接投入到液氮(-196℃)，分装保存。

5)后将分装保存于液氮中的黄颡鱼冻精进行解冻，具体方法为：将存有精液的麦管直接放入35℃水浴中解冻7s，然后置于室温(18-20℃)条件下完全融化，淡水激活，相对复活率高于80％。

Claims (5)

1.一种黄颡鱼精子超低温温冷冻保存方法，其特征在于：取发育成熟黄颡雄鱼的精巢，反复清洗研磨，用稀释液稀释过滤，收集精液；精液再与抗冻液混合，梯度降温、冷冻，投入液氮中进行长期保存；

其中，稀释液的配置：90ml蒸馏水中加入NaCl3.5g，定容至100ml；

12％甲醇抗冻液配置：取70ml稀释液，加入12ml甲醇，加入3.5g葡萄糖，然后定容至100ml。

2.按权利要求1所述的黄颡鱼精子超低温温冷冻保存方法，其特征在于：所述液氮长期保存的精液，将存有精液的麦管直接放入35-37℃水浴中解冻5-7s，然后置于室温条件下完全融化，自来水激活，获得高质量的精子。

3.按权利要求1所述的黄颡鱼精子超低温温冷冻保存方法，其特征在于：选取性腺发育成熟的黄颡鱼雄鱼，取两侧性腺将性腺周围的血管摘除，并用蒸馏水冲洗至无血污，冰浴条件下研磨精巢5-10min，研磨过程中加入同等体积稀释液。

4.按权利要求1所述的黄颡鱼精子超低温温冷冻保存方法，其特征在于：将研磨后的精巢组织液，通过400目的筛绢过滤，去掉组织残渣，收集滤液，检测精子活力，活力高于85％，用于后续实验。

5.按权利要求1所述的黄颡鱼精子超低温温冷冻保存方法，其特征在于：将收集到的精液加入至其5-10倍体积的抗冻液，置于0-4℃冰箱中，孵育10-15min；将孵育后的精液，分装至0.5ml麦管中，然后以-8－-10℃/min的降温速率至-80℃直接投入到液氮(-196℃)，分装保存。