CN113558044A - 一种翘嘴鲌精子冷冻保存技术 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种翘嘴鲌精子冷冻保存技术，包括稀释液配制、抗冻液配制、精子采集、鲜精活力检测、精子分装、降温程序、升温解冻程序、冻精活力检测。本发明采用乙二醇与海藻糖的复合配方，实现了更好的保存效果，冷冻保存翘嘴鲌精子一个月后复苏，激活率达到70％。本发明使用2mL离心管取代了0.25mL麦管，装样量更多，在人工授精实验中使用2管精子就顺利完成授精，并培育出50条左右的鱼苗。本发明采用的冷冻容器为0.25mL麦管，实际每支麦管装有的精子量仅为0.03mL左右。采用少量多管方式，在后期复苏验证、解冻激活都可以灵活选择复苏/解冻管数。
Description
技术领域
本申请涉及生物技术领域，具体涉及生物材料/组织冷冻保存领域，尤其是精子冷冻保存技术。
背景技术
生物配子的冷冻保存技术在上世纪50年代首次取得成功以来，经过几十年的发展，目前在人类医疗领域、动植物优良遗传育种的保存以及野生濒危物种的种质保存等方面都发挥着重要的作用。其中对于鱼类精子冷冻保存的研究相对较少，但也有一些鱼类的精子实现了冷冻保存，例如大泷六线鱼(专利号CN202110469108.5)、泉水鱼(专利号CN202110227761.0)、棕点石斑鱼(专利号CN201710039157.9)等，而我国大多数的经济鱼类都还未能实现精子冷冻保存。翘嘴鲌是鲤科、鮊属鱼类，在我国广泛分布于中国珠江、台湾、闽江、钱塘江、长江、黄河、辽河、黑龙江等水系，是重要的经济鱼类，2007年12月12日，列入《中国国家重点保护经济水生动植物资源名录(第一批)》。程顺等人在2019年的研究中表明，以D-15为稀释液，10％乙二醇(EG)为抗冻剂冷冻翘嘴鲌精子，解冻后能够达到62.67％的激活率(《翘嘴鲌精子生理特性及超低温冷冻的研究》，江苏农业科学，2019，47(7)。
与本发明最相似的现有技术是程顺等人发表的《翘嘴鲌精子生理特性及超低温冷冻的研究》一文中的冷冻方案。该方案主要步骤为：(1)稀释液D-15配制：称取0.80g NaCl，0.05g KCl，1.50g葡萄糖，溶于100mL纯水中；(2)抗冻液配制：用D-15稀释液配制10％乙二醇溶液，放于4℃冰箱备用；(3)精子采集：提前10h对雄鱼注射绒毛膜促性腺激素(HCG)和促黄体释放激素(LRH-A2)，采集精子时用干毛巾擦干鱼腹部，轻按鱼腹使精液流入离心管中；(4)加入抗冻液分装：将精液和抗冻液按1:5比例混匀，与4℃下平衡5-10min后分装入0.25mL麦管中(每支装约0.2mL)；(5)冷冻保存：将分装好的麦管放于液氮上方3-4cm处3-5min后，迅速转入液氮中保存。
(1)本方案得到的冷冻精子的激活率为60％左右，与新鲜精子相比仍有一定差距，可以进一步优化改善。该方案中的抗冻剂采用的是乙二醇作为单一抗冻剂，单一抗冻剂在冷冻保存中的缺点在于难以兼顾保护效果与细胞毒性，即为了起到更好的保护效果往往需要更高浓度的抗冻剂，而高浓度的抗冻剂对精子会有毒害作用。因此现在越来越多的方案开始采用复合抗冻剂，在降低了每一种抗冻剂的浓度的同时，保证整体的保护效果，实现更好的冷冻保存。
(2)本方案采用的冷冻容器为0.25mL麦管，实际装管量为0.2mL，考虑到其精液与抗冻液按照1:5混合，因此实际每支麦管装有的精子量仅为0.03mL左右，在实际繁育过程中需要解冻大量管数的精子，才能达到人工授精所需精子量，不便于操作。
发明内容
本申请提供了一种翘嘴鲌精子冷冻保存技术，其目的在于，第一：探寻合适的复合抗冻剂配方，提高冻存后翘嘴鲌精子的激活率。第二：使用冻存管进行翘嘴鲌精子冷冻保存，提高保存量，便于人工授精实验操作。
本申请是通过以下技术方案实现的：
一种翘嘴鲌精子冷冻保存技术，包括稀释液配制、抗冻液配制、精子采集、鲜精活力检测、精子分装、降温程序、升温解冻程序、冻精活力检测五个步骤，具体如下：
1、一种翘嘴鲌精子冷冻保存技术，其特征在于，包括稀释液配制、抗冻液配制、精子采集、鲜精活力检测、精子分装、降温程序、升温解冻程序、冻精活力检测。
2、根据权利要求1所述的一种翘嘴鲌精子冷冻保存技术，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)稀释液D-15配制：配制8mg/ml NaCl溶液、0.5mg/ml KCl溶液，15mg/ml KCl溶液，定容后，需倒入250mL抽滤瓶中，过滤；放于4℃保存；
(2)抗冻液配制：取上述稀释液配制8％-12％浓度乙二醇，最适浓度为10％。称取海藻糖(分析纯)配制终浓度5mg/ml，充分混匀；
(3)鲜精活力检测：用D-15稀释液以不低于1：5的比例稀释精液，混匀，取0.5-2微升在显微镜下观察。加入10微升50％D-15稀释液激活精子，显微镜下观察精子运动情况，使用精子活力检测系统(CASA)检测精子的活力；
(4)精子分装：同时测量其体积；按照1:5加入抗冻液，吹打至完全混匀；每个冻存管加入精液-抗冻液混合液不超过300微升；全部分装完毕后放于冰上暂时保存；
(5)降温程序：将冻存管横放于高度为4-5cm的泡沫板上，使其漂浮在液氮面上；静置3-5min后，迅速转移到液氮中保存。
作为优先实施例，所述步骤(3)前面增加精子采集步骤：在翘嘴鲌繁育季节，撒网捞出性成熟的翘嘴鲌雄鱼，用干毛巾擦干泄殖孔周围，轻压腹部，将精液挤到培养皿中，迅速转移到冰上。
作为优先实施例，所述步骤(4)前面增加升温解冻程序：从液氮中取出装有精液的2mL冻存管；迅速插入40℃水浴锅中；不断摇晃至精液完全解冻。
作为优先实施例，在所述步骤(5)之前，吸取1微升解冻后的精液于载玻片上，调节显微镜至合适焦距；加入10微升50％D-15稀释液激活精子，显微镜下观察精子运动情况，使用精子活力检测系统(CASA)检测精子的活力。
有益效果：
(1)本方案采用乙二醇与海藻糖的复合配方，实现了更好的保存效果，冷冻保存翘嘴鲌精子一个月后复苏，激活率达到70％。
(2)本实验使用2mL离心管取代了0.25mL麦管，装样量更多，在人工授精实验中使用2管精子就顺利完成授精，并培育出50条左右的鱼苗。
(3)本方案采用的冷冻容器为0.25mL麦管，实际每支麦管装有的精子量仅为0.03mL左右。采用少量多管方式，在后期复苏验证、解冻激活都可以灵活选择复苏/解冻管数。
附图说明
图1为冻存翘嘴鲌精子人工授精胚胎发育过程示意图。
图2为冻存翘嘴鲌精子人工授精10d后鱼苗示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：
(1)稀释液D-15配制：本稀释液配方为8g/L NaCl，0.5g/L KCl，15g/L葡萄糖，具体配制过程为：用分析天平称取1.6g NaCl、0.1g KCl、3.0g葡萄糖，放入500mL烧杯中，加入约150mL超纯水；转移到200mL容量瓶中，定容到200mL；倒入250mL抽滤瓶中，过滤；放于4℃保存。
(2)抗冻液配制：用量筒量取36mL D-15稀释液，倒入50mL离心管中；用5mL移液枪吸取4mL乙二醇，加入上述离心管中；用分析天平称取0.2g海藻糖，加入上述离心管中；用涡旋震荡仪充分混匀。
(3)精子采集：在翘嘴鲌繁育季节，撒网捞出翘嘴鲌雄鱼，挑选性成熟的健康雄鱼，用干毛巾擦干泄殖孔周围，轻压腹部，将精液挤到培养皿中，迅速转移到冰上。用10微升移液枪吸取10微升精液至200微升离心管中，加入50微升D-15稀释液，吹打混匀；吸取1微升混合液至载玻片，调节显微镜至合适焦距；加入10微升50％D-15稀释液激活精子，显微镜下观察精子运动情况，使用精子活力检测系统(CASA)检测精子的活力，选用鲜精活力达到90％以上的精液用于冷冻保存。
(4)精子保存：用5mL移液枪将精液转移到50mL离心管中，同时测量其体积；按照1:5加入抗冻液，吹打混匀；量取240微升精液抗冻液混合液至2mL冻存管中，全部分装完毕后放于冰上暂时保存。将装有精液的2mL冻存管横放于高度为4cm的泡沫板上，使其漂浮在液氮面上；静置3min后，迅速转移到液氮中保存。
(5)解冻复苏：冷冻保存1个月后，从液氮中取出装有精液的2mL冻存管；迅速插入40℃水浴锅中；不断摇晃直至精液完全解冻。吸取1微升解冻后的精液于载玻片上，调节显微镜至合适焦距；加入10微升50％D-15稀释液激活精子，显微镜下观察精子运动情况，使用精子活力检测系统(CASA)检测精子的活力，精子活力达到71.3±3.2％。
实施例2：
(1)稀释液D-15配制：本稀释液配方为8g/L NaCl，0.5g/L KCl，15g/L葡萄糖，具体配制过程为：用分析天平称取1.6g NaCl、0.1g KCl、3.0g葡萄糖，放入500mL烧杯中，加入约150mL超纯水；转移到200mL容量瓶中，定容到200mL；倒入250mL抽滤瓶中，过滤；放于4℃保存。
(2)抗冻液配制：用量筒量取36mL D-15稀释液，倒入50mL离心管中；用5mL移液枪吸取4mL乙二醇，加入上述离心管中；用分析天平称取0.2g海藻糖，加入上述离心管中；用涡旋震荡仪充分混匀。
(3)精子采集：在翘嘴鲌繁育季节，撒网捞出翘嘴鲌雄鱼，挑选性成熟的健康雄鱼，用干毛巾擦干泄殖孔周围，轻压腹部，将精液挤到培养皿中，迅速转移到冰上。用10微升移液枪吸取10微升精液至200微升离心管中，加入50微升D-15稀释液，吹打混匀；吸取1微升混合液至载玻片，调节显微镜至合适焦距；加入10微升50％D-15稀释液激活精子，显微镜下观察精子运动情况，使用精子活力检测系统(CASA)检测精子的活力，选用鲜精活力达到90％以上的精液用于冷冻保存。
(4)精子保存：用5mL移液枪将精液转移到50mL离心管中，同时测量其体积；按照1:5加入抗冻液，吹打混匀；量取240微升精液抗冻液混合液至2mL冻存管中，全部分装完毕后放于冰上暂时保存。将装有精液的2mL冻存管横放于高度为4cm的泡沫板上，使其漂浮在液氮面上；静置3min后，迅速转移到液氮中保存。
(5)解冻复苏：冷冻保存1个月后，从液氮中取出装有精液的2mL冻存管；迅速插入40℃水浴锅中；不断摇晃直至精液完全解冻。吸取1微升解冻后的精液于载玻片上，调节显微镜至合适焦距；加入10微升50％D-15稀释液激活精子，显微镜下观察精子运动情况，使用精子活力检测系统(CASA)检测精子的活力，精子活力达到74.7±5.0％。如下表(1)所示。
表(1)翘嘴鲌激活率
(6)人工授精：选取性成熟的翘嘴鲌雌鱼，提前8小时注射激素；解冻2管冷冻1个月后的翘嘴鲌精子，与新鲜的卵子进行人工授精；记录胚胎发育过程，最终顺利孵化出50尾左右鱼苗。
如图1所示，为采用本翘嘴鲌冷冻保存方案冻存一个月的精子复苏后，与新鲜的卵子人工授精获得的胚胎的发育过程，可见其发育过程正常，最终能顺利孵化出鱼苗。
如图2所示，为采用本翘嘴鲌冷冻保存方案冻存一个月的精子复苏后，与新鲜的卵子人工授精获得的胚胎发育10d后的鱼苗，可见其生长发育正常。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (5)
1.一种翘嘴鲌精子冷冻保存技术，其特征在于，包括稀释液配制、抗冻液配制、精子采集、鲜精活力检测、精子分装、降温程序、升温解冻程序、冻精活力检测。
2.根据权利要求1所述的一种翘嘴鲌精子冷冻保存技术，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)稀释液D-15配制：配制8mg/ml NaCl溶液、0.5mg/ml KCl溶液，15mg/ml KCl溶液，定容后，需倒入250mL抽滤瓶中，过滤；放于4℃保存；
(2)抗冻液配制：取上述稀释液配制8％-12％浓度乙二醇，最适浓度为10％，称取海藻糖(分析纯)配制终浓度5mg/ml，充分混匀；
(3)鲜精活力检测：用D-15稀释液以不低于1：5的比例稀释精液，混匀，取0.5-2微升在显微镜下观察，加入10微升50％D-15稀释液激活精子，显微镜下观察精子运动情况，使用精子活力检测系统(CASA)检测精子的活力；
(4)精子分装：同时测量其体积；按照1:5加入抗冻液，吹打至完全混匀；每个冻存管加入精液-抗冻液混合液不超过300微升；全部分装完毕后放于冰上暂时保存；
(5)降温程序：将冻存管横放于高度为4-5cm的泡沫板上，使其漂浮在液氮面上；静置3-5min后，迅速转移到液氮中保存。
3.根据权利要求2所述的一种翘嘴鲌精子冷冻保存技术，其特征在于，所述步骤(3)前面增加精子采集步骤：在翘嘴鲌繁育季节，撒网捞出性成熟的翘嘴鲌雄鱼，用干毛巾擦干泄殖孔周围，轻压腹部，将精液挤到培养皿中，迅速转移到冰上。
4.根据权利要求2所述的一种翘嘴鲌精子冷冻保存技术，其特征在于，所述步骤(4)前面增加升温解冻程序：从液氮中取出装有精液的2mL冻存管；迅速插入40℃水浴锅中；不断摇晃至精液完全解冻。
5.根据权利要求2所述的一种翘嘴鲌精子冷冻保存技术，其特征在于，在所述步骤(5)之前，吸取1微升解冻后的精液于载玻片上，调节显微镜至合适焦距；加入10微升50％D-15稀释液激活精子，显微镜下观察精子运动情况，使用精子活力检测系统(CASA)检测精子的活力。
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| 程顺 等: ""翘嘴精子生理特性及超低温冷冻的研究"", 《江苏农业科学》 * |
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