CN105145546A - 一种蜜蜂雄蜂精液的保存液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物遗传育种领域，公开了一种蜜蜂雄蜂精液的保存液、其制备方法以及利用所述精液的保存液进行蜜蜂雄蜂精液保存的方法。本发明所述蜜蜂雄蜂精液的保存液包括精液贮存液和精液保护液；所述精液贮存液包括葡萄糖、氯化钾、碳酸氢钠、柠檬酸钠和水；所述精液保护液包括氯化钠、双氢链霉素和水，配方简单，对精子活力影响小，适合于雄蜂精液的常温保存及低温保存。本发明所述蜜蜂雄蜂精液的保存液的制备方法配制方法简单，配置时间短。采用所述蜜蜂雄蜂精液的保存液保存雄蜂精液，条件要求低，成本低，精子活力不下降，人工授精成功率高。

Description

一种蜜蜂雄蜂精液的保存液及其制备方法

技术领域

本发明属于动物遗传育种领域，具体涉及精液的保存液，特别涉及蜜蜂雄蜂精液的保存液及其制备方法，同时还涉及了利用所述蜜蜂雄蜂精液的保存液对蜜蜂精液进行保存的方法。

背景技术

蜜蜂是社会性昆虫群体，蜜蜂群体中具有同一性别但有不同的形态、身体结构、智能和行为的个体类型，称为级型分化。在蜜蜂生物学上的级型指同属于雌性的蜂王和工蜂两种类型。蜜蜂雌性的不同级型与其主要的职能分工有关，蜂王专司产卵，工蜂负责护理幼虫、供给食物，但是没有生育能力。蜂王是由受精卵发育而成的生殖器官发育完全的雌蜂，具有二倍染色体，在蜂群中专司产卵。但是蜜蜂还具有孤雌生殖的能力，未经交配的蜂王可以产生雄性后代，即雄蜂。处女王是羽化后但未经交配的蜂王，即蜂王未交配前称为处女王。而雄蜂是由未受精卵发育而成的蜜蜂，具有单倍染色体。雄蜂无采集能力，食物都是巢内已有的，它的职能主要是在巢外空中与婚飞的处女王交配。

根据蜜蜂生物遗传育种原理，利用人工的方法诱导蜂群，在蜜粉源丰富、气候温暖的季节，可以有计划、大规模地培育优质雄蜂，采集雄蜂精液，进行保存。蜜蜂雄蜂精液的保存是指在实验室条件下将健康成熟的蜜蜂雄蜂精液经过某种处理(如混以一定比例的保护液等)，制成某种剂型。放置一段时间后，这种保存的精液仍能存活并具有受精能力，即给蜜蜂处女蜂王进行人工授精后，授精蜂王仍可以产出受精卵，这些卵可以发育成正常的工蜂。

蜜蜂雄蜂精液的保存可以有效解决在世界范围内以及国内范围内进行蜜蜂优良蜂种遗传物质的传递，实现了经济、安全的运输方式。同时不受检疫检验的限制，降低传播病毒病等危害，降低运输成本，使得低成本利用优良蜜蜂资源成为可能。

在选择育种方面，蜜蜂雄蜂精液的保存可以解决多目的父本雄蜂精液的传递、运输、待用等问题，固定地点开展多父本选择育种工作。国家间以保存的精液的形式交流遗传物质可以避免蜜蜂疾病和寄生物的传播，为养蜂业所面临的潜在问题提供了解决办法。

在基因库保存方面，蜜蜂雄蜂精液的保存可以有效的开展多地区的蜜蜂遗传物质的收集工作，对全面开展我国(甚至是世界)范围内蜜蜂遗传物质的收集与整理、保存等工作提供了技术基础。

在日常生产方面，由于蜜蜂雄蜂的出现有季节性，仅在每年夏秋大流蜜期可以大量生产高质量雄蜂，其他季节雄蜂较少或质量较差。而蜜蜂雄蜂精液的保存技术可以有效地摆脱气候条件的约束和季节的限制，并可以在雄蜂大量自然生产和容易培育时大量使用、储存，摆脱雄蜂生产的季节性限制。当自然界缺少或没有雄蜂的时候，可以使用储存的精液为处女蜂王进行人工授精，从而容易生产出早春繁殖蜂王和秋末替代蜂王。

目前蜜蜂雄蜂精液的保存主要将健康成熟的蜜蜂雄蜂精液与蜜蜂保护液混合，低温保存。但低温保存条件要求高，成本高，限制了蜜蜂雄蜂精液的保存的广泛推广。而常温保存，保存时间短，保存后精子成活率低，人工授精成功率低。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术存在的缺陷提供一种蜜蜂雄蜂精液的保护液及其制备方法。采用本发明所述蜜蜂雄蜂精液的保护液保存雄蜂精液，保存后精子成活率高，人工授精成功率高。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种蜜蜂雄蜂精液的保存液，包括精液贮存液和精液保护液；所述精液贮存液包括葡萄糖、氯化钾、碳酸氢钠、柠檬酸钠和水；所述精液保护液包括氯化钠、双氢链霉素和水。

在一些实施方案中，本发明所述的保存液，每100ml精液贮存液中含有：

在一些优选实施方案中，本发明所述的保存液，每100ml精液贮存液中含有：

在一些实施方案中，本发明所述的保存液，所述精液保护液中各成分含量如下：

NaCl1wt％-3wt％

双氢链霉素0.1wt％-2wt％

水余量。

在一些优选实施方案中，本发明所述的保存液，所述精液保护液中各成分含量如下：

NaCl1wt％

双氢链霉素0.25wt％

水余量。

本发明还提供了所述蜜蜂雄蜂精液的保存液的制备方法，分别称取葡萄糖、氯化钾、碳酸氢钠和柠檬酸钠，加水溶解后定容制得精液贮存液；将氯化钠、双氢链霉素按比例加入水中溶解后制成精液保护液。

在一些实施方案中，所述制备方法还包括灭菌的步骤。具体为120℃高压灭菌15min。

在一些具体实施例中，所述蜜蜂雄蜂精液的保存液中所述精液贮存液的制备方法为葡萄糖、氯化钾、碳酸氢钠和柠檬酸钠加水溶解后定容，120℃高压灭菌15min，冷却后置于2-5℃备用。

在一些具体实施例中，所述蜜蜂雄蜂精液的保存液中所述精液保护液的制备方法为按浓度配制氯化钠溶液，120℃高压灭菌15min，然后加入双氢链霉素至终浓度，120℃高压灭菌15min。

本领域技术人员可以理解，本发明所述蜜蜂雄蜂精液的保存液中的水优选为超纯水。

本发明所述蜜蜂雄蜂精液的保存液中精液贮存液和精液保护液优选现用现配。

本发明还提供了一种蜜蜂精液的保存方法，将雄蜂精液与精液贮存液混合后置于密闭的容器中，然后置于含有精液保护液的保存容器中封闭保存。

在一些实施方案中，本发明所述的保存方法，所述雄蜂精液与精液贮存液的混合的体积比约为1:3-1:3.5。

本领域技术人员可以理解本发明所述的保存方法中所使用的保存容器可以为任意一种可以用来保存蜜蜂精液的容器。如0.2mL保存管，0.5mL冻存管等均可。

在一些实施方案中，本发明所述的保存方法，所述保存为28-32℃保存27天-68天或低温保存35周以内。28-32℃常温保存，便于运输。而低温保存，保存时间更长，精液中精子成活率和人工授精的成功率更高。

在一些实施方案中，本发明所述的保存方法，所述低温保存的具体方法为将封闭的保存容器在5℃平衡1.5h-2h；然后将保存容器按照3℃/min降温的速度，从5℃降温至-6℃；之后将保存容器放置在离液氮液上方2cm-3cm处快速降温，降温速率是-140℃/min，最后于液氮中冷冻保存中。

在低温保存后精液在使用前需要对低温保存的精液进行解冻。具体的解冻方法为将低温冷冻的保存容器从液氮中迅速取出后，投入36℃-40℃水中30秒。

对蜜蜂精液进行保存需要先采集雄蜂精液。在一些具体实施例中，所述雄蜂精液的采集的具体操作为先将进样器针头吸入少许生理液和气泡，然后右手操纵进样器，使针头与精液接触后稍微拉开点距离，但二者并不断开，借助于精液本身的粘滞性把覆盖在白色粘液上的土黄色精液较完全地抽吸进针头，然后继续采集其它雄蜂的精液，待进样器针头内贮满所需精液量后，用生理液封闭针头。所述生理液的配方为每100ml缓冲液中含有NaCl0.5g-2g，KCl0.01g-0.05g，CaCl₂0.01g-0.05g，葡萄糖0.2g-0.6g，余量为水。

其中，值得注意的是，在采集雄蜂时精液每2只雄蜂的精液间应避免出现气泡。

本领域技术人员可以理解，本发明所述雄蜂精液采用强迫性成熟的雄蜂排精获得。

通常雄蜂出房12天后，即达性成熟，便可捕捉采精。性成熟雄蜂的捕捉方法包括：利用颜色标记雄蜂日龄法、巢内直接选择性成熟雄蜂法、巢门捕捉婚飞雄蜂法和捕捉幽闭饲养雄蜂法等。目前用于雄蜂精液的采集的雄蜂的标准要求雄蜂种纯、个大、健壮、活跃和性成熟。

而所述强迫雄蜂排精的具体方法为：用左手拇指和食指从腹面捉住胸、腹部两侧，用右手拇指按压雄蜂的腹部背板1节～3节处，然后三指配合，同时向腹部尾端施加压力，强迫“阴茎”外翻并射精。在强迫雄蜂排精时需要注意用力适度，以保精液在“阴茎”顶端形成近球状，以利采集且不易被污染。

此外，在保存蜜蜂精液的过程中，根据需要，每次保存一批雄蜂精液或是隔了一段时间后准备使用的精液都需要进行抽样镜检，以贮存精子的活力和形态来评价保存效果。观察并记录精子活力即精子成活率。活精子一般在注射时被视为有效精子数。在使用液态精液时，可以采用肉眼估测和血球计数法测定精子成活率。

其中肉眼估测是将要检查的精液从保存液中提取出来，吹到载玻片上，在15×8倍光学显微镜下观察，估计活精子占视野内总精子的比例。其中精子有打转、尾部摆动的均为有效。而血球计数法是将要检查的精液从保存液中提取出来，将精液用生理盐水稀释，用红血球吸管将之打散，然后导入计算室中，先算已死的精子数，然后快速将计数板放入到已经升温至100℃的恒温干燥箱中2min，活精子瞬间被杀死，尔后取出再计算总精子数，由此可知精子活动比例。

在一个具体实施例中，本发明比较了采用本发明所述精液的保存液与现有的精液保存液分别保存雄蜂精液后的精液的精子成活率。结果显示采用本发明所述精液的保存液常温或低温保存雄蜂精液，精子成活率和人工授精成功率均高于现有的精液保存液。而采用本发明所述精液的保存液低温保存雄蜂精液精子成活率和人工授精成功率均高于采用本发明所述精液的保存液常温保存的雄蜂精液。

本发明提供了一种蜜蜂雄蜂精液的保存液包括精液贮存液和精液保护液；所述精液贮存液包括葡萄糖、氯化钾、碳酸氢钠、柠檬酸钠和水；所述精液保护液包括氯化钠、双氢链霉素和水，配方简单，对精子活力影响小，适合于雄蜂精液的常温保存及低温保存。本发明所述蜜蜂雄蜂精液的保存液的制备方法为分别称取葡萄糖、氯化钾、碳酸氢钠和柠檬酸钠，加水溶解后定容制得精液贮存液；将氯化钠、双氢链霉素按比例加入水中溶解后制成精液保护液，配制方法简单，配置成本低、时间短。采用本发明所述蜜蜂雄蜂精液的保存液保存雄蜂精液，保存条件要求低，成本低，精子活力不下降，人工授精成功率高。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述。

实施例1、蜜蜂雄蜂精液的保存液的制备

1、精液贮存液的制备：用电子分析天平准确称取葡萄糖0.3g，氯化钾0.41克，碳酸氢钠0.21g，二水合柠檬酸钠2.43g，将其溶解于50mL超纯水中，用磁力搅拌器搅拌均匀后，配置成100mL基础液，120℃高压灭菌％，待自然冷却后放入2℃-5℃冰箱中备用。

2、精液保护液的制备：将5g双氢链霉素溶于20mL水中，配成终浓度为25％的贮液(100×)；配置1％NaCl溶液，120℃高压灭菌15min，待冷却后按比例加入双氢链霉素，使终浓度为0.25％。灭菌后的保护液分装在1.5mL保存管内待用；

精液贮存液和精液保护液均需现用现配。

实施例2、蜜蜂雄蜂精液的保存液的制备

1、精液贮存液的制备：用电子分析天平准确称取葡萄糖0.1g，氯化钾0.2克，碳酸氢钠0.1g，二水合柠檬酸钠1g，将其溶解于50mL超纯水中，用磁力搅拌器搅拌均匀后，配置成100mL基础液，120℃高压灭菌％，待自然冷却后放入2℃-5℃冰箱中备用。

2、精液保护液的制备：将5g双氢链霉素溶于20mL水中，配成终浓度为25％的贮液(100×)；配置1％NaCl溶液，120℃高压灭菌15min，待冷却后按比例加入双氢链霉素，使终浓度为0.1％。灭菌后的保护液分装在1.5mL保存管内待用；

精液贮存液和精液保护液均需现用现配。

实施例3、蜜蜂雄蜂精液的保存液的制备

1、精液贮存液的制备：用电子分析天平准确称取葡萄糖0.5g，氯化钾0.5克，碳酸氢钠0.5g，二水合柠檬酸钠5g，将其溶解于50mL超纯水中，用磁力搅拌器搅拌均匀后，配置成100mL基础液，120℃高压灭菌％，待自然冷却后放入2℃-5℃冰箱中备用。

2、精液保护液的制备：将5g双氢链霉素溶于20mL水中，配成终浓度为25％的贮液(100×)；配置3％NaCl溶液，120℃高压灭菌15min，待冷却后按比例加入双氢链霉素，使终浓度为2％。灭菌后的保护液分装在1.5mL保存管内待用；

精液贮存液和精液保护液均需现用现配。

实施例4、雄蜂精液低温保存

1、精液采集：

捕捉种纯、个大、健壮、活跃和性成熟的雄蜂。用左手拇指和食指从腹面捉住胸、腹部两侧，用右手拇指按压雄蜂的腹部背板1节～3节处，然后三指配合，同时向腹部尾端施加压力，强迫“阴茎”外翻并射精(注意用力适度，以保精液在“阴茎”顶端形成近球状，以利采集且不易被污染)。在体视显微镜下，直接用进样器逐只采集雄蜂精液。

采集雄蜂精液的方法具体为：先将进样器针头吸入少许生理液和气泡，然后右手操纵进样器，使针头与精液接触后稍微拉开点距离，但二者并不断开，这样就能借助于精液本身的粘滞性，把覆盖在白色粘液上的土黄色精液较完全地抽吸进针头，然后继续采集其它雄蜂的精液，每2只雄蜂的精液间，不应出现气泡隔离。待针头内贮满所需精液量后，用生理液封闭针头，以防精液干涸或污染。

2、雄蜂精液常温保存：

将雄蜂精液按1:3的比例加入含有实施例1所述的精液贮存液的200μL保存管中，盖严，并用医用封口膜封口后再装入含有实施例1所述的精液保护液的保存管内，医用封口膜封闭。封口完毕后裹不透光锡纸，于20℃-25℃保存。

实施例5、雄蜂精液低温保存

1、精液采集：

按照实施例4所述精液采集方法采集雄蜂精液。

2、雄蜂精液低温保存：

将雄蜂精液按1:3.5的比例加入含有实施例1所述的精液贮存液的200μL保存管中，盖严，并用医用封口膜封口后再装入含有实施例1所述的精液保护液的保存管内，医用封口膜封闭。封口完毕后在5℃冰箱或恒温箱中平衡1.5h-2h。

平衡完毕后，将保存管转移至冷冻室进行冷冻。先用程序冷冻仪冷冻，其程序是：按照3℃/min降温的速度，从5℃降温至-6℃。然后将保存管迅速从冷冻仪中取出，放置在离液氮液上方2-3cm处快速降温，其降温速率是-140℃/min，然后迅速投入到液氮中冷冻保存。

实施例6、现有雄蜂精液保存液及精液的保存

取D-葡萄糖1g、Tris3.0mL、柠檬酸1.6g、DMSO6.0mL、甘油5.0mL、乙二醇8.0mL、1,2丙二醇5.0mL、异戊二醇5.0mL、卵黄12.0mL，将其溶解于50mL超纯水中，用磁力搅拌器搅拌均匀后，超纯水定容至100mL制得雄蜂精液保存液。

按照实施例4所述精液采集方法采集雄蜂精液。将雄蜂精液与混合后加入保存管中，盖严，并用医用封口膜封口后在5℃冰箱或恒温箱中平衡1.5h-2h。

平衡完毕后，将保存管转移至冷冻室进行冷冻。先用程序冷冻仪冷冻，其程序是：按照3℃/min降温的速度，从5℃降温至-6℃。然后将保存管迅速从冷冻仪中取出，放置在离液氮液上方2-3cm处快速降温，其降温速率是-140℃/min，然后迅速投入到液氮中冷冻保存。

实施例7

比较实施例4-6各保存方法保存10天、20天、40天和60天后的精液的精子成活率及人工授精成功率。结果见表1。其中所述人工授精成功率是指将保存的精液为蜂王进行人工授精后，蜂王生产健康工蜂的比例。

由表1结果可见，采用本发明所述精液的保存液常温或低温保存雄蜂精液，精子成活率和人工授精成功率均高于实施例6所述现有的精液保存液。而采用本发明所述精液的保存液低温保存雄蜂精液精子成活率和人工授精成功率均高于采用本发明所述精液的保存液常温保存的雄蜂精液。

采用实施例2及实施例3所述精液的保存液，按照实施例4和实施例5方法对雄蜂精液进行保存，精子成活率及人工授精成功率与上述实施例4和实施例5的结果相似。

Claims (10)

1.一种蜜蜂雄蜂精液的保存液，包括精液贮存液和精液保护液；所述精液贮存液包括葡萄糖、氯化钾、碳酸氢钠、柠檬酸钠和水；所述精液保护液包括氯化钠、双氢链霉素和水。

2.根据权利要求1所述的保存液，每100ml精液贮存液中含有：

3.根据权利要求1或2所述的保存液，每100ml精液贮存液中含有：

4.根据权利要求1所述的保存液，所述精液保护液中各成分含量如下：

NaCl1wt％-3wt％

双氢链霉素0.1wt％-2wt％

水余量。

5.根据权利要求1或4所述的保存液，所述精液保护液中各成分含量如下：

NaCl1wt％

双氢链霉素0.25wt％

水余量。

6.权利要求1-5任意一项所述精液的保存液的制备方法，分别称取葡萄糖、氯化钾、碳酸氢钠和柠檬酸钠，加水溶解后定容制得精液贮存液；将氯化钠、双氢链霉素按比例加入水中溶解后制成精液保护液。

7.一种蜜蜂雄蜂精液的保存方法，将雄蜂精液与精液贮存液混合后置于密闭的容器中，然后置于含有精液保护液的保存容器中封闭保存。

8.根据权利要求7所述的保存方法，所述雄蜂精液与精液贮存液的混合的体积比约为1:3-1:3.5。

9.根据权利要求7所述的保存方法，所述保存为28-32℃保存27天-68天或低温保存35周以内。

10.根据权利要求9所述的保存方法，所述超低温保存的具体方法为将封闭的保存容器在5℃平衡1.5h-2h；然后将保存容器按照3℃/min降温的速度，从5℃降温至-6℃；之后将保存容器放置在离液氮液上方2cm-3cm处快速降温，降温速率是-140℃/min，最后于液氮中冷冻保存中。