CN108588013A - 一种斑重唇鱼精子激活液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种斑重唇鱼精子激活液，是由以下离子浓度的组分溶于去离子水中制备得到的：氯化钠45‑150mmol/L或氯化钾5‑100mmol/L或氯化钙50‑150mmol/L或葡萄糖90‑360mmol/L；精子激活液的温度为14℃；并提供了其制备方法。本发明的有益效果为：本发明提供的斑重唇鱼精子激活液及其制备方法，能够有效提高斑重唇鱼的精子活力，实验结果证明，选用Na+浓度为135mmol/L的激活液，斑重唇鱼精子活力提高最强，为快速运动时间543±7秒，寿命时间1109±22秒，激活率95％，能够有效提高其人工繁殖的生产效率。

Description

一种斑重唇鱼精子激活液及其制备方法
技术领域
本发明涉及斑重唇鱼孵育技术领域，具体涉及一种斑重唇鱼精子激活液及其制备方法。
背景技术
斑重唇鱼[D.(D.)maculatus Steindachner],别名斑黄瓜鱼,为鲤形目，鲤科，重唇鱼属，为冷水性土著鱼类，喜生活在水温20℃以下的砂砾河流及山间支流的深水潭或洄水湾等水流较缓处，以底栖无脊椎动物和着生藻类为食。体前部圆筒形，后部略侧扁。头钝锥形。吻突出。口下位，横直或略呈弧形；下颌具锐利的角质缘；下唇左右两叶狭窄，表面具粒状突起；唇后沟中断。须1对，粗短，短于或等于眼径。眼中等大，侧上位。咽齿柱状，顶端尖，具钩。下咽骨窄长。在我国仅分布于新疆塔里木河水系及伊犁河水系，因其肉质细嫩，价格较高，近年来成为当地偷捕滥捕的重点鱼类，又因水环境的改变，种群数量及分布区域明显减少，已被列入新疆维吾尔自治区Ⅱ级保护鱼类。
近年来，随着国家对环境保护及生态修复工作的越来越重视。斑重唇鱼的增殖放流任务陆续开展，需要对斑重唇鱼进行人工繁殖。但是，在人工驯化繁殖中，我们发现其雄鱼精液随着暂养时间的加长，精液量减少且质量降低，导致人工授精时，鱼卵受精率低，阻碍增殖放流工作的开展。
精子的质量是决定鱼类人工繁殖的关键因素。因为精巢和精浆中的高渗透压水环境，鱼类精子在内环境中是静止的，只有当精子被排入体外的水环境时，外环境渗透压降低后才可被激活。在精子与卵结合前，两者存在一定的距离，在精子在排入水体后，需要精子尽快移动这段距离。故活力越强的鱼类精子，在人工繁殖中的授精率越高。斑重唇鱼精子在正常水体中，精子激活后快速运动时间仅为46±2秒，寿命时间为70±6秒，激活率55％，存活时间较短，不利于其进行人工繁殖。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种斑重唇鱼精子激活液及其制备方法。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种斑重唇鱼精子激活液，是由以下离子浓度的溶质组分溶于去离子水中制备得到的：氯化钠45-150mmol/L或氯化钾5-100mmol/L或氯化钙50-150mmol/L或葡萄糖90-360mmol/L；精子激活液的温度为14℃。
进一步的，上述的一种斑重唇鱼精子激活液，是由以下离子浓度的溶质组分溶于去离子水中制备得到的：氯化钠85-135mmol/L或氯化钾10-50mmol/L或氯化钙50-100mmol/L或葡萄糖180-270mmol/L。
进一步的，上述的一种斑重唇鱼精子激活液，是由以下离子浓度的溶质组分溶于去离子水中制备得到的：氯化钠135mmol/L。
进一步的，上述的一种斑重唇鱼精子激活液，是由以下离子浓度的溶质组分溶于去离子水中制备得到的：氯化钾20mmol/L。
进一步的，上述的一种斑重唇鱼精子激活液，是由以下离子浓度的溶质组分溶于去离子水中制备得到的：氯化钙50mmol/L。
进一步的，上述的一种斑重唇鱼精子激活液，是由以下离子浓度的溶质组分溶于去离子水中制备得到的：葡萄糖180mmol/L。
本发明的第二个目的是提供了上述一种斑重唇鱼精子激活液的制备方法，包括以下步骤：
1)按照计算公式计算出溶质组分的质量，称量出分析纯的溶质组分，放入烧杯；
2)在烧杯中加入一半激活液体积的去离子水搅拌，使烧杯中的氯化钾充分溶解，将溶解的激活液移入容量瓶中，用少量去离子水洗涤烧杯3次，将洗涤后的溶液一并倒入容量瓶中，最后用去离子水定容至所需刻度线处，摇匀，即可得到所述斑重唇鱼精子激活液。
进一步的，上述一种斑重唇鱼精子激活液的制备方法，所述步骤1)中的计算公式为：溶质组分质量＝溶质分子量×溶质量浓度×激活液体积÷1000。
本发明的有益效果为：本发明提供的斑重唇鱼精子激活液及其制备方法，能够有效提高斑重唇鱼的精子活力，实验结果证明，选用Na+浓度为135mmol/L的激活液，斑重唇鱼精子活力提高最强，为快速运动时间543±7秒，寿命时间1109±22秒，激活率95％，能够有效提高其人工繁殖的生产效率。
具体实施方式
实施例1：
1、实验用亲鱼选择：
亲鱼捕捞于新疆伊犁河上游河段，捕捞时间为2017年4月。体长9-18cm，体重75-187g，养殖于流水池塘。水温升至12℃左右时，开始进入繁殖期，挑选体质较好，追星明显且体表无伤的雄鱼12尾(每组3尾)，用洁净纸包裹鱼身，吸水纸擦拭泄殖孔周围水分，慢捏鱼体下腹部，将乳白、无血、无粪便的精液滴在干净的载玻片上，以备使用。
2、激活液制备方法：
不同浓度的Na+、K+、Ca2+及葡萄糖分别选取NaCl、KCl、CaCl2及葡萄糖为溶质；将其溶质分别溶于去离子水中组合成不同梯度的离子浓度。NaCl浓度梯度为45、85、135和150mmol/L，KCL浓度梯度为5、10、20、50、100、150、200、250和300mmol/L，CaCl2浓度梯度为50、100、150、200和300mmol/L，葡萄糖浓度梯度为90、180、270和360mmol/L，纯水作为对比参照。实验中，水温为14摄氏度，所用溶质均为分析纯。
3、精子活力观察：
精子活力的观察采用平板载片法。取载玻片，提前清洗干净，用胶头吸管吸取药品溶液滴在载玻片上，在显微镜下定好视野(400倍)，然后用尖头针的针尖蘸取少量精液到载玻片上的药品溶液中，立即在显微镜下观察精子的运动情况，并用秒表计时。每个试验重复做2次，结果取平均值。用快速运动时间(FT，即精子呈现快速运动，运动过程看不清路线，只能看到翻滚的黑点的持续时间)、寿命时间(LT，即从精子开始活动到90％以上精子精子死亡的时间)和精子激活率(即三个指标来评价精子活力)，每个梯度做2次取其平均值为观测值记录。快速运动时间：当精子与溶液相遇，在显微镜下只看到翻滚的黑点，精子运动速度很快，在整个运动过程中看不清路线。精子寿命时间：精子开始活动直至90％以上精子停止死亡的时间。精子激活率：指激活起始时，给定视野内被激活的精子数量占全部精子数量的百分比。
4、激活液结果：
表1显示为斑重唇鱼精子在不同浓度NaCl溶液中的活力情况(n＝3)。
表1
Na+浓度(mmol/L) 快速运动时间(s) 寿命时间(s) 精子激活率(％)
0 46±2 70±6 55
45 53±2 94±4 70
85 178±4 249±6 80
135 543±7 1109±22 95
150 72±4 132±14 70
从表1可以看出，斑重唇鱼在浓度为0～135mmol/L Na+溶液中，随着Na+浓度的升高斑重唇鱼精子活力时间逐渐延长；延长到Na+浓度为135mmol/L时，斑重唇鱼精子活力最强，快速运动时间、寿命时间和激活率分别为543±7s、1109±22s和95％；其后Na+浓度增加至150mmol/L时，时间缩短，精子活力骤然下降，快速运动时间、寿命时间和激活率分别为72±4s、132±14s和70％。统计分析表明，当Na+浓度为135mmol/L时斑重唇鱼精子的快速运动时间(FT)、寿命时间(LT)和激活率均极显著高于其他浓度组(P＜0.01，下同)(表1)。说明135mmol/L的Na+对斑重唇鱼的精子活力有着极显著的影响，可以延长其活力时间及激活率。表2显示为斑重唇鱼精子在不同K+浓度梯度中的活力情况(n＝3)。
表2
K+浓度(mmol/L) 快速运动时(s) 寿命时间(s) 精子激活率(％)
0 46±2 70±6 55
5 31±2 50±3 40
10 47±2 141±8 65
20 52±3 202±6 85
50 48±4 121±8 70
100 0 0 0
当K+浓度在0～100mmol/L范围内时，斑重唇鱼精子活力随K+浓度梯度的升高而增加；K+浓度为20mmol/L时，斑重唇鱼精子精子活力最强，其FT、LT和激活率分别为52±3s、202±6s和85％(表2)。当K+浓度超过50mmol/L后，斑重唇鱼精子精子活力随K+浓度梯度的增加而下降。t检验结果表明，当K+浓度为50mmol/L时，斑重唇鱼精子的LT和激活率均极显著高于其他浓度梯度，而FT显著高于除50mmol/L外的其他浓度梯度，说明K+对斑重唇鱼精子活力也存在明显的激活或抑制作用，但其对斑重唇鱼精子影响要弱于Na+激活液。表3显示为斑重唇鱼精子在不同Ca2+浓度梯度中的活力情况(n＝3)。
表3
从表3看出，当Ca2+浓度在50mmol/L以下时，斑重唇鱼精子活力时间随Ca2+浓度梯度的升高而延长；在50mmol/L时，斑重唇鱼精子活力时间达到峰值，其快速运动时间FT、寿命时间LT和激活率分别为95±2s、275±7s和85％(表3)。Ca2+浓度大于50mmol/L后，随Ca2+浓度梯度的增加而骤然下降。t检验结果表明，当Ca2+浓度为50mmol/L时，斑重唇鱼精子的FT、LT和激活率极显著高于其他浓度。可见，Ca2+对斑重唇鱼的精子活力也有激活或抑制作用。
表4显示为斑重唇鱼精子在不同葡萄糖浓度梯度中的活力情况(n＝3)。
表4
葡萄糖浓度(mmol/L) 快速运动时间(s) 寿命时间(s) 精子激活率(％)
0 46±2 70±6 55
90 56±2 222±16 85
180 68±8 301±14 90
270 35±3 75±2 60
360 0 0 0
从表4可以看出，当葡萄糖浓度为180mmol/L时，斑重唇鱼精子活力最强，其FT、LT和激活率分别为68±8s、301±14s和90％(表4)。当葡萄糖的浓度超过90mmol/L后，随着葡萄糖浓度的继续增加，斑重唇鱼的精子活力会骤然下降。t检验结果表明，当葡萄糖浓度为180mmol/L时，精子的FT、LT和激活率均明显高于其他浓度。由此表明，葡萄糖对斑重唇鱼精子活力具有显著影响。
5、综合实验结果：
在Na+浓度为135mmol/L的激活液中，斑重唇鱼精子活力最强，为快速运动时间543±7秒，寿命时间1109±22秒，激活率95％。实际应用中，可选用Na+浓度为135mmol/L作为斑重唇鱼的精子的激活液，可提高其人工繁殖的生产效率。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种斑重唇鱼精子激活液，其特征在于，是由以下离子浓度的溶质组分溶于去离子水中制备得到的：氯化钠45-150mmol/L或氯化钾5-100mmol/L或氯化钙50-150mmol/L或葡萄糖90-360mmol/L；精子激活液的温度为14℃。
2.根据权利要求1所述的一种斑重唇鱼精子激活液，其特征在于，是由以下离子浓度的溶质组分溶于去离子水中制备得到的：氯化钠85-135mmol/L或氯化钾10-50mmol/L或氯化钙50-100mmol/L或葡萄糖180-270mmol/L。
3.根据权利要求2所述的一种斑重唇鱼精子激活液，其特征在于，是由以下离子浓度的溶质组分溶于去离子水中制备得到的：氯化钠135mmol/L。
4.根据权利要求2所述的一种斑重唇鱼精子激活液，其特征在于，是由以下离子浓度的溶质组分溶于去离子水中制备得到的：氯化钾20mmol/L。
5.根据权利要求2所述的一种斑重唇鱼精子激活液，其特征在于，是由以下离子浓度的溶质组分溶于去离子水中制备得到的：氯化钙50mmol/L。
6.根据权利要求2所述的一种斑重唇鱼精子激活液，其特征在于，是由以下离子浓度的溶质组分溶于去离子水中制备得到的：葡萄糖180mmol/L。
7.根据权利要求1-6任一所述的一种斑重唇鱼精子激活液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)按照计算公式计算出溶质组分的质量，称量出分析纯的溶质组分，放入烧杯；
2)在烧杯中加入一半激活液体积的去离子水搅拌，使烧杯中的氯化钾充分溶解，将溶解的激活液移入容量瓶中，用少量去离子水洗涤烧杯3次，将洗涤后的溶液一并倒入容量瓶中，最后用去离子水定容至所需刻度线处，摇匀，即可得到所述斑重唇鱼精子激活液。
8.根据权利要求7所述的一种斑重唇鱼精子激活液的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中的计算公式为：溶质组分质量＝溶质分子量×溶质量浓度×激活液体积÷1000。
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