CN102578076B - 一种罗非鱼精子通用稀释液及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种罗非鱼精子通用稀释液及制备方法，它由氯化钠、氯化钾、碳酸氢钠、氯化钙按一定比例制成，其制备步骤为A、精子稀释液母液的配制：(1)每毫升含氯化钠1mmol的母液的制备；(2)每毫升含氯化钾1mmol的母液的制备；(3)每毫升含氯化钙0.5mmol的母液的制备；(4)每毫升含碳酸氢钠0.5mmol的母液的制备；(5)上述母液均放置4℃冰箱保存；B、精子稀释液的配制：(1)用微量取样器从各组分母液中量取配制稀释液；(2)将上述各组分混合均匀；(3)配制好的稀释液放置4℃冰箱保存，备用。本发明配方合理，使用方便，适合各种罗非鱼品种精子的稀释，方法易行，操作简便，适合配制各种体积的稀释液，可确保所配制稀释液中个组分浓度的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及罗非鱼品种的精子技术领域，更具体涉及一种罗非鱼精子通用稀释液，同时还涉及一种罗非鱼精子通用稀释液的制备方法，适合所有罗非鱼品种的精子。
背景技术
罗非鱼(Tilapia)为一种中小型鱼，被誉为未来动物性蛋白质的主要来源之一。原产于非洲，上世纪70年代被引进到我国，目前已成为我国一个重要的水产养殖品种。随着我国对罗非鱼品种的选育和改良，除最初引进的尼罗罗非鱼(O.niloticus)和奥尼亚罗非鱼(O.aureus)外，又培育了许多新的品种。如：尼罗罗非鱼和奥尼亚罗非鱼的杂交后代奥尼罗非鱼；通过3系杂交选育的后代尼罗超雄鱼；以及由8个品系的尼罗罗非鱼经杂交混合选育的吉富罗非鱼等。
为了能进一步开展罗非鱼的新品种选育，以及罗非鱼的人工繁殖，为市场提供更优质的罗非鱼新品种和苗种，需要进行罗非鱼精子超低温保存和人工繁殖。然而，无论是精子的超低温保存，还是进行人工繁殖，都需要一种稀释液对罗非鱼精子进行稀释。这是因为罗非鱼精液中所含精子的密度很高，一般可以达到1.4～1.8×109个/ml。当对罗非鱼精子进行超低温保存时，含高密度精子的精原液是不能直接进行超低温冷冻保存的。这是因为在冷冻过程中，当温度降到0℃～-20℃区间时，被保存的精液中会形成冰晶，冰晶像锋利的刀一样刺向四周的精子，将精子刺破。精液中的精子密度越高，精子被刺破的概率也越高。这种在冷冻过程中冰晶对精子的物理损伤将直接导致精子超低温冷冻保存的失败。因此，冷冻前必须要对精子进行稀释，这就需要有一种适合罗非鱼精子的精子稀释液。而在进行罗非鱼人工繁殖时，由于精液中含精子的密度很高，如果直接用来进行人工授精，不仅对非常宝贵的精液是一种浪费，而且，因为精子密度过高，精液的黏稠度增加，使精子不易与卵子混合均匀，从而导致授精效果也不好。如果对精液进行稀释后，再用来进行人工授精，可大大降低人工授精的成本，同时还能起到很好的授精效果，获得较高的受精率。因此，罗非鱼精子稀释液的作用就是在不激活精子的前提下，对精子进行稀释，使精子尽可能的保持其原有的生物学特性。
然而，精子稀释液是有一定要求的。每种鱼类的精子都有自己一定的渗透压，不同种鱼类的渗透压是不同的。鱼类的精子在未遇见水或其它溶液前始终处在休眠状态，淡水鱼类只有在遇见低于自己渗透压的溶液或淡水时才能被激活，而海水鱼类则要遇见高于自己渗透压的溶液或海水时才能被激活。精子一旦被激活，很快会衰减死亡。精子的寿命一般很短，短的只有几十秒，长的也就几十分钟。要想对精子进行稀释，首先要保证精子在稀释液中不会被激活。这就要求每种鱼的精子稀释液必须与这种鱼的精液渗透压尽可能的相等。稀释液的渗透压是由稀释液中的离子浓度总和决定的，不同浓度的稀释液就有不同的渗透压，调节稀释液中的离子浓度就能调节这种稀释液的渗透压，从而达到与精液等渗的效果。除此之外，稀释液中不同的离子成分对精子又有不同的作用。如：稀释液中的Na离子主要是起调节稀释液渗透压的作用；K离子起着改变精子膜表面通透性的作用；Ca、Mg离子则起着增加或降低精子运动速度的作用；而CO3离子则起着调节稀释液pH的作用等。除此之外，有报道显示葡萄糖等大分子类溶质除了起到调节渗透压的作用外，还具有提供精子能量的作用。因此，不同的鱼不仅稀释液浓度完全不同，而且，根据精子的生物学特性，其离子成分也会有很大差异。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种罗非鱼精子通用稀释液，配方合理，使用方便，适合各种罗非鱼品种精子的稀释，是罗非鱼精子超低温保存和进行人工授精所必须的一种溶液。在罗非鱼精子超低温保存过程中，可确保精子不会被激活，并最大限度降低冰晶对精子的损伤。在进行罗非鱼人工授精过程中，可有效稀释精子，降低人工授精成本，提高受精率。
本发明的另一个目的是在于提供了一种罗非鱼精子通用稀释液制备方法，方法易行，操作简便，适合配制各种体积的稀释液，可确保所配制稀释液中个组分浓度的准确性。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
一种罗非鱼精子通用稀释液，它由以下重量份的原料制成：
稀释液渗透压为265.4～320.6mOsM，pH为8-9。
一种罗非鱼精子通用稀释液，它由以下重量份的原料制成(较好范围)：
稀释液渗透压为273.0～314.2mOsM，pH为8.1-8.8。
一种罗非鱼精子通用稀释液，它由以下重量份的原料制成(优选范围)：
稀释液渗透压为280.0～307.0mOsM，pH为8.3-8.6。
罗非鱼精子通用稀释液，它由以下重量份的原料制成(最佳范围)：
稀释液渗透压为285.8～300.6mOsM，pH为8.4-8.5。
一种罗非鱼精子通用稀释液，它由以下重量份的原料制成(最佳值)：
本配方的稀释液渗透压为293.0mOsM，pH为8.5。
一种罗非鱼精子通用稀释液的制备方法，其步骤是：
1.精子稀释液母液的配制：
(1)每毫升含氯化钠1mmol的母液：根据母液的浓度、体积和氯化钠分子量计算出配制母液需要的氯化钠重量，计算精确度为0.0g。用天平精确称取该重量分析纯的氯化钠(NaCl)，将氯化钠(NaCl)放入烧杯中，加入体积约为需要配制母液体积二分之一的蒸馏水，使NaCl充分溶解，将溶解后的氯化钠(NaCl)溶液倒入需要配制母液同样体积的容量瓶中，用5～10ml蒸馏水洗涤3次烧杯，将洗涤后的蒸馏水也倒入容量瓶，最后用蒸馏水定容至容量瓶刻度处。NaCl重量计算公式如下：
溶质重量＝(母液浓度×溶质分子量)÷母液体积
以下溶质重量均按此公式计算。
(2)每毫升含氯化钾1mmol的母液：根据母液的浓度、体积和氯化钾分子量计算出配制母液需要的氯化钾重量，计算精确度为0.0g。用天平精确称取该重量分析纯的氯化钾(KCl)，将氯化钾(KCl)放入烧杯中，加入体积约为需要配制母液体积二分之一的蒸馏水，使氯化钾(KCl)充分溶解，将溶解后的氯化钾(KCl)溶液倒入需要配制母液同样体积的容量瓶中，用5～10ml蒸馏水洗涤3次烧杯，将洗涤后的蒸馏水也倒入容量瓶，最后用蒸馏水定容至容量瓶刻度处。
(3)每毫升含氯化钙0.5mmol的母液：根据母液的浓度、体积和氯化钙分子量计算出配制母液需要的氯化钙重量，计算精确度为0.0g。用天平精确称取该重量分析纯的氯化钙(CaCl2)，将氯化钙(CaCl2)放入烧杯中，加入体积约为需要配制母液体积二分之一的蒸馏水，使氯化钙(CaCl2)充分溶解，将溶解后的CaCl2溶液倒入需要配制母液同样体积的容量瓶中，用5～10ml蒸馏水洗涤3次烧杯，将洗涤后的蒸馏水也倒入容量瓶，最后用蒸馏水定容至容量瓶刻度处。
(4)每毫升含碳酸氢钠0.5mmol的母液：根据母液的浓度、体积和碳酸氢钠分子量计算出配制母液需要的碳酸氢钠重量，计算精确度为0.0g。用天平精确称取该重量分析纯的碳酸氢钠(NaHCO3)，将碳酸氢钠(NaHCO3)放入烧杯中，加入体积约为需要配制母液体积二分之一的蒸馏水，使碳酸氢钠(NaHCO3)充分溶解，将溶解后的NaHCO3溶液倒入需要配制母液同样体积的容量瓶中，用5～10ml蒸馏水洗涤3次烧杯，将洗涤后的蒸馏水也倒入容量瓶，最后用蒸馏水定容至容量瓶刻度处。
(5)上述母液均放置4℃冰箱保存，备用。
2.精子稀释液的配制：
(1)用微量取样器(规格：5μl～5ml)从各组分母液中精确量取配制稀释液所需体积的各组分。量取各组分所需的体积根据稀释液配方中各组分的浓度、各组分母液的浓度、以及所需配制的稀释液体积，按如下公式计算：
量取体积＝(配方浓度×稀释液体积)÷母液浓度
(2)将上述各组分混合均匀。如果需要配制的稀释液体积大于100ml，则在相应体积的容量瓶中混匀，然后用蒸馏水定容至容量瓶刻度。如果需要配制的稀释液体积小于100ml，则在玻璃瓶中混匀，然后根据需要配制的稀释液体积减去已经量取的各组分体积总和，就是需要加入的蒸馏水体积(因为容量瓶最小为100ml)。
(3)配制好的稀释液放置4℃冰箱保存，备用。
与其他鱼类精子稀释液的比较：
下表为罗非鱼精子与其他几种鱼类精子稀释液成分的比较
罗非鱼精子通用精子稀释液与其他鱼类精子稀释液的比较，具有以下优点和效果：
1.罗非鱼精子稀释液的成分和浓度与其它鱼类精子稀释液存在较大差异。罗非鱼精子稀释液属于无机盐组成的离子型稀释液，同属这一类的稀释液有鲤鱼精子稀释液和鳗鲡精子稀释液。但与鲤鱼精子稀释液比，罗非鱼精子稀释液中多了CaCl2成分。而与鳗鲡精子稀释液比，罗非鱼精子稀释液又少了MgCl2成分。
2.罗非鱼精子稀释液的渗透压也与其它鱼类精子的渗透压存在较大差异。罗非鱼精子稀释液属于中渗稀释液。其渗透压远高于中华鲟的低渗稀释液，同时又远低于大口鲶的高渗稀释液。与它较接近的有鲤鱼和白鲢精子稀释液，但它比鲤鱼精子稀释液高14.1mOsM，而比白鲢精子稀释液低29.2mOsM。
3.罗非鱼精子稀释液的pH虽然与有些鱼类基本相同，如：大口鲶、鲤鱼。但与其它鱼类的pH仍存在一定的差异。
具体实施方式
实施例1：
以下以超低温保存10ml尼罗罗非鱼精液为例，说明罗非鱼精子稀释液的配制和使用方法。
一种罗非鱼精子通用稀释液，它由以下重量份的原料制成：
本配方的稀释液渗透压为293.0mOsM，pH为8.7。
一种罗非鱼精子通用稀释液的制备方法，其步骤是：
1.精子稀释液母液的配制：
(1)配制1000ml浓度为1M的NaCl母液：根据方法中描述的计算公式，计算出需要称取的氯化钠重量。用天平精确称取58.4g分析纯的NaCl，放置于1000ml烧杯中，加入约500ml蒸馏水，待NaCl充分溶解后，将其倒入1000ml容量瓶中，每次用5～10ml蒸馏水洗涤烧杯3次，将洗涤后的蒸馏水也倒入容量瓶，最后用蒸馏水定容至容量瓶刻度处。
(2)配制500ml浓度为1M的KCl母液：根据方法中描述的计算公式，计算出需要称取的氯化钾重量。用天平精确称取37.3g分析纯的KCl，放置于500ml烧杯中，加入约250ml蒸馏水，待KCl充分溶解后，将其倒入500ml容量瓶中，每次用5～10ml蒸馏水洗涤烧杯3次，将洗涤后的蒸馏水也倒入容量瓶，最后用蒸馏水定容至容量瓶刻度处。
(3)配制500ml浓度为0.5M的CaCl2母液：根据方法中描述的计算公式，计算出需要称取的氯化钙重量。用天平精确称取55.5g分析纯的CaCl2，放置于500ml烧杯中，加入约250ml蒸馏水，待CaCl2充分溶解后，将其倒入500ml容量瓶中，每次用5～10ml蒸馏水洗涤烧杯3次，将洗涤后的蒸馏水也倒入容量瓶，最后用蒸馏水定容至容量瓶刻度处。
(4)配制500ml浓度为0.5M的NaHCO3母液：根据方法中描述的计算公式，计算出需要称取的碳酸氢钠重量。用天平精确称取42.0g分析纯的NaHCO3，放置于500ml烧杯中，加入约250ml蒸馏水，待NaHCO3充分溶解后，将其倒入500ml容量瓶中，每次用5～10ml蒸馏水洗涤烧杯3次，将洗涤后的蒸馏水也倒入容量瓶，最后用蒸馏水定容至容量瓶刻度处。
(5)上述母液均放置4℃冰箱保存，备用。
2.100ml精子稀释液的配制：
(1)根据公式：量取体积＝(配方浓度×稀释液体积)÷母液浓度，计算出需要从母液中量取的各组分体积。具体体积见(2)中数据。
(2)分别精确量取12.7ml 1M的NaCl母液；700μl 1M的KCl母液；340μl 0.5M的CaCl2母液；400μl NaHCO3 0.5M的母液于100ml容量瓶中。
(3)将上述溶液混匀后，加蒸馏水定容至100ml。
(4)将上述配制好的100ml罗非鱼精子稀释液放置4℃冰箱保存，备用。
3.尼罗罗非鱼精子的超低温保存：
(1)罗非鱼精子的采集：选择性腺发育成熟的尼罗罗非鱼雄鱼2～3尾，用干毛巾擦干生殖孔周围及腹部的水。用手轻轻挤压雄鱼腹部，待挤出精液后，前面几滴精液不要，然后将精液挤入干燥的容器中。将挤出的精液混匀后，准备镜检。
(2)精子活力检测：在10×20倍的显微镜下进行镜检，计算机辅助检测鲜精平均活率达到85％以上，平均曲线运动速度(VCL)达到35微米/秒以上，平均直线运动速度达到20微米/秒以上，该精子便可用于超低温冷冻保存。放入4℃冰箱保存，备用。
(3)精液的稀释与平衡：取10ml镜检后符合冷冻标准的精液，加入30ml预先配制好的罗非鱼精子稀释液，稀释比为1∶3。精液与稀释液混匀后，放置4℃冰箱，冻前平衡20分钟～2小时。
(4)添加抗冻剂与分装：将上述稀释平衡20分钟后的精液加入3.2ml二甲亚砜(DMSO)，使其终浓度达到8％左右，混匀后立即分装。用2ml微量进样器将上述混合液吸入2.0ml冷冻管中。共分装20支冷冻管，然后将冷冻管放在冷冻架上，每5支冷冻管放1个冷冻架，共4个冷冻架。分装前应准备1个约30cm×30cm×20cm的泡沫箱，箱内放入碎冰，上述操作全部在冰面完成，且时间不能超过1小时40分钟。分装完成后，立即将冷冻架放入程序降温仪的冷冻仓中，准备降温。
(5)程序降温：降温程序从0℃开始，以5℃/分钟的速度降至-15℃，在-15℃停留5分钟，然后再以25℃/分钟速度从-15℃降至-85℃，最后在-85℃处平衡10分钟。降温完成后，直接将装有麦管的冷冻架从程序降温仪中取出，立即放入液氮罐中，在-196℃温度中保存。
实施例2-6
其制备方法实施例1相同。
实施例7：
以下以人工授精20尾尼罗罗非鱼雌鱼的卵为例，说明罗非鱼通用稀释液在人工授精过程中的使用方法。
1.精子稀释液母液的配制：
精子稀释液母液配制方法与案例一完全相同。
2.20ml精子稀释液的配制：
(1)根据公式：量取体积＝(配方浓度×稀释液体积)÷母液浓度，计算出需要从母液中量取的各组分体积。具体体积见(2)中数据。
(2)分别精确量取2.55ml 1M的NaCl母液；150μl 1M的KCl母液；80μl 0.5M的CaCl2母液；100μl 0.5M的NaHCO3母液于30ml指管瓶中。
(3)将上述溶液混匀后，加17.12ml蒸馏水。
(4)将上述配制好的20ml罗非鱼精子稀释液放置4℃冰箱保存，备用。
3.尼罗罗非鱼的人工授精
(1)尼罗罗非鱼精子的采集：选择性腺发育成熟的尼罗罗非鱼雄鱼1～2尾，用干毛巾擦干生殖孔周围及腹部的水。用手轻轻挤压雄鱼腹部，待能挤出精液后，前面几滴精液不要，然后将精液挤入干燥的容器中。将挤出的精液混匀后，放入4℃冰箱保存，备用。
(2)精液的稀释与平衡：用干燥的取样器取5ml精液，加入10ml预先配制好的罗非鱼精子稀释液，稀释比为1∶2。精液与稀释液混匀后，放置4℃冰箱，平衡1小时以上。
注：研究证明尼罗罗非鱼精液被稀释后，在4℃冰箱里存放1小时以上的授精效果比不存放的效果要好很多。
(3)尼罗罗非鱼人工采卵：待稀释后的精液在冰箱平衡1小时左右后，选择20尾性腺发育成熟的雌性尼罗罗非鱼，分别用干毛巾揩干雌鱼生殖孔周围以及腹部，按照自头向尾方向轻轻挤压腹部，将这20尾雌鱼的卵全部挤入干燥的容器中，常温备用。
(4)尼罗罗非鱼人工授精：将平衡好的15ml精液倒入卵中，用羽毛轻轻搅匀。1～2分钟后加入250～300ml预先配制好的罗非鱼精子激活液(其配方另外发布)，轻轻搅拌3～5分钟，静置2分钟后，再加入1000ml以上清水。再轻轻搅拌2～3分钟后，倒掉面上的污水，然后用此清水洗卵2～3次，即可将卵移入孵化器中孵化。
Claims (6)
1.一种尼罗罗非鱼精子通用稀释液，它由以下重量份的原料制成：
稀释液渗透压为265.4～320.6mOsM，pH为8-9；
所述稀释液的制备方法是：
A、精子稀释液母液的配制：
(1)每毫升含氯化钠1mmol的母液：根据母液的浓度、体积和氯化钠分子量计算出配制母液需要的氯化钠重量，称取氯化钠，将氯化钠放入烧杯中，加入配制母液体积二分之一的蒸馏水，使氯化钠充分溶解，将溶解后的氯化钠溶液倒入配制母液同样体积的容量瓶中，用5～10ml蒸馏水洗涤3次烧杯，将洗涤后的蒸馏水也倒入容量瓶，最后用蒸馏水定容至容量瓶刻度处；
(2)每毫升含氯化钾1mmol的母液：根据母液的浓度、体积和氯化钾分子量计算出配制母液需要的氯化钾重量，称取氯化钾，将氯化钾放入烧杯中，加入母液体积二分之一的蒸馏水，使氯化钾充分溶解，将溶解后的氯化钾溶液倒入配制母液同样体积的容量瓶中，用5～10ml蒸馏水洗涤3次烧杯，将洗涤后的蒸馏水也倒入容量瓶，最后用蒸馏水定容至容量瓶刻度处；
(3)每毫升含氯化钙0.5mmol的母液：根据母液的浓度、体积和氯化钙分子量计算出配制母液需要的氯化钙重量，称取的氯化钙，将氯化钙放入烧杯中，加入配制母液体积二分之一的蒸馏水，使氯化钙充分溶解，将溶解后的氯化钙溶液倒入配制母液同样体积的容量瓶中，用5～10ml蒸馏水洗涤3次烧杯，将洗涤后的蒸馏水也倒入容量瓶，最后用蒸馏水定容至容量瓶刻度处；
(4)每毫升含碳酸氢钠0.5mmol的母液：根据母液的浓度、体积和碳酸氢钠分子量计算出配制母液的碳酸氢钠重量，称取碳酸氢钠，将碳酸氢钠放入烧杯中，加入配制母液体积二分之一的蒸馏水，使碳酸氢钠充分溶解，将溶解后的碳酸氢钠溶液倒入配制母液同样体积的容量瓶中，用5～10ml蒸馏水洗涤3次烧杯，将洗涤后的蒸馏水也倒入容量瓶，最后用蒸馏水定容至容量瓶刻度处；
(5)上述母液均放置4℃冰箱保存；
B、精子稀释液的配制：
(1)用微量取样器从各组分母液中量取配制稀释液，量取各组分的体积根据稀释液配方中各组分的浓度、各组分母液的浓度、以及配制的稀释液体积，按如下公式计算：
量取体积＝配方浓度×稀释液体积÷母液浓度；
(2)将上述各组分混合均匀，配制的稀释液体积100ml，在体积的容量瓶中混匀，然后用蒸馏水定容至容量瓶刻度；
(3)配制好的稀释液放置4℃冰箱保存，备用。
2.根据权利要求1所述的一种尼罗罗非鱼精子通用稀释液，其特征在于：
稀释液渗透压为273.0～314.2mOsM，pH为8.1-8.8。
3.根据权利要求1所述的一种尼罗罗非鱼精子通用稀释液，其特征在于：
稀释液渗透压为280.0～307.0mOsM，pH为8.3-8.6。
4.根据权利要求1所述的一种尼罗罗非鱼精子通用稀释液，其特征在于：
稀释液渗透压为285.8～300.6mOsM，pH为8.4-8.5。
5.根据权利要求1所述的一种尼罗罗非鱼精子通用稀释液，其特征在于：
稀释液渗透压为293.0mOsM，pH为8.5。
6.根据权利要求1所述的一种尼罗罗非鱼精子通用稀释液，其特征在于：
本配方的稀释液渗透压为293.0mOsM，pH为8.7。
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