CN102986652B - 一种细鳞鲑精液超低温冷冻保存方法 - Google Patents
一种细鳞鲑精液超低温冷冻保存方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102986652B CN102986652B CN 201210570268 CN201210570268A CN102986652B CN 102986652 B CN102986652 B CN 102986652B CN 201210570268 CN201210570268 CN 201210570268 CN 201210570268 A CN201210570268 A CN 201210570268A CN 102986652 B CN102986652 B CN 102986652B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seminal fluid
- freezing
- dmso
- dimethyl sulfoxide
- thin squama
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
一种细鳞鲑精液超低温冷冻保存方法，它涉及一种鱼类精液超低温冷冻保存方法，本发明是为解决现有的鱼类超低温冷冻保存方法中使用的抗冻液具有种的特异性且毒性大，不适合于细鳞鲑精液的超低温冷冻保存，冻精解冻后受精率低的技术问题，本发明的抗冻液的保存方法如下：以二甲基亚砜作为抗冻剂，以胎牛血清和葡萄糖作为稀释液，与精液混合后用液氮进行超低温冷冻保存，抗冻液组成简单，化学物质少，毒性小，使冷冻后的细鳞鲑精液解冻后受精率达80%以上，相比使用现有的鱼类抗冻液冷冻保存细鳞鲑精液解冻后受精率提高了30%～50%，冷冻效果好，适用于细鳞鲑精液超低温冷冻保存。
Description
技术领域
本发明涉及一种鱼类精液超低温冷冻保存方法。
背景技术
丰富的种质资源是鱼类遗传育种、商业养殖品种开发及水产养殖业可持续发展的重要物质基础，但由于渔业资源的过度捕捞、无序利用及人工放流等，造成了某些鱼类资源的衰退和珍惜种类濒临灭绝，如不及时采取保护措施，将会造成绝大部分鱼类的原、良种遗传资源的丧失。细鳞鲑(Brachymystaxlenok)属鲑形目(Salmoniformes)、鲑科(Salmonidae)、隶属于细鳞鲑属(Brachymystax)。濒危等级：易危，国家二级保护动物。细鳞鲑营养丰富，肉质细嫩，肉味鲜美，易于驯化，深受广大消费者青睐，随着近些年来市场对细鳞鲑的需求量不断增加，细鳞鲑的商业化养殖与育种事业得到了大力发展，但在进行选育工作中种质资源的保护往往被忽视了，进而导致商业养殖过程中近交种质退化愈演愈烈，遗传多样性降低，品质下降，生长性能低下，大部分养殖品种对病害和环境胁迫的防御能力降低，病害频发，因而给养殖企业造成了巨大的经济损失。
自从上个世纪50年代，英国学者Blaxter首次成功对鱼类精巢进行冷冻以来，国外许多学者对鱼类精子的长期冷冻保存也进行了相关研究和探索，在鱼类中，精子冷冻保存技术是一种对濒危种类基因库进行有效保护的重要方法；同时在水产养殖中还具有重要生产价值，如对一些重要的商业养殖种类的经济保护，以及保护养殖品系免受突发疾病、自然灾害、或水域污染等，而且冻精也易于在不同苗种场之间运输，利用其对不同品种或品系以及不同地理种群间的鱼类进行杂交，进而利用杂交优势。
目前现有的鱼类抗冻液配方具有种的特异性，且抗冻液中化学成分多从而导致毒性大，不适合于细鳞鲑精液的超低温冷冻保存，因而如能开发出适合细鳞鲑的抗冻液配方，进而通过超低温冷冻保存技术构建该鱼的冷冻精子库，将为细鳞鲑的种质保存与遗传多样性保护作出巨大贡献，从而为该鱼的人工繁育与杂交优势利用不间断的提供技术保障。
发明内容
本发明是为解决现有的鱼类超低温冷冻保存方法中使用的抗冻液具有种的特异性且毒性大，不适合于细鳞鲑精液的超低温冷冻保存，冻精解冻后受精率低的技术问题，而提供一种细鳞鲑精液超低温冷冻保存方法。
本发明的一种细鳞鲑精液超低温冷冻保存的抗冻液由二甲基亚砜和稀释液组成，稀释液由胎牛血清和葡萄糖按质量比为100∶（1.4～1.6）混合而成，二甲基亚砜和稀释液的体积比为（2～4）∶17。
用上述细鳞鲑精液超低温冷冻保存的抗冻液冷冻保存细鳞鲑精液的方法按如下步骤进行：
一、新鲜精液的采集：将细鳞鲑雄性亲本进行麻醉，麻醉后用干燥的无菌纱布将细鳞鲑雄性亲本体表和生殖孔擦拭干净；然后挤压腹部使精液流出，采集至器皿中，激活精子后将精子活动率超过80％的新鲜精液置于温度为0～4℃的条件下保温待用；
二、精液抗冻混合液的制备：按二甲基亚砜和稀释液的体积比为（2～4）∶17，按稀释液中胎牛血清和葡萄糖质量比为100∶（1.4～1.6），分别称取二甲基亚砜、胎牛血清和葡萄糖，然后将二甲基亚砜分成三等份，先取第一份二甲基亚砜与胎牛血清混合，在温度为3～5℃的条件下保温8～12min，再按照二甲基亚砜和稀释液的总体积与步骤一的新鲜精液的体积之比为（2～4）∶1，将步骤一的新鲜精液加入，充分混合后在温度为3～5℃的条件下保温8～12min，然后再加入第二份二甲基亚砜，充分混合后在温度为3～5℃的条件下保温1～3min，再加入第三份二甲基亚砜，充分混合后在温度为3～5℃的条件下保温，最后加入葡萄糖，得到精液抗冻混合液；
三、精液抗冻混合液的分装：将步骤二得到的精液抗冻混合液分装于冷存管中，然后在温度为3～5℃的条件下保温；
四、精液抗冻混合液冷冻：首先将液氮导入带盖泡沫箱中，液氮液面距离箱口14～16cm，使步骤三的冷存管在液氮表面6～10cm处停留2～5min，然后在距液氮面1～3cm处停留1～3min，最后直接放入液氮中保存；
五、精液抗冻混合液冷冻后的解冻：将步骤四后的冷存管放在温度为25～30℃的水浴中，摇动冷存管至冷存管中精液抗冻混合液溶解45%～55%，然后取出放置室温下至完全解冻。
本发明的一种细鳞鲑精液超低温冷冻保存的抗冻液以二甲基亚砜作为抗冻剂，以胎牛血清和葡萄糖作为稀释液，组成简单，化学物质少，毒性小，且本发明的冷冻方法将抗冻剂分成三等份，先将其中一份与稀释液混合后，再与精液混合，然后再分两次将第二份和第三份抗冻剂加入其中并混合，冷冻后的细鳞鲑精液解冻后受精率达80%以上，相比使用现有的鱼类抗冻液冷冻保存细鳞鲑精液解冻后受精率提高了30%～50%，冷冻效果好，适用于细鳞鲑精液超低温冷冻保存。
附图说明
图1是试验组和对照组解冻后的细鳞鲑精液受精率和抗冻剂二甲基亚砜添加量关系的对比曲线图；其中a为对照组解冻后的细鳞鲑精液受精率和抗冻剂二甲基亚砜添加量关系曲线，b为试验组解冻后的细鳞鲑精液受精率和抗冻剂二甲基亚砜添加量关系曲线。
具体实施方式
本发明的技术方案不局限于以下具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式的一种细鳞鲑精液超低温冷冻保存的抗冻液由二甲基亚砜和稀释液组成，稀释液由胎牛血清和葡萄糖按质量比为100∶（1.4～1.6）混合而成，二甲基亚砜和稀释液的体积比为（2～4）∶17。
本实施方式的一种细鳞鲑精液超低温冷冻保存的抗冻液以二甲基亚砜作为抗冻剂，以胎牛血清和葡萄糖作为稀释液，组成简单，化学物质少，毒性小，适用于细鳞鲑精液的超低温冷冻保存。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：葡萄糖为液态葡萄糖或固态葡萄糖，其它步骤与参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：稀释液由胎牛血清和葡萄糖按质量比为100∶1.5混合而成，其它步骤与参数与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：二甲基亚砜和稀释液的体积比为3∶17，其它步骤与参数与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式的一种用细鳞鲑精液超低温冷冻保存的抗冻液冷冻保存细鳞鲑精液的方法按如下步骤进行：
一、新鲜精液的采集：将细鳞鲑雄性亲本进行麻醉，麻醉后用干燥的无菌纱布将细鳞鲑雄性亲本体表和生殖孔擦拭干净；然后挤压腹部使精液流出，采集至器皿中，激活精子后将精子活动率超过80％的新鲜精液置于温度为0～4℃的条件下保温待用；
二、精液抗冻混合液的制备：按二甲基亚砜和稀释液的体积比为（2～4）∶17，按稀释液中胎牛血清和葡萄糖质量比为100∶（1.4～1.6），分别称取二甲基亚砜、胎牛血清和葡萄糖，然后将二甲基亚砜分成三等份，先取第一份二甲基亚砜与胎牛血清混合，在温度为3～5℃的条件下保温8～12min，再按照二甲基亚砜和稀释液的总体积与步骤一的新鲜精液的体积之比为（2～4）∶1，将步骤一的新鲜精液加入，充分混合后在温度为3～5℃的条件下保温8～12min，然后再加入第二份二甲基亚砜，充分混合后在温度为3～5℃的条件下保温1～3min，再加入第三份二甲基亚砜，充分混合后在温度为3～5℃的条件下保温，最后加入葡萄糖，得到精液抗冻混合液；
三、精液抗冻混合液的分装：将步骤二得到的精液抗冻混合液分装于冷存管中，然后在温度为3～5℃的条件下保温；
四、精液抗冻混合液冷冻：首先将液氮导入带盖泡沫箱中，液氮液面距离箱口14～16cm，使步骤三的冷存管在液氮表面6～10cm处停留2～5min，然后在距液氮面1～3cm处停留1～3min，最后直接放入液氮中保存；
五、精液抗冻混合液冷冻后的解冻：将步骤四后的冷存管放在温度为25～30℃的水浴中，摇动冷存管至冷存管中精液抗冻混合液溶解45%～55%，然后取出放置室温下至完全解冻。
本实施方式的冷冻方法将抗冻剂分成三等份，先将其中一份与稀释液混合后，再与精液混合，然后再分两次将第二份和第三份抗冻剂加入其中并混合，冷冻后的细鳞鲑精液解冻后受精率达80%以上，相比使用现有的鱼类抗冻液冷冻保存细鳞鲑精液解冻后受精率提高了30%～50%，冷冻效果好，适用于细鳞鲑精液超低温冷冻保存。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式五不同的是：步骤二中稀释液由胎牛血清和葡萄糖按质量比为100∶1.5混合而成，其它步骤与参数与具体实施方式五相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式五或六之一不同的是：步骤二中二甲基亚砜和稀释液的体积比为3∶17，其它步骤与参数与具体实施方式五或六相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式五至七之一的是：步骤二中二甲基亚砜和稀释液的总体积与新鲜精液的体积之比为3∶1，其它步骤与参数与具体实施方式五至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式五至八之一不同的是：步骤三中的冷存管为麦管，其它步骤与参数与具体实施方式五至八之一相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式五至九之一不同的是：步骤五中冷存管为0.5ml的麦管时，摇动麦管15～20s，其它步骤与参数与具体实施方式五至九之一相同。
用以下试验验证本发明的有益效果：
试验一、选择体重和健康状况相同的十尾细鳞鲑雄性亲本随即分成两组，试验组作如下处理：
一、新鲜精液的采集：用浓度为0.05%的苯氧乙醇对细鳞鲑雄性亲本进行麻醉，然后用干燥的无菌纱布将细鳞鲑雄性亲本体表和生殖孔擦拭干净，挤压腹部使精液流出，采集10ml新鲜精液至器皿中，激活精子后取精子活动率超过80％的新鲜精液6ml置于温度为4℃的条件下保温待用；
二、精液抗冻混合液的制备：向7.65ml的胎牛血清中加入0.45ml的二甲基亚砜，混合后在温度为4℃的条件下保温10min，然后加入步骤一处理后的新鲜精液3ml，混合后在温度为4℃的条件下保温10min，再加入0.45ml的二甲基亚砜，混合后在温度为4℃的条件下保温2min，再加入0.45ml的二甲基亚砜，混合后在温度为4℃的条件下保温，最后加入0.115克葡萄糖，得到精液抗冻混合液；
三、精液抗冻混合液的分装：将步骤二得到的精液抗冻混合液分装于，0.5ml的麦管中，然后在温度为4℃的条件下保温；
四、精液抗冻混合液冷冻：首先将液氮导入带盖泡沫箱中，液氮液面距离箱口15cm，使步骤三的麦管在液氮表面8cm处停留4min，然后在距液氮面2cm处停留2min，最后直接放入液氮中保存；
五、精液抗冻混合液冷冻后的解冻：将步骤四后的麦管放在温度为28℃的水浴中，摇动麦管至麦管中精液抗冻混合液溶解50%，然后取出放置室温下至完全解冻。
对照组作如下处理：用现有的鱼类精液抗冻液超低温冷冻保存细鳞鲑精液的方法按以下步骤进行：
一、精液抗冻混合液的制备与分装：取含有氯化钠的质量分数为0.8%，含有氯化钾的质量分数为0.05%的稀释液7.65ml与0.45ml二甲基亚砜充分混合，混合后在温度为4℃的条件下保温10min，然后加入试验组步骤一处理后的新鲜精液3ml，混合后在温度为4℃的条件下保温10min，再加入0.45ml的二甲基亚砜，混合后在温度为4℃的条件下保温2min，再加入0.45ml的二甲基亚砜，混合后在温度为4℃的条件下保温，得到精液抗冻混合液，将精液抗冻混合液分装于0.5ml的麦管中，然后在温度为4℃的条件下保温；
二、精液抗冻混合液冷冻：首先将液氮导入带盖泡沫箱中，液氮液面距离箱口约15cm，使步骤一的麦管在液氮表面8cm处停留4min，然后在距液氮面2cm处停留2min，最后直接放入液氮中保存；
四、精液抗冻混合液冷冻后的解冻：将步骤二后的麦管放在温度为28℃的水浴中，摇动麦管至麦管中精液抗冻混合液溶解50%，然后取出放置室温下至完全解冻。
取上述试验组和对照组解冻后的细鳞鲑精液进行人工授精试验，试验得出试验组和对照组解冻后的细鳞鲑精液受精率和添加的抗冻剂二甲基亚砜添加量的对比关系曲线图，如图1所示，从图中可以看出对照组解冻后的细鳞鲑精液受精率最高达42%，而试验组解冻后的细鳞鲑精液受精率达80%，受精率提高了38%，同时由图1得出，抗冻剂二甲基亚砜添的最佳添加量为抗冻液体积的15%，由此可以得出本发明的一种细鳞鲑精液超低温冷冻保存的抗冻液及其冷冻保存方法，冷冻效果好，且抗冻液组成简单，毒性小，适用于细鳞鲑精液超低温冷冻保存。
Claims (7)
1.一种细鳞鲑精液超低温冷冻保存方法，其特征在于一种细鳞鲑精液超低温冷冻保存方法按以下步骤进行：
一、新鲜精液的采集：将细鳞鲑雄性亲本进行麻醉，麻醉后用干燥的无菌纱布将细鳞鲑雄性亲本体表和生殖孔擦拭干净；然后挤压腹部使精液流出，采集至器皿中，激活精子后将精子活动率超过80％的新鲜精液置于温度为0～4℃的条件下保温待用；
二、精液抗冻混合液的制备：按二甲基亚砜和稀释液的体积比为（2～4）∶17，按稀释液中胎牛血清和葡萄糖质量比为100∶（1.4～1.6），分别称取二甲基亚砜、胎牛血清和葡萄糖，然后将二甲基亚砜分成三等份，先取第一份二甲基亚砜与胎牛血清混合，在温度为3～5℃的条件下保温8～12min，再按照二甲基亚砜和稀释液的总体积与步骤一的新鲜精液的体积之比为（2～4）∶1，将步骤一的新鲜精液加入，充分混合后在温度为3～5℃的条件下保温8～12min，然后再加入第二份二甲基亚砜，充分混合后在温度为3～5℃的条件下保温1～3min，再加入第三份二甲基亚砜，充分混合后在温度为3～5℃的条件下保温，最后加入葡萄糖，得到精液抗冻混合液；
三、精液抗冻混合液的分装：将步骤二得到的精液抗冻混合液分装于冷存管中，然后在温度为3～5℃的条件下保温；
四、精液抗冻混合液冷冻：首先将液氮导入带盖泡沫箱中，液氮液面距离箱口14～16cm，使步骤三的冷存管在液氮表面6～10cm处停留2～5min，然后在距液氮面1～3cm处停留1～3min，最后直接放入液氮中保存；
五、精液抗冻混合液冷冻后的解冻：将步骤四后的冷存管放在温度为25～30℃的水浴中，摇动冷存管至冷存管中精液抗冻混合液溶解45%～55%，然后取出放置室温下至完全解冻。
2.根据权利要求1所述的一种细鳞鲑精液超低温冷冻保存方法，其特征在于步骤二中所述葡萄糖为液态葡萄糖或固态葡萄糖。
3.根据权利要求1或2所述的一种细鳞鲑精液超低温冷冻保存方法，其特征在于步骤二中稀释液由胎牛血清和葡萄糖按质量比为100∶1.5混合而成。
4.根据权利要求3所述的一种细鳞鲑精液超低温冷冻保存方法，其特征在于步骤二中二甲基亚砜和稀释液的体积比为3∶17。
5.根据权利要求3所述的一种细鳞鲑精液超低温冷冻保存方法，其特征在于步骤二中二甲基亚砜和稀释液的总体积与新鲜精液的体积之比为3∶1。
6.根据权利要求3所述的一种细鳞鲑精液超低温冷冻保存方法，其特征在于步骤三中的冷存管为麦管。
7.根据权利要求3所述的一种细鳞鲑精液超低温冷冻保存方法，其特征在于步骤五中冷存管为0.5ml的麦管时，摇动麦管15～20s。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201210570268 CN102986652B (zh) | 2012-12-25 | 2012-12-25 | 一种细鳞鲑精液超低温冷冻保存方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201210570268 CN102986652B (zh) | 2012-12-25 | 2012-12-25 | 一种细鳞鲑精液超低温冷冻保存方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102986652A CN102986652A (zh) | 2013-03-27 |
| CN102986652B true CN102986652B (zh) | 2013-12-18 |
Family
ID=47916140
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201210570268 Expired - Fee Related CN102986652B (zh) | 2012-12-25 | 2012-12-25 | 一种细鳞鲑精液超低温冷冻保存方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102986652B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104604845A (zh) * | 2015-02-06 | 2015-05-13 | 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 | 一种哲罗鲑精液超低温冷冻保存液及哲罗鲑精液的冷冻保存方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1309301C (zh) * | 2003-09-28 | 2007-04-11 | 中国水产科学研究院东海水产研究所 | 鲟科鱼类精子超低温冷冻保存方法 |
| KR100522582B1 (ko) * | 2004-02-05 | 2005-10-19 | 강원도 화천군 | 연어과 어류의 훈제방법 및 이에 의해 제조된 훈제품 |
| CN102258007A (zh) * | 2011-09-02 | 2011-11-30 | 大连海洋大学 | 太平洋鳕鱼精子保存冷冻剂及太平洋鳕鱼精子保存方法 |
| CN102578076B (zh) * | 2012-01-11 | 2013-07-03 | 中国水产科学研究院长江水产研究所 | 一种罗非鱼精子通用稀释液及制备方法 |
| CN102726369A (zh) * | 2012-06-18 | 2012-10-17 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 龙趸精子超低温冷冻保存应用方法 |
| CN102763641A (zh) * | 2012-08-07 | 2012-11-07 | 中国科学院昆明动物研究所 | 滇池金线鲃精子超低温冷冻保存及复苏方法 |
-
2012
- 2012-12-25 CN CN 201210570268 patent/CN102986652B/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102986652A (zh) | 2013-03-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Maria et al. | Extenders and cryoprotectants for cooling and freezing of piracanjuba (Brycon orbignyanus) semen, an endangered Brazilian teleost fish | |
| CN102273439A (zh) | 七带石斑鱼精子冷冻保存和应用方法 | |
| CN104145944B (zh) | 一种魁蚶精子超低温冷冻保存与激活方法 | |
| CN104521943A (zh) | 一种云斑尖塘鳢精子超低温冷冻保存及复苏方法 | |
| CN106417113A (zh) | 鞍带石斑鱼精子冷冻库建立及辅助石斑鱼远缘杂交育种方法 | |
| Yang et al. | Optimization of conditions for the cryopreservation of yellow catfish (Pelteobagrus fulvidraco) sperm | |
| CN114258911B (zh) | 一种黄鳍鲷精子的冷冻保存溶液及冷冻保存方法 | |
| Santiago-Moreno et al. | Animal board invited review: Germplasm technologies for use with poultry | |
| CN109819976B (zh) | 一种卵胎生鱼类许氏平鲉精子超低温保存及激活方法 | |
| CN107683850A (zh) | 一种黄鳝精子超低温冷冻保存液及其冷冻复苏方法 | |
| CN103931531B (zh) | 一种利用冰点前临界低温长期保存香港牡蛎眼点幼虫的方法 | |
| CN102726369A (zh) | 龙趸精子超低温冷冻保存应用方法 | |
| CN103329889B (zh) | β-胡萝卜素用于制备猪精液冷冻保护剂的应用 | |
| KR101457526B1 (ko) | 돼지 정액의 보존성 개선을 위한 희석액 조성물 | |
| CN103262837B (zh) | 一种家畜精液冷冻保护剂及其应用 | |
| CN103891711A (zh) | 花鲈精液的处理方法 | |
| CN106070184A (zh) | 一种猪精液的冷冻和解冻方法 | |
| CN106818708B (zh) | 棕点石斑鱼精子超低温冷冻保护剂及其保存方法 | |
| CN102986652B (zh) | 一种细鳞鲑精液超低温冷冻保存方法 | |
| CN105145546A (zh) | 一种蜜蜂雄蜂精液的保存液及其制备方法 | |
| Yang et al. | Optimization of a sperm cryopreservation protocol for giant grouper (Epinephelus lanceolatus) | |
| CN102217590A (zh) | 银鲳精子冷冻保存方法 | |
| CN102870763A (zh) | 一种红鳍笛鲷精子的冷冻保存方法 | |
| CN103348932B (zh) | 一种夏鲆冻精与牙鲆种间杂交人工授精的方法 | |
| Sarder et al. | Cryopreservation of spermatozoa of Mrigal, Cirrhinus cirrhosus with a view to minimize inbreeding and hybridization |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20131218 Termination date: 20171225 |