CN105532639A - 一种鞍带石斑鱼精子大容量、高效超低温冷冻保存的方法 - Google Patents

一种鞍带石斑鱼精子大容量、高效超低温冷冻保存的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属海洋生物技术领域，具体地说是一种鞍带石斑鱼精子大容量、高效超低温冷冻保存的方法。将鞍带石斑鱼的精液与抗冻液按体积比2：1-4:1的比例混合，混合后经过一步平衡，三步降温处理后投入到液氮(-196℃)，分装保存；所述抗冻液由稀释液、抗冻剂、添加剂三部分组成；本发明的鞍带石斑鱼精子高效冷冻保存方法获得的高质量的冻精对于石斑鱼种间人工杂交、种质保存、遗传多样性及可持续养殖等方面有着重要意义。

Description

一种鞍带石斑鱼精子大容量、高效超低温冷冻保存的方法
技术领域
本发明属海洋生物技术领域，具体地说是一种鞍带石斑鱼精子稳定、高效超低温冷冻保存的方法。
背景技术
鞍带石斑鱼(Epinepheluslanceolatus)又称龙趸或龙胆石斑,隶属于鲈形目,鮨科,石斑鱼亚科,石斑鱼属,是石斑鱼类群中体型最大的鱼类,有巨石斑之称,英文称为giantgrouper。鞍带石斑鱼主要产地在东南亚、澳洲海域,在中国的南海海域亦有分布。鞍带石斑鱼适宜在海水池塘和海水网箱中养殖,生长快,肉质好,食用价值高,具有很好的养殖前景。近几年,中国的广东、福建、海南等南方沿海地区相继开展鞍带石斑鱼人工养殖,并取得良好的养殖效益。但目前中国鞍带石斑鱼的人工繁殖和育苗仍处于试验阶段,虽有部分企业在人工繁育技术上有所突破,但生产技术尚未成熟,苗种培育生产效果不稳定,从而制约了鞍带石斑鱼养殖的发展。因此很多企业采用按带石斑鱼的精液与其他种类石斑鱼进行杂交的方法获得生长快的杂交种。其中珍珠龙胆即为鞍带与棕点杂交的该两种。由于石斑鱼是雌性先熟，雄性后熟并具有性逆转(Sexreversal)特性，雄性亲鱼获得较难，优质精子难以获得，是石斑鱼苗种规模化生产受到限制的一个重要因素。尤其对于鞍带石斑鱼等待雄鱼性成熟时个体达到几十甚至上百公斤，因此集中批量保存优质鞍带石斑鱼精液，在需要时解冻进行人工授精获得受精卵，从而克服了鞍带石斑鱼优质精液供不应求的困难。建立鞍带石斑鱼精子超低温保存的可靠方法对促进鞍带石斑鱼苗种规模化培育以及种质资源的保护都具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鞍带石斑鱼精子稳定、高效超低温冷冻保存的方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种鞍带石斑鱼精子大容量、高效超低温冷冻保存的方法，将鞍带石斑鱼的精液与抗冻液按体积比2：1-4:1的比例混合，混合后经过一步平衡，三步降温处理后投入到液氮(-196℃)，分装保存；抗冻液由稀释液、抗冻剂、添加剂三部分组成；
其中，稀释液为NaCl7.5-7.8g/L，MgSO4·7H2O0.1-0.12g/L，CaCl20.1-0.12g/L,Na2HPO4·2H2O0.1-0.12g/L，NaHCO30.4-0.5g/L；15-20％PG(丙二醇)；添加剂：海藻糖15-20g/L，蛋黄5-10％。(百分比皆体积百分比以稀释液为基准加入)
所述鞍带石斑鱼的精液与抗冻液在碎冰中(0℃)轻轻震荡、充分混匀5-8min，而后以-12℃--15℃/min的降温速率使温度降至-140℃--150℃，然后投入到液氮(-196℃)，分装保存。
所述抗冻液在使用前放置于0℃冰箱中预冷过夜，待用。
将混合均匀的鞍带石斑鱼精液分装于5ml-10ml的冻存管中；
将经液氮处理分装保存的鞍带石斑鱼冻精进行解冻，将其直接放入35-37℃水浴110s-130s，然后置于室温18-20℃放置至完全融化，而后于自然海水中激活。
激活后复苏，具体是载玻片滴入100μL海水，然后加入1-2μL冻精，用移液器吸打3-5次混匀，随即去3个视野，检测运动的精子数量占视野中所有精子数量的比例，经检测冻精相对复苏率高于95％。
本发明具有如下优点：
1.本发明冷冻保存过程中采用丙二醇作抗冻剂，保持较好渗透性的同时丙二醇的毒性较小，保护效果作用稳定；
2.本发明抗冻液中加入了海藻糖15-20g/L和5-10％蛋黄作为细胞外部保护剂，对精子的质膜起到很好的保护作用；
3.本发明冷冻保存过程中采用并且2：1-4：1的精液与抗冻液的比例，5ml-10ml冻存管进行保存，将实际的保存效率提高了近100倍。
4.降温前鲜精与抗冻液震荡混匀8-10min,直接放入程序降温仪中，节省了时间，操作简便易行；
5.同时精子与抗冻液的比例为2:1－4:1比以往1:3－1:1的保存，利于人工授精，同时节约精液；
6.本发明冷冻保存过程采用一步降温，采用以-12℃--－15℃/min速度降温，直接降至-140℃--150℃，投入液氮，加快保存速度，提高保存效率。整个保存过程不超过10min；冷冻保存降温程序精密，重复性稳定性好，好冻精解冻后复苏率高，激活后相对复活率高于90％，与鲜精活力状态差异不显著；
7.本发明冷冻精子从液氮中取出后，采用35℃-37℃解冻，可使精子快速度过重结晶区，同时又避免了局部温度过高导致的损伤。
具体实施方式
本发明的鞍带石斑鱼精子高效冷冻保存方法获得的高质量的冻精对于石斑鱼种间人工杂交、种质保存、遗传多样性及可持续养殖等方面有着重要意义。
下面结合实施例对本发明作进一步说明：
实施例1：
1)2013年8月份正值鞍带石斑鱼生殖生殖期，于胶南通用水产有限公司亲鱼车间，亲鱼养殖车间，将雄鱼从养殖池中捞出，放置于海绵上，蒸馏水冲洗生殖孔三次，纸巾擦净，轻轻从后向前挤压腹部获得1尾雄鱼的新鲜精液20ml，存于干净的离心管中，避光，显微镜检测活力高于95％，置于冰盒中回实验室进行冷冻保存，置于冰盒中进行冷冻保存；
2)抗冻液配制，由稀释液、丙二醇、海藻糖和蛋黄组成，配置后置于0℃冰箱预冷，待用；其中，稀释液为：NaCl7.5g/L，MgSO4·7H2O0.1g/L，CaCl20.1g/L，Na2HPO4·2H2O0.1g/L，NaHCO30.35g/L；12％PG(丙二醇)；添加剂：蔗糖15-20g/L，和5-10％蛋黄。
抗冻液的配置过程：首先用蒸馏水配置稀释液，秤取NaCl7.5g，MgSO4·7H2O0.1g，CaCl20.1g，Na2HPO4·2H2O0.1g，NaHCO30.35g，海藻糖15-20g，蛋黄100ml，然后定容至1L备用；采用已配置的稀释液作为基础液配置抗冻液，其中含12％PG(V:V)(即100mL抗冻液含12mlPG)。
3)将上述鲜精与抗冻液以体积2:1(鲜精：抗冻液)的比例混合，而后在碎冰中(0℃)轻轻震荡、充分混匀5min，分装至5ml冻存管中。
4)将冻存管置于降温仪中以-12℃/min降温速率降温至-150℃，将所有的冻存管倒入盛有液氮的泡沫盒中，然后逐一顺序放入冻存盒然后放入液氮容器中长期贮存(-196℃)；
5)将上述冷冻保存3个月后精液进行解冻，任意选取3个冻存管解冻，解冻前将冻存盒先置于盛有液氮的保温盒中，然后将冻存管快速从盒中取出放入35-37℃水浴锅中，轻轻摇动120s，然后置于室温18-20℃至完全融解；
6)将上述融解后精液用自然海水激活，激活后取1-2μL激活后冻精滴加至
滴入100μL海水的载玻片，然后用移液器吸打3-5次混匀，在显微镜下检测随即去3个视野，检测运动的精子数量占视野中所有精子数量的比例，经检测冻精相对复苏率高于95％。
实施例2
1)2013年9月份正值鞍带石斑鱼生殖期，于胶南通用水产有限公司亲鱼车间，将雄鱼从养殖池中捞出，放置于海绵上，蒸馏水冲洗生殖孔三次，纸巾擦净，轻轻从后向前挤压腹部获得鲜精。共采集鞍带石斑鱼2尾，共计鲜精50ml，显微镜检测活力95％，置于冰盒中回实验室进行冷冻保存，置于冰盒中进行冷冻保存。
2)抗冻液配制，由稀释液、抗冻剂、添加剂和蒸馏水组成，配置后置于0℃冰箱预冷，待用；其中，稀释液为：NaCl7.5g/L，MgSO4·7H2O0.1g/L，CaCl20.1g/L，Na2HPO4·2H2O0.1g/L，NaHCO30.4g/L，抗冻剂：15％PG(丙二醇)；添加剂：海藻糖25g/L，蛋黄10％。
抗冻液的配置过程：首先用蒸馏水配置稀释液，秤取NaCl7.5g，MgSO4·7H2O0.1g，CaCl20.1g，Na2HPO4·2H2O0.1g，NaHCO30.4g，海藻糖25g，100ml，然后定容至1L，精液冷冻保存前向上述定容后混合液体中加入15％PG(丙二醇)(即取85mL容后混合液体加入15mLPG)。
3)将上述鲜精与抗冻液以体积4:1(鲜精：抗冻液)的比例混合，而后在碎冰中(0℃)轻轻震荡、充分混匀10min，分装至10ml冻存管中，同时程序降温仪开启，预冷至0℃；
4)将冻存管置于降温仪中以-15℃/min降温速率降温至-150℃，将所有的冻存管倒入盛有液氮的泡沫盒中，然后逐一顺序放入冻存盒然后放入液氮容器中长期贮存(-196℃)；
5)将上述冷冻保存1年后精液进行解冻，任意选取3个冻存管解冻，解冻前将冻存盒先置于盛有液氮的保温盒中，然后将冻存管快速从盒中取出放入35-37℃水浴锅中，轻轻摇动130s，然后置于室温18-20℃放置于振荡器震荡30s至完全融解；
6)将上述融解后精液用自然海水激活，激活后取1-2μL激活后冻精滴加至
滴入100μL海水的载玻片，然后用移液器吸打3-5次混匀，在显微镜下检测随即去3个视野，检测运动的精子数量占视野中所有精子数量的比例，经检测冻精相对复苏率高于95％，同时冻精均作快速的直线运动。

Claims (5)

1.一种鞍带石斑鱼精子大容量、高效超低温冷冻保存的方法，其特征在于：将鞍带石斑鱼的精液与抗冻液按体积比2：1-4:1的比例混合，混合后经过一步平衡，三步降温处理后投入到液氮(-196℃)，分装保存；所述抗冻液由稀释液、抗冻剂、添加剂三部分组成；
其中，稀释液为NaCl7.5-7.8g/L，MgSO4·7H2O0.1-0.12g/L，CaCl20.1-0.12g/L,Na2HPO4·2H2O0.1-0.12g/L，NaHCO30.4-0.5g/L；15-20％PG(丙二醇)；添加剂：海藻糖15-20g/L，蛋黄5-10％。(百分比皆以稀释液为基准加入)。
2.按权利要求1所述的鞍带石斑鱼精子高效超低温冷冻保存的方法，其特征在于：所述鞍带石斑鱼的精液与抗冻液在碎冰中(0℃)轻轻震荡、充分混匀5-8min，而后以-12℃--15℃/min的降温速率使温度降至-140℃--150℃，然后投入到液氮(-196℃)，分装保存。
3.按权利要求1或2所述的鞍带石斑鱼精子高效超低温冷冻保存的方法，其特征在于：所述抗冻液在使用前放置于0℃冰箱中预冷过夜，待用。
4.按权利要求1所述的鞍带石斑鱼精子高效超低温冷冻保存的方法，其特征在于：将混合均匀的鞍带石斑鱼精液分装于5ml-10ml的冻存管中。
5.按权利要求1所述的鞍带石斑鱼精子高效超低温冷冻保存的方法，其特征在于：将经液氮处理分装保存的鞍带石斑鱼冻精进行解冻，将其直接放入35-37℃水浴110s-130s，然后置于室温18-20℃放置至完全融化，而后于自然海水中激活。
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