CN107183014B - 一种高效石斑鱼精子冷冻保存液及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效石斑鱼精子冷冻保存液及其使用方法，属于鱼类种质冷冻保存的技术领域。本发明包括稀释液和抗冻剂；所述稀释液为水溶液，所述稀释液中含有以下质量浓度的组分：葡萄糖10～20g/L、氯化钠7.5～8.5g/L、氯化钾0.6～0.7g/L；所述抗冻剂为1,2‑丙二醇，所述抗冻剂在所述保存液中的体积浓度为10～20％。本发明还给出上述保存液保存石斑鱼精子的使用方法，经过稀释液配制、抗冻剂配制、保存液预冷、精液稀释、平衡和分装、冷冻保存、解冻和受精七个步骤而完成。本发明的保存液成份简单，毒性低，易于配制，养殖技术人员容易掌握，冷冻活力高，具有广泛的通用性，提高了石斑鱼精子冷冻保存成活率。

Description

一种高效石斑鱼精子冷冻保存液及其使用方法

技术领域

本发明属于鱼类种质保存的技术领域，特别是指一种高效石斑鱼精子冷冻保存液及其使用方法。

背景技术

石斑鱼(Epinephelus)是我国重要的海水养殖经济鱼类和优良种质资源，在我国有36种石斑鱼，主要分布在东海和南海。2015年石斑鱼捕捞量达117593吨，养殖量达100006吨，对于蓝色农业发展具有重要的作用。由于石斑鱼是一类雌雄同体、雌性先熟的鱼类，在同一生态群体中雄性数量相当少，在石斑鱼的人工繁殖中很难获得雄鱼的精子；另一方面随着石斑鱼产业的迅速发展，以及养殖品种出现病害多、畸形率高等问题，养殖企业急需培育出具有优良养殖性状的新品种来提高养殖产量和效益。建立石斑鱼精子库可以将分布于不同地域、不同繁殖时间的各种石斑鱼种质冷冻保存起来，利用不同品种在生长、抗病等方面的性状进行远缘杂交育种，培育生产中急需的养殖新品种，因此研究石斑鱼精子冷冻保存技术具有重要的意义。

石斑鱼种繁多，例如：鞍带石斑鱼、七带石斑鱼、云纹石斑鱼、棕点石斑鱼、褐石斑鱼、金钱石斑鱼、清水石斑鱼等，每一种鱼在生态分布、生理和繁殖习性等方面都具有各自的特点，不同鱼类精子生理特点也不同，因此，在石斑鱼精子冷冻保存中需要针对性的研制各种精子稀释液和冷冻剂。目前，现有的石斑鱼精子冷冻保存液只能用于特定的、单一石斑鱼品种精子的冷冻保存，冷冻保存精子活力较低，活力平均在65％左右，不具有广普性，通用性差；而且，精子稀释液成份比较复杂，成本较高，养殖企业的一般技术人员难于掌握，往往在配制和精子冷冻保存中出现误差，导致冷冻精子的成活率较低，给石斑鱼精子冷冻保存及精子冷冻库的建立增加了实际困难。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效石斑鱼精子冷冻保存液及其使用方法，解决了现有技术中石斑鱼精子冷冻保存液存在通用性差、成分复杂和成活率低的问题。

本发明的一种高效石斑鱼精子冷冻保存液，其主要是通过以下技术方案加以实现的：包括稀释液和抗冻剂；所述稀释液为水溶液，所述稀释液中含有以下质量浓度的组分：葡萄糖10～20g/L、氯化钠7.5～8.5g/L、氯化钾0.6～0.7g/L；所述抗冻剂为1,2-丙二醇，所述抗冻剂在所述保存液中的体积浓度为10～20％。

本发明的石斑鱼精子冷冻保存液具有成份简单、毒性低、易于配制和冷冻活力高的特点，解决了现有石斑鱼精子冷冻保存液成份多、毒性高、配制和保存方法复杂，养殖技术人员难于掌握的问题；本发明的石斑鱼精子冷冻保存液具有广泛的通用性，可以广泛用于鞍带石斑鱼、七带石斑鱼、云纹石斑鱼、棕点石斑鱼、褐石斑鱼、金钱石斑鱼和清水石斑鱼等各类石斑鱼的精子冷冻保存，提高了石斑鱼精子冷冻保存成活率；本发明的精子冷冻保存液使用了毒性较低的1,2-丙二醇(PG)，极大降低了对精子细胞结构和遗传物质的损伤，提高了冷冻精子的成活率和受精率，也可降低对操作人员的伤害及对养殖环境的污染，达到了环保作用，为石斑鱼精子冷冻库的建立提供了一种高效的技术方法。

作为一种优选的实施方案，所述稀释液中含有以下质量浓度的组分：葡萄糖15g/L、氯化钠8g/L、氯化钾0.65g/L。本发明的稀释液含有三种物质，其成份少，浓度适宜，配制方便，不会对精子的细胞结构和遗传物质造成损伤，广泛用于各类石斑鱼精子的冷冻保存，提高了冷冻精子的成活率和受精率。

作为一种优选的实施方案，所述保存液的pH值为7～8，所述保存液的渗透压为322.28～420.69mOsm/L。本发明的这种保存液的pH值和渗透压维持精子在体外的生理环境，同时，也能为精子提供一定的营养环境，进一步提高了冷冻精子的成活率和受精率。

作为一种优选的实施方案，所述抗冻剂在所述保存液中的体积浓度为15％。抗冻剂在保存液中的种类和用量通过进一步优化，其保存效果更佳，进一步降低抗冻剂对操作人员的伤害及其对养殖环境的污染，达到了操作安全和环保的目的。

本发明的一种高效石斑鱼精子冷冻保存液的使用方法，其主要是通过以下技术方案加以实现的：包括以下步骤：1)稀释液的配制：取葡萄糖、氯化钠和氯化钾溶解在蒸馏水中，制成稀释液；2)保存液的配制：取1,2-丙二醇，添加至步骤1)所得稀释液中，制成精子冷冻保存液；3)保存液的预冷：将步骤2)所得冷冻保存液放置于4℃下预冷；4)精液的稀释：取石斑鱼精液，将精液与保存液按照1:1～1:1.5的体积比混合，摇匀；5)平衡和分装：将步骤4)所得稀释后的精液在室温下平衡5～10min，分装，得小装精液；6)冷冻保存：将步骤5)所得小装精液置于-140～-150℃的液氮蒸气中冷却10～15min，然后，浸入液氮中冷冻保存；7)解冻和受精：将步骤6)所得保存后的小装精液从液氮中取出，于37～38℃下解冻，受精。

本发明的石斑鱼精子冷冻保存液保存精子的方法简单，条件温和，便于控制，实际操作性强，养殖技术人员掌握的快；本发明的精子冷冻保存液冷冻保存6种石斑鱼的精子其活力平均达到78.83～85.83％，现有的精子冷冻保存液保存活力仅为65％左右，相对较显著提高了冷冻精子活力，而且，具有广泛的通用性。

作为一种优选的实施方案，所述步骤5)中，分装时采用2mL的冷冻管，每个冷冻管盛装1.0～1.6mL稀释后的精液。采用2mL的冷冻管进行分装，分装方便，冷冻保存体积大，可以用于大量精子冷冻保存，优于麦管等小体积保存；同时，冷冻管的比表面积大，冷冻和解冻速度快，温度均匀。

作为一种优选的实施方案，所述步骤6)中，每5～10个冷冻管为一组，利用小布袋包装，然后，置于液氮蒸气中冷却。分组进行包装，便于不同鱼类精子分类，便于取放，方便操作，还可以提高实验效率。

作为一种优选的实施方案，所述步骤7)中，在显微镜下观察解冻后精子的活力，活力达到75～85％，用于受精。解冻后蘸取精子涂在载玻片上，加一滴海水激活，在显微镜下观察精子活力，精子活力达到75～85％，说明精子质量可靠，可以保证提高受精率。

作为一种优选的实施方案，所述步骤7)中，受精时，精液与鱼卵的受精比例为1:500～1000mL。可以提高精子的利用率，保证精子与卵充分受精。

作为一种优选的实施方案，所述步骤7)中，解冻是在水浴中进行。利用37～38℃的水浴，一边摇动一边解冻，一方面加快精子解冻，另一方面可以控制精子温度的过度升高，避免了解冻时冰晶重新生成和温度变化对精子细胞的损伤，充分保证了精子的活力。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的石斑鱼精子冷冻保存液具有成份简单、毒性低、易于配制和冷冻精子活力高的特点，其保存精子的方法简单，条件温和，便于控制，实际操作性强，养殖技术人员掌握的快，解决了现有石斑鱼精子冷冻保存液成份多、毒性高、配制和保存方法复杂，养殖技术人员难于掌握的问题；本发明的石斑鱼精子冷冻保存液具有广泛的通用性，可以广泛用于鞍带石斑鱼、七带石斑鱼、云纹石斑鱼、棕点石斑鱼、褐石斑鱼、金钱石斑鱼和清水石斑鱼等各类石斑鱼的精子冷冻保存，提高了石斑鱼精子冷冻保存的成活率；本发明的精子冷冻保存液使用了毒性较低的1,2-丙二醇(PG)，极大降低了对精子细胞结构和遗传物质的损伤，提高了冷冻精子的成活率和受精率，同时，也可降低对操作人员的伤害及对养殖环境的污染，达到了保护环境的作用，为石斑鱼精子冷冻库的建立提供了一种高效的技术方法。

具体实施方式

下面将结合本发明的具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的一种高效石斑鱼精子冷冻保存液，包括稀释液和抗冻剂；所述稀释液为水溶液，所述稀释液中含有以下质量浓度的组分：葡萄糖10～20g/L、氯化钠7.5～8.5g/L、氯化钾0.6～0.7g/L；所述抗冻剂为1,2-丙二醇，所述抗冻剂在所述保存液中的体积浓度为10～20％。

具体地，所述稀释液中含有以下质量浓度的组分：葡萄糖15g/L、氯化钠8g/L、氯化钾0.65g/L。

优选地，所述保存液的pH值为7～8，所述保存液的渗透压为322.28～420.69mOsm/L。

进一步地，所述抗冻剂在所述保存液中的体积浓度为15％。

本发明的一种高效石斑鱼精子冷冻保存液保存精子的使用方法，包括以下步骤：1)稀释液的配制：取葡萄糖、氯化钠和氯化钾溶解在蒸馏水中，制成稀释液；2)保存液的配制：取1,2-丙二醇，添加至步骤1)所得稀释液中，制成精子冷冻保存液；3)保存液的预冷：将步骤2)所得冷冻保存液放置于4℃下预冷；4)精液的稀释：取石斑鱼精液，将精液与保存液按照1:1～1:1.5的体积比混合，摇匀；5)平衡和分装：将步骤4)所得稀释后的精液在室温下平衡5～10min，分装，得小装精液；6)冷冻保存：将步骤5)所得小装精液置于-140～-150℃的液氮蒸气中冷却10～15min，然后，浸入液氮中冷冻保存；7)解冻和受精：将步骤6)所得保存后的小装精液从液氮中取出，于37～38℃下解冻，受精。

优选地，所述步骤5)中，分装时采用2mL的冷冻管，每个冷冻管盛装1.0～1.6mL稀释后的精液。

具体地，所述步骤6)中，每5～10个冷冻管为一组，利用小布袋包装，然后，置于液氮蒸气中冷却。

进一步地，所述步骤7)中，在显微镜下观察解冻后精子的活力，活力达到75～85％，用于受精。

更具体地，所述步骤7)中，受精时，精液与鱼卵的受精比例为1:500～1000mL。

更优选地，所述步骤7)中，解冻是在水浴中进行。

实施例一

本发明的一种高效石斑鱼精子冷冻保存液保存精子的使用方法，具体地为一种云纹石斑鱼精子冷冻保存的方法，包括以下步骤：

1)稀释液的配制：取葡萄糖10g、氯化钠8g和氯化钾0.6g溶解在蒸馏水中，充分搅拌，溶解，定容，制成体积为1000mL的稀释液；

2)保存液的配制：取1,2-丙二醇溶解在上述稀释液中，制成精子冷冻保存液，使1,2-丙二醇在冷冻保存液中的体积浓度为10％；

3)保存液的预冷：将上述冷冻保存液放置于4℃下预冷，预冷时间为2小时；

4)精液的稀释：取云纹石斑鱼的精液，将精液与保存液按照1:1的体积比混合，摇匀；

5)平衡和分装：将上述稀释后的精液在室温下平衡5min，分装，得小装精液；

6)冷冻保存：将上述小装精液置于-140℃的液氮蒸气中冷却15min，然后，浸入液氮中冷冻保存；

7)解冻和受精：将上述保存后的小装精液从液氮中取出，于37℃下解冻，受精。

实施例二

本发明的一种高效石斑鱼精子冷冻保存液保存精子的使用方法，具体地是一种鞍带石斑鱼精子冷冻保存的方法，包括以下步骤：

1)稀释液的配制：取葡萄糖15.5g、氯化钠7.5g和氯化钾0.70g溶解在蒸馏水中，充分搅拌，溶解，定容，制成体积为1000mL的稀释液；

2)保存液的配制：取1,2-丙二醇溶解在上述稀释液中，制成精子冷冻保存液，使1,2-丙二醇在冷冻保存液中的体积浓度为15％；

3)保存液的预冷：将上述冷冻保存液放置于4℃下的冰箱中进行预冷，预冷时间为2小时；

4)精液的稀释：取鞍带石斑鱼的精液，将精液与保存液按照1:1.2的体积比混合，摇匀；

5)平衡和分装：将上述稀释后的精液在室温下平衡10min，利用移液枪将平衡后的精液分装在2mL的冷冻管中，每个冷冻管盛装1mL，冷冻管上注明品种、冷冻保存时间，得小装精液；

6)冷冻保存：将上述冷冻管以5个为一组，利用小布袋包装，置于-150℃的液氮蒸气中冷却10min，然后，将布袋直接浸入液氮中长期冷冻保存；

7)解冻和受精：将冷冻管从液氮中取出，在38℃的水浴中，一边摇动一边解冻，蘸取精子涂在载玻片上，加一滴海水激活，在显微镜下观察精子活力，活力达到75％即可使用，与云纹石斑鱼的杂交鱼卵的受精比例为1:500mL。

实施例三

本发明的一种高效石斑鱼精子冷冻保存液保存精子的使用方法，具体地是一种棕点石斑鱼精子冷冻保存的方法，包括以下步骤：

1)稀释液的配制：取葡萄糖15g、氯化钠8g和氯化钾0.65g溶解在蒸馏水中，充分搅拌，溶解，定容，制成体积为1000mL的稀释液；

2)保存液的配制：取1,2-丙二醇溶解在上述稀释液中，制成精子冷冻保存液，使1,2-丙二醇在冷冻保存液中的体积浓度为15％；

3)保存液的预冷：将上述冷冻保存液放置于4℃下的冰箱中进行预冷，预冷时间为2小时；

4)精液的稀释：取棕点石斑鱼的精液，将精液与保存液按照1:1.5的体积比混合，摇匀；

5)平衡和分装：将上述稀释后的精液在室温下平衡8min，利用移液枪将平衡后的精液分装在2mL的冷冻管中，每个冷冻管盛装1.6mL，冷冻管上注明品种、冷冻保存时间，得小装精液；

6)冷冻保存：将上述冷冻管以10个为一组，利用小布袋包装，置于-145℃的液氮蒸气中冷却15min，然后，将布袋直接浸入液氮中长期冷冻保存；

7)解冻和受精：将冷冻管从液氮中取出，在38℃的水浴中，一边摇动一边解冻，蘸取精子涂在载玻片上，加一滴海水激活，在显微镜下观察精子活力，活力达到85％即可使用，与棕点石斑鱼的鱼卵的受精比例为1:1000mL。

实施例四

本发明的一种高效石斑鱼精子冷冻保存液保存精子的使用方法，具体地是一种褐石斑鱼精子冷冻保存的方法，包括以下步骤：

1)稀释液的配制：取葡萄糖20g、氯化钠8.5g和氯化钾0.65g，溶解在蒸馏水中，充分搅拌，溶解，定容，制成体积为1000mL的稀释液；

2)保存液的配制：取1,2-丙二醇溶解在上述稀释液中，制成精子冷冻保存液，使1,2-丙二醇在冷冻保存液中的体积浓度为20％；

3)保存液的预冷：将上述冷冻保存液放置于4℃下的冰箱中进行预冷，预冷时间为2小时；

4)精液的稀释：取褐石斑鱼的精液，将精液与保存液按照1:1的体积比混合，摇匀；

5)平衡和分装：将上述稀释后的精液在室温下平衡8min，利用移液枪将平衡后的精液分装在2mL的冷冻管中，每个冷冻管盛装1.2mL，冷冻管上注明品种、冷冻保存时间，得小装精液；

6)冷冻保存：将上述冷冻管以8个为一组，利用小布袋包装，置于-140℃的液氮蒸气中冷却10min，然后，将布袋直接浸入液氮中长期冷冻保存；

7)解冻和受精：将冷冻管从液氮中取出，在38℃的水浴中，一边摇动一边解冻，蘸取精子涂在载玻片上，加一滴海水激活，在显微镜下观察精子活力，活力达到80％即可使用，与褐石斑鱼的鱼卵的受精比例为1:800mL。

实施例五

本发明的一种高效石斑鱼精子冷冻保存液保存精子的使用方法，具体的是一种金钱石斑鱼精子冷冻保存的方法，包括以下步骤：

1)稀释液的配制：取葡萄糖15g、氯化钠8g和氯化钾0.65g，溶解在蒸馏水中，充分搅拌，溶解，定容，制成体积为1000mL的稀释液；

2)保存液的配制：取1,2-丙二醇溶解在上述稀释液中，制成精子冷冻保存液，使1,2-丙二醇在冷冻保存液中的体积浓度为15％；

3)保存液的预冷：将上述冷冻保存液放置于4℃下的冰箱中进行预冷，预冷时间为2小时；

4)精液的稀释：取金钱石斑鱼的精液，将精液与保存液按照1:1的体积比混合，摇匀；

5)平衡和分装：将上述稀释后的精液在室温下平衡7min，利用移液枪将平衡后的精液分装在2mL的冷冻管中，每个冷冻管盛装1.4mL，冷冻管上注明品种、冷冻保存时间，得小装精液；

6)冷冻保存：将上述冷冻管以6个为一组，利用小布袋包装，置于-150℃的液氮蒸气中冷却10min，然后，将布袋直接浸入液氮中长期冷冻保存；

7)解冻和受精：将冷冻管从液氮中取出，在37℃的水浴中，一边摇动一边解冻，蘸取精子涂在载玻片上，加一滴海水激活，在显微镜下观察精子活力，活力达到80％时使用，与金钱石斑鱼的鱼卵的受精比例为1:700mL。

实施例六

本发明的一种高效石斑鱼精子冷冻保存液保存精子的使用方法，具体地是一种清水石斑鱼精子冷冻保存的方法，包括以下步骤：

1)稀释液的配制：取葡萄糖15g、氯化钠8g和氯化钾0.7g，溶解在蒸馏水中，充分搅拌，溶解，定容，制成体积为1000mL的稀释液；

2)保存液的配制：取1,2-丙二醇溶解到上述稀释液中，制成精子冷冻保存液，使1,2-丙二醇在冷冻保存液中的体积浓度为15％；

3)保存液的预冷：将上述冷冻保存液放置于4℃下的冰箱中进行预冷，预冷时间为2小时；

4)精液的稀释：取清水石斑鱼的精液，将精液与保存液按照1:1的体积比混合，摇匀；

5)平衡和分装：将上述稀释后的精液在室温下平衡7min，利用移液枪将平衡后的精液分装在2mL的冷冻管中，每个冷冻管盛装1.5mL，冷冻管上注明品种、冷冻保存时间，得小装精液；

6)冷冻保存：将上述冷冻管以10个为一组，利用小布袋包装，置于-150℃的液氮蒸气中冷却13min，然后，将布袋直接浸入液氮中长期冷冻保存；

7)解冻和受精：将冷冻管从液氮中取出，在37℃的水浴中，一边摇动一边解冻，蘸取精子涂在载玻片上，加一滴海水激活，在显微镜下观察精子活力，活力达到75％时使用，与清水石斑鱼的鱼卵的受精比例为1:1000mL。

将实施例一至实施例六在石斑鱼精子冷冻保存过程中所得冷冻精子的精子保存量、活力和受精率统计结果列入表1。由表1可以看出，本发明的保存液大量冷冻保存了金钱石斑鱼、鞍带石斑鱼、棕点石斑鱼、褐石斑鱼、云纹石斑鱼、清水石斑鱼六种石斑鱼的精子，冷冻精子的平均活力达到了75～90％，其受精率均在80％以上，冷冻精子的总量达到1130mL；并且，利用鞍带石斑鱼冷冻精子与云纹石斑鱼杂交培育了200多万尾优良鱼苗，利用金钱石斑鱼精子与棕点石斑鱼杂交培育出10万尾鱼苗。

表1石斑鱼精子冷冻保存结果统计

品种	冷冻保存量(mL)	精子活力(％)	受精率(％)
				云纹石斑鱼	100	80～90	90～95
鞍带石斑鱼	500	75～85	80～95
				棕点石斑鱼	200	80～90	90～95
褐石斑鱼	100	80～85	80～85
				金钱石斑鱼	80	78～80	85～90
清水石斑鱼	150	80～85	80～90

对比实验一

表2精子梯度稀释液的配制

稀释液	葡萄糖(g·L<sup>-1</sup>)	NaCl(g·L<sup>-1</sup>)	KCl(g·L<sup>-1</sup>)	1,2-丙二醇(％)
					EMS-1	15	8	0.55	15
EMS-2	15	8	0.60	15
					EMS-3	15	8	0.65	15
EMS-4	15	8	0.70	15
					EMS-5	15	8	0.75	15
EMS-6	15	8	0.80	15

表3棕点石斑鱼精子在稀释液中冷冻保存效果(M±SD)

稀释液	快速运动时间(Sec)	精子活力(％)	精子寿命(Sec)
				EMS-1	26.67±1.53	41.10±1.46	76.00±2.00
EMS-2	32.00±2.00	81.01±2.31	90.00±2.00
				EMS-3	44.33±2.08*	94.65±1.06*	108.00±2.00*
EMS-4	31.33±1.15	78.33±2.95	89.00±1.73
				EMS-5	31.00±1.73	70.86±1.34	84.00±1.00
EMS-6	26.33±1.53	61.55±1.25	79.67±0.58
				FS	47.67±2.52*	95.48±0.73*	128.33±3.51*

备注：*——P<0.05，FS——新鲜的精子。

取葡萄糖、氯化钠和氯化钾，按照表2的设计配制6种不同梯度的稀释液，在其中添加1,2-丙二醇，得冷冻保存液，使1,2-丙二醇在冷冻保存液中的体积浓度为15％；然后，将其放置在4℃冰箱中预冷，将采集的棕点石斑鱼精液与冷冻保存液以1:1的比例稀释，在室温下平衡5min，分装在2mL冷冻管中，在液氮面上10cm处(温度约为-142℃)冷冻15min后，直接浸入液氮中冷冻保存，保存24h后，从液氮中取出，利用37℃水浴解冻，在显微镜下检测冷冻解冻后，统计精子活力，将实验结果列入表3中。

由表3可以看出，稀释液中氯化钾的浓度在0.60～0.70g/L之间时，即样品EMS-2、EMS-3和EMS-4，所配制的冷冻保存液在冷冻石斑鱼精子时，其精子活力、快速运动时间和寿命均达到最佳，与对照组中新鲜的精子的活力接近，较样品EMS-1、EMS-5和EMS-6具有明显的优势；其中，利用样品EMS-3进行冷冻保存石斑鱼精子时，其精子活力、快速运动时间和寿命都最高，解冻后精子活力可达94.65±1.06％、快速运动时间为44.33±2.08Sec，寿命达108.00±2.00Sec，这显著高于其它几种稀释液(P<0.05)，而且，与对照组中新鲜的精子的活力无显著性差异(P>0.05)；因此，本发明的保存液中稀释液的组成为葡萄糖15g/L、氯化钠8g/L、氯化钾0.65g/L时其效果最好。

对比实验二

表4金钱石斑鱼精子在几种精子稀释液中冷冻对比

稀释液	冻前活力(％)	冻后活力(％)
			ELRS-3	67.86±13.50	45.00±13.23
ELS-3	78.33±7.64	56.67±5.77
			EMS-3	91.67±2.89*	60.00±10.00*
MPRS	76.67±5.77	35.00±7.07
			FS	91.67±2.08*	-------

备注：*——P<0.05，FS——新鲜的精子。

取之前研制的用于鞍带石斑鱼、鲈鱼精子冷冻保存的稀释液(稀释液名称分别为ELRS-3、ELS-3和MPRS)与本发明的对比实验一制备的稀释液EMS-3分别冷冻保存金钱石斑鱼的精子，并分别将精液与稀释液混合平衡5min，在液氮中冷冻保存24h后镜检活力，实验结果列入表4。由表4可以看出，本发明的EMS-3稀释液冷冻保存精子在冷冻前和冷冻后的活力都显著的高于其它几种稀释液(P<0.05)，与新鲜的精子活力无显著差异(P>0.05)。

对比实验三

表5不同抗冻剂冷冻保存金钱石斑鱼的精子活力

冷冻剂	冻前活力(％)	冻后活力(％)
			PG	85.67±12.14*	90.40±2.97*
DMSO	57.63±12.11	31.60±10.74
			Met	75.67±9.52	2.33±0.58
Gly	42.12±0.00	0.00±0.00
			FS	95.33±0.58*	------

备注：*——P<0.05，FS——新鲜的精子。

取对比实验一制备的稀释液EMS-3分别添加体积浓度为20％的1,2-丙二醇(PG)、二甲基亚砜(DMSO)、甲醇(Met)和甘油(Gly)，以体积比1:1的比例与金钱石斑鱼精液混合，在室温下平衡时检测精子活力，然后冷冻保存精子，在冷冻24h后解冻，再检查精子活力，实验结果如表5所示。由表5可以看出，在EMS-3中加入1,2-丙二醇冷冻保存精子活力在冷冻前和冷冻后都显著的高于其它抗冻剂(P<0.05)。

对比实验四

表6金钱石斑鱼精子在不同浓度的DMSO和1,2-丙二醇中冷冻保存活力(M±SD)

冷冻剂	平衡10min精子活力(％)	冻后精子活力(％)
			5％DMSO	82.83±3.19	41.75±8.88
10％DMSO	57.63±12.11	31.60±10.74
			15％DMSO	74.33±7.39	48.50±8.70
20％DMSO	60.20±4.30	20.11±3.20
			5％PG	83.67±5.77	61.25±8.54
10％PG	86.83±10.30*	78.50±6.02*
			15％PG	91.00±2.65*	80.50±5.55*
20％PG	93.67±3.21*	53.67±3.21

备注：*——P<0.05。

取对比实验一制备的稀释液EMS-3分别将二甲基亚砜和1,2-丙二醇配制成抗冻剂的体积浓度分别为5、10、15和20％的冷冻保存液，分别冷冻保存金钱石斑鱼的精子，在冷冻前和冷冻后检测精子活力，实验结果如表6所示。由表6可以看出，在相同浓度下1,2-丙二醇在冷冻前和冷冻后精子活力都比DMSO高；体积浓度为10～20％的PG作为冷冻剂时其冷冻保存液所得精子活力明显高于相同浓度下的DMSO，与其它浓度相比具有显著性差异(P<0.05)。

因此，与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的石斑鱼精子冷冻保存液具有成份简单、毒性低、易于配制和冷冻活力高的特点，其保存精子的方法简单，条件温和，便于控制，实际操作性强，养殖技术人员掌握的快，解决了现有石斑鱼精子冷冻保存液成份多、毒性高、配制和保存方法复杂，养殖技术人员难于掌握的问题；本发明的石斑鱼精子冷冻保存液具有广泛的通用性，可以广泛用于鞍带石斑鱼、七带石斑鱼、云纹石斑鱼、棕点石斑鱼、褐石斑鱼、金钱石斑鱼和清水石斑鱼等各类石斑鱼的精子冷冻保存，提高了石斑鱼精子冷冻保存的成活率；本发明的精子冷冻保存液使用了毒性较低的1,2-丙二醇(PG)，极大降低了对精子细胞结构和遗传物质的损伤，提高了冷冻精子的成活率和受精率，同时，也可降低对操作人员的伤害及对养殖环境的污染，达到了环保作用，为石斑鱼精子冷冻库的建立提供了一种高效的技术方法。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种石斑鱼精子冷冻保存液，其特征在于：包括稀释液和抗冻剂；

所述稀释液为水溶液，所述稀释液中含有以下质量浓度的组分：葡萄糖15g/L、氯化钠8g/L、氯化钾0.65g/L；

所述抗冻剂为1,2-丙二醇，所述抗冻剂在所述保存液中的体积浓度为15%。

2.根据权利要求1所述的石斑鱼精子冷冻保存液，其特征在于：

所述保存液的pH值为7~8，所述保存液的渗透压为322.28~420.69mOsm/L。

3.根据权利要求1或2所述的石斑鱼精子冷冻保存液保存精子的使用方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）稀释液的配制：取葡萄糖、氯化钠和氯化钾，溶解在蒸馏水中，制成稀释液；

2）保存液的配制：取1,2-丙二醇，添加至步骤1）所得稀释液中，制成精子冷冻保存液；

3）保存液的预冷：将步骤2）所得冷冻保存液放置于4℃下预冷；

4）精液的稀释：取石斑鱼精液，将精液与保存液按照1:1~1:1.5的体积比混合，摇匀；

5）平衡和分装：将步骤4）所得稀释后的精液在室温下平衡5~10min，分装，得小装精液；

6）冷冻保存：将步骤5）所得小装精液置于-140~-150℃的液氮蒸气中冷却10~15min，然后，浸入液氮中冷冻保存；

7）解冻和受精：将步骤6）所得保存后的小装精液从液氮中取出，于37~38℃下解冻，受精。

4.根据权利要求3所述的石斑鱼精子冷冻保存液保存精子的使用方法，其特征在于：

所述步骤5）中，分装时采用2mL的冷冻管，每个冷冻管盛装1.0~1.6mL稀释后的精液。

5.根据权利要求4所述的石斑鱼精子冷冻保存液保存精子的使用方法，其特征在于：

所述步骤6）中，每5~10个冷冻管为一组，利用小布袋包装，然后，置于液氮蒸气中冷却。

6.根据权利要求3所述的石斑鱼精子冷冻保存液保存精子的使用方法，其特征在于：

所述步骤7）中，在显微镜下观察解冻后精子的活力，活力达到75~85%，用于受精。

7.根据权利要求6所述的石斑鱼精子冷冻保存液保存精子的使用方法，其特征在于：

所述步骤7）中，受精时，精液与鱼卵的受精比例为1:500~1000mL。

8.根据权利要求7所述的石斑鱼精子冷冻保存液保存精子的使用方法，其特征在于：

所述步骤7）中，解冻是在水浴中进行。