CN106417113A - 鞍带石斑鱼精子冷冻库建立及辅助石斑鱼远缘杂交育种方法 - Google Patents

鞍带石斑鱼精子冷冻库建立及辅助石斑鱼远缘杂交育种方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鞍带石斑鱼精子冷冻库建立及辅助石斑鱼远缘杂交育种方法，所述精子冷冻库建立步骤为配制精子稀释液、配制精子冷冻保存液、精子冷冻保存、精子冷冻库建立。所述石斑鱼远缘杂交方法包括建立鞍带石斑鱼精子冷冻库、构建云纹石斑鱼育种群体、培育云纹石斑鱼亲鱼和生殖调控、对云纹石斑鱼雌性亲鱼进行人工催产繁殖、冷冻精子受精和孵化、苗种培育。本发明在国内建立了第一个鞍带石斑鱼精子冷冻库，克服了石斑鱼因为地理分布、适温范围和繁殖时间等方面的因素造成的生殖隔离，使石斑鱼种群间远缘杂交成为可能，从而培育出远缘杂交品种。

Description

鞍带石斑鱼精子冷冻库建立及辅助石斑鱼远缘杂交育种方法
技术领域
本发明属于鱼类育种技术领域，具体涉及一种鞍带石斑鱼精子冷冻库建立方法及利用冷冻精子辅助石斑鱼远缘杂交育种方法。
背景技术
石斑鱼是我国重要的海水养殖经济鱼类和优良种质资源，在我国有36种石斑鱼，主要分布在东海和南海。2014年石斑鱼捕捞量达113096吨、养殖量达88130吨，对于蓝色农业发展具有重要的作用。近年来随着海水养殖业的迅速发展，这一名贵鱼类品种在我国南北方开始大量养殖，苗种需求量上亿尾；同时养殖企业对于优良品种的需求进一步提高。目前国内外石斑鱼养殖品种达10多个种，主要有青石斑鱼(Epinephelus awoara)、云纹石斑鱼(E.moara)、七带石斑鱼(E.septemfasciatus)、赤点石斑鱼(E.akaara)、棕点石斑鱼(E.fuscoguttatus)、褐石斑鱼(E.bruneus)、鞍带石斑鱼(E.lanceolatus)等。但是石斑鱼养殖苗种培育相当困难，而且纯种养殖的生长速度也比较慢、产量低。一方面，由于石斑鱼是一类雌雄同体、雌性先熟的鱼类，只有当群体中某一雌性生长到最大个体时才有机会转化为雄性，在同一生态群体中雄性数量相当少，在石斑鱼的人工繁殖中很难获得雄鱼的精子，因此建立石斑鱼精子冷冻库尤其重要。另一方面，经过多年的养殖及近亲繁殖，石斑鱼苗种成活率相当低，一般成活率只有30％左右，而且苗种畸形率高(可达70％以上)、病害多发，养殖种质退化现象严重，给产业的持续发展带来诸多限制。因此培育生长快、畸形率低和成活率高的养殖新品种是产业发展急需解决的问题。
近年来国内外学者及养殖企业利用不同品种石斑鱼之间杂交，试图找到一个较好的杂交组合，培育出优良的养殖苗种。例如地中海石斑鱼(E.costae)(♀)×东大西洋石斑鱼(E.marginatus)(♂)(Laboratory for Ecology and Aquaculture,Institute ofOceanography and Fisheries,Glamuzina B.etal,Aquaculture,2001)、棕点石斑鱼(♀)×鞍带石斑鱼(♂)(广东省大亚湾水产试验中心，2010)、斜带石斑鱼(♀)×鞍带石斑鱼(♂)(中国水产科学研究院南海水产研究所，吴水清等，中国水产科学，2014)、云纹石斑鱼(♀)×七带石斑鱼(♂)(中国水产科学研究院黄海水产研究所，李炎璐等，渔业科学进展，2015)等石斑鱼品种之间的杂交实验，大多杂交组合由于畸形率高、成活率低，只能获得少量的鱼苗，无法培育大量苗种，只有棕点石斑鱼(♀)×鞍带石斑鱼(♂)杂交能够培育出大量的鱼苗，也是目前石斑鱼养殖的主要杂交品种“珍珠龙胆”，但是仍然存在苗种培育成活率低、有时畸形率可达90％以上的缺陷。主要原因是不同石斑鱼种群之间存在着地理分布、生态条件、繁殖时间、遗传差异等多方面的生殖隔离，利用现有技术条件难于筛选到有效的杂交组合。
鞍带石斑鱼，俗名龙胆，主要分布在东南亚、澳洲海域和我国的南海、台湾附近海域。为暖水性、中下层珊瑚礁鱼类，生长速度快，1龄鱼可生长到1.5-3.0kg，2龄生长到5-6kg(杨洪志，现代渔业信息，2002)，最大可以成长至约2.7m，440kg，是石斑鱼类中体型最大者，故称为“斑王”。在中国产于南海(南沙群岛)海域，但数量稀少(张海发等，广东海洋大学学报，2008)，自然性成熟温度26-30℃，人工繁殖技术还未完全突破，目前市场上还没有大量养殖的苗种。云纹石斑鱼，俗称油斑，主要分布于日本、韩国和中国沿岸，属于冷温性鱼类，繁殖温度22-24℃，但具有适温范围广(8-35℃)、适盐范围广(10-40‰)、耐低氧、生长快、肉质鲜美等特点，是石斑鱼养殖中较早开发的品种，于1981年日本栽培渔业协会开始了苗种培育研究(殷蕊等，河北渔业，2013)，但是苗种培育成活率低，畸形率高，畸形率可达70％以上，养殖商品鱼的品质受到严重影响。
由于鞍带石斑鱼和云纹石斑鱼在地理分布、适温范围、繁殖时间等方面具有较大的差异，在天然环境中无法实现种群间的杂交。即使在养殖环境中，由于鞍带石斑鱼性成熟晚，5－6龄、在体重达到20-30kg以上才能达到性成熟，雄性鱼类极少，亲鱼难于培育，获得足够的亲鱼精液也比较困难。另外主要原因是鞍带石斑鱼与云纹石斑鱼的繁殖时间和温度不同，在无精子冷冻库的条件下极大的限制了两种鱼类杂交育种和大量培育苗种的可能性。
发明内容
本发明涉及一种鞍带石斑鱼精子冷冻库建立方法和冷冻精子辅助石斑鱼远缘杂交育种方法，解决了石斑鱼人工繁殖育苗中雄鱼数量少、成熟不同步和精液量不足的问题，克服了因地理分布、繁殖时间、繁殖温度等因素造成的石斑鱼品种之间的生殖隔离，从而实现了石斑鱼不同品种之间的远缘杂交育种，培育出具有优良生长性状的石斑鱼新品种。
为了实现上述目的，本发明采用下述技术方案予以实现。
一种鞍带石斑鱼精子冷冻库建立方法，其特征在于，步骤为：
(1)配制精子稀释液：包括葡萄糖49.97g/L、NaCl 6.5g/L、NaHCO30.199g/L、KCl0.14g/L、CaCl2·2H2O 0.12g/L、NaH2PO40.0098g/L，溶解在蒸馏水中；
(2)配制精子冷冻保存液：在上述精子稀释液中加入15％二甲基亚砜和10％小牛血清，均为体积百分数；
(3)精子冷冻保存：将鞍带石斑鱼精液与精子冷冻保存液以1:1的体积比混合，分装后在液氮罐蒸气中平衡，然后直接投入液氮中冷冻保存；
(4)精子冷冻库建立：收集不同养殖群体和野生群体的鞍带石斑鱼精液，在液氮中冷冻保存，建立鞍带石斑鱼精子冷冻库。
为了提高冷冻保存后精子的成活率，所述平衡温度为-140℃，平衡时间为10min；所述冷冻保存温度为-196℃。
本发明提供的一种石斑鱼远缘杂交育种方法，步骤为：
(1)以权利要求1或2所述方法建立鞍带石斑鱼精子冷冻库；
(2)构建云纹石斑鱼育种群体：收集野生或养殖云纹石斑鱼，养殖群体中以5％的选择强度筛选，对亲鱼生长性状进行测量，并注射电子标记，采集DNA样本，建立育种群体档案，构建云纹石斑鱼育种群体；
(3)培育云纹石斑鱼亲鱼和生殖调控：亲鱼在工厂化流水培育池中培育，定时、定量投喂野杂鱼；进入繁殖季节后，重新调整培育池的水温及光照时间，在投喂饲料中添加维生素，培育2个月左右达到性成熟；
(4)对云纹石斑鱼雌性亲鱼进行人工催产繁殖：选择腹部膨大、发育良好的云纹石斑鱼雌性亲鱼，注射催产激素，之后人工挤压腹部采卵；
(5)冷冻精子受精和孵化：从鞍带石斑鱼精子冷冻库中选取精子，在37℃水浴中解冻，将解冻精子与云纹石斑鱼卵进行干法受精，分离上浮受精卵，放入网箱孵化；孵化到尾芽期后，收集上浮卵放入苗种池孵化和培育；
(6)苗种培育：利用微流水进行苗种培育，培育到40天左右鱼苗完成变态发育，进入幼鱼期。
为了建立了健康、无畸形的育种群体，所述步骤(2)中云纹石斑鱼要求体形正常无畸形、体表无伤痕、体色为褐色或棕色，体侧有六条暗棕色横纹，体上具有云状白色块纹，体重在3.5kg以上，体长40cm以上的正常发育个体。
进一步的，所述步骤(3)中亲鱼培育时控制冬季水温15-16℃，夏季水温25-26℃，盐度28-31‰，溶解氧≥10mg/L，光照度≤5000Lx，光照节律与自然光相同，昼夜水循环10-15次。
为了满足云纹石斑鱼亲鱼的最适产卵环境，所述步骤(3)中进入繁殖季节后，将培育池水温逐渐提高到24℃，光照时间调整为14h，在投喂饲料中添加维生素C 5‰、维生素E3‰。
为了促进云纹石斑鱼亲鱼的成熟，提高产卵量，所述步骤(4)中催产激素为绒毛膜促性腺激素HCG 200-300IU/kg和促排卵激素类似物LHRH-A3 5μg/kg的混合物，进行肌肉注射催产，催产后24h人工挤压腹部采卵。
为了提高受精率，所述步骤(5)中干法受精过程是将解冻精子与云纹石斑鱼卵以1:200的体积比混合，再加入2倍体积的海水后静置4-6min；利用盐度为35‰的海水漂洗，分离上浮受精卵，放入网箱孵化，海水温度保持在24℃、盐度30‰、溶解氧6-10mg/L，水流保持0.2m3/h。
进一步的，所述步骤(6)中苗种培育时水温26-27℃，盐度30‰，溶解氧(DO)≥10mg/L，pH 7.8-8.2；初期水流量0.3m3/h，20天后水流增大到2m3/h，30天后水流增大到3-5m3/h。
为了促进鱼苗的快速生长，所述步骤(6)中苗种培育时，在水体中加入小球藻，密度为(5-10)×105cells/mL；孵化后3-4天投喂轮虫，投喂密度为8-15ind/mL，日投喂2次；10日龄后增加投喂卤虫无节幼体，投喂密度1-2ind/mL，日投喂2次，25日龄开始投喂配合饲料。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明中鞍带石斑鱼精子冷冻库建立方法解决了石斑鱼杂交育种和苗种培育中雄鱼难于培育、数量少、成熟不同步和精液不足的问题，突破了不同品种石斑鱼之间在地理分布、繁殖时间和温度等方面的生殖隔离，使分布于不同环境、不同繁殖温度和不同繁殖时间的石斑鱼之间的远缘杂交成为可能，拓展了石斑鱼远缘杂交育种的范围，提高了杂交育种成功的概率。本发明中冷冻精子辅助石斑鱼远缘杂交育种方法，培育出了生长快、畸形率低的优良杂交新品种，而且利用精子冷冻库能够大量培育优良苗种，解决了目前石斑鱼养殖中优良苗种缺乏，以及目前石斑鱼养殖苗种中生长慢、畸形率高的问题。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细说明。
本实施例提出了一种鞍带石斑鱼精子冷冻库建立技术，首先收集和冷冻保存了大量的不同生态环境和养殖环境下的鞍带石斑鱼精子，建立了鞍带石斑鱼精子冷冻库，保存了大量鞍带石斑鱼优良种质，为石斑鱼远缘杂交育种创造了有利条件，可以在任何时间、任何地点进行多种石斑鱼之间的杂交育种实验，克服了不同石斑鱼种群之间在地理、繁殖时间等方面的生殖隔离。
本实施例提供的鞍带石斑鱼精子冷冻库建立方法，包括如下步骤：
(1)精子稀释液(ELRS3)的配制：利用葡萄糖49.97g/L、NaCl 6.5g/L、NaHCO30.199g/L、KCl 0.14g/L、CaCl2·2H2O 0.12g/L、NaH2PO40.0098g/L在蒸馏水中配制精子稀释液ELRS3，所述精子稀释液的渗透压为400mOsm/L，pH值为7.03。
(2)精子冷冻保存液配制：在精子稀释液ELRS3中加入15％二甲基亚砜(DMSO)和10％小牛血清(FBS)配制成精子冷冻保存液，均为体积百分数；
(3)精子冷冻保存：将鞍带石斑鱼精液与精子冷冻保存液以1:1的比例混合，分装在2mL的塑料冷冻管中，在液氮罐蒸气(-140℃)中平衡10min，然后直接投入液氮中(-196℃)冷冻保存；
(4)精子冷冻库建立：收集不同时间、不同养殖群体和野生群体鞍带石斑鱼精液分别冷冻保存在60L生物液氮罐(-196℃)中，建立了多年代的鞍带石斑鱼精子冷冻库，冷冻精子保存最长时间达到了6年。
本实施例首先研制了提高精子活力的精子稀释液配方ELRS3，相比现有的精子稀释液，本实施例可以提高冷冻保存精子的活力，精子活力达到76.69±2.36％以上，可以达到大量的收集和保存不同生态环境和繁殖时间的鞍带石斑鱼的精子目的。
在基于本实施例的精子稀释液能够提高冷冻精子活力，进而延长冷冻保存时间的基础上，本实施例建立了鞍带石斑鱼精子冷冻库，大量冷冻保存了不同年代(2011-2015年)、不同生态环境下的鞍带石斑鱼精子，为石斑鱼苗种培育贮备了大量的精子资源，提高了精子受精率和利用率，同时为石斑鱼不同品种之间的远缘杂交创建了一个技术平台，可以在雌性鱼类成熟的任何季节，利用贮备的冷冻精子进行杂交育种，突破了不同品种石斑鱼之间在地理分布、繁殖时间等方面的生殖隔离，使分布于不同环境、不同繁殖时间的石斑鱼之间的远缘杂交成为可能，拓展了石斑鱼远缘杂交育种的范围，提高了杂交育种成功的概率。
在云纹石斑鱼成熟季节利用本实施例建立的鞍带石斑鱼精子冷冻库中的精子，进行杂交育种和大量苗种培育，克服了两种石斑鱼生殖隔离和精子资源不足的问题，同时克服了精子成活率低、受精率低、无法大量培育杂交苗种的问题；实现了鞍带石斑鱼和云纹石斑鱼之间的远缘杂交育种，大量培育出生长快、畸形率低的优良杂交新品种，使鞍带石斑鱼精子冷冻库得到了产业化应用，培育的杂交新品种在生产中获得了大量推广养殖。
本实施例利用上述鞍带石斑鱼精子冷冻库，提出了一种石斑鱼远缘杂交育种方法，对鞍带石斑鱼冷冻精子和云纹石斑鱼进行杂交实验，利用鞍带石斑鱼具有生长快的优良性状，利用云纹石斑鱼适温、适盐和耐低氧的抗逆性状，以及云纹石斑鱼人工繁殖和苗种培育技术较成熟的特点，筛选了一种优良的石斑鱼杂交组合：云纹石斑鱼(♀)×鞍带石斑鱼(♂)，其杂交后代命名为“云龙斑”，具有生长快、畸形率低的优良特性。
本实施例的冷冻精子辅助石斑鱼远缘杂交育种方法，包括如下步骤：
(1)以上述方法建立鞍带石斑鱼精子冷冻库。
(2)构建云纹石斑鱼育种群体：
收集野生或养殖云纹石斑鱼，养殖群体中以5％的选择强度筛选，均要求体形正常无畸形、体表无伤痕、体色为褐色或棕色，体侧有六条暗棕色横纹，体上具云状白色块纹，体重在3.5kg以上，体长40cm以上正常发育个体；对亲鱼生长性状进行测量，并注射电子标记，采集DNA样本，建立育种群体档案，构建云纹石斑鱼育种群体。
(3)云纹石斑鱼亲鱼培育和生殖调控：
亲鱼在工厂化流水培育池中培育，冬季水温15-16℃，夏季水温25-26℃，盐度28-31‰，溶解氧(DO)≥10mg/L，光照度≤5000Lx，光照节律与自然光相同，昼夜水循环10-15次。定时、定量投喂野杂鱼，投喂量为鱼体重的1-3％。所述野杂鱼可以是鲐鱼(Pneumatophorus japonicus)、太平洋柔鱼(Todarodes pacificus)或玉筋鱼(Ammodytespersonatus)。
进入繁殖季节后，将培育池水温逐渐提高到24℃，光照时间调整为14h，满足云纹石斑鱼的产卵要求，在投喂饲料中添加维生素C 5‰、维生素E3‰，增加营养，提高产卵质量，所述比例是占饲料质量的百分比，培育2个月左右达到性成熟。
(4)人工催产繁殖
选择腹部膨大、发育良好的云纹石斑鱼雌性亲鱼，利用催产激素进行肌肉注射催产，催产后24h人工挤压腹部采卵。所述催产激素采用绒毛膜促性腺激素(HCG)200-300IU/kg和促排卵激素类似物(LHRH-A3)5μg/kg，能更加有效促进亲鱼的成熟，提高产卵量。
(5)冷冻精子受精和孵化
利用37℃水浴解冻鞍带石斑鱼精子，将解冻精子与云纹石斑鱼卵以1:200的体积比进行干法受精，加入2倍体积的海水后静置4-6min；利用盐度为35‰的海水漂洗分离上浮受精卵，放入网箱孵化，海水温度保持在24℃、盐度30‰、溶解氧6-10mg/L，水流保持0.2m3/h。孵化到尾芽期后，收集上浮卵放入苗种池孵化和培育。
(6)苗种培育
利用微流水进行苗种培育，水温26-27℃，盐度30‰，溶解氧(DO)≥10mg/L，pH7.8-8.2；初期水流量0.3m3/h，20天后水流增大到2m3/h，30天后增大到3-5m3/h；在水体中加入小球藻，密度保持在(5-10)×105cells/mL，小球藻的作用一方面是用于改善水质，一方面是为轮虫提供饵料；孵化后3-4天投喂轮虫，投喂密度为8-15ind/mL，日投喂2次；10日龄后增加投喂卤虫无节幼体，投喂密度1-2ind/mL，日投喂2次，25日龄开始投喂配合饲料；培育到40天左右鱼苗完成变态发育，进入幼鱼期。
采用本实施例的冷冻精子辅助远缘杂交育种方法，首先克服了鞍带石斑鱼和云纹石斑鱼之间因地理分布、繁殖时间、繁殖温度等因素造成的生殖隔离，实现了生态习性、繁殖习性差异较大的两种石斑鱼之间的远缘杂交。其此冷冻精子库克服了石斑鱼群体中雄性数量少、成熟晚的缺点，为大量繁殖培育石斑鱼杂交苗种提供了丰富的精子资源。另外精子冷冻库的建立和应用为石斑鱼人工繁殖提供了极其便利的条件，极大的降低的操作人员的工作强度，提高了劳动效率，降低了生产成本。另一方面，通过对云纹石斑鱼的高强度筛选，建立了健康、无畸形的育种群体的；从而实现了利用鞍带石斑鱼冷冻精子与云纹石斑鱼卵杂交大量培育出优良杂交鱼苗的目的，结合优化的杂交育种方法，培育出的鱼苗具有生长快、畸形率低、成活率高、体型修长、花色一致的特点，杂交鱼苗兼具鞍带石斑鱼生长快、云纹石斑鱼抗逆性强的优良性状；鱼苗当年可生长到700g，最大可生长到1250g，相比国内目前养殖的杂交品种珍珠龙胆苗种(当年可生长到550g，最大生长到850g)具有更快的生长速度。
实施例1
1、鞍带石斑鱼精子冷冻库建立
(1)精子稀释液(ELRS3)的配制：利用葡萄糖49.97g/L、NaCl 6.5g/L、NaHCO30.199g/L、KCl 0.14g/L、CaCl2·2H2O 0.12g/L、NaH2PO40.0098g/L，在蒸馏水中配制精子稀释液ELRS3，其渗透压为400mOsm/L，pH值为7.03。
(2)精子冷冻保存液配制：在精子稀释液ELRS3中加入15％二甲基亚砜(DMSO)和10％小牛血清(FBS)配制成精子冷冻保存液，事先放置在4℃冰箱中备用，均为体积份数。
(3)精子冷冻保存：在鞍带石斑鱼性成熟季节(每年4-7月份)，在海南三亚陵水石斑鱼养殖场和山东省莱州明波水产有限公司进行鞍带石斑鱼的精子冷冻保存，将达到性成熟的鞍带石斑鱼利用50ppm丁香酚麻醉，采用人工挤压腹部法采集精子，将精子采集在100mL干燥的玻璃瓶中，放入事先准备好的冰盒中带回实验室，保证冰盒内的温度为4-5℃。将鞍带石斑鱼精液与精子冷冻保存液以1:1的体积比混合，分装在2mL的塑料冷冻管中，将装入精液的冷冻管每10个分装在纱布袋中，吊入液氮罐蒸气(-140℃)中平衡10min，然后投入直接投入液氮中(-196℃)冷冻保存。
(4)精子冷冻库建立：利用以上方法将不同养殖公司、不同时期的鞍带石斑鱼精液，建立不同养殖群体的鞍带石斑鱼精子冷冻库，保存精子达到1380多份，精子活力达到76.69±2.36％。
表1鞍带石斑鱼冷冻精子库信息
2、云纹石斑鱼育种群体构建
2013-2016年相继从福建东山岛海域和养殖场收集野生云纹石斑鱼900尾，体形正常无畸形、体表无伤痕、体色为褐色或棕色，体侧有六条暗棕色横纹，体上具云状白色块纹，运输到莱州明波水产有限公司培育。2014年从莱州明波水产有限公司养殖云纹石斑鱼商品鱼群体中，以5％的选择强度筛选无畸形、无疾病的云纹石斑鱼个体900尾，集中在工厂化流水池中培育。2015年春季对收集和筛选的云纹石斑鱼亲鱼生长性状进行测量(表2)，亲鱼体重6.25±4.30kg，全长50.00±10.47cm。并逐个注射电子标记，标记号从5755至6934，同时采集DNA样本保存在-80℃冰箱中，建立育种群体档案，从而构建了云纹石斑鱼育种群体。
表2云纹石斑鱼生物学特征
3、云纹石斑鱼亲鱼培育和生殖调控
将逐年收集和筛选的云纹石斑鱼亲鱼1800尾左右，养殖在莱州明波水产有限公司，分别放在40m3的工厂化流水池中培育，每池放养量100尾，冬季水温不低于15-16℃，夏季最高水温在25-26℃，盐度28-31‰，溶解氧(DO)≥10mg/L，pH 7.8-8.2，NH 4 +-N≤0.5mg/L，NO2 －-N≤0.02mg/L，光照度≤5000Lx，平时的光照节律与自然光周期相同，昼夜水循环10-15次。每天定时、定量投喂野杂鱼，主要为鲐鱼、太平洋柔鱼和玉筋鱼，质量比为5:3:1，每次投喂量为鱼体重的2％左右，每天投喂1次。
2016年2月初开始对云纹石斑鱼进行生殖调控，将培育池水温逐渐提高到24℃，光照时间逐渐调整延长到14h，水流保持在15-20m3/h，适当增加饲料投喂量到成鱼体重的3％左右，在投喂饲料中添加维生素C 5‰、维生素E3‰。3月下旬到5月初部分亲鱼达到性成熟，雌鱼腹部膨胀，个别亲鱼挤压腹部有成熟卵流出，此时可以进行人工催产和繁殖。
4、人工催产繁殖
2016年3月29日开始对云纹石斑鱼进行人工催产，从亲鱼池中挑选达到性成熟、腹部彭大、发育良好的雌性亲鱼，事先利用生理盐水分别配制绒毛膜促性腺激素(HCG)和促排卵激素类似物(LHRH-A3)，按照绒毛膜促性腺激素(HCG)200-300IU/kg、促排卵激素类似物(LHRH-A3)5μg/kg的注射量，从胸鳍基部对亲鱼进行肌肉注射，注射后亲鱼利用网箱隔离培养，催产后24h人工挤压腹部采卵，将成熟的卵子接入干燥的塑料盆中，等待利用冷冻保存的鞍带石斑鱼精子进行人工授精。
2016年3月29日－6月7日，共计人工催产9批次，催产亲鱼340尾，产卵75.363kg，亲鱼平均产卵量为204.25±98.33g。
表3 2016年云龙斑鱼人工催产、受精和出苗情况统计
5、冷冻精子受精和孵化
将冷冻保存的鞍带石斑鱼精子从液氮罐中取出，在37℃水浴中边摇动边解冻，到精液开始流动为止；接着利用解冻的鞍带石斑鱼精液以精卵比1：200mL的比例干法受精，充分将精液与卵混合，加入2倍体积的24℃海水，静置5min。之后受精卵利用盐度为35‰的海水漂洗，利用丝网过滤分离上浮的受精卵，弃去下沉的死卵；将受精卵放入500L网箱中，海水温度保持在24℃、盐度30‰、溶解氧6-10mg/L，水流保持0.2m3/h进行孵化。在受精后6-7h，当胚胎发育到囊胚时统计受精率。在受精后28h，当胚胎发育到尾芽期，晶体形成后，收集上浮卵放入鱼苗培育池中孵化和培育，同时采样统计孵化率。
2016年利用冷冻保存的鞍带石斑鱼精液209份，共380mL，解冻后人工授精云纹石斑鱼卵75363mL，平均受精率达到83.17±2.94％，孵化率达到27.69±8.28％，培育云龙斑杂交鱼苗69.4万尾。
6、苗种培育
将孵化到尾芽期、晶体形成的卵收集、称量后，放入50m3的培育池中孵化，并进行苗种培育，每池布卵200-300mL，利用微流水进行苗种培育，初期水流量保持在0.3m3/h，孵化后20天增大水流到2m3/h，30天后增大到3-5m3/h。在放入受精卵前，事先将水温调整至26-27℃，盐度30‰，溶解氧(DO)≥10mg/L，pH 7.8-8.2。在培育池水体中加入小球藻，密度保持在(5-10)×105cells/mL。孵化后3-4天投喂S型轮虫，投喂密度为5-10ind/mL，7日龄开始投喂L型褶皱臂尾轮虫，日投喂2次，投喂密度为8-15ind/mL。10日龄开始，增加投喂卤虫无节幼体，投喂密度1-2ind/mL，日投喂2次，25日龄开始进行投喂配合饲料。培育到40天左右鱼苗完成变态发育，进入幼鱼养殖期。
在云龙斑鱼苗生长过程中对其生长性状进行测量，并与目前国内养殖场广泛养殖珍珠龙胆进行比较，云龙斑生长到127天时全长达16.19±0.78cm，体重达到76.73±9.15g；珍珠龙胆的全长和体重分别为12.21±0.57cm和33.29±4.15。生长到592天时云龙斑全长达到34.89±4.29cm，体重达702.94±247.39g；珍珠龙胆的全长和体重分别达到31.81±3.39cm和556.76±224.89g，云龙斑的生长速度明显较珍珠龙胆快(表4)。
表4云龙斑生长性状及与珍珠龙胆生长比较
云纹石斑鱼苗种的畸形率相当高，可达70-90％以上，是多年来云纹石斑鱼养殖中存在的主要问题，一直以来是限制云纹石斑鱼养殖业发展的主要因素，严重的影响商品鱼的品质。目前在国内大量养殖的珍珠龙胆是利用棕点石斑鱼(♀)×鞍带石斑鱼(♂)杂交培育的杂交苗种，2016年春季在莱州明波水产有限公司培育的一批珍珠龙胆鱼苗中畸形率达到80％以上，大部分表现为尾部短小、鳍条缺失现象，其它石斑鱼的养殖中也存在着苗种畸形率高、病害多的现象，给石斑鱼类养殖产业可持续发展提出了严峻的课题，也是多年石斑鱼养殖业中急需解决的主要问题。本实施例解决了上述问题，利用云纹石斑鱼(♀)×鞍带石斑鱼(♂)杂交，并经过优化培育方法，得到的云龙斑鱼苗中未发现有畸形鱼苗，解决了石斑鱼养殖产业中鱼苗畸形率高的问题。
以上实施例仅是本发明若干种优选实施方式中的几种，应当指出，本发明不限于上述实施例；对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种鞍带石斑鱼精子冷冻库建立方法，其特征在于，步骤为：
（1）配制精子稀释液：包括葡萄糖49.97g/L、NaCl 6.5g/L、NaHCO3 0.199g/L、KCl 0.14g/L、CaCl2·2H2O 0.12 g/L、NaH2PO4 0.0098 g/L，溶解在蒸馏水中；
（2）配制精子冷冻保存液：在上述精子稀释液中加入15% 二甲基亚砜和10%小牛血清，均为体积百分数；
（3）精子冷冻保存：将鞍带石斑鱼精液与精子冷冻保存液以1:1的体积比混合，分装后在液氮罐蒸气中平衡，然后直接投入液氮中冷冻保存；
（4）精子冷冻库建立：收集不同养殖群体和野生群体的鞍带石斑鱼精液，在液氮中冷冻保存，建立鞍带石斑鱼精子冷冻库。
2.根据权利要求1所述的鞍带石斑鱼精子冷冻库建立方法，其特征在于，所述平衡温度为-140℃，平衡时间为10min；所述冷冻保存温度为-196℃。
3.一种石斑鱼远缘杂交育种方法，其特征在于，步骤为：
（1）以权利要求1或2所述方法建立鞍带石斑鱼精子冷冻库；
（2）构建云纹石斑鱼育种群体：收集野生或养殖云纹石斑鱼，养殖群体中以5%的选择强度筛选，对亲鱼生长性状进行测量，并注射电子标记，采集DNA样本，建立育种群体档案，构建云纹石斑鱼育种群体；
（3）培育云纹石斑鱼亲鱼和生殖调控：亲鱼在工厂化流水培育池中培育，定时、定量投喂野杂鱼；进入繁殖季节后，重新调整培育池的水温及光照时间，在投喂饲料中添加维生素，培育2个月左右达到性成熟；
（4）对云纹石斑鱼雌性亲鱼进行人工催产繁殖：选择腹部膨大、发育良好的云纹石斑鱼雌性亲鱼，注射催产激素，之后人工挤压腹部采卵；
（5）冷冻精子受精和孵化：从鞍带石斑鱼精子冷冻库中选取精子，在37℃水浴中解冻，将解冻精子与云纹石斑鱼卵进行干法受精，分离上浮受精卵，放入网箱孵化；孵化到尾芽期后，收集上浮卵放入苗种池孵化和培育；
（6）苗种培育：利用微流水进行苗种培育，培育到40天左右鱼苗完成变态发育，进入幼鱼期。
4.根据权利要求3所述的石斑鱼远缘杂交育种方法，其特征在于，所述步骤（2）中云纹石斑鱼要求体形正常无畸形、体表无伤痕、体色为褐色或棕色，体侧有六条暗棕色横纹，体上具有云状白色块纹，体重在3.5kg以上，体长40cm以上的正常发育个体。
5. 根据权利要求3所述的石斑鱼远缘杂交育种方法，其特征在于，所述步骤（3）中亲鱼培育时控制冬季水温15-16℃，夏季水温25-26℃，盐度28-31‰，溶解氧≥10 mg /L，光照度≤5000 Lx，光照节律与自然光相同，昼夜水循环10-15 次。
6. 根据权利要求5所述的石斑鱼远缘杂交育种方法，其特征在于，所述步骤（3）中进入繁殖季节后，将培育池水温逐渐提高到24℃，光照时间调整为14h，在投喂饲料中添加维生素C 5‰、维生素E3‰。
7. 根据权利要求3所述的石斑鱼远缘杂交育种方法，其特征在于，所述步骤（4）中催产激素为绒毛膜促性腺激素HCG 200-300IU/kg和促排卵激素类似物LHRH-A3 5μg/kg的混合物，进行肌肉注射催产，催产后24h人工挤压腹部采卵。
8.根据权利要求3-7任一项所述的石斑鱼远缘杂交育种方法，其特征在于，所述步骤（5）中干法受精过程是将解冻精子与云纹石斑鱼卵以1:200的体积比混合，再加入2倍体积的海水后静置4-6min；利用盐度为35‰的海水漂洗，分离上浮受精卵，放入网箱孵化，海水温度保持在24℃、盐度30‰、溶解氧6-10mg/L，水流保持0.2m3/h。
9. 根据权利要求3-7任一项所述的石斑鱼远缘杂交育种方法，其特征在于，所述步骤（6）中苗种培育时水温26-27℃，盐度30‰，溶解氧（DO）≥10 mg /L，pH 7.8-8.2；初期水流量0.3m3/h， 20天后水流增大到2m3/h，30天后水流增大到3-5m3/h。
10. 根据权利要求3-7任一项所述的石斑鱼远缘杂交育种方法，其特征在于，所述步骤（6）中苗种培育时，在水体中加入小球藻，密度为(5-10)×105cells /mL；孵化后3-4天投喂轮虫，投喂密度为8-15 ind /mL，日投喂2 次；10日龄后增加投喂卤虫无节幼体，投喂密度1-2 ind /mL，日投喂2 次，25日龄开始投喂配合饲料。
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