CN116998479B - 一种超低温保存液及其保存豹纹鳃棘鲈精液的方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种超低温保存液及其保存豹纹鳃棘鲈精液的方法和应用，属于豹纹鳃棘鲈人工繁育领域。所述超低温保存剂包括稀释液和抗冻剂，所述抗冻剂占所述超低温保存剂的体积分数为1%‑10%；其中，所述稀释液是由基础稀释液和胎牛血清混合而成。抗冻剂包括二甲基亚砜或甲醇，最优抗冻剂种类为二甲基亚砜，占超低温保存液总体积的1%。将精液与超低温保存液以1:4的比例混合，经过一个月的超低温保存，复温后进行人工授精，受精率和孵化率分别为68.1±1.1%和72.72±1.79%。本发明对延长豹纹鳃棘鲈精液保存时间有着显著优势，解冻后的精液可满足于人工良种选育，对建立和保护豹纹鳃棘鲈优良精子库具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及豹纹鳃棘鲈人工繁育领域，特别是涉及一种超低温保存液及其保存豹纹鳃棘鲈精液的方法和应用。
背景技术
豹纹鳃棘鲈（Plectropomus leopardus），俗称东星斑，属暖水礁栖性鱼类。它不仅肉质细腻，口感鲜美，营养丰富，而且因其体表颜色的绚丽而具有较高的观赏价值，是一种名贵的海产品。然而，豹纹鳃棘鲈种质资源不容乐观，一方面，野生资源过度捕捞而导致个体数量大幅度衰减，野生豹纹鳃棘鲈已被国际自然保护联盟（IUCN）列为近危物种。另一方面，随着养殖规模和密度的不断扩大，种质退化问题显露。在人工繁养过程中，由于雌雄亲本性成熟不同步，导致苗种供应不稳定。雌雄个体体型呈性别二态性，使得雄鱼养殖价值较雌鱼更低。此外，养殖场会周期性的远距离运输亲本来找到匹配其繁殖状态的地理环境，导致生产成本加大。因此，迫切需要更加优良的保种技术，来提高精液的稳定供应，丰富亲本的来源，同时降低企业的养殖成本，这对幼鱼大规模生产、选择育种或相关科学研究具有重要意义。
精液超低温保存技术已成为保护濒危或重要商业物种的主要工具之一，可为养殖场提供稳定且具有育种价值的雄性亲本。然而，现有关于豹纹鳃棘鲈精子冷冻保存技术（专利号：CN201410473950.6）仅采用非渗透性抗冻剂，且未体现受精情况，未深入探究不同条件下精液冻存效果差异，更重要的是无法很好的保存豹纹鳃棘鲈精子，存在较大误差。本团队所采用的稀释液，已在之前研究中证明了该稀释液对豹纹鳃棘鲈精液低温短期保存具有优良的效用（专利号：CN202210107918.0）。但对于长期保存来说，需利用超低温（-196℃）停滞精子的新陈代谢活动，稳定其生命状态，并尽量减少操作过程中冰晶形成对精子造成的损伤。不同的抗冻剂种类及其浓度对精子保护效果不同，浓度过低保护作用不明显，浓度过高则会产生毒害作用。因此，添加相应抗冻剂并摸索最适冻存条件是进行超低温保存的关键步骤。
精子活力是一个主要的质量评价因素，一般认为，精子运动率越高，运动时间越长，则受精能力越强。计算机辅助精子分析（CASA）与人工分析相比，CASA更具优势，包括对众多精子细胞更客观和可重复的测量，而具有较强统计和分析能力。此外，能否达到和鲜精类似的生理状态是冻存精子的最终目的，本发明通过人工授精复温后的精子，统计其受精率和孵化率来评价生产实践上的应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种超低温保存液及其保存豹纹鳃棘鲈精液的方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过抗冻剂和稀释液的联合使用，获得超低温保存（-196℃）豹纹鳃棘鲈精液可供使用的配方，有效保证了豹纹鳃棘鲈在经过超低温保存下仍存在较高的活力，不仅满足了长期保存豹纹鳃棘鲈精液的需求，同时还能够应用于人工授精，对人工良种繁育具有重要意义。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供了一种豹纹鳃棘鲈精液超低温保存液，所述超低温保存剂包括稀释液和抗冻剂，所述抗冻剂占所述超低温保存剂的体积分数为1%-10%；
其中，所述稀释液是由基础稀释液和胎牛血清混合而成，所述基础稀释液包括以下组分：氯化钠、碳酸氢钠、氯化钾、还原性谷胱甘肽和葡萄糖；
所述抗冻剂为二甲基亚砜或甲醇。
优选的是，所述基础稀释液包括以下质量浓度的组分：氯化钠3.5 g/L，碳酸氢钠1.68 g/L，氯化钾2 g/L，还原性谷胱甘肽2 g/L和葡萄糖0.44 g/L；
所述基础稀释液和所述胎牛血清的体积比9:1。
优选的是，所述抗冻剂为二甲基亚砜。
优选的是，所述抗冻剂占所述超低温保存剂的体积分数为1%。
本发明还提供利用所述的超低温保存液保存豹纹鳃棘鲈精液的方法，将豹纹鳃棘鲈精液与超低温保存液混合，然后置于超低温环境下保存，其中，所述豹纹鳃棘鲈精液与所述超低温保存液的体积比为（1-2）:（1-9）。
优选的是，所述豹纹鳃棘鲈精液与所述超低温保存液的体积比为1:4。
优选的是，所述超低温环境下保存的操作方法包括以下步骤：将豹纹鳃棘鲈精液与超低温保存液的混合液在冰上平衡15-20min，再于液氮罐中距离液氮面上方5cm处停留4-5min，之后再于液氮底面处停留4-5min，最后将所述混合液完全浸入液氮内保存一个月。
本发明还提供所述的超低温保存液在超低温环境长期保存豹纹鳃棘鲈精液以及提高超低温保存豹纹鳃棘鲈精液的活力方面的应用。
本发明还提供所述的超低温保存液在提高超低温保存豹纹鳃棘鲈精液的体外人工授精的受精率和孵化率中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明公开的豹纹鳃棘鲈超低温保存液，在该超低温保存液配方中，基础稀释液具有保持精液pH、维持渗透压、抑制精子被激活、提供营养物质和减少氧化损伤的作用；胎牛血清含有大量的蛋白质，其为非渗透性抗冻剂，能够降低细胞外溶质浓度，使细胞脱水而减少胞内冰晶形成，从而减少溶质损伤；二甲亚砜、甲醇和甘油为渗透性抗冻剂，可进入精子内部，降低胞质冰点，并防止冰晶形成；精子内外两种抗冻剂的添加，为精子提供良好的超低温保存效果。本发明在豹纹鳃棘鲈精液保存中创新的使用渗透性抗冻剂和非渗透性抗冻剂相结合的方法，提高了超低温保存精液的效果，复温后精子仍然具有较高的活力。
本发明通过实验验证发现，即便是在液氮中超低温保存了1个月的时间，其精子运动率达到90.42±2%，与鲜精类似，90%失活时运动持续时间达175±6s，受精率和孵化率分别为68.1±1.1%和72.72±1.79%，依旧具有较高的受精能力，对豹纹鳃棘鲈种质资源保护和遗传改良具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明豹纹鳃棘鲈精液超低温保存方法及应用的技术流程；
图2为不同抗冻剂种类及浓度的精子运动率；
图3为不同浓度二甲基亚砜及精液和超低温保存液不同混合比例的精子运动率。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明关于豹纹鳃棘鲈精液超低温保存方法及应用的技术流程如下（见图1）：（1）配制超低温保存液；（2）获取精液（精子活力检测）；（3）精液与超低温保存液混合；（4）程序性冷冻（液氮中长期保存）；（5）程序性复温（精子活力检测）；（6）人工授精；（7）统计受精率和孵化率。
豹纹鳃棘鲈精液的超低温保存液的制备方法为：
（1）基础稀释液中各组分的质量浓度为：氯化钠3.5 g/L，碳酸氢钠1.68 g/L，氯化钾2 g/L，还原性谷胱甘肽2 g/L和葡萄糖0.44 g/L，以稀释液的体积为基准常温溶解于超纯水；
（2）以基础稀释液和胎牛血清体积比9:1混合，制成稀释液，于4℃下保存备用；
（3）将抗冻剂二甲基亚砜、甲醇或甘油与稀释液混合制成超低温保存液，浓度为1%-15%。
根据上述超低温保存液的使用方法，通过以下步骤进行豹纹鳃棘鲈精液超低温保存及相关检测和应用，下面以具体实施例进一步说明。
实施例1 筛选最优抗冻剂种类
（1）按上述方法配制超低温保存液：简而言之，先将基础稀释液和胎牛血清混合配制成稀释液，再用稀释液稀释二甲基亚砜、甲醇或甘油至终浓度为5%、10%和15%，于4℃保存备用。其中，二甲基亚砜和甲醇直接用稀释液一次性稀释至所需浓度，而甘油由于太过黏稠，将移液器枪头剪去尖端部分，吸取甘油，与稀释液等体积混合，再用稀释液二次稀释至所需浓度。
（2）采集精液：在繁殖季节，选取30尾精巢发育成熟的豹纹鳃棘鲈雄鱼，用干净毛巾搽干泄殖孔周围，沿头至泄殖孔轻压鱼腹，收集精液，每10尾混匀，共三次生物学重复。
（3）将精液和超低温保存液按照1:1混合，含不同抗冻剂种类和浓度的混合液分别装入200 μL的EP管中，并用透明胶裹住，置入液氮勺底部。
（3）程序性冷冻：将混合液在碎冰上平衡15 min，然后将液氮勺伸入液氮罐，液氮勺底部距液氮面上方5 cm处时停留5 min，接着其底部接触液氮面并停留5 min，最终完全浸入液氮内保存一个月。
（4）程序性复温：将液氮勺顶部平齐于液氮罐（10 L）开口边缘处5 min，接着置入-80℃冰箱中平衡20 min，最后取出EP管，于37℃水浴中不断摇晃10 s至含精液的混合液完全溶解。
（5）精子活力检测：将冻精用稀释液稀释一定比例后，随后用移液枪吸取1 μL稀释后的冻精，加入2 μL过滤后的天然海水激活精子，并最终控制豹纹鳃棘鲈原精稀释总倍数达300倍，立即用CASA检测精子运动率。计时，记录精子寿命，为90%精子激活后从快速运动到原地打转的持续时间。每个样品进行三次技术重复。
统计结果显示，鲜精激活后运动率为92.08±1.42%，精子寿命为312±9s。超低温保存一个月时间后，如图2和表1所示，最优抗冻剂为二甲基亚砜，初步筛选出较优浓度为5%，此时CASA检测精子运动率为75.27±3.24%，精子寿命为139±3s。在该条件下，精子激活后的运动率和运动时间都受到了一定影响。
表1 不同抗冻剂种类及浓度的复温后精子寿命
注：“-”表示由于运动率偏低，无法准确记录精子寿命。
实施例2 筛选最适抗冻剂浓度以及精液与超低温保存液的混合比例
（1）按上述方法配制超低温保存液：将基础稀释液和胎牛血清混合配制成稀释液，根据实施例1结果可知最优抗冻剂为二甲基亚砜，初步较优抗冻剂浓度为5%。但为了更好的确定最适抗冻剂浓度，细化后，二甲基亚砜占超低温保存液体积的1%、3%、5%和7%，于4℃保存备用。
（2）采集精液：同实施例1。
（3）将精液和超低温保存液按照2:1，1:1，1:4和1:9体积比混合，分别装入200 μL的EP管中，并用透明胶裹住，置入液氮勺底部。
（4）程序性冷冻：同实施例1。
（5）程序性复温：同实施例1。
（6）精子活力检测：同实施例1。
（7）人工授精：依据最优条件下超低温保存的精液，按照原精:卵子＝1:2000的体积比进行人工干法授精，即将精液与卵子混合搅匀后，立即加入适量的常温干净海水激活精子，常温孵化，统计受精率和孵化率。计算公式如下：
受精率＝(发育至4～16细胞期胚胎数/总卵数)×100％
孵化率＝(初孵仔鱼数/已受精胚胎数)×100％
需要特别说明的是，从雌鱼中剥离卵子的手法与雄鱼类似，形态上卵子呈球形、均质且透明，具一个油球，约90%以上漂浮于海水表面才可用于后续实验。
统计结果显示，鲜精激活后运动率为93.91±1.4%，寿命为303±5s，人工受精后受精率为95.25±0.63%，孵化率为81.84±3.05%。精液经过一个月的超低温保存后，如图3和表2所示，二甲基亚砜浓度为1%，精液和超低温保存液体积比为1:4时运动率最高，为90.42±2%，接近于鲜精，但精子寿命比鲜精更短，相比其他组运动持续时间最长，为175±6s。为了证明在该条件下超低温保存的精子能够激活卵子发育，因此将复温后的精子进行人工授精，其受精率为68.1±1.1%，孵化率为72.72±1.79%。具有较为优异的长期保存效果，可满足于人工良种选育。
表2不同浓度二甲基亚砜及精液和超低温保存液不同混合比例复温后精子寿命
注：“-”表示由于运动率偏低，无法准确记录精子寿命。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (6)
1.一种豹纹鳃棘鲈精液超低温保存液，其特征在于，所述超低温保存液包括稀释液和抗冻剂，所述抗冻剂占所述超低温保存液的体积分数为1%；
其中，所述稀释液是由基础稀释液和胎牛血清混合而成，所述基础稀释液包括以下质量浓度的组分：氯化钠3.5 g/L，碳酸氢钠1.68 g/L，氯化钾2 g/L，还原性谷胱甘肽2 g/L和葡萄糖0.44 g/L；
所述基础稀释液和所述胎牛血清的体积比9:1；
所述抗冻剂为二甲基亚砜。
2.利用如权利要求1所述的超低温保存液保存豹纹鳃棘鲈精液的方法，其特征在于，将豹纹鳃棘鲈精液与超低温保存液混合，然后置于超低温环境下保存，其中，所述豹纹鳃棘鲈精液与所述超低温保存液的体积比为（1-2）:（1-9）。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述豹纹鳃棘鲈精液与所述超低温保存液的体积比为1:4。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述超低温环境下保存的操作方法包括以下步骤：将豹纹鳃棘鲈精液与超低温保存液的混合液在冰上平衡15-20 min，再于液氮罐中距离液氮面上方5 cm处停留4-5 min，之后再于液氮底面处停留4-5 min，最后将所述混合液完全浸入液氮内保存一个月。
5.如权利要求1所述的超低温保存液在超低温环境长期保存豹纹鳃棘鲈精液以及提高超低温保存豹纹鳃棘鲈精液的活力方面的应用。
6.如权利要求1所述的超低温保存液在提高超低温保存豹纹鳃棘鲈精液的体外人工授精的受精率和孵化率中的应用。
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