CN110973118A - 一种黄河鲤精子超低温冷冻保存方法 - Google Patents

一种黄河鲤精子超低温冷冻保存方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种黄河鲤精子超低温冷冻保存方法，具体过程为：将抗冻剂甲醇与稀释液配成精子保存液，再将黄河鲤精液与精子保存液按照体积比1:5装入冻存管内，在黄河鲤精液与精子保存液的混合液中抗冻剂甲醇的体积浓度为17%，然后于4℃预冷5min，随后在液氮上方5cm处平衡12min后投入液氮中，超低温处理1d，所述稀释液由以下重量百分配比的原料组成：NaCl 0.9%、KCl 0.05%、葡萄糖1.5%，余量为水。本发明建立了黄河鲤超低温冷冻保存技术，为黄河鲤精子冷冻库的建立提供了技术保障，同时为黄河鲤的种质保存和遗传育种工作提供了技术支撑。

Description

一种黄河鲤精子超低温冷冻保存方法
技术领域
本发明属于精子超低温冷冻保存方法技术领域，具体涉及一种黄河鲤精子超低温冷冻保存方法。
背景技术
黄河鲤(Cyprinuscarpiohaematopterus)是我国黄河水系里宝贵的鱼类资源，是河南省重要的淡水养殖鱼类，也是我国淡水四大名鱼之一。但是由于人类活动及自然环境变化的影响，如水质污染、黄河断流及不正当捕捞，使得黄河的生态环境遭到严重破坏，其群体数量快速下降，急需开展种质资源的保护工作。
在水产动物中，建立冷冻基因库是保护种质资源的重要方法之一。目前，国内外科学家已在不同类型的细胞中进行冷冻保存研究，包括精子、卵母细胞和胚胎等，由于精子具有体积小、抗旱性强等优势，精子冷冻保存引起了研究人员的广泛关注。从1953年Blaxter用干冰成功保存了大西洋鲑精巢以后，人们开始了对多种鱼类精子进行冷冻保存的研究，精子冷冻保存已发展成水产动物中最成熟的种质保存技术。目前中国已建立了包括“青、草、鲢、鳙”在内的多种鱼类精子库及相关技术。为了保护黄河鲤种质资源，对黄河鲤进行精子冷冻保存研究是十分必要的。
精子冷冻保存主要包括低温保存和超低温保存两种方式。精子超低温冷冻保存是利用-196℃的温度使精子细胞内酶活性降低，新陈代谢活动停滞，生命处于稳定状态，以达到保存的目的。其原理是用渗透压适宜的稀释液对精子进行稀释，降低其浓度；添加适宜浓度的抗冻剂，避免细胞在冷冻与解冻过程被冻伤，如严重脱水、细胞内形成冰晶等；采用适当的平衡方式，使精子安全进入液氮；采用合适的解冻温度，使精子能够恢复活力，而不同物种适用的稀释液种类、抗冻剂种类及浓度、精液稀释比例、平衡方式及解冻温度有所不同。精子超低温冷冻保存技术在物种保护和防止物种灭绝方面具有重要作用，不仅可以保护种质资源、保证动物遗传物质的多样性，也可以克服因繁殖时间不同和地理环境而导致的杂交障碍。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供了一种黄河鲤精子超低温冷冻保存方法，该方法建立了黄河鲤超低温冷冻保存技术，为黄河鲤精子冷冻库的建立提供了技术保障，同时为黄河鲤的种质和遗传育种工作提供了技术支撑。
本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种黄河鲤精子超低温冷冻保存方法，其特征在于具体过程为：将抗冻剂甲醇与稀释液配成精子保存液，再将黄河鲤精液与精子保存液按照体积比1:5装入冻存管内，在黄河鲤精液与精子保存液的混合液中抗冻剂甲醇的体积浓度为17％，然后于4℃预冷5min，随后在液氮上方5cm处平衡12min后投入液氮中，超低温处理1d，所述稀释液由以下重量百分配比的原料组成：NaCl 0.9％、KCl 0.05％、葡萄糖1.5％，余量为蒸馏水。
优选的，所述黄河鲤精液的具体采集过程为：用促黄体素释放激素A2与绒毛膜促性腺激素对实验黄河鲤雄鱼进行一次胸腔注射，放入水池并用微水流刺激，维持水温在20±0.5℃，8～12h后检查催产情况，采用挤压法采集精液，先用麻醉剂将鱼麻醉2min，再用洁净的干毛巾将雄鱼生殖孔及体表擦干，然后沿着胸鳍到腹鳍方向轻轻按压其腹部，让精液缓慢流出，精液要呈乳白色，不能掺杂有血液和粪便，之后用2mL注射器将1～2mL精液收集到2mL冷冻管中，避免阳光直射，每尾黄河鲤鱼的精液放置单独的冷冻管中，于4℃冰箱中保存备用。
本发明通过筛选稀释液种类、抗冻剂种类及浓度、黄河鲤精液稀释比例及平衡方式对黄河鲤精子冷冻保存的影响，最终筛选出适合黄河鲤精子超低温冷冻保存的方法，即以D-17(0.9wt％NaCl、0.05wt％KCl和1.5wt％葡萄糖)为稀释液；稀释后体积浓度为17％的甲醇作为抗冻剂；黄河鲤精液与精子保存液按体积比1:5混合；液氮面以上5cm平衡12min的平衡方式。因此，本发明可以为黄河鲤精子超低温保存提供一种解决方案。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
实施例
为实现对黄河鲤精子超低温冷冻保存的目的，本实验根据以上技术原理，拟通过对稀释液(D-14、D-15、D-16、D-17、D-19、D-20、D-21、壬氏液)、稀释后抗冻剂终体积浓度(15％、16％、17％、18％、19％)、稀释体积比例(1:3、1:4、1:5、1:6、1:7)及不同平衡时间和平衡距离的进行筛选，以期得到保存黄河鲤精子的最佳配方和程序。
1.1实验试剂和材料
1.1.1实验试剂
注射用促黄体素释放激素A2(杭州动物药品厂)、绒毛膜促性腺激素(杭州日月动物药品有限公司)、氯化钠(国药集团化学试剂有限公司)、氯化钾(天津市天力化学试剂有限公司)、甲醇(天津市光复科技发展有限公司)、鱼用壬氏液、葡萄糖、甘油、乙二醇。
1.1.2实验仪器
光学显微镜(尼康股份有限公司)、电脑(戴尔DESKTOP-LNV8DOI)、2mL注射器、2mL冷冻管、冻存管盒、移液枪(北京大龙，型号：ToPette，10-200μL、100-1000μL)、枪头(10-200μL、100-1000μL)、载玻片、毛巾、黑色记号笔、泡沫箱、冰箱(新飞电器公司，型号：BCD-223MTX)、液氮罐(航空牌)、XMTD-6000型恒温水浴锅(北京市长风仪器仪表公司)。
1.2实验方法
1.2.1精液来源
精液采自河南师范大学水产养殖基地养殖的2龄黄河鲤雄鱼，体重在500～800g。
1.2.2精液的采集及检测
1.2.2.1精液采集
用促黄体素释放激素A2与绒毛膜促性腺激素对实验黄河鲤雄鱼进行一次胸腔注射，放入水池并用微水流刺激，维持水温在20±0.5℃，8～12h后检查催产情况，采用挤压法采集精液：先用麻醉剂将鱼麻醉2min，再用洁净的干毛巾将雄鱼生殖孔及体表擦干，然后沿着胸鳍到腹鳍方向轻轻按压其腹部，让精液缓慢流出，精液要呈乳白色，不能掺杂有血液和粪便，之后用2mL注射器将1～2mL精液收集到2mL冷冻管中(避免阳光直射)，每尾鱼的精液放置单独的冷冻管中，于4℃冰箱中备用。
1.2.2.2精子活力的检测
精子活力是指用显微镜观察时，一个视野里快速运动的精子占精子总数的比例。根据丁淑荃等精子活力判定及记录方式，本文采用的精子活力记录方式为：“0”表示精子没有活力；“1”表示精子活力<20％；“2”表示精子活力为20％～40％；“3”表示精子活力为40％～60％；“4”表示精子活力为60％～80％；“5”表示精子活力为80％～100％。
取少量新鲜精液于干燥载玻片上，用0.4wt％的NaCl溶液激活，在100倍显微镜下检查精子活力，精子活力需要超过90％才可以被用于实验，其检测需同一人完成，实验重复3次。
1.2.3抗冻剂浓度梯度的筛选
通过预实验，发现以甲醇作为抗冻剂的保存效果比甘油和乙二醇更好，故以甲醇作为黄河鲤精子超低温保存的抗冻剂。将甲醇与D-17配成精子保存液，黄河鲤精液与精子保存液的比例按照体积比1:5进行配制，在黄河鲤精液与精子保存液的混合液中，抗冻剂甲醇的体积浓度分别设为15％、16％、17％、18％、19％，冷冻及解冻流程为：将黄河鲤精液和精子保存液按照体积比1:5的比例装入2mL的冻存管，然后再4℃中预冷5min，随后在液氮上方5cm处平衡12min后投入液氮中，超低温处理1d，将样品放入37℃水浴锅中解冻，待有部分解冻，取少量的精液于干燥载玻片上，滴加一滴0.4wt％的NaCl溶液激活精子，在100倍光学显微镜下观察精子的活力，从而筛选出最佳抗冻剂浓度，实验重复三次。
1.2.4稀释液的筛选
采用以下稀释液(表1)对黄河鲤精子进行保存：D-14、D-15、D-16、D-17、D-19、D-20、D-21、鱼用壬氏液。冷冻及解冻流程为：稀释液与甲醇配成精子保存液，取100μL精液与500μL保存液于2mL冷冻管中混匀，使甲醇终体积浓度达到17％，4℃中预冷5min，在液氮上方5cm处平衡12min后投入液氮中，超低温处理1d，将样品放入37℃水浴锅中解冻，待有部分解冻，取少量精液于干燥载破片上，用0.4wt％的NaCl溶液进行激活，在100倍光学显微镜下观察精子的活力，从而筛选出最佳稀释液，实验重复三次。
表1稀释液的组成成分及比例(％)
Figure BDA0002293991880000041
1.2.5精液稀释比例的筛选
精子保存液由稀释液和抗冻剂两部分组成，黄河鲤精液与精子保存液的稀释比例，要根据种类而定。在黄河鲤精子超低温冷冻保存中，D-17和甲醇配制成精子保存液，取100μL黄河鲤精液，分别与精子保存液按照体积比1:3、1:4、1:5、1:6和1:7的比例混合均匀(使甲醇终体积浓度达到17％)，4℃中预冷5min，在液氮上方5cm处平衡12min后投入液氮中，超低温处理1d，将样品放入37℃水浴锅中解冻，待有部分解冻，取少量精液于干燥载破片上，用0.4wt％的NaCl溶液进行激活，在100倍光学显微镜下观察精子的活力，选出最佳的精液稀释比例，实验重复三次。
1.2.6平衡方式的筛选
将D-17和甲醇按一定比例配成精子保存液，取100μL新鲜黄河鲤精液于2mL冷冻管中，与精子保存液按体积比1:5的比例进行混匀，使甲醇终体积浓度达到17％，4℃中预冷5min，采用不同的平衡方式(表2)将精液超低温保存1d，经37℃水浴解冻后，取少量的精液于干燥载玻片上，滴加0.4wt％的NaCl溶液激活精子，在100倍光学显微镜下观察精子的活力。探索液氮上或液氮里的平衡时间和平衡距离对精子活力的影响，按照冷冻平衡时间和距离进行梯度实验，筛选出最佳的平衡方式，实验重复3次。
表2超低温冷冻平衡方式
Figure BDA0002293991880000051
1.2.7数据处理与分析
采用WPS 2019和SPSS 19.0对实验数据进行处理和分析，用单因素方差分析和多重比较的方法，检验各组之间精子活力的差异显著性。
2.1抗冻剂浓度梯度对精子超低温冷冻保存的影响
以D-17为稀释液，终体积浓度15％、16％、17％、18％、19％的甲醇为抗冻剂，冷冻保存后，结果如表3所示：精子活力随抗冻剂浓度的升高呈先升后降的趋势，以解冻后精子平均活力最差的处理组(终浓度为19％的甲醇)为对照组，甲醇终体积浓度为17％时，解冻后精子平均活力为4.67，甲醇浓度为16％时，精子平均活力为3.33，这两组的精子活力均显著高于对照组(P<0.01)。
表3抗冻剂甲醇浓度对精子超低温保存的影响
Figure BDA0002293991880000052
注：以解冻后精子平均活力最差的处理组(终体积浓度为19％的甲醇)为对照组，**表示差异极显著(P<0.01)
2.2稀释液对精子超低温冷冻保存的影响
以D-14、D-15、D-16、D-17、D-19、D-20、D-21、鱼用壬氏液为稀释液进行精子的超低温冷冻保存，结果如表4所示，只有稀释液D-17在激活前能够完全抑制精子的活力，在激活之后，只有任氏液保存组没有活力，也就是说无法进行精子保存，其他组均有60％以上的活力，综合各组数据，稀释液D-17为保存黄河鲤精子的最优稀释液。
表4稀释液种类对精子超低温保存的影响
Figure BDA0002293991880000061
2.4稀释比例对精子超低温冷冻保存的影响
不同稀释液比例对黄河鲤精子冷冻保存的结果如表5所示，，随着稀释比例的递增，精子活力呈先升后降的趋势，以解冻后精子活力最差的处理组(稀释体积比例为1:7)为对照组，其中稀释体积比例为1:5时，精子平均活力为4.67，精子保存效果最好；稀释体积比例为1:7时，精子平均活力为2.33，效果最差。单因素方差结果显示，稀释体积比1:5组解冻后的精子活力极显著对照组(P<0.01)，稀释体积比为1:3和1:4解冻后的精子活力显著高于对照组(P<0.05)。综合各组数据，稀释体积比例1:5为保存黄河鲤精子的最优稀释比例。
表5精子稀释比例对精子超低温保存的影响
Figure BDA0002293991880000062
Figure BDA0002293991880000071
注：以解冻后精子平均活力最差的处理组(稀释比例1:7)为对照组，**表示差异极显著(P<0.01)，*表示差异显著(P<0.05)
2.5平衡方式对精子超低温冷冻保存的影响
不同平衡方式对黄河鲤精子超低温冷冻保存的结果见表6：第六组、第七组和第八组解冻后无活力，其他组解冻后的活力平均值从高到低依次为：第五组、第三组、第一组、第二组和第四组。将第一组、第二组、第三组和第五组分别与解冻后有活力但是平均活力最低的第四组相比，第三组和第五组极显著高于第四组，第一组显著高于第四组，综合各组数据，第五组为保存黄河鲤精子的最优平衡方式。
平衡时间对黄河鲤精子超低温冷冻保存实验结果见表7：将解冻后精子活力最差的处理组(平衡时间为6min)作为对照组，平衡时间为8min、10min和12min时，精子平均活力分别为3.33、4.33和4.67，极显著高于对照组，其中平衡时间为12min时，精子活力最高；平衡时间为16min时，解冻后精子平均活力为2.67，显著高于对照组。综合各组数据，12min为保存黄河鲤精子的最优平衡时间。
表6平衡方式对精子超低温冷冻保存的影响
Figure BDA0002293991880000072
注：以解冻后精子平均活力最差的处理组(第四组)为对照组，**表示差异极显著(P<0.01)，*表示差异显著(P<0.05)
表7液氮面上5cm平衡不同时间对精子超低温冷冻保存的影响
Figure BDA0002293991880000073
Figure BDA0002293991880000081
注：以解冻后精子平均活力最差的处理组(6min)为对照组，**表示差异极显著(P<0.01)，*表示差异显著(P<0.05)
3讨论
随着自然环境的改变和人类活动的影响，许多鱼类面临着灭绝的危险，种质资源越来越稀少，为了保护鱼类的种质资源，国内外研究人员开展了大量的鱼类种质资源保护工作。鱼类精子冷冻保存是保护种质资源的重要方法之一，已经在不同的细胞类型进行研究，但由于鱼类精子特殊的性质，即在体内处于不活动状态，排出体外后，一旦遇到适宜条件就会被激活，直到精子体内储藏的能量消耗殆尽后死亡，因此对鱼类精子进行冷冻保存的研究较多。
3.1抗冻剂浓度梯度对精子超低温冷冻保存的影响
在超低温保存的过程中，精子细胞极易产生冰晶，致使细胞丧失功能，而抗冻剂可以使溶液的粘性增加，帮助精子度过冰晶危险区，从而达到保护的目的，但抗冻剂本身具有一定毒性。目前常用的抗冻剂有乙二醇、二甲基亚砜、甘油及甲醇，其中，乙二醇在鱼类中应用较少；二甲基亚砜被广泛应用；甘油适用于海水鱼类精子冷冻保存；由于甲醇相对分子小，能充分地进入淡水鱼类的精子细胞中，且毒性较低，能起到很好的保护作用，所以甲醇更适合淡水鱼类精子冷冻保存。夏良萍等证明甲醇对黄颡鱼精子保存效果最好；王晓爱等认为甲醇对暗色唇鱼精子有较好的冷冻保护效果。本实验得出终体积浓度为17％的甲醇对黄河鲤精子超低温冷冻保存效果最好。
3.2稀释液及稀释比例对精子超低温冷冻保存的影响
稀释液对精子低温保存和超低温保存至关重要，它不仅可以降低精液浓度，达到稀释的作用；也可以为精子提供营养物质，延长精子的寿命，防止精子冷休克的发生，但稀释液不能对精子有毒害作用。陈松林等证明稀释液D-17对鲤鱼精液冷冻保存的效果最好，这可能与鲤精液的渗透压较高有关。本实验证明D-17稀释液在精子激活前能有效地抑制精子活力，激活后精子活力为4.67，最适用于黄河鲤精子超低温冷冻保存。
不同的精液由于理化性质不同，稀释体积比例也会不同，淡水鱼类精液稀释体积比例一般在1:1～1:10范围内，在团头鲂、青、草、鲢、鳙精子冷冻保存中，稀释体积比例为1:2～1:4时，精子活力较高，而鲤精液稀释体积比例常为1:1或者1:5。本实验中，随着稀释体积比例的递增，精子活力呈出现先上升后下降的趋势，其中稀释体积比例为1:5时，精子保存效果最佳，稀释体积比例大于或小于1:5时精子活力明显下降。因此，精子稀释体积比例为1:5时，稀释液和抗冻剂能够充分渗透入黄河鲤精子细胞中，更适于黄河鲤精子超低温冷冻保存。
3.3平衡方式对精子超低温冷冻保存的影响
精液放入液氮之前，需要经过一个平衡阶段，对超低温冷冻过程中的温度变化有一个适应时间，平衡的目的是让释释液和抗冻剂能够充分进入精子细胞内，降低精子体内的代谢活动，增强精子对低温的抵抗力，起到一定的保护作用。目前多采用慢速分段的平衡方式，Ding等利用液氮面上6cm处平衡10min、然后在液氮面平衡5min的平衡方法冷冻保存鳜鱼精子；王晓爱等利用在距液氮面6cm平衡2min、然后液氮面平衡2min的平衡方法冷冻保存软鳍新光唇鱼精子。不同鱼类精子的冷冻平衡距离和时间各不相同，一般平衡时间控制在10～60min为宜，而鲤精子冷冻保存平衡时间为10～30min。
本实验采用在液氮上方5cm处平衡12min，然后直接投入液氮的平衡方式，最终得到了较好的保存效果，因此，上述平衡方式能够很好地避免黄河鲤精子在冷冻过程中受到损害，更适合黄河鲤精子超低温冷冻保存。
4结论
本发明通过筛选稀释液种类、抗冻剂种类及浓度、黄河鲤精液稀释体积比例及平衡方式对黄河鲤精子冷冻保存的影响，最终找出适合黄河鲤精子超低温冷冻保存的方法，即以D-17(0.9wt％NaCl、0.05wt％KCl和1.5wt％葡萄糖)为稀释液；稀释后终体积浓度为17％的甲醇作为抗冻剂；黄河鲤精液与精子保存液按体积比1:5混合；液氮面以上5cm平衡12min的平衡方式。因此，本发明可以为今后黄河鲤精子超低温保存提供一种参考方案。
以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。

Claims (2)

1.一种黄河鲤精子超低温冷冻保存方法，其特征在于具体过程为：将抗冻剂甲醇与稀释液配成精子保存液，再将黄河鲤精液与精子保存液按照体积比1:5装入冻存管内，在黄河鲤精液与精子保存液的混合液中抗冻剂甲醇的体积浓度为17%，然后于4℃预冷5min，随后在液氮上方5cm处平衡12min后投入液氮中，超低温处理1d，所述稀释液由以下重量百分配比的原料组成：NaCl 0.9%、KCl 0.05%、葡萄糖1.5%，余量为蒸馏水。
2.根据权利要求1所述的黄河鲤精子超低温冷冻保存方法，其特征在于所述黄河鲤精液的具体采集过程为：用促黄体素释放激素A2与绒毛膜促性腺激素对实验黄河鲤雄鱼进行一次胸腔注射，放入水池并用微水流刺激，维持水温在20±0.5℃，8~12h后检查催产情况，采用挤压法采集精液，先用麻醉剂将鱼麻醉2min，再用洁净的干毛巾将雄鱼生殖孔及体表擦干，然后沿着胸鳍到腹鳍方向轻轻按压其腹部，让精液缓慢流出，精液要呈乳白色，不能掺杂有血液和粪便，之后用2mL注射器将1~2mL精液收集到2mL冷冻管中，避免阳光直射，每尾黄河鲤鱼的精液放置单独的冷冻管中，于4℃冰箱中保存备用。
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