CN114271264A - 一种江鳕精液冷冻保存液、制备方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种江鳕精液冷冻保存液、制备方法及其用途，用腹部挤压法从成熟雄鱼获得精液，将3种不同配方的精液冷冻保存液分别以3∶1比例与精液混合，装入0.5mL麦管中，在泡沫箱里距液氮面2cm的浮架上降温10min，保存在液氮罐内。解冻(40℃，10s)后，观察并记录精子激活比例和精子存活时间。II号精液冷冻保存液和III号精液冷冻保存液的精子激活比例和存活时间均显著高于I号精液冷冻保存液，其中II号精液冷冻保存液的精子激活比例和存活时间均高于III号精液冷冻保存液，但均未达到显著差异水平。本研究所用的3种精液冷冻保存液中，成分简单的II号获得的冻精激活比例和精子存活时间最高，可用于江鳕精液冷冻保存。

Description

一种江鳕精液冷冻保存液、制备方法及其用途

技术领域

本发明涉及江鳕养殖技术领域，具体是一种江鳕精液冷冻保存液、制备方法及其用途。

背景技术

江鳕在分类学上属鳕形目、鳕科、江鳕属，为凶猛肉食性鱼类，也是重要的大型冷水性经济鱼类，广泛分布于北纬45°以北的欧亚和北美洲的内陆水域，在中国仅分布于额尔齐斯河、黑龙江和鸭绿江上游流域。江鳕肉质鲜美细腻，营养价值高，其肥大的肝脏更是美味佳肴。由于江鳕的独特价值和发展潜力，国内外学者已经对江鳕的生物学特征、人工繁殖、养殖开发等方面开展一定的研究，并深入到基因组学方面的研究。但是近来，由于生态环境的改变和捕捞过度，威胁着江鳕自然种群的生存，导致捕捞个体小型化、低龄化，分布区域缩小，额尔齐斯河自然种群数量急剧下降，对江鳕进行种质保存成为水产基础研究急需解决的问题。因此，研究和开发江鳕精液冷冻保存技术对江鳕增养殖业的发展和种质保存具有重要意义。

目前江鳕精液冷冻保存技术研究报道还比较少，仅有Lahnsteiner和Jensen等报道了一个成分复杂的江鳕精子冷冻保存液(100mmol/L NaCl、0.02mmol/L KCl、1mmol/LCaCl₂、1mmol/L MgSO₄、20mmol/L Hepes，pH 7.8)添加混合抗冻剂(10％甲醇、1.5％葡萄糖、7％蛋黄)，其中Lahnsteiner获得46.6±8.0％的冻精精子激活比例和78.1±2.7％的受精率，Jensen获得大约15％的冻精精子激活比例和69％的受精率。田永胜等人经过大量筛选，也得到2个复杂的精液冷冻保存液，分别为SS-5(NaCl 0.5g/100mL、NaHCO3 0.2g/100mL、KCl 0.04g/100mL、葡萄糖1g/100mL、FBS10％)添加6％DM(二甲亚砜和甲醇3∶2混合物)，以及D15-7(NaCl 0.4g/100mL、KCl 0.05g/100mL、葡萄糖1.5g/100mL、FBS10％)添加7％DM，用它们获得的冻精解冻后的精子激活比例都达到(26.67±5.77)％。实际操作证明，这三个配方不但成分复杂，而且效果不稳定，很难重复成功实现额尔齐斯河江鳕精子冷冻保存。而目前在其它鱼类，如白斑狗鱼和虹鳟鱼的精子冷冻保存已经取得非常好的进展。研制开发成分简单、效果稳定的江鳕精液冷冻保存液，已经成为江鳕增养殖业的发展和种质保存研究的当务之急。

发明内容

本发明的目的在于提供一种江鳕精液冷冻保存液、制备方法及其用途，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种江鳕精液冷冻保存液，江鳕精液冷冻保存液包含以下浓度的组分：0.3mol/L葡萄糖、10％甲醇、10％蛋黄和KCl 1.79g/L。

优选的：所述精液冷冻保存液包括基础稀释溶液和渗透性抗冻保护剂。

优选的：所述基础稀释溶液包括葡萄糖和KCl。

优选的：所述渗透性抗冻保护剂包括甘油、甲醇、二甲亚砜、乙二醇、乙酰胺、丙二醇。

优选的：所述江鳕精液冷冻保存液包含以下浓度的组分：0.3mol/L葡萄糖、10％甲醇和10％蛋黄。

一种江鳕精液冷冻保存液制备方法，包括如下步骤：

1)、称取10克甲醇、5.4克葡萄糖和10克蛋黄；

2)、将步骤1)中的混合物溶解到70ml纯净水中：

3)、将步骤2)中混合液搅拌后，加入30ml纯净水，最后定容到100ml。

一种江鳕精液冷冻保存液在江鳕精液冷冻保存中的用途。

一种江鳕精液冷冻保存方法：包括以下步骤：

1)、将已预冷精液冷冻保存液分别与精液以3∶1的比例进行混合，并迅速装到0.5mL麦管中，用烧热的镊子进行封口；

2)、在盛有液氮的泡沫箱里以距液氮面2cm的位置进行降温，10min后投入液氮中；

3)、将麦管装入纱布袋，保存在液氮罐内。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明采用液氮表面冷冻法研究了3种精液冷冻保存液对江鳕冻精激活比例和存活时间的影响，筛选出江鳕适宜的精液冷冻保存液，开发出更好的精液冷冻保存技术，为江鳕种质冷冻保存、精子库建立及应用打下基础，同时为新疆珍稀冷水鱼类种质库的建立提供必要的基础资料。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

现有技术中江鳕精液冷冻保存液包含以下浓度的组分：NaCl 5.84g/L、KCl0.015g/L、CaCl2·2H2O 0.11g/L、MgSO4·7H2O 0.12g/L、Hepes 4.77g/L、蛋黄7％和10％甲醇。

本发明中江鳕精液冷冻保存液具体如下：

实施例1

一种江鳕精液冷冻保存液，江鳕精液冷冻保存液包含以下浓度的组分：

0.3mol/L葡萄糖、10％甲醇、10％蛋黄和KCl 1.79g/L。

江鳕精液冷冻保存液的制备方法包括如下步骤：

1)、称取10克甲醇、5.4克葡萄糖、10克蛋黄和0.179gKCl；

2)、将步骤1)中的混合物溶解到70ml纯净水中：

3)、将步骤2)中混合液搅拌后，加入30ml纯净水，最后定容到100ml。

实施例2

一种江鳕精液冷冻保存液，江鳕精液冷冻保存液包含以下浓度的组分：

0.3mol/L葡萄糖、10％甲醇和10％蛋黄。

江鳕精液冷冻保存液的制备方法包括如下步骤：

1)、称取10克甲醇、5.4克葡萄糖和10克蛋黄；

2)、将步骤1)中的混合物溶解到70ml纯净水中：

3)、将步骤2)中混合液搅拌后，加入30ml纯净水，最后定容到100ml。

实施例3

精液冷冻保存液对江鳕精子激活比例影响的试验材料如下：

1)、试验材料

亲鱼的选择：

试验所用的鱼为额尔齐斯河野生江鳕，使用前挑选身体健康、发育成熟的雄鱼；

2)、试验地点

亲鱼培育的水温为2℃，养殖场所采取必要的避光措施，保持比较暗的光线，尽量避免光线对精子的杀伤；

3)、试验试剂

葡萄糖、甲醇、NaCl、KCl、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、Hepes和蛋黄。

精液冷冻保存液对江鳕精子激活比例影响的试验方法如下：

S1、精液冷冻保存液配制

1)、I号精液冷冻保存液的配制：分别称取NaCl 0.584g、KCl 0.0015g、CaCl2·2H2O 0.011g、MgSO4·7H2O 0.012g、Hepes 0.477g、7克蛋黄和10克甲醇分别溶解到70ml纯净水中，最后定容到100ml：

2)、II号精液冷冻保存液的配制：分别称取10克甲醇、5.4克葡萄糖、10克蛋黄和0.179gKCl分别溶解到70ml纯净水中，最后定容到100ml；

3)、III号精液冷冻保存液的配制：分别称取10克甲醇、5.4克葡萄糖和10克蛋黄分别溶解到70ml纯净水中，最后定容到100ml；

S2、精液采集

选择5条可以挤出精液的江鳕亲鱼，利用毛巾将鱼体裹住，腹部朝上，用干毛巾将生殖孔周围的腹部擦干，由前向后轻轻挤压，用培养皿接住流出的乳白色精液，并防止尿液和水混入。采精后在显微镜下进行激活，检查精子浓度和活力，将浓度适宜且活力旺盛的精液置于冰盒内，闭光储存待用；

S3、精液冷冻保存

1)、将3种已预冷精液冷冻保存液分别与精液以3∶1的比例进行混合，并迅速装到0.5mL麦管中，用烧热的镊子进行封口；

2)、在盛有液氮的泡沫箱里以距液氮面2cm的位置进行降温，10min后投入液氮中；

3)、将麦管装入纱布袋，保存在液氮罐内；

S4、冻精精子活力与存活时间分析

将装有冻精的纱布袋提至液氮罐罐口，迅速取出麦管，放入温水中解冻(40℃，10s)后，取出剪开，用牙签蘸取少许精液涂在载玻片上，滴加1-2滴授精液(100mmol/L的NaCL，用1mol/L的NaOH调pH＝9.0)，观察并录像记录精子在激活后的运动情况，每个冷精液冷冻保存液重复3次。以主观判断得到的每个视野中运动精子占全部精子比例计为激活比例，以观察到约95％精子不再运动的时间计为精子存活时间。

S5、数据分析

数据用“平均值±标准差”表示，用SPSS 16.0软件对数据进行单因素方差(One-Way ANOVA)分析，采用Duncan’s法对平均值进行多重比较，P＜0.05表示差异显著。

S6、结果与分析

3种精液冷冻保存液对江鳕精子激活比例的影响

采用3种不同的精液冷冻保存液对江鳕精液进行冷冻保存后解冻，测得精子激活比例如表1所示。从结果可以看出，II号和III号精液冷冻保存液的精子激活比例均显著高于I号精液冷冻保存液(P＜0.05)，其中II号精液冷冻保存液的精子激活比例高于III号精液冷冻保存液，但未达到显著差异水平(P＞0.05)。

表1 不同精液冷冻保存液对江鳕精液激活比例的影响

注：标准差后肩标相同小写字母表示差异不显著(P＞0.05)，肩标不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。下表同。

3种精液冷冻保存液对江鳕精子存活时间的影响

江鳕冷冻精液用3种精液冷冻保存液进行冷冻保存后解冻，观察并记录其存活时间，结果如表2所示。用II号和III号精液冷冻保存液冻存的精子激活后的存活时间均显著长于I号精液冷冻保存液(P＜0.05)，其中II号精液冷冻保存液冻存的精子激活后的存活时间长于III号精液冷冻保存液，但未达到显著差异水平(P＞0.05)。

表2 不同精液冷冻保存液对江鳕冻精精子存活时间的影响

精液冷冻保存液包括基础稀释溶液和抗冻保护剂，不同鱼类的精子生理特性不同，选用不同的基础稀释溶液和不同的抗冻保护剂。渗透性抗冻保护剂有甘油、甲醇、二甲亚砜、乙二醇、乙酰胺、丙二醇等，这类抗冻剂多属小分子物质，那个轻易渗透到细胞内，使细胞脱水，并在溶液中结合水分子，弱化水的结晶过程，达到保护目的。本研究的三种精液冷冻保存液都以甲醇和蛋黄为基本成分，其中I号精液冷冻保存液成分复杂，但结果并不理想，而成分简单的II号与III号稀释液获得了更高的激活比例和更长的精子存活时间，冷冻保存效果更优。

精子在一定条件下(如在精巢中)会受到抑制，而一旦抑制条件被解除(如释放到水中)则会激烈运动起来。K+是淡水鱼类精浆的重要组成成分之一，也是构成精浆渗透压的主要物质和淡水鱼类精子激活的主要抑制因子。为防止精液在与精液冷冻保存液混合过程中被激活，本研究在通过0.3M的葡萄糖来提供足量渗透压的同时，又添加KCl来进一步抑制精子的激活。本研究的结果表明添加有1.79g/L氯化钾的II号精液冷冻保存液能够获得比未添加有氯化钾的III号精液冷冻保存液较高的激活比例和更长的精子存活时间。

本研究所用的3种精液冷冻保存液中，成分简单的II号和III号获得的冻精激活比例和精子存活时间显著高于成份复杂的I号；II号(含0.3mol/L葡萄糖、10％蛋黄、10％甲醇、KCl g/L1.79)的冻精激活比例和精子存活时间都高于III号，所以II号精液冷冻保存液可以用于江鳕的精液冷冻保存。

上面对本发明的较佳实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。

Claims (8)

1.一种江鳕精液冷冻保存液，其特征在于，所述江鳕精液冷冻保存液包含以下浓度的组分：0.3mol/L葡萄糖、10％甲醇、10％蛋黄和KCl 1.79g/L。

2.根据权利要求1所述的江鳕精液冷冻保存液，其特征在于，所述精液冷冻保存液包括基础稀释溶液和渗透性抗冻保护剂。

3.根据权利要求2所述的江鳕精液冷冻保存液，其特征在于，所述基础稀释溶液包括葡萄糖和KCl。

4.根据权利要求2所述的江鳕精液冷冻保存液，其特征在于，所述渗透性抗冻保护剂包括甘油、甲醇、二甲亚砜、乙二醇、乙酰胺、丙二醇。

5.根据权利要求1所述的江鳕精液冷冻保存液，其特征在于，所述江鳕精液冷冻保存液包含以下浓度的组分：0.3mol/L葡萄糖、10％甲醇和10％蛋黄。

6.一种江鳕精液冷冻保存液制备方法，包括如下步骤：

1)、称取10克甲醇、5.4克葡萄糖、10克蛋黄和0.179gKCl；

2)、将步骤1)中的混合物溶解到70ml纯净水中；

3)、将步骤2)中混合液搅拌后，加入30ml纯净水，最后定容到100ml。

7.一种如权利要求1-4任一项所述的江鳕精液冷冻保存液在江鳕精液冷冻保存中的用途。

8.一种江鳕精液冷冻保存方法：包括以下步骤：

1)、将已预冷精液冷冻保存液分别与精液以3∶1的比例进行混合，并迅速装到0.5mL麦管中，用烧热的镊子进行封口；

2)、在盛有液氮的泡沫箱里以距液氮面2cm的位置进行降温，10min后投入液氮中；

3)、将麦管装入纱布袋，保存在液氮罐内。