CN102763640A - 一种暗色唇鱼精子超低温冷冻保存方法 - Google Patents
一种暗色唇鱼精子超低温冷冻保存方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102763640A CN102763640A CN2012102775227A CN201210277522A CN102763640A CN 102763640 A CN102763640 A CN 102763640A CN 2012102775227 A CN2012102775227 A CN 2012102775227A CN 201210277522 A CN201210277522 A CN 201210277522A CN 102763640 A CN102763640 A CN 102763640A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sperms
- liquid nitrogen
- semilabeo
- obscurus
- minutes
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
一种暗色唇鱼精子超低温冷冻保存方法，属于低温生物学技术领域。本发明的方法为：选择达到性成熟的优质原种或良种，用100ppm的MS-222麻醉5min，轻轻挤压擦干的腹部，成熟的精液流入5mL离心管中，检测鲜精活力，活力在85%以上的精液样品用于精子冷冻。将采集的优质精液与抗冻液（D-15+5%甲醇）按三步稀释法稀释，使精子终密度为2.5×108个/mL，分装入1.8ml冻存管中，4℃平衡30min，液氮面上6cm平衡10min，液氮面上平衡5min后投入液氮中保存。使用时将保存的精子在40℃水浴中解冻，进行人工授精。本发明具有成本低，操作简便，保持时间长，复苏后精子的活力较高，人工繁殖的暗色唇鱼的受精率和孵化率较高，能投入规模生产的优点；对于开展鱼类资源恢复与重建也具有重要意义。
Description
技术领域：
本发明涉及一种暗色唇鱼精子超低温冷冻保存方法，属于低温生物学技术领域。
背景技术：
暗色唇鱼Semilabeo obscurus Lin，隶属于鲤科（Cyprinidae）野鲮亚科（Labeoninae）唇鱼属（Semilabeo）。由于该鱼体肥、肉嫩、味美，成了捕捞的首选目标。又因其具有群居岩洞的生活习性，便成为不法分子电、毒、炸的最大受害者，随着鱼类资源的利用强度加大和捕捞技术的更新，鱼类生物多样性呈下降趋势，暗色唇鱼已成为李仙江流域珍稀濒危物种。且暗色唇鱼1989年被列入云南省II级保护动物，1998年被列入《中国濒危动物红皮书》。为了保护、开发利用这一珍稀的土著鱼类资源，2007年由云南省环保局批准立项，云南大唐国际李仙江流域水电开发有限公司委托中国科学院昆明动物研究所开展了暗色唇鱼的人工增殖放流研究。而开展暗色唇鱼的精子冷冻保存研究，建立精子库，长期保存精子，是种质资源保护与保存的有效途径之一，也能为遗传育种提供优良种质材料。
自从1949年首次用甘油作为抗冻剂冷冻成功保存精子以来，精子低温冷冻保存的研究取得了很大进展，并逐渐发展成为物种迁地保护和遗传种质资源保存的一个重要手段。在鱼类塘养种群遗传管理实践中，精子低温和超低温冷冻保存能有效地“延长”繁殖个体的繁殖寿命，并在塘养种群的世代数最小化方面显示出很广泛的应用潜力，但该技术仅在一小部分动物物种中使用。
经文献检索，未见与本发明的相同报道。
发明内容：
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种方法简单、操作性强的暗色唇鱼精子超低温冷冻保存方法。
本发明的暗色唇鱼精子超低温冷冻保存方法，其具体步骤如下：
a.配子的采集：采精方法为轻压腹部法，选择形态正常、生长良好、无疾病、达到性成熟的亲鱼原种或良种，用100 ppm的MS-222麻醉5min，鱼类腹部用毛巾擦干，然后轻轻挤压腹部，成熟的精液自然流出到5 mL离心管中；
b.鲜精活力检测：先用移液器滴一滴水于载玻片上，对准视野，然后用针尖挑取上述精液立即于显微镜下搅拌，观察其活力，鲜精活力在85%以上的精液样品用于精子冷冻；
c.冷冻方法：将精液与抗冻液按常规三步稀释法稀释至精子终密度为2.5×108个/mL后分装入1.8 mL冻存管中，经4℃平衡30 min，然后在液氮面上方6 cm处平衡10 min，液氮面上平衡5 min后投入液氮中保存；其中：抗冻液为稀释液D-15+5%甲醇。
使用时将保存的精子在40℃水浴中解冻，然后按照常规方法进行人工授精。
本发明的各步骤中所用的百分比为体积百分比。
本发明具有成本低，操作简便，保存时间长，复苏后精子的活力较高，人工繁殖的暗色唇鱼的受精率和孵化率较高，能投入规模生产的优点；对于开展鱼类资源恢复与重建也具有重要意义。
具体实施方式：
本发明的暗色唇鱼精子超低温冷冻保存方法，其具体步骤如下：
1、配子的采集：采精方法为轻压腹部法，选择性成熟的优良亲鱼，用100 ppm的MS-222 (Tricaine，C10H15NO3S)麻醉5 min，鱼类腹部用毛巾擦干，然后轻轻挤压腹部，成熟的精液自然流出到5 mL离心管中；
2、鲜精活力检测：先用移液器滴一滴水于载玻片上，对准视野，然后用针尖挑取上述精液立即于显微镜下搅拌，观察其活力，鲜精活力在85%以上的精液样品用于精子冷冻；
3、冷冻方法：将精液与抗冻液按三步稀释法稀释至精子终密度为2.5×108个/mL后分装入1.8 mL冻存管中，经4℃平衡30 min，然后在液氮面上方6 cm处平衡10 min，液氮面上平衡5 min后投入液氮中保存；抗冻液是以稀释液D-15（0.8% NaCl、0.05% KCl、1.5% Glucose）为基础液，其中加入5%甲醇。
4、鲜精寿命检测：即精子从被激活至视野中90%以上的精子基本不动为止所持续的时间；
5、细胞膜完整率检测：精液稀释100倍后，用0.4%台盼蓝染色3 min；细胞膜破损的精子头部被染成蓝色，而细胞膜完整的精子头部不被染色；显微镜下计算未染色的精子数占总精子数的百分比；
使用时：将冻存管从液氮中取出后迅速置于40℃水浴锅中快速晃动30s，然后进行人工授精，即：将暗色唇鱼鱼卵挤入容器中，按105：1的精卵数量比例加入解冻后的精液，拌匀，再滴加0.2 ml激活液，搅拌，使卵受精。
应用结果表明：在鲜精活力为86.17±4.06%，寿命为47.5±3.1 s，细胞膜完整率为86.22±5.29%；通过上述冷冻方法，暗色唇鱼的精液在超低温下能够保存一年；通过上述冻精解冻方法，复苏后冻精的精子活力为76.33±1.70%，精子寿命为44.3±3.6 s，细胞膜完整率为85.67±1.11%，受精率达85%以上。
Claims (1)
1.一种暗色唇鱼精子超低温冷冻保存方法，其特征在于该保存方法的具体步骤如下：
a. 配子的采集：采精方法为轻压腹部法，选择形态正常、生长良好、无疾病、达到性成熟的亲鱼原种或良种，用100 ppm的MS-222麻醉5 min，鱼类腹部用毛巾擦干，然后轻轻挤压腹部，成熟的精液自然流出到5 mL离心管中；
b. 鲜精活力检测：先用移液器滴一滴水于载玻片上，对准视野，然后用针尖挑取上述精液立即于显微镜下搅拌，观察其活力，鲜精活力在85%以上的精液样品用于精子冷冻；
c. 冷冻方法：将精液与抗冻液按常规三步稀释法稀释至精子终密度为2.5×108个/mL后分装入1.8 mL冻存管中，经4℃平衡30 min，然后在液氮面上方6 cm处平衡10 min，液氮面上平衡5 min后投入液氮中保存；其中：抗冻液为稀释液D-15+5%甲醇。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2012102775227A CN102763640A (zh) | 2012-08-07 | 2012-08-07 | 一种暗色唇鱼精子超低温冷冻保存方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2012102775227A CN102763640A (zh) | 2012-08-07 | 2012-08-07 | 一种暗色唇鱼精子超低温冷冻保存方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102763640A true CN102763640A (zh) | 2012-11-07 |
Family
ID=47091405
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2012102775227A Pending CN102763640A (zh) | 2012-08-07 | 2012-08-07 | 一种暗色唇鱼精子超低温冷冻保存方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102763640A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103404508A (zh) * | 2013-06-19 | 2013-11-27 | 浙江省淡水水产研究所 | 花*精子超低温冷冻保存和复苏方法 |
| CN114271264A (zh) * | 2022-01-11 | 2022-04-05 | 新疆农业大学 | 一种江鳕精液冷冻保存液、制备方法及其用途 |
-
2012
- 2012-08-07 CN CN2012102775227A patent/CN102763640A/zh active Pending
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 王晓爱等: "软鳍新光唇鱼精子的超低温冷冻保存", 《动物学研究》 * |
| 采克俊: "鱼类精子低温冷冻保存研究进展", 《湖州师范学院学报》 * |
| 陈松林: "鱼类配子和胚胎冷冻保存研究进展及前景展望", 《水产学报》 * |
| 陈松林等: "鲢、鲤、团头鲂和草鱼精液冷冻保存的研究", 《动物学报》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103404508A (zh) * | 2013-06-19 | 2013-11-27 | 浙江省淡水水产研究所 | 花*精子超低温冷冻保存和复苏方法 |
| CN103404508B (zh) * | 2013-06-19 | 2014-12-24 | 浙江省淡水水产研究所 | 花*精子超低温冷冻保存和复苏方法 |
| CN114271264A (zh) * | 2022-01-11 | 2022-04-05 | 新疆农业大学 | 一种江鳕精液冷冻保存液、制备方法及其用途 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Tsai et al. | Advantages and applications of cryopreservation in fisheries science | |
| Paredes et al. | Comparative cryopreservation study of trochophore larvae from two species of bivalves: Pacific oyster (Crassostrea gigas) and Blue mussel (Mytilus galloprovincialis) | |
| CN104521943A (zh) | 一种云斑尖塘鳢精子超低温冷冻保存及复苏方法 | |
| Liu et al. | Use of computer-assisted sperm analysis (CASA) to evaluate the quality of cryopreserved sperm in red seabream (Pagrus major) | |
| CN101884322A (zh) | 条斑星鲽精子冷冻保存方法 | |
| CN108244099A (zh) | 一种大泷六线鱼精子高效超低温冷冻保存方法 | |
| Rodina et al. | Cryopreservation of tench, Tinca tinca, sperm: sperm motility and hatching success of embryos | |
| Koh et al. | Sperm cryopreservation of Japanese eel, Anguilla japonica | |
| Palhares et al. | Effect of melatonin supplementation to a cytoprotective medium on post-thawed Brycon orbignyanus sperm quality preserved during different freezing times | |
| Santana et al. | Step by step optimization of a sperm cryopreservation protocol for spotted wolffish (Anarhichas minor Olafsen, 1772) | |
| Malecki et al. | Artificial insemination technology for ratites: a review | |
| CN105360109A (zh) | 一种黄颡鱼精子超低温冷冻保存方法 | |
| Kusuda et al. | Cryopreservation of chum salmon blastomeres by the straw method | |
| Zhu et al. | Cryopreservation of sperm from wild greenlip abalone (Haliotis laevigata) in Australia | |
| CN102763640A (zh) | 一种暗色唇鱼精子超低温冷冻保存方法 | |
| Gaitán-Espitia et al. | Cryogenic preservation of sperm from lane snapper (Lutjanus synagris): testing the effects of extenders and freezing rates on sperm quality | |
| Šćekić et al. | A novel strategy for conservation of European eel (Anguilla anguilla) genetic resources: Cryopreservation of ovarian stem cells | |
| CN102763641A (zh) | 滇池金线鲃精子超低温冷冻保存及复苏方法 | |
| Liu et al. | Development of a programmable freezing technique on larval cryopreservation in the Pacific oyster Crassostrea gigas | |
| Yamaner et al. | Sperm quality and effects of different cryomedia on spermatozoa motility in first-time spawning of cultured Russian... | |
| Le François et al. | Characterization and husbandry of wild broodstock of the blackfin icefish Chaenocephalus aceratus (Lönnberg 1906) from the Palmer Archipelago (Southern Ocean) for breeding purposes | |
| Widyaningsih et al. | Effect of various concentrations of palm date (Phoenix dactylifera L.) on spermatozoa motility of giant grouper (Epinephelus lanceolatus) | |
| CN103348932B (zh) | 一种夏鲆冻精与牙鲆种间杂交人工授精的方法 | |
| CN103404508B (zh) | 花*精子超低温冷冻保存和复苏方法 | |
| Pan et al. | Cryopreservation of black seabream (Acanthopagrus schlegelii) sperm |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20121107 |